diagnostic par rt-pcr sur lightcycler · pdf fileet d’un lightcycler 2.0, système...
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ROCH E DIAG NOSTICS - 10 000 B IO N°76 - SE PTE M B R E 2007 ROCH E DIAG NOSTICS - 10 000 B IO N°76 - SE PTE M B R E 2007ROCH E DIAG NOSTICS - 10 000 B IO N°76 - SE PTE M B R E 2007 ROCH E DIAG NOSTICS - 10 000 B IO N°76 - SE PTE M B R E 2007
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Pouvez vous nous rappeler la chronologie des faits et l’évolution de cette situation de crise épidémique d’infection par le virus du Chikungunya ?Alain Michault : En février 2005, nous avons découvert le premier cas de CHIK chez une personne originaire des Comores et le nombre de cas n’a pas cessé d’augmenter jusqu’en juin. Avec l’arrivée de l’hiver austral, le nombre de cas a diminué progressivement. En sep-tembre nous avons eu une recrudescence de contaminations et nous avons décou-vert les premiers cas de transmissions materno-fœtales et d’encéphalopathies.
ChikungunyaEfficacité de la réponse
biologique dans un contexte épidémique
C ’est dans le cadre des 4e Rencontres LightCycler
et Genome Sequencer que le Dr Alain Michault nous a présenté cette expérience unique et ses résultats méthodologiques appliqués concrètement à la réalité du terrain. Nous avons profité de son passage en métropole pour en savoir plus.
Le Dr Alain Michault lors de son intervention à l’Institut Pasteur.
DIAgnostIC pAr rt-pCr sur LIgHtCyCLEr
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puis le nombre de sujets infectés a augmenté de manière exponentielle durant tout l’été aus-tral pour atteindre son pic mi-février 2006, avec 45 000 cas en une semaine. puis la cour-be s’est inversée et en novembre 2006 nous ne déplorions plus un seul cas de transmission. À la fin de l’épidémie 38 % de la population était atteinte (300 000 sur 785 000 habitants)
Devant cette situation, de quels moyens humains et matériels disposiez vous pour développer rapidement un diagnostic biologique fiable de cette infection ?AM : tout d’abord, je tiens à préciser que nous ne connaissions pas très bien cette infection. nous avons pensé que le retour de l’été austral serait probable-ment propice à une amplification de ce phénomène. Il fallait donc anticiper.nous avons donc dés juin 2005 fait la bibliographie pour rechercher les tech-niques de biologie moléculaire publiées et commandé les amorces qui nous paraissaient les mieux adaptées pour réaliser une rt pCr en temps réel sur Light Cycler. Au mois de septembre nous avons découvert et confirmé les premiers cas de transmission materno-fœtale et d’encéphalopathie en collaboration avec Isabelle schuffenecker du Centre national de référence des Arbovirus (Cnr, Lyon). nous avons donc ressorti les amorces que nous avions comman-dés fin juin et en quelques jours, avec gérard Bertil, technicien du laboratoire, nous avons monté une technique de base en recherchant les meilleurs amor-ces avec une technique sybergreen ; une fois les amorces trouvées, nous avons commandé la sonde taqMan cor-respondante.
pour sécuriser la tech-nique, nous voulions absolument avoir un témoin interne et pour mieux étudier cette maladie nous avons pensé qu’il serait utile de connaître la charge virale. Le nombre de cas augmentait très vite, et nous n’avions pas le temps de réaliser des mises au point avec les techniques habituelles (Arn transcript pour le témoin interne et pour
la charge virale). Donc nous avons utilisé, pour rechercher les inhibiteurs de la taq polymerase et pour contrôler l’extraction de l’Arn, un Arn d’enterovirus comme témoin car nous avions une technique taqMan Entérovirus que nous maîtrisions bien au laboratoire. pour la charge virale, nous l’avons calculée par une technique de quantification relative, en pensant que cela nous permettrait, dès lors que nous aurions une bonne technique de quanti-fication du témoin de pouvoir réévaluer ces charges virales relatives. pour suivre les patients, nous avions aussi besoin de la sérologie et nous avons adapté les techniques sérologiques du Cnr de Lyon pour les IgM (Immunocapture) et les Igg (ELIsA) sur automate.
Dans un premier temps, il faut répondre à l’urgence, mais pour la suite comment avez-vous validé vos techniques ?AM : pour la rt-pCr, nous avons envoyé 100 plasmas au Cnr qui a confirmé la sensibilité de la technique, 100 % de résultats concordants. pour les techni-ques sérologiques, nous avons égale-ment comparé nos résultats avec ceux du Cnr pour évaluer la sensibilité et la spécificité. pour la quantification par rt-pCr, nous avons constaté à pos-teriori que la sensibilité de la techni-que développée dans l’urgence était de 350 copies/mL.
Pourquoi avez-vous choisi de monter une RT-PCR ?AM : nous avons tout de suite fait ce choix, car nous disposions au labora-toire d’un Magnapure pour l’extraction et d’un LightCycler 2.0, système de pCr en temps réel sur capillaire. De plus nous avions une bonne maîtrise de ces techniques ayant mis au point de nom-breuses techniques au laboratoire avec ces systèmes :• en virologie : Herpès (HsV1 et 2), Varicelle et Zona, EBV, CMV, Entérovirus, Dengue, West nile Virus• en bactériologie : Leptospirose, Coqueluche, staph. Metir, Legionnelle, Mycobacterium groupe tuberculosis ;• enfin en parasitologie : plasmodium sp et identification des espèces dont p. falciparum, Aspergillus fumigatus, Candida albicans, Amibe (Entamoeba histolytica et dispar).En pleine épidémie, le ministère a déblo-qué des budgets. nous avons donc pu installer un deuxième LightCycler 2 pour pouvoir traiter plus efficacement la demande croissante et répondre à cet état de crise.
Que vous ont apporté le MagNa Pure et le LightCycler dans cette course contre la montre ?AM : Les points forts nous les connais-sions bien pour avoir, comme nous venons de le voir, monté de nombreu-ses techniques. Le système LightCycler est très souple et lorsque vous maî-trisez bien toutes les possibilités de son logiciel, il permet à des personnes expérimentées d’être très réactif. Dans cette entreprise, il nous a aussi fallu pas mal d’intuition alliée à nos connais-sances. nous avons tout de même monté cette technique en 5 jours ! sans l’automatisation de l’extraction avec le Magna pure, répondre à la demande en période épidémique aurait été impossible.
Le nombre de sujets infectés a augmenté
de manière exponentielle durant
tout l’été austral pour atteindre son pic
mi-février 2006, avec 45 000 cas
en une semaine. Au total, 38 %
de la population a été atteinte.
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Quelles ont été les étapes d’amélioration de la technique ?tout d’abord, nous découvrions une pathologie et nous savions peu de chose sur les mécanismes de transmission, notamment materno-fœtale – passage placentaire ? transmission à l’accouche-ment ? transmission par l’allaitement ? Il a fallu répondre à toutes ces questions et dans le même temps assurer le dépis-tage. Les phases d’amélioration que je vais vous décrire se sont donc étalées sur environ 6 mois.
La première étape d’amélioration de la technique a porté sur le contrôle interne afin que celui-ci puisse être amplifié par les amorces CHIK et non plus par les amorces Entero. Cette contrainte nous obligeait à travailler jusque là, sur 2 capil-laires (un pour le contrôle et un pour CHIKV) réduisant de 50% notre produc-tivité. nous avons donc fabriqué un ADn à partir de l’Arn Entero en y greffant les séquences des amorces CHIKV à l’aide d’amorces flottantes puis nous avons cloné l’ADn obtenu. Enfin, nous avons
transcrit cet ADn en Arn.Mais pour pouvoir réaliser la rt-pCr avec l’étalon interne dans le même capil-laire, il était nécessaire d’avoir des sondes CHIKV et Entéro émettant à différentes longueurs d’onde.nous avons trouvé avec l’aide de roche Diagnostics France, une publication décrivant une technique utilisant une sonde DyXL (tibMolBiol) dont la lon-gueur d’onde d’émission est très éloignée de celle du FAM/tAMrA ; nous l’avons commandée et testée avec succès. Avoir un bon étalon interne est essentiel pour pouvoir rechercher cet arbovirus dans n’importe quel milieu avec certitude (ex : le lait maternel, biopsie…) et en s’affran-chissant totalement des nombreux inhibi-teurs pouvant être présent. En n’utilisant plus qu’un seul capillaire, nous avons beaucoup gagné en coût, en temps et en efficacité.La deuxième étape d’amélioration concer-nait la mesure de la charge virale. nous avons fabriqué un Arn CHIKV, ce qui nous a permis d’établir une gamme de quantification et ainsi de définir parfai-tement la sensibilité de cette technique. La sensibilité était alors de 145 copies/mL (2,9 copies/capillaire). pour améliorer la sensibilité, nous avons augmenté le volume d’échantillon (200 µl à 500 µl), la taille du capillaire (20 µl à 100 µl) et les temps des run de pCr. Au final, le seuil de détection obtenu est de 40 copies/mL. Cette technique a également été montée sur le cobas taqMan 48 sans problème. Ainsi, nous avons pu recal-culer rétroactivement les charges virales pour tous les prélèvements et en tirer des informations précieuses pour mieux comprendre cette pathologie.
L’équipe technique « PCR en temps réel » : en haut, Gérard Bertil à l’écran du cobas TaqMan 48, Florence Naze à la paillasse LightCycler 2.0. En bas, Miguel Picard dans la pièce « extraction » devant le MagNa Pure.
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Quelles informations par exemple ?nous avons pour cet infection des char-ges virales très élevés et des variations importantes en fonction de l’âge : les charges virales les plus fortes le sont chez les nouveaux nées (nourissons < 3 mois) et chez les personnes âgées. pour donner un exemple nous avons trouvé chez un nouveau née une charge virale de 1,2 milliard de copies/mL !
Vous travaillez actuellement sur une évolution vers une RT-PCR multiplex. Pouvez-vous nous en dire plus ?À La réunion, nous avons d’autres virus émergents susceptibles de, ou ayant déjà été la cause d’épidémie. En 1978, la Dengue a touché 30 % de la population et récidivé en 2004
avec 2 000 cas environ. Cette patholo-gie virale est problématique. En effet, si seulement 6 % des patients atteints par le CHIK sont asymptomatiques, 90 % des cas le sont avec la Dengue, c’est un vrai problème.Dans ce contexte, une technique multiplex permettrait de ne pas passer à coté de co-infections possibles. Celle-ci aurait aussi un intérêt en trans-fusion sanguine.nous finalisons une techniques duplex CHIK et Dengue et nous envisageons une multiplex CHIK/DEnguE/WnV. Des essais sont en court et il nous faut maintenant trouver des amorces et des sondes compatibles entre elles, avec des longueurs d’ondes d’émis-sions bien séparées. Aujourd’hui, nous n’avons jamais mis en évidence de contamination par le WnV, même dans
des cas graves d’encéphalites où nous l’avons recherché, mais il faut se pré-parer à cette éventualité ; les oiseaux migrateurs concernés passent aussi par La réunion !
En conclusion, que retirez-vous de cette expérience ?Cela a été pour moi et toute mon équipe une expérience passion-nante, épuisante… mais très riche sur le plan scientifique et humain. En espérant qu’elle reste unique et que nous n’ayons pas le privilège de la revivre, par exemple avec une épidémie de grippe aviaire !
Contact Roche Diagnostics :[email protected]@roche.com
Le panel virus Herpès disponible sur le LightCycler® 2.0 CE-IVD
CMV • EBV • HSV1/2 • VZV*
Un diagnostic entièrement marqué CE-IVD de l’extraction au rendu du résultat par PCR en temps réel
Les 4 tests allient une grande sensibilité à une gamme de linéarité très large (CMV & EBV)
Un diagnostic PCR temps réel simultané Les 4 virus peuvent être analysés simultanément par un profi l de PCR commun
Un diagnostic rapide Rendu en moins de 3 heures
Simplifi cation et robustesse du rendu du résultat La programmation et l’analyse sont entièrement automatisées
* Distribué par Roche Diagnostics, manufacturé par Sangtec Molecular Diagnostics AB.