diagnosi
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Il percorso diagnostico in allergologia. Diagnosi. Sintomo. Diagnosi. Sintomo. Il percorso diagnostico in allergologia. L’Iter diagnostico si fonda su:. Anamnesi; Esame obiettivo; Indagini allergologiche. Anamnesi. Una anamnesi corretta permette da sola : - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
DiagnosiDiagnosi
SintomoSintomo
Il percorso diagnostico in allergologia
DiagnosiDiagnosi
SintomoSintomo
Il percorso diagnostico in allergologia
L’Iter diagnostico si fonda su:
Anamnesi;
Esame obiettivo;
Indagini allergologiche
Anamnesi
Una anamnesi corretta permette da sola :
di individuare circa il 60 % dei pazienti allergici ;
ha una specificità che sfiora il 95% ;
consente di individuare la presenza di comorbidità
Non presenta caratteristiche peculiari,
Può essere negativo per la caratteristica accessionalità delle sindromi allergiche (utile esaminare il paziente in fase acuta e in fase intervallare, per confrontare i reperti osservati);
Esame Obiettivo:
• Test in vivo
Prick test
Intradermoreazioni
Patch test
Test di provocazione
• Test in vitro
Dosaggio IgE sieriche
Dosaggio mediatori
Indagini Allergologiche :
Principi diagnostici delle malattie IgE-mediate
Test Cutanei
Dosaggio delleIgE specifiche nel siero
Rilascio istamina
Attivazione basofili
Challenge specifico nasale, bronchiale, congiuntivale, oraleConta Eosinofili
Cute
Sangue
Mucosa
Indagini allergologiche in vivo
Prick testPrick test Prick test alimentiPrick test alimenti Patch testPatch test
Test intradermicoTest intradermico TPOTPO
• Prick & Storia Clinica Positivi Entrambi
• Prick & Storia Clinica Negativi Entrambi
• Prick & Storia Clinica Controversi
• Prick & Storia Clinica Positivi Entrambi
• Prick & Storia Clinica Negativi Entrambi
• Prick & Storia Clinica Controversi
Prick test e allergia respiratoria
• Prick & Storia Clinica Positivi Entrambi
• Prick & Storia Clinica Negativi Entrambi
• Prick & Storia Clinica Controversi
• TPO
• Prick & Storia Clinica Positivi Entrambi
• Prick & Storia Clinica Negativi Entrambi
• Prick & Storia Clinica Controversi
• TPO
Prick test e allergia alimentare
• Determinazione IgE totali e specifiche verso estratti e verso singole
moleole
• Determinazione di anticorpi non-IgE verso allergeni
• Dosaggio di mediatori chimici flogogeni
• Dosaggio di immunocomplessi
• Dosaggio di frazioni complementari
• Eosinofili su secreto nasale
TEST IN VITRO
Determinazione delle IgE
IgE Totali
IgE Specifiche
Le IgE totali costituiscono lo 0,004% di tutte le immunoglobuline. .
Dosaggio delle IgEs
IgE Specifiche verso estratti
IgE Specifiche verso singole molecole
TERMINOLOGIA• Fonte allergenica
• Estratto allergenico
• Allergene
• Isoallergene
• Epitopo
FONTE ALLERGENICA
Indica il contenitore materiale degli allergeni, ad es. : la parietaria, l’uovo, sono fonti allergeniche,
non allergeni, come spesso siamo soliti far riferimento.
ESTRATTI ALLERGENICI
Gli estratti allergenici comunemente impiegati perla diagnostica in vivo (Ptick test) e in vitro
(RAST, ELISA ecc.) provengono da fonti allergeniche (polline di graminacee,parietaria,uovo ecc.).
Caratteristiche degli Estatti Allergenici:
il il Materiale GrezzoMateriale Grezzo viene viene sottoposto a processo sottoposto a processo estrattivo della componenteestrattivo della componente proteica,proteica,
Gli Estratti Allergenici Grezzi contengono: gli allergeni responsabili della sensibilizzazione, altre sostanze e proteine
La La Componente ProteicaComponente Proteica viene trattata per individuare viene trattata per individuare le sostanze con potere le sostanze con potere antigenico (mappa antigenica antigenico (mappa antigenica dell’ estratto),non tutte fornite dell’ estratto),non tutte fornite di potere allergenicodi potere allergenico
L’Estratto AntigenicoL’Estratto Antigenico viene viene sottoposto a processo disottoposto a processo di tipizzazione degli allergenitipizzazione degli allergeni facendolo reagire con il facendolo reagire con il siero di pazienti contenentisiero di pazienti contenenti le IgE specifiche.le IgE specifiche.
Ciascun soggetto allergico Ciascun soggetto allergico possiede infatti un proprio possiede infatti un proprio caratteristico caratteristico Assetto Assetto AllergenicoAllergenico per la presenza per la presenza di IgE specifiche rivolte di IgE specifiche rivolte verso l’uno o l’altro verso l’uno o l’altro componente allergenico componente allergenico dell’estratto. dell’estratto.
ALLERGENI
Gli allergeni sono proteine, glicoproteine o apteniconiugati a carrier, con peso molecolare tra 5 e150 kDa, e punto isoelettrico compreso tra 2-10
ISOALLERGENI
Indicano forme molecolari multiple dello stesso allergene proveniente dallo stesso organismo con un’estesa, ma non obbligatoria, cross-reattività. Hanno in genere un peso molecolare molto simile, la stessa struttura terziaria e la stessa funzione biologica e hanno almeno il 67% d’identità nella sequenza aminoacidica. Ad esempio di Bet v 1 si conoscono 31 isoallergeni con identità di sequenza tra il 73 e il 98%.
Isoallergeni
Xxx y1.01Xxx y1.01Xxx y1Xxx y1
EPITOPI
Gli Epitopi sono la porzione di allergene effettivamente riconosciuta e legata da un anticorpo specifico
Ciascun allergene può presentare un numero elevato di epitopi pertanto ad es. non esistono IgE specifiche per latte (fonte
allergenica) o per caseina (allergene del latte) ma IgE specifiche dirette verso gli epitopi della caseina.
Gli Epitopi possono essere lineari o conformazionali
EPITOPO Lineare
Epitopi “lineari” (aminoacidi in sequenza, contigui e presenti sulla struttura primaria dell’allergene) solitamente termo- e gastro-resistenti
EPITOPO Conformazionale
Epitopi “conformazionali” (aminoacidi non in sequenza, non contigui, distanti tra loro ma che a causa del ripiegamento della catena proteica possono diventare contigui, la loro formazione dipende quindi dalla struttura tridimensionale dell’allergene) solitamente termo- e gastro- labili
Effetto della cottura e della digestione sulle proteine alimentari
Processing1
1
2
2GG
GE
E G E GG
G
E
G
Sampson & Cooke. J Immunol 1997; 159:2026-2032.
CLASSIFICAZIONE DELLE MOLECOLE ALLERGENICHE
Le molecole allergeniche si possono ulteriormente classificare in:
-“GENUINE”, vere marcatrici di una determinata fonte (es. Ole e 1 è la proteina marcatrice dell’allergia al polline dell’olivo e delle altre Oleaceae)
- “PANALLERGENI”, proteine condivise da fonti allergeniche anche tassonomicamente tra loro non correlate, responsabili di apparenti polisensibilizzazioni ai test eseguiti con estratti
Dalla Fonte allergenica alle molecole
Genuine Panallergeni
Dosaggio delle IgEs
IgE Specifiche vs estrattiRAST
Si può eseguire, in casi di dubbi, dopo aver effettuato i prick test, per ottenere conferma diagnostica
Possono essere eseguite, al posto dei test cutanei, quando questi risultino poco affidabili per:
iporeattività cutanea legata a: - età (primi anni di vita, età avanzata) - farmaci (anti h-1, steroidi, ecc.) - precedenti reazioni cutanee intensamente positive
alterata reattività cutanea (ipo o iperreattività) legata a: - malattia allergica in fase acuta e grave - affezioni cutanee estese -. dermografismo
Dosaggio delle IgEs
Il livello di IgE specifiche non è sempre correlato con la gravità della sindrome clinica
la positività delle IgE specifiche può non rivestire significato eziologico nei confronti della malattia in atto (es. Cross-reattività con alimenti vegetali, che si riscontra spesso nei pollinosici, senza che vi sia alcuna manifestazione clinica dopo ingestione di quegli alimenti).
Il dosaggio di IgE specifiche ha sensibilità e specificità inferiori rispetto ai test cutanei
Il Dosaggio delle IgE Specifiche va attentamente e criticamente
valutato
Ricerca delle IgEs
IgE Specifiche verso singole molecole
CRD: Component Resolved Diagnosis
Prick test con estrattodi Phleum
Diagnosi Allergologica in vivo tradizionaleCon estratto di Pleum pratense
Diagnosi Allergologica in vitro tradizionaleCon estratto di Phleum pratense
Allergologia Molecolare
kU /lA
kU /lA
kU /lA kU /lA kU /lA
kU /lA
kU /lA
kU /lA
kU /lA
Phleum: proteine e allergeniImmunoblotting di 12 paz. allergici al Phleum pratense
Estazione
Pattern delle proteine e immunoblotting del siero di pazienti allergici
Prick test con estrattodi Phleum
Phl p1 + - Phl p5
+ -
Phl p 7 + -
Phl p12 + -
Diagnosi Allergologica in vivo tradizionaleCon estratto di Phleum pratense
La fonte allergenica…
Phleum pratense: proteine e allergeni
…contiene milioni di molecole….…di cui solo alcune hanno proprietà allergeniche
Che cosa è un allergene ricombinante?Un allergene ricombinante è molecola allergenica prodotta con tecniche di biotecnologia originariamente identificata da un estratto allergenico. La maggior parte dei ricombinanti allergenici esistenti vengono espressi in Escherichia coli e sono normalmente confrontabili con il loro modello naturale(proteina) per quanto riguarda le caratteristiche strutturali e le proprietà immunologiche.
Gli allergeni ricombinanti vengono prodotti senza che le proteine subiscano variazioni genetiche, biologiche o di lotto.Questo assicura l’ottenimento di allergeni di qualità costante ed elevata standardizzazione
Caratteristiche
Phl p 1Genere Specie Cronologia Isoallergeni
IDENTICHE FUNZIONI BIOLOGICHE
PESO MOLECOLARE SIMILE
>67% IDENTITA’ DELLA SEQUENZA AA.
.01
IUIS – Nomenclatura WHO
1. Miglioramento nel profilo diagnostico
2. Maggiori informazioni sulle poli-sensibilizzazioni (distinzione tra co-sensibilizzazione e co-riconoscimento)
3. Valutazione della potenziale gravità di una reazione clinica (alcune molecole allergeniche possono essere ”più pericolose” di altre)
4. Ruolo decisionale nell’ambito della ITS
5. Monitoraggio della risposta immunologica durante il trattamento …
Lidholm J et al. Component-resolved diagnostics in food allergy. Curr Opin Allergy Clin Immunol 2006;6:234-40
Molecole Allergeniche: principali applicazioni
Cosensibilizzazione o Cross Reattività Cosensibilizzazione o Cross Reattività
Polisensibilizzazione
CO-SENSIBILIZZAZIONE:presenza di IgE dirette verso epitopi distinti e unici presenti in fonti allergeniche diverse (molecole allergeniche genuine)
CO-RICONOSCIMENTO (cross-reattività):presenza di IgE verso molecole omologhe presenti in fonti allergeniche diverse (panallergeni)
Asero R, 2010, mod.Asero R, 2010, mod.
Polisensibilizzazione
Asero R, 2010, mod.Asero R, 2010, mod.
PolisensibilizzazionePolisensibilizzazione
I “panallergeni” inalanti sono :
Profiline
CBP (Calcium binding protein o Polcalcine)
Phl p1, Phl p5 Phl p1290 % 85 %
PROFILINA
Pollini, alberi, erbe, graminacee
CBP
Phleum pratense
Phl p7
Allergia Molecolare - Graminacee
Genuine
La Diagnostica Molecolare nell’Allergia respiratoria
Phl p1, Phl p590 % 85 %
Phleum pratense
Allergia Molecolare - Graminacee
Genuine
Phl p1, Phl p5 Phl p1290 % 85 %
PROFILINA
Phleum pratense
Allergia Molecolare - Graminacee
Genuine
Phl p1, Phl p5 Phl p1290 % 85 %
PROFILINA
Pollini, alberi, erbe,
CBP
Phleum pratense
Phl p7
Allergia Molecolare - Graminacee
Genuine
Allergia Molecolare - Parietaria
Parietaria
Par j 2
83 %
Par j 3 PROFILINA
Pollini, alberi, erbe,
CBP
Par j 4Genuine
Allergia Molecolare - Olivo
Olivo, (frassino, ligustro,forsitia)
Ole e 3, Ole e 8 CBPOle e 1
< 30 %
Ole e 2 PROFILINAGenuine
Allergia Molercolare – Betulla
Betulla (fagales)
Bet v 1
90 – 98 %
Genuine
Allergia Molecolare - Betulla
Bet v 1 Bet v 2
90 – 98 %
10 – 20 %
PROFILINA
Birch (fagales)
Pollini, alimenti
Bet v 4
Polleni, alberi, graminacee, erbe
CBP
mela, ciliegia, pera, albicocca, carota, sedano, soia,pomodoro, ontano, nocciolo, carpino
Alberi, graminacee, erbe, frutta, vegetali, frutta con guscio, spezie, latice
Genuine
A) IDENTIFICAZIONE DELLE FONTI ALLERGENICHE PRIMARIE
Storia clinica (la sensibilizzazione esclusiva ad allergeni cross-reagenti è spesso Storia clinica (la sensibilizzazione esclusiva ad allergeni cross-reagenti è spesso clinicamente silente), SPT, IgE specifiche estrattoclinicamente silente), SPT, IgE specifiche estrattoIgE specifiche per gli IgE specifiche per gli allergeni genuiniallergeni genuini specifici (Phl p 1/5; Amb a 1; Bet v 1; Art specifici (Phl p 1/5; Amb a 1; Bet v 1; Art v 1; Par j 2; Ole e 1; Fel d 1; Alt a 1)v 1; Par j 2; Ole e 1; Fel d 1; Alt a 1)
B) IDENTIFICAZIONE REATTIVITA’ A PANALLERGENIIgE specifiche per IgE specifiche per panallergenipanallergeni (Phl p 7; Bet v 2; Der p 10) (Phl p 7; Bet v 2; Der p 10)
SCELTA DELLA TERAPIA IDONEASCELTA DELLA TERAPIA IDONEA
Allergia Molecolare come procedere in pratica
AM il razionale: Chi, Perchè e Quale vantaggio
1. Chi testare?
2. Perchè testare con AM?
3. Quale vantaggio l’AM comporta al clinico?
• Pazienti con estratto allergenico completo positivo• Pazienti poli-sensibili (inalanti, alimenti)• Pazienti con pattern e sintomi respiratori non chiari
• Fare una diagnosi differenziale• Definire il reale profilo di sensibilizzazione del paziente• Migliore gestione del paziente
• Definizione della ITS (o altra terapia)• Supporto nell’indicazione di eliminazione dell’allergene• Suggerimenti per le reazioni di cross-reattività
CRD e ITS
Selezione dei pazienti da avviare alla ITS
• Anamnesi• Esame Obiettivo• SPT o dosaggio IgEs basato
sugli estratti
Mugwort
Birch
Timothy
Si tratta di tre sensibilizzazioni genuine?
MugwortMugwort
BirchBirch
TimothyTimothy
..o di cross-reattività?
Profilins and polcalcins may cause positive tests
MugwortMugwort
BirchBirch
TimothyTimothy
La risposta è data dalla CRD
Genuine sensitization to timothy only
MugwortMugwort
BirchBirch
TimothyTimothy
Componenti genuine
Bet v 1
Art v 1
Phl p 1
Phl p 5
Indicazione Indicazione per ITSper ITS
Profilin Polcalcin
Bet v 2Bet v 2 Bet v 4Bet v 4
Art v 4Art v 4 Art v 5 Art v 5
Phl p 12Phl p 12 Phl p 7 Phl p 7
If only cross-reactive markes are identified
further investigation is needed
Componenti cross-reative
Bet v 1Bet v 1
Art v 1Art v 1
Phl p 1Phl p 1
Phl p 5Phl p 5
Allergia Molecolare: come procedere in praticaAllergia Molecolare: come procedere in pratica
Bianchi A, RIAP febbraio 2011;12-19Bianchi A, RIAP febbraio 2011;12-19
La Diagnostica Molecolare nell’Allergia La Diagnostica Molecolare nell’Allergia AlimentareAlimentare
Asero R, 2010, mod.Asero R, 2010, mod.
PolisensibilizzazionePolisensibilizzazione
I “panallergeni“ alimentari sono :
Profiline (Bet v2 omologhe) PR10 (Bet v1 omologhe) LTP (Lipid Transfer Protein) SSD (Seed Storage Protein) CCD (Cross-reactive Carbohydrate Determinants)
Risk assessmentRisk assessment
Stabilità delle proteineStabilità delle proteine
Proteine Labili Reazioni localiProteine Labili Reazioni locali
Proteine Stabili Reazioni sistemicheProteine Stabili Reazioni sistemiche
Allergia Molecolare – PR -10Allergia Molecolare – PR -10
Betulla (Betulla (fagalesfagales))
Bet v 1Bet v 1
mela, ciliegia, pera, albicocca, carota, sedano, soia,pomodoro, ontano, nocciolo, carpino
Caratteristiche
• Estremamente labili, facilmente distrutte dal calore, dall’ossidazione, dai processi di estrazione e dalla digestione pepsinica • reazioni OAS• I pazienti allergici a proteine Bet v 1 omologhe riportano frequentemente una buona tolleranza per gli alimenti cotti e per i succhi di frutta commerciali
Allergeni
Pesca (Pru p 3), mela (Mal d 3), albicocca (Pru ar 3), ciliegia (Pru av 3), prugna (Pru d 3), nocciola (Cor a 8), castagna (Cas s 8), mais (Zea m 14), asparago (Aspa o 1), orzo ( Hor v ), uva (Vit v 1), lattuga (Lac s 1), arachide (Ara h 9 ), senape
Lipid Transfer Protein
Caratteristiche
• Presenti nella buccia delle Rosacee• Resistenza alla pepsina e al calore• Reazioni sistemiche• Pazienti allergici alle LTP riportano frequentemente una buona tolleranza alla frutta sbucciata• Essenzialmente presenti nel sud Europa (Italia e Spagna)
Famiglia delle Rosaceae Famiglia delle Rosaceae
Pru p 1Pru p 1
Pru p 3Pru p 3
Pru p 4Pru p 4
Pru ar 1Pru ar 1
Pru ar 3Pru ar 3
Pru ar 4Pru ar 4
Mal d 1Mal d 1
Mal d 3Mal d 3
Mal d 4Mal d 4
Pru d 1Pru d 1
Pru d 3Pru d 3
Pru d 4Pru d 4
Pyr c 1Pyr c 1
Pyr c 3Pyr c 3
Pyr c 4Pyr c 4
Pru av 1Pru av 1
Pru av 3Pru av 3
Pru av 4Pru av 4
Somiglianza di queste componenti tra differenti frutti con nocciolo
Pru p1Pru p1
Pru p3Pru p3
Pru p4Pru p4
LTP - Frutta e nociLTP - Frutta e noci
• Rosaceae– Pera– Pesca– Ciliegia– Albicocca– Mandorla– Zucca
• Noce• Nocciola• Mais• Semi di sesamo• Semi di girasole• Birra (LTP dell’orzo, stabilizzante per
fermentazione)
• Uva• Arachidi• Senape
Pru p 3
Pru p 3
Cor a 8
Cor a 8
Pru p 3Pru p 3 Par j 2Par j 2 Cor a 8Cor a 8
Non basta essere sensibilizzato all’LTP per avere anticorpi contro Non basta essere sensibilizzato all’LTP per avere anticorpi contro TUTTE le LTP!!!!TUTTE le LTP!!!!
Esiste solo una LTP?Esiste solo una LTP?
Plant nsLTP as food and pollen allergens Saledo G.et al Clin Exp Allergy 2004,34
Omologia tra LTPOmologia tra LTP
Allergia a proteine di depositoAllergia a proteine di deposito
2S AlbumineArachide (Ara h 2, 6, 7), senape, noce brasiliana (Ber e 1), noce (Jug r 1), semi di ricino (Ric c 1, 3), semi di sesamo (Ses i 1, 2), anacardio (Ana o 3), semi di girasole Caratteristiche
• Allergeni estremamente stabili • Sensibilizzazione sia per via gastrointestinale che respiratoria• Resistenza alla pepsina e al calore• Spesso associate a reazioni sistemiche
VicilineArachide (Ara h 1),lenticchia (len c 1), nocciola (Cor a 11), noce (Jug r 2), semi di sesamo (Ses i 3), anacardio (Ana o 1)
LegumineArachide (Ara h 3), noce (Jug r 4), anacardio (Ana o 2), nocciola (Cor a 9)