development of simple and efficiency rna extraction method for … · 2017-10-12 · development of...

ปญหาพเศษปรญญาตร สาขาเทคโนโลยชวภาพทางการเกษตร

เรอง

การพฒนาวธการสกดอารเอนเออยางงายและมประสทธภาพส าหรบปาลมน ามน Development of simple and efficiency RNA extraction method for oil palm

โดย

นางสาวพลอยไพลน ธนกกล

ควบคมและอนมตโดย

................................................................. วนท.......เดอน.......................พ.ศ........... (รศ.ดร.สนธชย จนทรเปรม) ................................................................. วนท.......เดอน.......................พ.ศ........... (ดร.นงลกษณ เทยนเสร)

การพฒนาวธการสกดอารเอนเออยางงายและมประสทธภาพส าหรบปาลมน ามน

นางสาวพลอยไพลน ธนกกล

บทคดยอ

ใบปาลมน ามนมสวนประกอบของ secondary metabolites เชน สารประกอบฟนอลค และโพลแซคคาไรดเปนปรมาณมาก ซงเปนอปสรรคในการสกดอารเอนเอใหมคณภาพดส าหรบใชในการศกษาการแสดงออกของยนในระดบโมเลกล เพอน าขอมลจากการศกษามาพฒนาสายพนธของปาลมน ามนในอนาคต การทดลองนมวตถประสงค เพอเปรยบเทยบวธการสกดอารเอนเอจากใบออนและใบแกของปาลมน ามนใหไดอารเอนเอทมคณภาพดและใชระยะเวลาสนทสด ซงประกอบดวย 6 วธการ พบวา วธท 3 เปนวธทใช NaCl และ Isopropanol ตกตะกอนอารเอนเอแทน LiCl โดยใชเวลาตกตะกอนเพยง 10 นาท เปนวธการทดทสด โดยใชระยะเวลาในการสกดประมาณ 1.5 ชวโมง จากการตรวจสอบตวอยางอารเอนเอดวยเครอง spectrophotometer พบวาคณภาพของอารเอนเอมความบรสทธและมความเขมขนสงถง 1,054 ng/µl ในใบออนและ 587.4 ng/µl ในใบแก เมอท า gel electrophoresis ดวย denaturing formaldehyde agarose gel พบแถบอารเอนเอทคมชด ประกอบดวยแถบของ ribosomal RNA ขนาด 28s, 18s และ 16s และเมอน าอารเอนเอทไดมาเพมปรมาณโดยการท า RT-PCR กบไพรเมอรของยน Actin และ OsBOR แลวตรวจสอบล าดบเบสของผลผลตจากปฏกรยาทงสอง พบวามความเหมอนกบยน Actin และ OsBOR ของพชชนดตาง ๆ ในฐานขอมล แสดงใหเหนวาวธการนมความเหมาะสมในการสกดอารเอนเอจากใบออนและใบแกของปาลมน ามนเพอใชในการศกษาการแสดงออกของยน ค าส าคญ : ปาลมน ามน, อารเอนเอ, อารทพซอาร, อเลคโทรโฟรซส ปญหาพเศษ : ปรญญาตร สาขาเทคโนโลยชวภาพทางการเกษตร คณะเกษตร ก าแพงแสน มหาวทยาลยเกษตรศาสตร อาจารยทปรกษา : รศ.ดร.สนธชย จนทรเปรม และ ดร.นงลกษณ เทยนเสร ปทพมพ : 2555 จ านวนหนา : 34

Development of simple and efficiency RNA extraction method for oil palm

Miss. Ploypilin Thanikkul

Abstract

Oil palm leave is rich in secondary metabolites such as phenolic compound and polysaccharides. These compounds cause difficulty when high quality RNA isolation for gene expression analysis is required for oil palm improvement. The objective of this experiment is to compare RNA isolation protocols for high quality and rapid of RNA isolated from young and mature oil palm leave. There were 6 protocols, protocol 3 that used NaCl and isopropanol instead of LiCl for RNA precipitation in 10 minute is the best method for RNA isolation which the whole process can be completed within 1.5 hr. RNA analyzed spectrophotometrically showed high purity and high concentration of 1,054 ng/µl in young leave and 587.4 ng/µl in mature leave. Electrophoresis analysis on denaturing formaldehyde agarose gel showed 28s, 18s and 16s ribosomal RNA integrity bands. Using the extracted RNA to amplified with Actin and OsBOR primer by RT-PCR produced fragments of DNA. When they were sequenced, their sequences are similar to Actin and OsBOR gene of other plants in the database. This indicates that the protocol is suitable for RNA isolation from young and mature leave of oil palm for gene expression analysis. Key words : oil palm, RNA, RT-PCR, electrophoresis Degree : Bachelor of Science, Program in Agricultural Biotechnology,

Faculty of Agriculture Kamphaeng Sean, Kasetsart University Advisor : Associate Professor Sontichai Chanprame, Ph. D. and

Nongluk Teinseree, Ph.D. Year : 2012 Page : 34

ค านยม

ขอขอบพระคณ รองศาสตราจารย ดร. สนธชย จนทรเปรม และดร. นงลกษณ เทยนเสร อาจารยทปรกษาปญหาพเศษ ทไดกรณาใหความร ค าแนะน า ค าปรกษา รวมทงโอกาส ในการท าโครงการปญหาพเศษครงน ดวยก าลงใจอยางดยงเสมอมา อกทงยงกรณาตรวจทานแกไขรายงานปญหาพเศษฉบบนใหส าเรจลลวงไปดวยด

ขอขอบคณ คณชนากานต ลกษณะ และพ ๆ หองปฏบตการ A 207 อาคารปฏบตการวจยเทคโนโลยชวภาพเกษตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสน ทคอยใหความชวยเหลอ และแนะน าวธการแกปญหาตาง ๆ ตลอดระยะเวลาการทดลองและการเขยนรายงาน ขอขอบคณ ส าขา เ ทค โน โล ย ช วภ าพทางกา ร เ กษตร คณะ เกษตร ก า แพงแส น มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสน ทสนบสนนงบประมาณในการท าปญหาพเศษ

ขอขอบคณ กระทรวงวทยาศาสตรและเทคโนโลย และส านกงานพฒนาวทยาศาสตร และเทคโนโลยแหงชาต (สวทช.) ส าหรบทนการศกษาในระดบอดมศกษา ขอขอบคณ เพอน ๆ ส าหรบความชวยเหลอ ค าแนะน า ค าปรกษา และเปนเพอนทดตลอดมา ขาพเจาดใจทเราไดเปนเพอนกน

สดทายน ขอกราบขอบพระคณบดา มารดา และทกคนในครอบครว ทใหการสนบสนนทางการศกษาอยางเตมท และคอยอยเคยงขางขาพเจาเสมอมา

พลอยไพลน ธนกกล มกราคม 2555

สารบญ

หนา

สารบญ (1) สารบญตาราง (2) สารบญภาพ (3) ค าน า 1 วตถประสงค 2 การตรวจเอกสาร 3 อปกรณและวธการ 8 ผลการทดลอง 16 วจารณผลการทดลอง 23 สรปผลการทดลอง 25 เอกสารอางอง 26 ภาคผนวก 29

สารบญตาราง

ตารางท หนา

1. สวนประกอบของ extraction buffer ทใชในการสกด 9 อารเอนเอรวมแตละวธ

2. ความเขมขนและคณภาพของอารเอนเอทสกดได 16 จากใบออนปาลมน ามนจาก 6 วธการสกด

3. ความเขมขนและคณภาพของอารเอนเอทสกดได 17 จากใบแกปาลมน ามนจาก 6 วธการสกด

4. คาความเหมอนของล าดบเบสทไดจากการวเคราะห 22 ดวย blastn ของชน cDNA จากการเพมปรมาณผลผลต จากปฏกรยา RT-PCR ดวยไพรเมอร Actin

5. คาความเหมอนของล าดบเบสทไดจากการวเคราะห 22 ดวย blastn ของชน cDNA จากการเพมปรมาณผลผลต จากปฏกรยา RT-PCR ดวยไพรเมอร OsBOR

สารบญภาพ

ภาพท หนา

1. ใบออนและใบแกของปาลมน ามน 8 2. อารเอนเอของใบออนและใบแกปาลมน ามน 18

ทสกดไดจากทง 6 วธการ 3. ผลผลตทไดจากการสงเคราะห cDNA โดยใชไพรเมอร 19

ทจ าเพาะตอ Actin ขนาด 550 bp ดวยเทคนค RT-PCR 4. ผลผลตทไดจากการการสงเคราะห cDNA โดยใชไพรเมอร 20

ทจ าเพาะตอ OsBOR ขนาด 280 bp ดวยเทคนค RT-PCR

ค าน า ปาลมน ามนเปนพชทมความส าคญทางเศรษฐกจ เพราะน ามนจากผลปาลมน ามนมความส าคญทงเพอการบรโภคและอปโภค อกทงยงเปนแหลงพลงงานทางเลอกทส าคญของโลก มแนวโนมวาความตองการของตลาดโลกจะเพมสงขนในอนาคต ดงนนการเพมเปอรเซนตน ามนปาลมดบโดยการปรบปรงพนธปาลมน ามนจงเปนแนวทางทจะเพมก าลงและมลคาการผลต เพอตอบสนองตอความตองการดงกลาว วธในการปรบปรงพนธปาลมน ามนคอ วธการคดเลอกแบบวงจรสลบประยกต เปนการปรบปรงทงฝายแมพนธและพอพนธ และวธคดเลอกตระกลและตน จะพจารณาจากแมพนธเปนหลก แตวธดงกลาวนตองการพนทในการปรบปรงพนธ ทมขนาดใหญและอาศยระยะเวลาในการด าเนนงานนานประมาณ 15-25 ป ท าใหบางครงเกดความไมแนใจวาไดคดเลอกตนทมพนธกรรมด หรอเกดจากอทธพลของสภาพแวดลอม ดวยเหตนการปรบปรงพนธปาลมน ามนโดยอาศยความรและเครองมอทางดานอณชวโมเลกลจงเปนอกทางเลอกทจะท าใหนกปรบปรงพนธสามารถเชอมโยงกบลกษณะทสนใจของสายพนธทตองการไดอยางถกตองและรวดเรวขน แตเนองจากลกษณะปรากฏตาง ๆ ของปาลมน ามนเกดจากการแสดงออกของยนทควบคมลกษณะนน ๆ การศกษาการแสดงออกของยนทแสดงออกในรปของเอมอารเอนเอ (mRNA) จงเปนแนวทางการคนหายนทตองการในปาลมน ามนได ดงนนอารเอนเอคณภาพสงทสกดจากปาลมน ามนดวยวธการทมประสทธภาพ จงเปนวตถดบตงตนทส าคญทสด ในขนตอนเรมแรกของการศกษาการแสดงออกของยนทสนใจในแตละระยะของการเจรญเตบโต

วตถประสงค

เพอพฒนาวธการสกดอารเอนเอรวมของปาลมน ามนใหงาย รวดเรว และมประสทธภาพ

สถานทท าการทดลอง

หองปฏบตการชวโมเลกล (A 207) ศนยเทคโนโลยชวภาพเกษตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสน

ระยะเวลาในการทดลอง

เดอนกรกฎาคมถงเดอนตลาคม พ.ศ. 2554

ตรวจเอกสาร

ปาลมน ามน ปาลมน ามน (oil palm) มชอวทยาศาสตรวา Elaeis guineensis Jacq. เปนพชในวงศ Arecaceae (หรอ Palmae) เรมปลกเปนการคาเมอประมาณ พ.ศ. 2350 ทางชายฝงตะวนตกของทวปแอฟรกา และน าเขามาปลกในทวปเอเชยครงแรกใน พ.ศ. 2391 ทสวนพฤกษชาตโบกอรบนเกาะชวา ประเทศอนโดนเซย จ านวน 4 ตน ส าหรบประเทศไทยเรมน าเขาเมลดพนธปาลมน ามนตงแต พ.ศ. 2480 โดยพระยาประดพทธภบาล เพอปลกเปนไมประดบทสถานทดลองยางคอหงส จงหวดสงขลา ตอมาหมอมเจาอมรมานลกษณ ไดน ามาปลกเพอการคาครงแรก ทต าบลบานปรก อ าเภอสะเดา จงหวดสงขลา จนเกดเปนโครงการความรวมมอระหวางรฐและเอกชน เพอสงเสรมการปลกปาลมน ามนลกผสมและคดเลอกพนธปาลมน ามนเรอยมา (นพพร และคณะ, 2542) ปาลมน ามนเปนพชน ามนทมความส าคญทางเศรษฐกจ และสามารถผลตน ามนตอหนวยพนทไดสงทสด เมอเทยบกบพชทใหน ามนชนดอน ๆ โดยสามารถผลตน ามนไดปละประมาณ 640-800 กโลกรมตอพนทปลก 1 ไร ปจจบนประเทศไทยสามารถผลตน ามนในรปน ามนปาลมดบอยทประมาณ 1,500,000 ตนตอป เปนเงนมลคาประมาณ 45,000 ลานบาท หากการปรบปรงสายพนธปาลมน ามนใหมเปอรเซนตน ามนปาลมดบเพมขนอกรอยละ 1 กจะสามารถเพมมลคาการผลตถง 450 ลานบาทตอป (สกญญา และคณะ, 2554; พชรนทร และพระศกด, 2554) จากสถตชวง ค.ศ. 1998-2011 ความตองการน ามนปาลมในตลาดโลกมแนวโนมสงขน เฉลยเพมขนรอยละ 11-13 ตอป โดยเฉพาะประเทศอนเดยและจน ซงเปนผน าเขารายใหญของโลก รวมถงสหรฐอเมรกาและประเทศโซนยโรปทมอตราการน าเขาทสงเพอการบรโภค เพราะโครงสรางทางเคมของน ามนปาลมทนทานตออณหภมสง ไมกอใหเกดมะเรง และนโยบายเกยวกบพลงงานทดแทนซงใชน ามนปาลมเปนวตถดบ สวนประเทศไทยมแนวโนมความตองการสงขนโดยเฉลยรอยละ 4 ตอป เพอใชบรโภคในครวเรอน เพออตสาหกรรมตาง ๆ และเพอผลตไบโอดเซล โดยมสดสวนของภาคอาหารตอภาคพลงงานรอยละ 70:30 ปจจบนประเทศไทยมศกยภาพในการผลตน ามนปาลมทเพยงพอตอความตองการของประเทศ แตคดเปนรอยละ 6-9 ของน ามนปาลมทงหมดของประเทศมาเลเซย ซงเปนสดสวนทนอยมากในระดบโลก (การญ, 2554)

ลกษณะทวไป ปาลมน ามนชอบอากาศในเขตรอน ฝนตกชก ดนอดมสมบรณ น าไมขง ชอบดนเหนยวปนทราย ม pH ประมาณ 4.0-6.0 อณหภมทเหมาะสมตอการเจรญเตบโตอยระหวาง 23-32 องศาเซลเซยส ความชนสมพทธรอยละ 70-80 มแสงแดดมาก อยางนอยวนละ 5 ชวโมง ฝนตกสม าเสมอตลอดป และไมควรแลงเกน 2-3 เดอนตอป พบวาการกระจายของฝนในฤดแลงและปรมาณแสงแดดมผลตอผลผลตปาลมน ามน (นพรตน, 2536)

ลกษณะทางพฤกษศาสตร (นพรตน, 2536; นพพร และคณะ, 2542; ธระ และคณะ, 2546; ชาย และคณะ, 2547; พรชย, 2549) ราก เปนแบบระบบรากฝอย สวนใหญกระจายอยบรเวณผวดน แตในกรณทดนมการถายเทอากาศดและระดบน าในดนเหมาะสมอาจเจรญไดลกถง 5 เมตร ซงจะชวยยดล าตนไวไมใหลมงาย ตนปาลมทเจรญเตบโตเตมทจะประกอบดวยราก 4 ชดคอ รากชดแรกมทงรากทเจรญในแนวนอนและแนวดงซงจะชวยในการยดล าตนเพยงเลกนอย รากชดทสองเปนรากทงอกจากรากชดทหนง สวนรากชดทสามและส เปนรากทงอกจากรากชดทสองและสามตามล าดบ โดยรากชดทสจะท าหนาทดดซมธาตอาหาร กรณน าทวมจะพบรากบางสวนทเจรญโผลเหนอพนดนเพอชวยในการหายใจ ล าตน เนองจากปาลมน ามนมจดเจรญคอเนอเยอเจรญปลายยอดเทานน ท าใหล าตนเจรญสงขนและตงตรง แตในระยะ 3 ปแรกจะเจรญทางดานขวางเปนล าตนใตดน จากนนจะเจรญดานความสงเปนล าตนเหนอดนทมกาบใบหอหม หากอายมากขนกาบใบกจะทยอยรวงออก จงอาจมการตดแตงใบ ท าใหเหนปลองฐานโคนใบและขอชดเจน โดยทวไปปาลมน ามนจะมความสงเพมขนปละประมาณครงเมตร แตทงนกขนอยกบสภาพแวดลอมและพนธกรรมของปาลมน ามน ใบ จดก าเนดใบออนอย ทศนยกลางของสวนยอด ใบเปนใบประกอบแบบขนนก ประกอบดวย แกนทางใบ กานใบ ซงเปนสวนทอยตดกบล าตนจะมลกษณะเปนหนาม และใบยอยรปรางแบบหอกประมาณ 100-160 ใบ โดยแตละใบจะมสวนของตวใบ กานใบและเสนใบ มอายประมาณ 2 ป แตกใบไดประมาณเดอนละ 2 ใบ ดงนนตนปาลมน ามนตนหนง ๆ จะมใบทตดตนคราวหนงประมาณ 40 ใบ การจดเรยงใบบนล าตนมลกษณะเปนเกลยวรอบล าตน รอบหนงจะม 8 ใบ สวนรอบตอไปจะม 13 ใบ สลบกน โดยการเวยนจะมทงซายและขวา ซงสงเกตไดจากรอยแผลทฐานใบตดกบล าตนหลงการตดแตงทางใบ การเวยนของทางใบจะสามารถน ามาใชในการวเคราะหธาตอาหารได การผลตทางใบจงขนอยกบ

อายของปาลมน ามน โดยปาลมน ามนทมอายนอยจะมการผลตทางใบในรอบปสงกวาปาลมน ามนอายมาก ชอดอก ปาลมน ามนมทงชอดอกตวผและชอดอกตวเมยในตนเดยวกน เกดจากตาดอกบรเวณซอกทางใบทตดกบตน แตแยกกนอยคนละซอกใบ ลมหรอแมลงจะชวยถายละอองเกสรซงมกลนแรง ชอดอกตวผจะมลกษณะคลายนวมอ สวนชอดอกตวเมยมลกษณะเปนหนามยาว ลกษณะเกดชอดอกจะเปนชนดใดชนดหนง แตละชวงจะมจ านวนชอดอก 8-10 ชอ ปาลมทมอายนอยกวา 3 ปอาจพบลกษณะทมทงดอกตวผและดอกตวเมยในชอเดยวกนเรยกวา ดอกกะเทย ซงการก าหนดเพศของชอดอกขนอยกบหลายปจจยซงรวมทงความสมดลของธาตอาหารในดนและในปาลมน ามน ทะลาย ทะลายปาลมน ามนประกอบดวย กานทะลาย ชอทะลายยอย และผล ปาลมน ามนทมอายนอยจะมจ านวนทะลายตอตนมากแตมขนาดเลก หากมอายมากขนจะมจ านวนทะลายตอตนนอยลงแตมขนาดใหญขน จ านวนทะลายตอปขนอยกบจ านวนชอดอกตวเมย อตราการเกดใบใหม และอายของปาลมน ามน ผล ผลปาลมน ามนเกดจากชอดอกตวเมย หลงไดรบการผสมแลวประมาณ 5.5-8 เดอน จะใหผลปาลมในทะลายสกพรอมเกบเกยว ผลปาลมน ามนจะไมมกานผลและมหลายรปแบบ ตงแตเรยวแหลมจนถงรปไข ผนงผลปาลมน ามนแบงออกเปน 3 ชน คอ ผนงผลชนนอก มลกษณะเปนมนและแขง ผนงผลชนกลาง เปนชนทเปนเสนใย เปนสวนทน าไปสกดเปนน ามนปาลม เนองจากมน ามนสง และผนงผลชนในหรอกะลา เปนเปลอกแขงสด า ถดจากสวนนเขาไปจะมเยอหมเมลดสน าตาลหมเอนโดสเปรมทแขงและแนน มน ามนสง สวนของคพภะอยบรเวณตาของผล อารเอนเอ อารเอนเอเปนสารพนธกรรมของสงมชวตเชนเดยวกบดเอนเอ มน าตาลไรโบสเปนองคประกอบ มหมไฮดรอกซทต าแหนง 2’ ของน าตาลไรโบส และมเบสทแตกตางจากดเอนเอคอ อารเอนเอม ยราซลแทนไทมน โดยสวนใหญมสายโพลนวคลโอไทดสายเดยว (ตรทพย, 2552)

วธการสกดอารเอนเอ

วธการสกดอารเอนเอมกประสบปญหาเกยวกบคณภาพและผลผลตของอารเอนเอ โดยเฉพาะอยางยงในพชทมสารพวก secondary metabolite สง เชน สารประกอบฟนอลค (phenolic compound) และโพลแซคคาไรด (polysaccharide) โดยเฉพาะในเนอเยอทเจรญเตมทแลว โดยสารเหลานจะสามารถ

จบกบอารเอนเอหรอตกตะกอนรวมกบอารเอนเอในระหวางขนตอนการสกด ท าใหเกดการปนเปอน สงผล

ใหอารเอนเอทไดจากการสกดมคณภาพต า (Camacho-Villasana et al., 2002) จงมการคดคนและพฒนาวธการสกดอารเอนเอขนมากหลากหลายวธเพอเอาชนะปญหาน เชน ใช CTAB (Cetyltrimethyl) buffer ชวยแยกสารพวกโพลแซคคาไรดออกจากอารเอนเอ (Jaakola et al., 2001), PVP (Polyvinylpyrrolidone) และ mercaptoethanol ชวยในการยบยงการเกดออกซเดชนของสารประกอบ ฟนอลค (Jaakola et al., 2001; Saïdi et al., 2008), LiCl หรอ NaCl และ Isopropanol ชวยในการตกตะกอนอารเอนเอ โดย LiCl จะตกตะกอนอารเอนเอไดอยางจ าเพาะกวา NaCl แตใชระยะเวลา

ตกตะกอนมากกวา (Camacho-Villasana et al., 2002; Moser et al., 2004; Wang et al., 2007; Laksana, 2011), Phenol:Chroloform:Isoamyl alcohol และ SSTE buffer ชวยในการก าจดโปรตนและสารพวก secondary metabolite ทงหลาย อกทงยงชวยยบยงการท างานของ RNase (Wang et al., 2005; Wang et al., 2006; Laksana, 2011) การตรวจสอบคณภาพของอารเอนเอภายหลงการสกดมกตรวจสอบดวยการวดคาการดดกลนแสงดวยเครอง Spectrophotometer สามารถทราบความเขมขนของอารเอนเอรวมทสกดได รวมทงจะมการประมวลผลคา A260/280 บงบอกการปนเปอนของโปรตน และคา A260/230 บงบอกการปนเปอนของสารประกอบฟนอลคและโพลแซคคาไรด (Cin et al., 2005; Djami-Tchatchou and Straker, 2011) และการตรวจสอบดวย denaturing formaldehyde agarose gel electrophoresis หากพบ 28s rRNA ชดเจนกวา 18s rRNA แสดงวาไมมการสญเสยอารเอนเอหรอมการสญเสยอารเอนเอนอยจากการเสยสภาพระหวางขนตอนการสกด (Daohong et al., 2004; Laksana, 2011) เทคนค Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) (วชร และคณะ, 2536) การเกด gene transcription เปนกระบวนการสงเคราะห mRNA จากรหสพนธกรรมบน DNA มบทบาทส าคญในการควบคมการแสดงออกของยน (gene expression) ระดบของ gene transcription ภายในเซลลหนง สามารถเปลยนแปลงเพอตอบสนองตอสญญาณมากมายทเกดขนในขณะทเกดการพฒนา การเปลยนแปลง และหนาททางสรรวทยาของเซลล การเปลยนระดบ transcription เปนสาเหตใหเกดการแปรเปลยนระดบของ mRNA แตละชนดจากภาวะปกต (steady-state levels) ฉะนนการตรวจวเคราะหระดบ mRNA ของยนหนงจงจ าเปน และมความส าคญมากตอการวจยทเกยวของกบการแสดงออกของยน

การดดแปลงเทคนค PCR ใหสามารถตรวจวเคราะห RNA ตพมพครงแรกโดย Veres และคณะ ในป ค.ศ. 1987 ไดอธบายเทคนค RT-PCR ซงท าการศกษา point mutations ในยน ornithine transcarmylase ของหน โดยใช subclones ทไดจากผลตผล PCR ของ mRNA ตงแตนนมาเทคนค RT-PCR กไดรบความนยมอยางมาก เพราะมความไวสง และท าไดรวดเรว ขนตอนส าคญของ เทคนค RT-PCR เรมตนโดยสกด RNA จากเนอเยอหรอเซลล แลวใช RNA นเปนแมพมพ (template) ส าหรบปฏกรยา reverse transcription ใหสงเคราะห cDNA (complementary DNA) เอนไซมทใชในปฏกรยาน คอ reverse transcriptase จากนนใช cDNA ทสงเคราะหไดเปนแมพมพส าหรบปฏกรยา PCR โดยใชไพรเมอร 2 สาย ทสงเคราะหมาเพอขยายต าแหนงยนทสนใจบน cDNA นน ผลตผล PCR ทขยายจ านวน cDNA สามารถตรวจวเคราะหในท านองเดยวกนกบผลตผล PCR จากเทคนคพนฐาน โดยการวเคราะหขนาดของผลตผล PCR ดวยวธ agarose gel electrophoresis และตรวจยนยนโดยวธ restriction digestion, hybridization หรอ nucleotide sequencing การประยกตใชเทคนค RT-PCR ในปจจบนเปนทนยมท ากนมาก ไดแก การตรวจหาผลตผลของยน (gene transcripts) ในสงสงตรวจทม RNA ปรมาณนอย ๆ การตรวจวเคราะหผลตผลของหลาย ๆ ยนไดพรอมกน (simultaneous analysis) การตรวจวเคราะหปรมาณ (quantitative analysis) ของ mRNA ทสนใจ การสรางตวตรวจจ าเพาะยนทเปน cDNA (generation of cDNA hybridization probes) และการตรวจหา alternatively spliced gene transcripts ขอดของเทคนค RT-PCR มหลายประการ ไดแก ไมมการรบกวน (interferences) จากล าดบนวคลโอไทดของ intron RNA เปาหมายถกเพมขยายจ านวนโดยธรรมชาตดวยกระบวนการ transcription มาแลว การตรวจวเคราะหท าไดกบ active genes และประการสดทายชวยใหสามารถวเคราะห RNA viruses ได สวนขอเสยของเทคนค RT-PCR ทส าคญ ไดแก RNA เปนสารทเสยคณสมบต (more labile) งายกวา DNA การแยกสกด RNA ตองท าหลายขนตอน และตองการขนตอน reverse transcription เพอสงเคราะห cDNA

อปกรณและวธการ 1. การเตรยมตวอยางพช

ใบออนและใบแกของปาลมน ามนจากตนปาลมน ามน (Elaeis guineensis) ชนดเทเนอรา

อาย 3 ป ทไดจากการเพาะเมลด

ภาพท 1 ใบปาลมน ามน (a) ใบออน (b) ใบแก

a

b

2. การสกดอารเอนเอรวมจากใบออนและใบแกของปาลมน ามน เปรยบเทยบวธการสกดอารเอนเอรวม 6 วธการ ซงแตละวธการใชชนดของ extraction buffer ท

แตกตางกน ดงแสดงในตารางท 1 ตารางท 1 สวนประกอบของ extraction buffer ทใชในการสกดอารเอนเอรวมแตละวธ

สารเคม

วธการ 1 2 3 4 5 6

extraction buffer 1 extraction buffer 2

Geneaid Kit®

2% CTAB √ √ √ √ √ 2% PVP √ √ √ √ √ 2M NaCl √ √ √ 2M LiCl √ √

25mM EDTA √ √ √ √ √ 100mM Tris-HCl pH √ √ √ √ √

2% β-mercaptoethanol √ √ √ √ √ หมายเหต : 2% β-mercaptoethanol จะเตมลงใน extraction buffer กอนจะใช วธการท 1

น าตวอยางใบออนและใบแกของปาลมน ามนหนก 0.1 กรม บดในไนโตรเจนเหลวจนละเอยด ยายตวอยางลงในหลอดขนาด 1.5 ไมโครลตร เตม extraction buffer 1 ปรมาตร 600 ไมโครลตร แลวเตม β-mercaptoethanol ปรมาตร 10 ไมโครลตร จากนนผสมใหเขากนดวย vortex และบมทอณหภมหองเปนเวลา 10 นาท เตม Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol (25:24:1) ปรมาณ 500 ไมโครลตร ผสมใหเขากน โดยเขยาแรง ๆ แลวน าไปหมนเหวยงทความเรว 12,000 รอบตอนาท ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 20 นาท ดดสวนใสใสหลอดใหม แลวเตม Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1) หนงเทาของปรมาตรสวนใส ผสมใหเขากน โดยเขยาแรง ๆ แลวน าไปหมนเหวยงทความเรว 12,000 รอบตอนาท ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 20 นาท ดดสวนใสใสหลอดใหม แลวเตม LiCl ใหความเขมขนสดทายเปน 2M และบมทอณหภม 4 องศาเซลเซยส นานขามคน จากนนหมนเหวยงทความเรว 12,000 รอบตอนาท ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 20 นาท เทสวนใสทง เตม SSTE buffer (ประกอบดวย 1M NaCl, 0.5% SDS, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA และ dH2O ทผานการก าจดเอนไซม RNase ดวย diethyl pyrocarbonate; DEPC) ทอนปรมาตร 600 ไมโครลตร ผสมใหอารเอนเอละลาย เตม

Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1) ปรมาณ 500 ไมโครลตร ผสมใหเขากน แลวหมนเหวยงทความเรว 12,000 รอบตอนาท ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 20 นาท ดดสวนใสใสหลอดใหม แลวเตม 5M NaCl ปรมาตร 0.1 เทาของสวนใส และเตม absolute ethanol ปรมาตร 2 เทาของสวนใส จากนนบมทอณหภม -20 องศาเซลเซยส นาน 2 ชวโมง แลวหมนเหวยงทความเรว 12,000 รอบตอนาท ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 20 นาท เทสวนใสทง แลวลางตะกอนดวย 70% ethanol ทแชเยนปรมาตร 300 ไมโครลตร แลวหมนเหวยงทความเรว 12,000 รอบตอนาท ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 2 นาท เทสวนใสทง แลวตากตะกอนประมาณ 20 นาท และเตม DEPC–dH2O ปรมาตร 25 ไมโครลตร และเกบตวอยางไวทอณหภม -20 องศาเซลเซยส

วธการท 2 น าตวอยางใบออนและใบแกของปาลมน ามนหนก 0.1 กรม บดในไนโตรเจนเหลวจนละเอยด

ยายตวอยางลงในหลอดขนาด 1.5 ไมโครลตร เตม extraction buffer 1 ปรมาตร 600 ไมโครลตร แลวเตม β-mercaptoethanol ปรมาตร 10 ไมโครลตร จากนนผสมใหเขากนดวย vortex และบมทอณหภมหองเปนเวลา 10 นาท เตม Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol (25:24:1) ปรมาณ 500 ไมโครลตร ผสมใหเขากน โดยเขยาแรง ๆ แลวน าไปหมนเหวยงทความเรว 12,000 รอบตอนาท ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 20 นาท ดดสวนใสใสหลอดใหม แลวเตม Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1) หนงเทาของปรมาตรสวนใส ผสมใหเขากน โดยเขยาแรง ๆ แลวน าไปหมนเหวยงทความเรว 12,000 รอบตอนาท ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 20 นาท ดดสวนใสใสหลอดใหม แลวเตม Isopropanol ปรมาตร 400 ไมโครลตร และ 5M NaCl ปรมาตร 100 ไมโครลตร แลวบมในน าแขงเปนเวลา 10 นาท หมนเหวยงทความเรว 12,000 รอบตอนาท ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 20 นาท แลวเทสวนใสทง เตม SSTE buffer ทอนปรมาตร 600 ไมโครลตร ผสมใหอารเอนเอละลาย เตม Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1) ปรมาณ 500 ไมโครลตร ผสมใหเขากน แลวหมนเหวยงทความเรว 12,000 รอบตอนาท ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 20 นาท ดดสวนใสใสหลอดใหม แลวเตม 5M NaCl ปรมาตร 0.1 เทาของสวนใส และเตม absolute ethanol ปรมาตร 2 เทาของสวนใส จากนนบมทอณหภม -20 องศาเซลเซยส นาน 2 ชวโมง แลวหมนเหวยงทความเรว 12,000 รอบตอนาท ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 20 นาท เทสวนใสทง แลวลางตะกอนดวย 70% ethanol ทแชเยนปรมาตร 300 ไมโครลตร แลวหมนเหวยงทความเรว 12,000 รอบตอนาท ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 2 นาท เทสวนใสทง แลวตากตะกอนประมาณ 20 นาท และเตม DEPC–dH2O ปรมาตร 25 ไมโครลตร และเกบตวอยางไวทอณหภม -20 องศาเซลเซยส


ยายตวอยางลงในหลอดขนาด 1.5 ไมโครลตร เตม extraction buffer 1 ปรมาตร 600 ไมโครลตร แลวเตม β-mercaptoethanol ปรมาตร 10 ไมโครลตร จากนนผสมใหเขากนดวย vortex และบมทอณหภมหองเปนเวลา 10 นาท เตม Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol (25:24:1) ปรมาณ 500 ไมโครลตร ผสมใหเขากน โดยเขยาแรง ๆ แลวน าไปหมนเหวยงทความเรว 12,000 รอบตอนาท ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 20 นาท ดดสวนใสใสเหลอดใหม แลวเตม Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1) หนงเทาของปรมาตรสวนใส ผสมใหเขากน โดยเขยาแรง ๆ แลวน าไปหมนเหวยงทความเรว 12,000 รอบตอนาท ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 20 นาท ดดสวนใสใสหลอดใหมแลว เตม Isopropanol ปรมาตร 400 ไมโครลตร และ 5M NaCl ปรมาตร 100 ไมโครลตร จากนนบมในน าแขงเปนเวลา 10 นาท หมนเหวยงทความเรว 12,000 รอบตอนาท ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 20 นาท เทสวนใสทง แลวลางตะกอนดวย 70% ethanol ทแชเยนปรมาตร 300 ไมโครลตร แลวหมนเหวยงทความเรว 12,000 รอบตอนาท ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 2 นาท เทสวนใสทง แลวตากตะกอนประมาณ 20 นาท และเตม DEPC–dH2O ปรมาตร 25 ไมโครลตร และเกบตวอยางไวทอณหภม -20 องศาเซลเซยส


ยายตวอยางลงในหลอดขนาด 1.5 ไมโครลตร เตม extraction buffer 2 ปรมาตร 600 ไมโครลตร แลวเตม β-mercaptoethanol ปรมาตร 10 ไมโครลตร จากนนผสมใหเขากนดวย vortex และบมทอณหภมหองเปนเวลา 10 นาท เตม Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol (25:24:1) ปรมาณ 500 ไมโครลตร ผสมใหเขากน โดยเขยาแรง ๆ แลวน าไปหมนเหวยงทความเรว 12,000 รอบตอนาท ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 20 นาท ดดสวนใสใสหลอดใหม แลวเตม Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1) หนงเทาของปรมาตรสวนใส ผสมใหเขากน แลวเขยาแรง ๆ แลวน าไปหมนเหวยงทความเรว 12,000 รอบตอนาท ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 20 นาท ดดสวนใส แลวเตม Isopropanol ปรมาตร 400 ไมโครลตร และ 5M NaCl ปรมาตร 100 ไมโครลตร แลวบมในน าแขงเปนเวลา 10 นาท หมนเหวยงทความเรว 12,000 รอบตอนาท ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 20 นาท แลวเทสวนใสทง เตม SSTE ทอนปรมาตร 600 ไมโครลตร ผสมใหอารเอนเอละลาย เตม Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1) ปรมาณ 500 ไมโครลตร ผสมใหเขากน แลวหมนเหวยงทความเรว 12,000 รอบตอนาท ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 20 นาท ดดสวนใสใสหลอดใหม แลวเตม 5M NaCl ปรมาตร 0.1 เทาของสวนใส และเตม absolute ethanol ปรมาตร 2 เทาของสวนใส จากนนบมทอณหภม -20 องศาเซลเซยส นาน 2

ชวโมง แลวหมนเหวยงทความเรว 12,000 รอบตอนาท ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 20 นาท เทสวนใสทง แลวลางตะกอนดวย 70% ethanol ทแชเยนปรมาตร 300 ไมโครลตร แลวหมนเหวยงทความเรว 12,000 รอบตอนาท ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 2 นาท เทสวนใสทง แลวตากตะกอนประมาณ 20 นาท และเตม DEPC–dH2O ปรมาตร 25 ไมโครลตร และเกบตวอยางไวทอณหภม -20 องศาเซลเซยส

วธท 5 น าตวอยางใบออนและใบแกของปาลมน ามนหนก 0.1 กรม บดในไนโตรเจนเหลวจนละเอยด

ยายตวอยางลงในหลอดขนาด 1.5 ไมโครลตร เตม extraction buffer 2 ปรมาตร 600 ไมโครลตร แลวเตม β-mercaptoethanol ปรมาตร 10 ไมโครลตร จากนนผสมใหเขากนดวย vortex และบมทอณหภมหองเปนเวลา 10 นาท เตม Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol (25:24:1) ปรมาณ 500 ไมโครลตร ผสมใหเขากน โดยเขยาแรง ๆ แลวน าไปหมนเหวยงทความเรว 12,000 รอบตอนาท ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 20 นาท ดดสวนใสใสหลอดใหม แลวเตม Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1) หนงเทาของปรมาตรสวนใส ผสมใหเขากน โดยเขยาแรง ๆ แลวน าไปหมนเหวยงทความเรว 12,000 รอบตอนาท ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 20 นาท ดดสวนใส แลวเตม Isopropanol ปรมาตร 400 ไมโครลตร และ 5M NaCl ปรมาตร 100 ไมโครลตร จากนนบมในน าแขงเปนเวลา 10 นาท หมนเหวยงทความเรว 12,000 รอบตอนาท ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 20 นาท เทสวนใสทง แลวลางตะกอนดวย 70% ethanol ทแชเยนปรมาตร 300 ไมโครลตร แลวหมนเหวยงทความเรว 12,000 รอบตอนาท ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 2 นาท เทสวนใสทง แลวตากตะกอนประมาณ 20 นาท และเตม DEPC–dH2O ปรมาตร 25 ไมโครลตร และเกบตวอยางไวทอณหภม -20 องศาเซลเซยส

วธท 6 ชดสกด RNA (Plant Total RNA Mini Kit : Geneaid®) ขนตอนในการสกดอารเอนเอรวมจากใบออนและใบแกปาลมน ามนปฏบตตามค าแนะน าและ

วธใชของทางบรษท (Geneaid, Taiwan) ตรวจสอบความเขมขนและคณภาพของอารเอนเอรวมทสกดไดจากทกวธการกอนการก าจด

จโนมคดเอนเอ โดยการท า gel electrophoresis ดวย 1.5% agarose gel ใน 1X NBC buffer (0.5M boric acid, 10mM Sodium citrate และ 50 mM NaOH) ทความตางศกย 100 โวลต เปนเวลา 30 นาท

3. การก าจดจโนมคดเอนเอออกจากตวอยางอารเอนเอ

น าตวอยางอารเอนเอ (RNA + DEPC – dH2O) ทไดจากการสกดทง 6 วธ มาก าจดจโนมคดเอนเอ ดวย DNase I (Fermentas, USA) โดยใช DNase I ปรมาตร 1 ไมโครลตร (1 ยนต/ไมโครลตร) ตอความเขมขนของดเอนเอ 1 ไมโครกรม จากนนบมท 37 องศาเซลเซยส นาน 1 ชวโมง และหยดปฏกรยา DNase โดยเตม 0.5M EDTA ปรมาตร 1 ไมโครลตร แลวบมท 65 องศาเซลเซยส นาน 5 นาท เกบท -20 องศาเซลเซยส 4. การประเมนความบรสทธและความเขมขนของอารเอนเอทสกดได

น าตวอยางอารเอนเอปรมาตร 2 ไมโครลตร ของแตละวธการสกดมาประเมนความเขมขน

และความบรสทธโดยการวดคาการดดกลนแสงดวยเครอง spectrophotometer (ND1000, Thermo Scientific, Delaware, USA) และประเมนผลจากคา A260/A280 และคา A260/230 พรอมทงตรวจสอบดวย denaturing formaldehyde agarose gel electrophoresis 5. ตรวจสอบหาอณหภม annealing ทเหมาะสม ส าหรบปฏกรยา PCR โดยการท า PCR

Gradient น าอารเอนเอปรมาตร 1 ไมโครลตร (100 นาโนกรม/ไมโครลตร) ของแตละวธการสกดมาท า

ปฏกรยา PCR gradient โดยใช BioscriptTM One-step RT-PCR kit (Bioline, USA) ท าปฏกรยารวมกบ 2X One-step RT-PCR Reaction buffer ปรมาตร 1 เทาของอารเอนเอ, 200 nM Forward Primer, 200 nM Reverse Primer, RNase Inhibitor 10 unit (RiboLock RNase inhibitor, Fermentas, USA), 1.5 mM MgCl2, 5% DMSO และปรบปรมาตรดวยน ากลนทผานการท าลายเอนไซม RNase (dH2O-DEPC) จนครบปรมาตรทตองการ น ามาท าปฏกรยา RT-PCR โดยก าหนดใหมอณหภม annealing ในชวง 46 องศาเซลเซยสจนถง 60 องศาเซลเซยส และใหแตละปฏกรยามอณหภมแตกตางกน 2 องศาเซลเซยส โดยมโปรแกรมของปฏกรยาดงน ปฏกรยา reverse transcription อณหภม 45 องศาเซลเซยส นาน 30 นาทและอณหภม 95 องศาเซลเซยส นาน 10 นาท ปฏกรยา PCR denature ทอณหภม 95 องศาเซลเซยส นาน 30 วนาท annealing ในชวงอณหภม 46-60 องศาเซลเซยส นาน 30 วนาท extension ทอณหภม 72 องศาเซลเซยส นาน 30 วนาท ท าซ าโปรแกรม denature ถง extension จ านวน 35 รอบแลวตามดวย final extension ทอณหภม 72 องศาเซลเซยส นาน 10 นาท

ตรวจสอบผลโดยการท า gel electrophoresis ใน 1% agarose gel ในสารละลาย 0.5X TBE buffer ทความตางศกย 100 โวลต เปนเวลา 30 นาท ยอมเจลดวย ethidium bromide ตรวจสอบแถบดเอนเอทไดภายใตแสงอลตราไวโอเลตและคดเลอกอณหภม annealing ทเหมาะสมในการท าปฏกรยา RT-PCR โดยพจารณาจากแถบดเอนเอทคมชด และปรากฏเพยงแถบเดยว 6. สงเคราะห cDNA ดวยปฏกรยา Reverse-Transcription Polymerase Chain

Reaction (RT-PCR) โดยใช specific primer และการเพมปรมาณชนสวน cDNA ทไดจากการท าปฏกรยา RT-PCR สงเคราะห cDNA ดวยปฏกรยา RT-PCR โดยใช SuperScript™ III First-Strand Synthesis

System for RT-PCR (invitrogen, Thailand) เรมดวยการเตรยม RNA/primer mixture ลงในหลอดทดลองขนาด 0.5 มลลลตร ซงมสวนประกอบคอ อารเอนเอรวม 1 ไมโครลตร (100 นาโนกรม/ไมโครลตร) ของแตละวธการสกด ไพรเมอร (50µM oligo(dT)20) ปรมาตร 1 ไมโครลตร และ 10mM dNTP mix ปรมาตร 1 ไมโครลตร แลวปรบปรมาตรดวยน ากลนทผานการท าลายเอนไซม RNase (dH2O-DEPC) จนครบปรมาตร 10 ไมโครลตร น าไปบมทอณหภม 65 องศาเซลเซยส นาน 5 นาท แลวน าไปแชบนน าแขงนาน 1 นาท และเตรยม cDNA Synthesis Mix ซงมสวนประกอบคอ 10x RT buffer ปรมาตร 2 ไมโครลตร 25mM MgCl2 ปรมาตร 4 ไมโครลตร 0.1M DTT ปรมาตร 2 ไมโครลตร RNaseOUT™ (40 ยนต/ไมโครลตร) ปรมาตร 1 ไมโครลตร และ SuperScript™ III RT (200 ยนต/ไมโครลตร) ปรมาตร 1 ไมโครลตร จากนนเตม cDNA Synthesis Mix ปรมาตร 10 ไมโครลตร ลงใน cDNA Synthesis Mix ของแตละตวอยาง แลวผสมใหเขากน จากนนน าไปบมทอณหภม 50 องศาเซลเซยส นาน 50 นาท และบมตอทอณหภม 85 องศาเซลเซยส นาน 5 นาท แลวแชไวบนน าแขง เตม RNase H (2 ยนต/ไมโครลตร) ปรมาตร 1 ไมโครลตร ลงในหลอดทดลองของแตละตวอยาง แลวบมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส นาน 20 นาท เกบไวทอณหภม -20 องศาเซลเซยส หรอใชในปฏกรยา PCR ตอไป

การเพมปรมาณของชนสวน cDNA อาศยไพรเมอรทไดรบการออกแบบมาใหจ าเพาะตอบรเวณ

ล าดบเบสอนรกษของยน Actin (Actin- forward : 5' CATGCCATCCTTCGATTGG 3' ; Actin Reverse : 5’ CACATCTGCTGGAAGGTGC3’) และยน OsBOR (OsBORt2 forward : 5’ CATACTCTGCTGCATCCA 3’ ;OsBORt2 reverse : 5’ GTCCTCTGGGGTTACTTT 3’) ปฏกรยา RT-PCR ประกอบดวย first-stand cDNA ปรมาตร 2 ไมโครลตร, 10mM dNTPs, Taq polymerase (5 ยนต/ไมโครลตร) ปรมาตร 0.4 ไมโครลตร, 25mM MgCl2 ปรมาตร 1.2 ไมโครลตร, 10x buffer ปรมาตร 2 ไมโครลตร, 5µM forward และ reverse Actin primer, forward และ reverse OsBORt2 primer ปรมาตร 1 ไมโครลตร โดยใชโปรแกรมในการท าปฏกรยา PCR ดงน preliminary denaturation ท

อณหภม 95 องศาเซลเซยส นาน 3 นาท denaturing ทอณหภม 94 องศาเซลเซยส นาน 1 นาท annealing ทอณหภม 58 องศาเซลเซยส (จากการทดลองขอ 5) นาน 1 นาท extension ทอณหภม 72 องศาเซลเซยส นาน 1 นาท ท าซ าโปรแกรม denature ถง extension จ านวน 30 รอบแลวตามดวย final extension ทอณหภม 72 องศาเซลเซยส นาน 5 นาท จากนนตรวจสอบการเพมปรมาณดวย 1% agarose gel ในสารละลาย 0.5X TBE buffer ทความตางศกย 100 โวลต เปนเวลา 30 นาท ยอมเจลดวย ethidium bromide ตรวจสอบแถบดเอนเอทไดภายใตแสงอลตราไวโอเลต

7. การท าใหผลผลตของปฏกรยา PCR บรสทธ (Purification PCR product)

น าชนสวนเจลของแถบดเอนเอทไดจากการท าปฏกรยา PCR บน 0.7% agarose gel มา ท าใหบรสทธโดยปฏบตตามค าแนะน า และวธใชของชด PCR clean up และ Gel extraction (NucleoSpin® Extract II) 8. หาล าดบเบสและตรวจสอบความเหมอนของล าดบเบส

น าผลผลตของปฏกรยา PCR (จากการทดลองขอ 7) สงไปหาล าดบเบสทบรษท 1st BASE

(ประเทศมาเลเซย) แลวน าล าดบเบสทไดมาเปรยบเทยบกบล าดบเบสของยน Actin และยน BOR ของพชชนดอน ๆ ในฐานขอมล (GenBank) โดยใชโปรแกรม BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) และ ClustalW (http://ebi.ac.uk/clustalw) แลวเปรยบเทยบคาความเหมอนของล าดบเบส

http://ebi.ac.uk/clustalw

ผลการทดลอง

1. การประเมนความบรสทธและความเขมขนของอารเอนเอทสกดได จากการวดคาการดดกลนแสงของตวอยางอารเอนเอทสกดไดจากแตละวธการดวยเครอง

spectrophotometer (ND1000, Thermo Scientific, Delaware, USA) เพอประเมนผลและเปรยบเทยบคา A260/A280 และคา A260/230 แสดงในตารางท 2 และ 3 พรอมทงตรวจสอบดวย denaturing formaldehyde agarose gel electrophoresis (ภาพท 2) พบวา อารเอนเอทสกดไดจากวธการท 3 มความเขมขนสงสด คอ 977 และ 1,131 นาโนกรมตอไมโครลตร ในใบออน และ 496.4 และ 678.4 นาโนกรมตอไมโครลตร และใหคา A260/280 เทากบ 2.04 และ 1.97 ในใบออน และ 2.14 และ 21.3 ในใบแก และคา A260/230 เทากบ 1.89 และ 1.65 ในใบออน และ 1.94 และ 1.93 ในใบแก

ตารางท 2 ความเขมขนและคณภาพของอารเอนเอทสกดไดจากใบออนปาลมน ามนจาก 6 วธการสกด

วธการ จ านวนซ า ใบออนปาลมน ามน

ความเขมขนเฉลย (ng/µl)

ความเขมขน (ng/µl)

A260/280 A 260/230

1 1 238.7 2.04 2.08

222.95 2 207.2 2.12 2.13

2 1 329.9 1.95 1.71

331.65 2 333.4 1.96 1.57

3 1 977 2.04 1.89

1,054 2 1,131 1.97 1.65

4 1 259.8 1.96 1.71

273.95 2 288.1 1.92 1.56

5 1 457 1.77 1.46

661.1 2 865.2 2.00 1.58

Kit (Geneaid®)

1 195.8 2.01 0.99 118.99

2 42.18 1.74 0.15

ตารางท 3 ความเขมขนและคณภาพของอารเอนเอทสกดไดจากใบแกปาลมน ามนจาก 6 วธการสกด

วธการ จ านวนซ า ใบแกปาลมน ามน

ความเขมขนเฉลย (ng/µl)

ความเขมขน (ng/µl)

A260/280 A 260/230

1 1 245.2 2.14 2.19

358.65 2 432.8 2.11 2.11

2 1 233.7 2.04 2.12

310.9 2 388.1 2.04 1.84

3 1 496.4 2.14 1.94

587.4 2 678.4 2.13 1.93

4 1 302.9 1.87 1.15

289.05 2 275.2 1.83 1.61

5 1 226 1.82 1.58

268.55 2 311.3 1.92 1.78

Kit (Geneaid®)

1 117.1 5.26 2.61 118.5

2 119.9 1.90 1.65

ภาพท 2 อารเอนเอรวมทสกดไดจาก 6 วธการ (1 ไมโครกรม) ใน 1.5% agarose formaldehyde gel ยอมดวย ethidium bromide จากใบออน (Y) และใบแก (M) ของ ปาลมน ามน M : Marker, 1 kb DNA ladder (Fermentas, USA) Y1-Y6 : อารเอนเอรวมของใบออนปาลมน ามนจากการสกดดวยวธการท 1 ตามล าดบ M1-M6 : อารเอนเอรวมของใบแกปาลมน ามนจากการสกดดวยวธการท 1 ตามล าดบ

2. ตรวจสอบหาอณหภม annealing ทเหมาะสม ส าหรบปฏกรยา PCR โดยการท า PCR

Gradient

การตรวจหาอณหภม annealing ทเหมาะสม ส าหรบปฏกรยา PCR ดวยการท า PCR gradient โดยน าตวอยางอารเอนเอมาท าปฏกรยา RT-PCR ทก าหนดใหมอณหภม annealing ในชวง 46 องศาเซลเซยสจนถง 60 องศาเซลเซยส แลวน ามาตรวจสอบดวยเทคนค gel electrophoresis ใน 1% agarose gel พบวา อณหภม annealing ท 58 องศาเซลเซยส เกดแถบดเอนเอทชดเจนของตวอยางอารเอนเอทสกดไดในแตละวธ จงเหมาะสมทจะน าอณหภมดงกลาวมาใชในปฏกรยา PCR

3. การสงเคราะห cDNA ดวยปฏกรยา Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) โดยใช specific primer และการเพมปรมาณชนสวน cDNA ทไดจากการท าปฏกรยา RT-PCR น าอารเอนเอจากใบออนและใบแกปาลมน ามนทสกดไดจากทง 6 วธการ และก าจดจโนมคดเอน

เอออกจากตวอยางแลวมาสงเคราะห cDNA จาก mRNA โดยใชไพรเมอรทจ าเพาะกบ house keeping gene (Actin) และ boron transporter gene (OsBOR) ดวยเทคนค RT-PCR และวเคราะหขนาดดวย 1% agarose gel พบวา ผลผลตทไดจากการสงเคราะห cDNA โดยใชไพรเมอรทจ าเพาะตอยน Actin มขนาด 550 bp (ภาพท 3) และยน OsBOR มขนาด 280 bp (ภาพท 4) จากนนเพมปรมาณผลผลตจากปฏกรยา RT-PCR โดยใชไพรเมอรทงสองดวยเทคนค PCR

ภาพท 3 ผลผลตทไดจากการสงเคราะห cDNA โดยใชไพรเมอรทจ าเพาะตอ Actin ขนาด 550 bp ดวยเทคนค RT-PCR M : Marker, 1 kb DNA ladder (Fermentas, USA) Y1-Y6 : ผลผลตจากใบออนปาลมน ามนจากการสกดดวยวธการท 1-6 ตามล าดบ M1-M6 : ผลผลตจากใบแกปาลมน ามนจากการสกดดวยวธการท 1-6 ตามล าดบ

ภาพท 4 ผลผลตทไดจากการการสงเคราะห cDNA โดยใชไพรเมอรทจ าเพาะตอ OsBOR ขนาด 280 bp ดวยเทคนค RT-PCR M : Marker, 1 kb DNA ladder (Fermentas, USA) Y1-Y6 : ผลผลตจากใบออนปาลมน ามนจากการสกดดวยวธการท 1-6 ตามล าดบ M1-M6 : ผลผลตจากใบแกปาลมน ามนจากการสกดดวยวธการท 1-6 ตามล าดบ

4. การวเคราะหล าดบเบส สงตวอยาง cDNA ทไดจากวธการสกดอารเอนเอจากใบออนปาลมน ามนดวยวธการท 3

เนองจากมความเขมขนของอารเอนเอทสงสด และไมมการปนเปอนของสารประกอบฟนอลค และโพลแซคคาไรด เมอน ามาเพมปรมาณดวยเทคนค PCR จนมความเขมขน 20 นาโนกรมตอไมโครลตร แลววเคราะหหาล าดบเบส พบวา cDNA ทสงเคราะหไดจากปฏกรยา RT-PCR โดยใชไพรเมอรทจ าเพาะตอยน Actin และยน OsBOR มขนาด 397 bp และ 311 bp ตามล าดบ โดยมล าดบเบสดงน

ล าดบเบสของชน cDNA ทเกดจากไพรเมอรทจ าเพาะตอ Actin มขนาด 397 bp

GGGGGGNTTCCCGCAGACTCCTGATGCCTGATGAGATACTTACTGAGAGAGGCTATTCTTTCACCACCACTGCAGAACGGGAAATTGTTAGGGATATAAAGGAGAAACTTGCTTATGTTGCCCTCGATTATGAGCAGGAATTGGAGTCTGCCAAGAGCAGCTCCTCTGTAGAAAGGAGTTATGAGCTGCCTGATGGGCAGGTCATCACCATTGGTGCAGAGAGATTCAGGTGTCCAGAGGTTCTTTTCCAGCCATCCCTGATTGGAATGGAAGCTGCTGGAATCCATGAAACTACCTACAATTCCATCAT

GAAGTGTGATGTGGATATCAGGAAGGACTTGTATGGTAACGTTGTGCTCAGTGGAGGATCAACCATGTTCCCTGGTATTGCTGATCG

ล าดบเบสของชน cDNA ทเกดจากไพรเมอรทจ าเพาะตอ OsBor มขนาด 311 bp

NNNNNNNNNNNTCTNTGAGAGCTTGGGAGACATACTGTCTCACAGGAACCAAAAGCATGATCATCAATGGAAAGAGGACCCCGGCTATAGGAATCCATGTTATTCCAAAGCACAATAGCAAGTAAGCGGTCTGGAAAAGGGTAAAAGCAGCAATTGTCTTGAAAGGTACAGTCTCCACGAAGGTGGCATGGTACTCTTCAAGCACTTTGTATCTTCTGCTTGGTGCGGTGAAGAGCAAGAGAATCCTCTCCCAGAACTGGTTTCCAGGTAAGCTTTCTATGGCCATGAAGGCAAAGTAACCCCAGAGGACA 5. การตรวจสอบความเหมอนของล าดบเบส

การตรวจสอบความเหมอนเปนค (pairwise alignment) ของล าดบเบสจากชน cDNA ท

สงเคราะหไดจากไพรเมอร Actin ขนาด 397 bp กบยน Actin ในปาลมน ามน ปาลมน ามนอเมรกน ฝาย ขาวสาล และขาว และชน cDNA ทสงเคราะหไดจากไพรเมอร OsBOR ขนาด 311 bp กบยน BOR ในองน ละหง ยาสบ มะเขอเทศ และผกกาดขาว ทรายงานในฐานขอมลสากลดวยโปรแกรม ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/) รวมทงการวเคราะหความเหมอนดวยโปรแกรม blastn (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi?PAGE=Nucleotides) พบวา ล าดบเบสจากชน cDNA ของ Actin ขนาด 397 bp มคาความเหมอนกบยน Actin ของพชชนดตาง ๆ อยในชวง 86-98 เปอรเซนต (ตารางท 4) และล าดบเบสจากชน cDNA ของ OsBOR ขนาด 311 bp มคาความเหมอนกบยน OsBOR ของพชชนดตาง ๆ อยในชวง 77-88 เปอรเซนต (ตารางท 5)

ตารางท 4 คาความเหมอนของล าดบเบสทไดจากการวเคราะหดวย blastn ของชน cDNA จากการเพมปรมาณผลผลตจากปฏกรยา RT-PCR ดวยไพรเมอร Actin

ตารางท 5 คาความเหมอนของล าดบเบสทไดจากการวเคราะหดวย blastn ของชน cDNA

จากการเพมปรมาณผลผลตจากปฏกรยา RT-PCR ดวยไพรเมอร OsBOR

พช Best match in database ความเหมอน (%)

Brassica napus (ผกกาดขาว)

Boron transporter 88%

Ricinus communis (ละหง)


Vitis vinifera vinifera (องน)


Nicotiana tabacum (ยาสบ) boron transporter-like mRNA 77%

Solanum lycopersicum lycopersicum (มะเขอเทศ) boron transporter-like mRNA 77%

พช Best match in database ความเหมอน (%)

Elaeis guineensis (ปาลมน ามน)

Actin 98%

Elaeis oleifera (ปาลมน ามนอเมรกน)

Actin 93%

Oryza sativa (japonica cultivar-group) (ขาว)

Actin 87%

Gossypium hirsutum (ฝาย)

Actin 86%

Triticum aestivum (ขาวสาล)

Actin 86%

วจารณผลการทดลอง

ความเขมขนและคณภาพของอารเอนเอของใบออนและใบแกปาลมน ามนหนก 0.1 กรม ทสกดไดจากวธการมาตรฐาน (วธการท 1) วธการทไดรบการพฒนา 4 วธ และชด kit สามารถประเมนผลและเปรยบเทยบไดจากความเขมของแถบ 28s, 18s และ 16s rRNA ในเจล (ภาพท 2) และจากการวดคาการดดกลนแสงจากเครอง spectrophotometer (ตารางท 2 และ 3) ความเขมขนและความบรสทธของอารเอนเอรวมทสกดไดจากวธการท 3 ใหความเขมขนและคณภาพของอารเอนเอรวมสงสด เมอเปรยบเทยบกบวธการอน ๆ และชด kit โดยพจารณาจากแถบอารเอนเอทมองเหนบน denaturing formaldehyde agarose gel ซงแสดงใหเหนถงคณภาพและความสมบรณสงของแถบ 28s, 18s และ 16s rRNA จากทกวธการสกด ความคมชดและความเขมของแถบ 28s, 18s และ 16s rRNA อกทงแถบ 28s rRNA มความสมบรณมากวาแถบ 18s rRNA ซงชใหเหนวาการสญเสยหรอเสยสภาพของอารเอนเอในระหวางขนตอนการสกดนนเกดขนนอยหรอไมเกดขนเลย คา A260/280 ของอารเอนเอจากใบออนและใบแกปาลมน ามนมคาเฉลยประมาณ 1.85-3.58 บงบอกถงการปนเปอนของโปรตนในอารเอนเอทสกดไดในแตละวธการ (Laksana, 2011) สวนคา A260/230 ของอารเอนเอจากใบออนปาลมน ามนมคาเฉลยประมาณ 1.88-2.0 แสดงใหเหนวาไมมการปนเปอนของสารประกอบฟนอลคและโพลแซคคาไรด (Laksana, 2011) แตคา A260/230 ของอารเอนเอในใบแกปาลมน ามนบางวธการมคาเฉลยต ากวา 1.8 หรอสงกวา 2.2 เชน วธการท 6 (ชด kit) แสดงวามการปนเปอนของสารประกอบฟนอลคและโพลแซคคาไรด (Laksana, 2011)

อยางไรกตาม วธการท 3 เปนวธการทดทสดในการสกดอารเอนเอจากใบออนและใบแกปาลม

น ามน เมอประเมนจากคา A260/280 และคา A260/230 และความเขมขนของอารเอนเอเฉลยทสงสดคอ 1,054 นาโนกรมตอไมโครลตร ในใบออน และ 587.4 นาโนกรมตอไมโครลตร ในใบแก อกทงวธการน ประกอบดวยขนตอนเดยวและใชระยะเวลาในการสกดสน (ประมาณ 1.5 ชวโมง) ในขณะทวธการมาตรฐาน (วธการท 1) มสองขนตอนและใชระยะเวลาในการสกดนาน 2 วน แตใหความเขมขนของ อารเอนเอทสกดไดต ากวา สวนวธการท 4 และ 5 นน การใช LiCl ในขนตอนการตกตะกอนไมไดสงผลตอคณภาพของอารเอนเอ เปนเพราะ PVP อาจก าจดอารเอนเอออกไปในระหวางขนตอนการสกด แตวธการท 3 ใช NaCl ชวยในการตกตะกอน ซงดพอส าหรบการตกตะกอนอารเอนเอ แตกยงมการปนเปอนของดเอนเอในอารเอนเอรวมทสกดไดดวย แมวา LiCl จะสามารถตกตะกอนอารเอนเอไดอยางจ าเพาะกวา (Wang et al., 2007; Laksana, 2011) แตอารเอนเอกยงรวมตวอยกบดเอนเอและสงตกคางอน ๆ ของเซลลดวย ดงนนจงใช DNase I ซงสามารถก าจดจโนมคดเอนเอทปนเปอนออกไป นอกจากนวธการท 1 และวธการ 2 และ 4 ใช SSTE ชวยท าความสะอาดอารเอนเอในการตกตะกอนโปรตน แตไมไดสงผลตอ

ความบรสทธและความเขมขนของอารเอนเอรวมเมอเปรยบเทยบกบอารเอนเอรวมทไดจากวธการท 3 ซงไมไดใช SSTE ในขนตอนการสกด

วธการสกดอารเอนเอทกวธใช isopropanol และ/หรอ absolute ethanol ส าหรบตกตะกอน

อารเอนเอ สวน phenol : chloroform : isoamyl alcohol ตองใชในขนตอนการท าความสะอาดอารเอนเอ เพราะอนภาคขนาดเลกของโปรตนและเกลอทมอยจ านวนมากรวมกบอารเอนเอ สามารถทจะยบยงหรอมอทธพลตอการท าปฏกรยา reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), ปฏกรยา real time- PCR และการสราง cDNA library ซง phenol มบทบาทส าคญในการยบยงการท างานของ Rnase ระหวางแตละขนตอนของการสกดอารเอนเอ สวน chloroform และ isopropanol ใชในการก าจด phenol ทเหลอตกคางอยภายหลง (Laksana, 2011) อารเอนเอรวมทสกดไดโดยใชชด kit มความบรสทธและความเขมขนต า (ตารางท 2 และ 3) อกทงยงไมมแถบของ rRNA ทสกดไดจากใบแกปาลมน ามนปรากฏบนเจล (ภาพท 2) ดงนนชด kit จงมประสทธภาพในการสกดอารเอนเอจากใบออนปาลมน ามน แตไมมประสทธภาพพอในการสกดอารเอนเอจากใบแกปาลมน ามน เพราะใบแกมปรมาณสารประกอบฟนอลคสงกวาใบออน แสดงใหเหนวาชด kit ไมไดรบการออกแบบมาเพอใชในการสกดอารเอนเอจากเนอเยอพชทมปรมาณสาร secondary metabolites สง

เทคนค RT-PCR ชวยสนบสนนการประเมนคณภาพของอารเอนเอทสกดไดจากทกวธการ (ภาพ

ท 3) อารเอนเอทสกดไดจากใบออนและใบแกปาลมน ามนดวยวธการทแตกตางกนทงสน 6 วธการ มความเขมขนและความบรสทธเพยงพอทจะน ามาเพมปรมาณ cDNA โดยใชไพรเมอรทมความจ าเพาะ ซงถกออกแบบมาจากล าดบเบสของยน Actin และ OsBOR

เมอน า cDNA คณภาพดทไดจากการสกดอารเอนเอโดยวธการท 3 มาเพมปรมาณ โดยเทคนค

PCR ดวยไพรเมอร Actin และ OsBOR แลวหาล าดบเบส จากนนน ามาเปรยบเทยบกบล าดบเบสในฐานขอมล (NCBI) ผลลพธแสดงใหเหนถงความเหมอนกนระหวางล าดบเบสของผลผลตกบยน Actin หรอ OsBOR ในพชชนดตาง ๆ (ตารางท 4 และ 5) ซงขอมลดงกลาวยนยนไดวาอารเอนเอทสกดไดจากใบออนและใบแกปาลมน ามนดวยวธการทไดรบการท 3 ใหอารเอนเอทมคณภาพสงเพยงพอทจะใชในการศกษาวจย โดยใชเทคนคทางดานอณชวโมเลกล

สรปผลการทดลอง

การสกดอารเอนเอทมคณภาพสง ถอวามความจ าเปนตอการศกษาทางดานอณชวโมเลกล จากการทดลองนแสดงใหเหนวาวธการทไดรบการพฒนาวธท 3 เหมาะสมทสดส าหรบใชในการสกดอารเอนเอจากใบออนและใบแกปาลมน ามน โดยใหความเขมขนของอารเอนเอสงสดและใชระยะเวลาในการสกดสน (ประมาณ 1.5 ชวโมง) และ LiCl และ SSTE buffer ยงไมมผลตอคณภาพของอารเอนเอ อกทงอารเอนเอทไดจากการสกดมคณภาพดพอส าหรบใชในเทคนค reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) และการวเคราะหล าดบเบส (sequencing) นอกจากนวธการดงกลาวยงอาจสามารถประยกตใชไดกบการสกดอารเอนเอจากสวนอน ๆ ของปาลมน ามน หรอพชชนดอน ๆ ทมปรมาณสารพวก secondary metabolites สงได

เอกสารอางอง การญ นนทลพงศ. 2554. “ทศทางอตสาหกรรม น ามนปาลม” ทศทาง ความตองการปาลมน ามนของ

ตลาดโลก และของไทย เปนอยางไร. น. 6-9. ใน สจนต ภทรภวดล. ขาวสารเทคโนโลยชวภาพเกษตร. ปท 3 ฉบบท 2. ส านกพฒนาบณฑตศกษา และวจยดานวทยาศาสตรและเทคโนโลย ส านกงานคณะกรรมการการอดมศกษา.

ชาย โฆรวส, สรกตต ศรกล, อรรตน วงศศร, ศรชย มามวฒนะ, ภญโญ มเดช, เกรกชย ธนรกษ

ทวศกด ชโยภาส, ศรสรางค ลขตเอกราช, พวงทอง บญทรง, เกรยงศกด หามะฤทธ, พชรนทร วณชยอนนตกล, สพร ฆงคมณ, วชร ศรรกษา และ วชณย ออมทรพยสน. 2547. เอกสารวชาการปาลมน ามน. ฝายประชาสมพนธและเผยแพร ส านกงานเลขานการกรม กรมวชาการเกษตร, กรงเทพฯ. 317 น.

ตรทพย รตนวรชย. 2552. อณพนธศาสตรเบองตน : มหศจรรยของดเอนเอ. ส านกพมพ

แหงจฬาลงกรณมหาวทยาลย, กรงเทพฯ. 301 น.

ธระ เอกสมทราเมษฐ, ชยรตน นลนนท, ธระพงษ จนทรนยม, ประกจ ทองค า และ วรรณา เลยววารณ. 2546. คมอปาลมน ามนและการจดสวน. คณะทรพยากรธรรมชาต มหาวทยาลยงขลานครนทร, สงขลา. 72 น.

นพพร สายมพล, เรวต เลศฤทยโยธน, รงสฤษด กาวตะ และ สนธชย จนทรเปรม. 2542. พชเศรษฐกจ.

ภาควชาพชไรนา คณะเกษตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร, กรงเทพฯ. 471 น. นพรตน บ ารงรกษ. 2536. พชหลกปกษใต. ปรามด จดพมพ, กรงเทพฯ. 184 น. พรชย เหลองอาภาพงศ. 2549. คมภรปาลมน ามน พชเศรษฐกจเพอบรโภคและอปโภค. ส านกพมพ

มตชน, กรงเทพฯ. 352 น. พชรนทร ตญญะ และ พระศกด ศรนเวศน. 2554. การปรบปรงพนธปาลมน ามนในประเทศไทย. น.

16-18. ใน สจนต ภทรภวดล. ขาวสารเทคโนโลยชวภาพเกษตร. ปท 3 ฉบบท 2. ส านกพฒนาบณฑตศกษา และวจยดานวทยาศาสตรและเทคโนโลย ส านกงานคณะกรรมการการอดมศกษา.

วชร อตถทพพหลคณ, ทรงศกด เพชรมตร, มนตร อตถทพพหลคณ, สรฤกษ ทรงศวไล, เพทาย เยนจตโสมนส, วระพงศ ลลตานนท, วสนต จนทราทตย, สมวงษ ตระกลรง, พสสวรรณ เจยมสมบต, อภชาต วรรณวจตร, มธรส พงษลขตมงคล และ Richard H. Lussier. 2536. ทฤษฎ & การประยกตใชประโยชน PCR Technology. คณะเทคนคการแพทย มหาวทยาลยมหดล, กรงเทพฯ. 208 น.

สกญญา จนเหนาะ, ป ม ปรดากล, สงกรานต ทองทว, นภา ชนปอม และ ฮโก โวลการด. 2554. การศกษาและพฒนาเครองหมายโมเลกลเพอใชในงานปรบปรงพนธปาลมน ามน. น. 4 ใน สจนต ภทรภวดล. ขาวสารเทคโนโลยชวภาพเกษตร. ปท 3 ฉบบท 2. ส านกพฒนาบณฑตศกษา และวจยดานวทยาศาสตรและเทคโนโลย ส านกงานคณะกรรมการการอดมศกษา.

Camacho-Villasana, Y.M., N. Ochoa-Alejo, L. Walling and E.A. Bray. 2002. An improved

method for isolating RNA from dehydrated and nondehydrated chili peper (Capsicum annuum L.) plant tissues. Plant Mol. Bi. Rept. 20: 407-414.

Cin, V.D., M. Danesin, F.M. Rizzini and A. Ramina. 2005. RNA extraction from plant tissues,

pp. 113-119. In Molecular Biology. Vol. 31, Humana Press Inc. Daohong, W., W. Bochu, L. Biao, D. Chuanren and Z. Jin. 2004. Extraction of total RNA

from Chrysanthemum containing high levels of phenolic and carbohydrates. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 36: 111-114.

Djami-Tchatchou, A.T. and C.J. Straker. 2011. The isolation of high quality RNA from the fruit

of avocado (Persea Americana Mill.). South Afri. Boi. (DOI 10.1016/j.sajb.2011.04.009) Jaakola, L., A.M. Pirttilä, M. Halonen and A. Hohtola. 2001. Isolation of high quality RNA

from bilberry (Vaccinium myrtillus L.) fruits, pp. 201-203. In Molecular Biology. Vol. 19, Humana Press Inc.

Laksana, C. 2011. Simple and radpid RNA extraction from young and mature leave of oil palm

(Elaeis guineensis Jacq.). M.S. Special Problem, Kasetsart Univ., Nakhonpathom.

Moser, C., P. Gatto, M. Moser, M. Pindo and R. Velasco. 2004. Isolation of functional RNA from small amounts of different grape and apple tissues, pp. 95-99. In Molecular Biology. Vol. 26, Humana Press Inc.

Saïdi, M.N., R. Gargouri-Bouzid, M. Rayanni and N. Drira. 2008. Optimization of RNA

isolation from brittle leaf disease affected date palm leaves and construction of a subtractive cDNA. Mol. Biotechnol. 41: 63-68.

Veres, G., R.A. Gibbs, S.E. Scherr and C.T. Caskey. 1987. The molecular basis of the

sparse fur mouse mutation. Science 237: 415-417. Wang, T., N. Zhang and L. Du. 2005. Isolation of RNA of high quality and yield from Ginkgo

biloba leaves. Biotech. Lett. 27: 629-633. Wang, C., T. Kim, D. Gao, A. Vaglenov and B. Kaltenboeck. 2006. Rapid high-yield mRNA

extraction for reverse-transcription PCR. J. Biochem. Biophys. Methods 70.(2007) 507-509.

Wang, X., W. Tian and Y. Li. 2007. Develop of an efficient protocol of RNA isolation from

recalcitrant tree tissues. Mol. Biotechnol. 38: 57-64.

ภาคผนวก

Elaeis guineensis TGAA-GATACTTACTGAGAGAGGCTATTCTTTCACCACCACTGCAGAGCG 720

Elaeis oleifera TGAAAGATACTTACTGAGAAAGGCTATTCTTTCACCACCACTGCAGAGCG 729

Oil palm (Actin) TGA--GATACTTACTGAGAGAGGCTATTCTTTCACCACCACTGCAGAACG 79

Gossypium hirsutum1 TGAA-GATTCTTACTGAGAGAGGTTACATGTTCACCACCACTGCTGAACG 655




Gossypium hirsutum5 TGAA-GATTCTTACTGAGAGAGGTTACATGTTCACCACCACTGCTGAACA 638

Gossypium hirsutum6 TGAA-GATTCTTACTGAGAGAGGTTATATGTTCACCACCACTGCTGAACG 754



Asarum europaeum TGAA-AATCCTTACTGAAAGAGGTTATTCCTTCACCACCACTGCGGAGCG 169

Ricinus communis1 TGAA-GATTCTTACCGAGAGAGGGTACATGTTCACCACCACTGCCGAACG 780

Ricinus communis2 TGAA-GATTCTTACGGAGAGGGGATACATGTTCACCACCACTGCCGAACG 803

Hevea brasiliensis TGAA-GATTCTCACTGAGAGAGGGTATATGTTCACCACCACTGCCGAACG 519

Triticum aestivum TGAA-GATTCTTACTGAGAGAGGTTACTCCTTCACCACCACTGCCGAACG 365

Leymus chinensis TGAA-GATTCTTACGGAGAGAGGTTACTCCTTCACCACGACTGCTGAACG 161

Gossypium barbadense TGAA-GATTCTTACCGAGAGAGGTTACATGTTCACCACCACTGCTGAACG 1289

Gossypium herbaceum TGAA-GATTCTTACCGAGAGAGGTTACATGTTCACCACCACTGCTGAACG 1202

Liriodendron tulipifera ------ATCCTTACAGAAAGAGGTTACTCATTCACGACCACTGCTGAACG 44

Oryza sativa TGAA-GATTCTTACTGAGAGAGGTTACTCCTTCACTACCACTGCTGAACG 623

** ** ** ** * ** ** ***** ** ***** ** *

Elaeis guineensis GGAAATTGTTAGGGATATAAAGGAGAAACTTG-CTTATGTTGCCCTCGAT 769

Elaeis oleifera GGAAATTGGTAGGGATTTCAAGGAGAAACTTGGCTTATGTTGCCCTCGAT 779

Oil palm (Actin) GGAAATTGTTAGGGATATAAAGGAGAAACTTG-CTTATGTTGCCCTCGAT 128

Gossypium hirsutum1 GGAAATTGTCCGTGACATGAAGGAGAAGCTTG-CTTATGTTGCCTTGGAC 704




Gossypium hirsutum5 GGAAATTGTCCGTGACATGAAGGAGAAGCTTG-CTTACGTTGCCTTGGAC 687

Gossypium hirsutum6 GGAAATTGTCCGTGACATGAAGGAGAAGCTTG-CCTATGTTGCCCTGGAC 803

Gossypium hirsutum7 GGAAATTGTCCGTGACATGAAGGAGAAGCTTG-CCTATGTTGCCCTGGAC 706

Gossypium hirsutum8 GGAAATTGTCCGTGACATGAAGGAGAAGCTTG-CTTATGTTGCCCTGGAC 690

Asarum europaeum GGAAATTGTCAGGGACATGAAGGAGAAGCTTG-CATATGTTGCACTAGAC 218

Ricinus communis1 GGAAATTGTCCGTGACATGAAGGAGAAACTTG-CATATGTTGCCCTTGAC 829

Ricinus communis2 GGAAATTGTCCGTGACATGAAGGAGAAACTTG-CATATGCTGCTCTTGAT 852

Hevea brasiliensis GGAAATTGTCCGTGACATGAAGGAGAAACTTG-CATATGTTGCCCTTGAC 568

Triticum aestivum GGAAATTGTAAGGGACATCAAGGAGAAGCTCG-CATATGTGGCTCTTGAC 414

Leymus chinensis GGAAATTGTAAGGGACATCAAGGAGAAGCTCG-CATATGTGGCTCTTGAC 210

Gossypium barbadense GGAAATTGTCCGTGACATGAAAGAGAAGCTTG-CTTATGTTGCCCTGGAC 1338

Gossypium herbaceum GGAAATTGTCCGTGACATGAAGGAGAAGCTTG-CTTATGTTGCCCTGGAC 1251

Liriodendron tulipifera GGAAATTGTTAGGGACATGAAAGAGAAGCTTG-CATATGTCGCCCTTGAC 93

Oryza sativa GGAAATTGTAAGGGACATCAAGGAGAAGCTTG-CATATGTGGCCCTTGAC 672

******** * ** * ** ***** ** * * ** * ** * **

Elaeis guineensis TATGAGCAGGAATTGGA-GTCTGCCAAGAGCAGCTCCTCTGTAGAAAGGA 818

Elaeis oleifera TATGACCAGGAATTGGAAGTTTGCCAAAAGCAGTTCTT-TGTAAAAAGGA 828

Oil palm (Actin) TATGAGCAGGAATTGGA-GTCTGCCAAGAGCAGCTCCTCTGTAGAAAGGA 177

Gossypium hirsutum1 TATGAGCAGGAGCTGGA-GACTGCCAAGAGCAGCTCTTCTGTTGAGAAGA 753




Gossypium hirsutum5 TATGAGCAGGAACTGGA-GACTGCCAAGAGCAGCTCTTCTGTTGAGAAGA 736




Asarum europaeum TACGAGCAGGAGCTTGA-GACAGCAAAGAGTAGTTCCTCCGTCGAGAAAA 267

Ricinus communis1 TACGAGCAGGAACTTGA-GACTGCCAAGAGCAGCTCCTCAGTTGAGAAGA 878

Ricinus communis2 TACGAGCAAGAACTTGA-GACTGCCAAGAGCAGCTCCTCTGTTGAGAAGA 901

Hevea brasiliensis TATGAGCAGGAACTTGA-AACTGCCAAGAGCAGCTCCTCAGTTGAGAAGA 617

Triticum aestivum TATGAACAAGAGCTGGA-AAATGCCAAGAGCAGCTCCTCTGTGGAGAAGA 463

Leymus chinensis TATGAACAAGAGCTGGA-AAATGCCAAGAGCAGCTCCTCTGTGGAGAAGA 259

Gossypium barbadense TATGAGCAGGAACTGGA-GACTGCCAAGAGCAGCTCATCTGTTGAGAAGA 1387

Gossypium herbaceum TATGAGCAGGAACTGGA-GACTGCGAAGAGCAGCTCATCTGTTGAGAAGA 1300

Liriodendron tulipifera TATGAGCAGGAGCTGGA-GACTGCCAAGAGCAGTTCCTCGGTCGAGAAGA 142

Oryza sativa TATGAGCAGGAGCTGGA-GGCTGCAAAGAGCAGCTCATCTGTGGAGAAGA 721

** ** ** ** * ** ** ** ** ** ** * ** * * *

Elaeis guineensis GTTATGAGCTGCCTGATGGGCAGGTCATCACCATTGGTGCAGAGAGATTC 868

Elaeis oleifera GTTATGAGCTGCTT-ATGGGCAGGTC-TCACCATTGGTGCGGAGAGATTC 876

Oil palm (Actin) GTTATGAGCTGCCTGATGGGCAGGTCATCACCATTGGTGCAGAGAGATTC 227

Gossypium hirsutum1 ACTATGAGTTGCCTGATGGGCAAGTCATTACTATTGGAGCTGAGAGATTC 803





Gossypium hirsutum6 ACTATGAGTTGCCTGATGGACAAGTAATTACTATTGGAGCTGAGAGATTC 902

Gossypium hirsutum7 ACTATGAGTTGCCTGATGGACAAGTAATTACTATTGGAGCTGAGAGATTC 805

Gossypium hirsutum8 ACTATGAATTGCCTGATGGACAAGTAATTACTATCGGAGCTGAGAGATTC 789

Asarum europaeum GCTATGAACTTCCTGATGGGCAGGTGATCACCATTGGTGCTGAGAGATTC 317

Ricinus communis1 ACTACGAGCTTCCTGATGGTCAGGTTATCACCATTGGAGCTGAGAGATTC 928

Ricinus communis2 ACTATGAGCTTCCTGATGGCCAGGTCATCACCATTGGCGCTGAGAGATTC 951

Hevea brasiliensis ACTATGAACTTCCTGATGGCCAGGTCATCACCATTGGAGCTGAACGATTC 667

Triticum aestivum GCTATGAGCTGCCTGATGGGCAGGTGATCACCATTGGGGCAGAGAGGTTC 513

Leymus chinensis GCTATGAGCTGCCTGATGGGCAGGTGATCACCATTGGGGCAGAGAGGTTC 309

Gossypium barbadense ACTATGAGTTGCCTGACGGACAAGTCATTACTATTGGAGCTGAGAGATTC 1437

Gossypium herbaceum ACTATGAGTTGCCTGACGGACAAGTCATTACTATTGGAGCTGAGAGATTC 1350

Liriodendron tulipifera GCTATGAGCTGCCTGATGGGCAGGTGATCACGATTGGAGCTGAGAGGTTC 192

Oryza sativa GCTATGAGCTGCCTGATGGACAGGTGATCACCATTGGGGCAGAGAGGTTC 771

** ** * * * * ** ** ** * ** ** ** ** ** * ***

Elaeis guineensis AGGTGTCCAGAGGTTCTTTTCCAGCCATCCCTGATTGGAATGGAAGCTGC 918

Elaeis oleifera AGGTGTCCAGAGGTTCTTTTCCAGCCATCCTCGATTGGAA-AGAAGCTGC 925

Oil palm (Actin) AGGTGTCCAGAGGTTCTTTTCCAGCCATCCCTGATTGGAATGGAAGCTGC 277

Gossypium hirsutum1 CGTTGTCCAGAAGTCCTCTTCCAGCCATCTCTTATTGGGATGGAAGCTGC 853




Gossypium hirsutum5 CATTGTCCAGAAGTCCTCTTCCAGCCATCTCTTATTGGGATGGAAGCTGC 836

Gossypium hirsutum6 CGTTGTCCAGAAGTCCTCTTCCAGCCATCTCTCATTGGAATGGAAGCTGC 952



Asarum europaeum CGGTGCCCTGAGGTCCTCTTCCAGCCTTCCCTCATTGGAATGGAAGCAGC 367

Ricinus communis1 CGTTGCCCAGAAGTACTTTTCCAGCCATCTCTCATTGGAATGGAAGCTGC 978

Ricinus communis2 CGTTGCCCAGAAGTACTTTTCCAACCATCTCTCATTGGAATGGAAGCTGC 1001

Hevea brasiliensis CGTTGCCCAGAAGTTCTGTTCCAGCCATCACTCATTGGAATGGAAGCTGC 717

Triticum aestivum CGTTGCCCTGAGGTCCTTTTCCAGCCATCTTTCATTGGTATGGAAGCTGC 563

Leymus chinensis CGTTGCCCTGAGGTCCTTTTCCAGCCATCTTTCATTGGTATGGAAGCTGC 359

Gossypium barbadense CGTTGCCCGGAAGTCCTCTTCCAGCCATCTTTCATTGGGATGGAAGCTGC 1487

Gossypium herbaceum CGTTGCCCGGAAGTCCTCTTCCAGCCATCTTTCATTGGGATGGAAGCTGC 1400

Liriodendron tulipifera CGTTGCCCTGAGGTTCTCTTCCAGCCATCCCTCATTGGAATGGAAGCTGC 242

Oryza sativa CGATGCCCTGAGGTCCTCTTCCAGCCCTCTTTCATCGGTATGGAAGCTCC 821

** ** ** ** ** ***** ** ** ** ** * ***** *

Elaeis guineensis TGGAATCCATGAAACTACCTACAATTCCATCATGAAGTGTGATGTGGATA 968

Elaeis oleifera TGGAATCCATGAAACTACCTACAATTCCATCATGAAGTGTGATGTGGTTA 975

Oil palm (Actin) TGGAATCCATGAAACTACCTACAATTCCATCATGAAGTGTGATGTGGATA 327

Gossypium hirsutum1 TGGAATCCATGAAACTACATACAACTCTATCATGAAGTGTGATGTTGATA 903





Gossypium hirsutum6 TGGAATCCATGAAACTACCTACAACTCTATCATGAAGTGTGATGTGGATA 1002



Asarum europaeum TGGTATTCATGAAACTACATACAATTCCATCATGAAGTGTGATGTGGATA 417

Ricinus communis1 AGGAATCCACGAGACTACATACAACTCTATCATGAAGTGTGATGTGGATA 1028

Ricinus communis2 AGGAATCCACGAGACTACATACAACTCTATCATGAAGTGTGATGTGGATA 1051

Hevea brasiliensis AGGCATCCATGAGACTACTTACAACTCCATCATGAAGTGTGATGTGGATA 767

Triticum aestivum TGGAATCCATGAGACCACCTACAACTCTATCATGAAGTGTGATGTGGATA 613

Leymus chinensis TGGAATCCATGAGACCACCTACAACTCTATCATGAAGTGTGATGTGGATA 409

Gossypium barbadense TGGAATCCATGAAACTACCTACAACTCTATCATGAAGTGTGATGTGGATA 1537

Gossypium herbaceum TGGAATCCATGAAACTACCTACAACTCTATCATGAAGTGTGATGTGGATA 1450

Liriodendron tulipifera TGGAATCCATGAGACCACATACAACTCCATCATGAAATGCGATGTGGATA 292

Oryza sativa TGGAATCCATGAGACCACTTACAATTCCATCATGAAGTGTGATGTGGATA 871

** ** ** ** ** ** ***** ** ******** ** ***** * **

Elaeis guineensis TCAGGAAGGACTTGTATGGTAACGTTGTGCTCAGTGGAGGATCAACCATG 1018

Elaeis oleifera TTAGGAAGGACTTGTATGGTAACGTTGTGCTCAGTGGAGGATCAACCATG 1025

Oil palm (Actin) TCAGGAAGGACTTGTATGGTAACGTTGTGCTCAGTGGAGGATCAACCATG 377

Gossypium hirsutum1 TCAGGAAGGATCTCTATGGTAACATTGTGCTCAGTGGTGGGTCAACTATG 953

Gossypium hirsutum2 TCACGAAGGATCTCTATGGTAACATTGTGCTCAGTGGTGGGTCAACTATG 948

Gossypium hirsutum3 TCAAGAAGGATCTCTATGGTAACATTGTGCTCAGTGGTGGTTCAACTATG 949

Gossypium hirsutum4 TCAAGAAGGATCTCTATGGTAACATTGTGCTCAGTGGTGGTTCAACTATG 1007

Gossypium hirsutum5 TCAGGAAGGATCTCTATGGTAACATTGTGCTCAGTGGTGGTTCAACTATG 936



Gossypium hirsutum8 TCAGGAAGGATCTCTACGGTAACATTGTGCTCAGTGGTGGTTCAACCATG 939

Asarum europaeum TCAGGAAGGACCTGTATGGCAACATTGTTCTCAGTGGTGGTTCGACTATG 467

Ricinus communis1 TCAGGAAGGATCTTTATGGTAACATTGTGCTCAGTGGTGGTTCCACTATG 1078

Ricinus communis2 TCAGGAAGGATCTTTATGGTAACATTGTGCTCAGTGGTGGTTCCACTATG 1101

Hevea brasiliensis TCAGGAAGGACCTTTATGGTAACATTGTGCTCAGTGGTGGTTCCACTATG 817

Triticum aestivum TCAGGAAGGATCTGTATGGTAACATTGTGCTCAGTGGTGGCTCAACTATG 663

Leymus chinensis TCAGGAAGGACCTGTATGGTAACATTGTGCTCAGTGGTGGGTCAACTATG 459

Gossypium barbadense TCAGGAAGGATCTCTATGGTAACATTGTGCTCAGTGGGGGTTCAACTATG 1587

Gossypium herbaceum TCAGGAAGGATCTCTACGGTAACATTGTGCTCAGTGGGGGTTCAACCATG 1500

Liriodendron tulipifera TCAGGAAGGATTTGTATGGCAACATAGTGCTGAGTGGTGGTTCAACCATG 342

Oryza sativa TCAGGAAGGACTTGTATGGTAACATTGTTCTCAGTGGTGGATCAACCATG 921

* * ****** * ** ** *** * ** ** ***** ** ** ** ***

Elaeis guineensis TTCCCTGGTATTGCTGATCGTATGAGCAAGGAAATCTCGGCCCTTGCTCC 1068

Elaeis oleifera TTCCCTGGTATTGCTGATCGTATGAGCAAGGAAATCTCGGCCCTTGCTCC 1075

Oil palm (Actin) TTCCCTGGTATTGCTGATCG------------------------------ 397

Gossypium hirsutum1 TTCCCTGGTATTGCTGACCGAATGAGCAAGGAGATCACTGCCCTTGCTCC 1003




Gossypium hirsutum5 TTCCCTGGTATTGCTGACCGAATGAGCAACGGGATCACTGCCCTTGCTCC 986

Gossypium hirsutum6 TTCCCTGGTATTGCAGACCGTATGAGCAAGGAGATCACTGCTCTTGCTCC 1102

Gossypium hirsutum7 TTCCCTGGTATTGCAGACCGTATGAGCAAGGAGATCACTGCTCTTGCTCC 1005

Gossypium hirsutum8 TTCCCTGGTATTGCAGACCGTATGAGCAAGGAGATCACTGCTCTTGCCCC 989

Asarum europaeum TTTCCTGGTATTGCCGATCGTATGAGCAAGGAGATCACAGCCCTCGCTCC 517

Ricinus communis1 TTCCCTGGTATTGCAGACCGTATGAGCAAGGAGATCACCGCCCTTGCTCC 1128

Ricinus communis2 TTCCCTGGTATTGCAGACCGTATGAGCAAGGAGATCACCGCCCTTGCTCC 1151

Hevea brasiliensis TTCCCTGGCATTGCAGACCGTATGAGTAAGGAGATCACTGCACTTGCTCC 867

Triticum aestivum TTCCCGGGTATTGCTGACCGTATGAGCAAGGAGATCACTGCCCTTGCACC 713

Leymus chinensis TTCCCGGGTATTGCTGACCGTATGAGCAAGGAGATCACTGCCCTTGCACC 509

Gossypium barbadense TTCCCTGGTATTGCGGACCGCATGAGCAAGGAGATCACTGCTCTTGCTCC 1637

Gossypium herbaceum TTCCCTGGTATTGCAGACCGCATGAGCAAGGAGATCACTGCACTTGCTCC 1550

Liriodendron tulipifera TTCCCAGGCATTGCTGATCGAATGAGCAAGGAGATCACAGCACTTGCTCC 392

Oryza sativa TTCCCTGGTATTGCTGACCGTATGAGCAAGGAGATCACTGCCCTCGCACC 971

** ** ** ***** ** **

ภาพผนวกท 1 การเปรยบเทยบความเหมอนระหวางล าดบเบสของ cDNA ทไดจาก การเพมปรมาผลผลตของปฏกรยา RT-PCR ดวยไพรเมอร Actin กบ ล าดบเบสของยน Actin ในปาลมน ามน (Elaeis guineensis No. AY550991.1), ปาลมน ามนอเมรกน (Elaeis oleifera No. AF394737.1), ฝาย (Gossypium hirsutum No. AY305730.1, AY305729.1, AY305737.1, FJ560484.1, AY305736.1, FJ560483.1, AY305732.1 และ AY305726.1), ขงปายโรป (Asarum europaeum No. HM121985.1), ละหง (Ricinus communis No. XM_002522148 และ AY360221.1), ยางพารา (Hevea brasiliensis No. GU270586.1), ขาวสาล (Triticum aestivum No. GQ339780.1), พช ตระกลหญา (Leymus chinensis No. HM623326.1), พชตระกลสน (Gossypium barbadense No. HQ142998.1 และ Gossypium herbaceum No. HQ142995.1), และขาว (Oryza sativa No. AY212324.1)

Vitis vinifera1 AGGACTACCATGCAACTTTTGTGGAAACCGTTCCTTTCAAGACAATTGCA 2078

Vitis vinifera2 AGGACTACCATGCAACTTTTGTGGAAACCGTTCCTTTCAAGACAATTGCA 1650

Ricinus communis1 AGAAATACCATGCCACCTTTGTGGAAACTGTGCCTTTCAAGACGATTGCA 1638

Nicotiana tabacum AGGATTATCACGCCACTTTTGTAGAGACTGTGCCTTTCAAGAGCATAGTG 2106

Solanum lycopersicum AGGATTATCACGCCACTTTTGTAGAGACTGTGCCTTTCAAGAGCATAGTG 2106

Oil palm (OsBOR) AAGAGTACCATGCCACCTTCGTGGAGACTGTACCTTTCAAGACAATTGCT 163

Ricinus communis2 AGGAGTATCATGCCACGTTTGTGGAAACAGTGCCTTTCAAGACAATTGCA 1635

Brassica napus1 AAGATTACCACGCAACATTCGTTGAAACCGTTCCTTTCAAGACAATTGCA 1632

Brassica napus2 AAGATTACCACGCAACATTCGTTGAAACCGTTCCTTTCAAGACAATTGCA 2391

Brassica napus3 AAGATTACCACGCAACATTCGTTGAAACCGTTCCATTCAAGACAATTGCA 1632

Brassica napus4 AAGATTACCACGCAACATTCGTTGAAACCGTTCCATTCAAGACAATTGCA 2396

Brassica napus5 AAGATTACCACGCAACGTTCGTTGAGACGGTTCCATTCAAGACGATTGCG 1632

Brassica napus6 AAGATTACCACGCAACGTTCGTTGAGACGGTTCCATTCAAGACGATTGCG 2240

* * ** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ******* ** *

Vitis vinifera1 ATGTTTACAATTTTCCAGACTGCCTACTTGCTTGTTTGTTTTGGGATTAC 2128

Vitis vinifera2 ATGTTTACAATTTTCCAGACTGCCTACTTGCTTGTTTGTTTTGGGATTAC 1700

Ricinus communis1 ATATTTACGATTTTTCAGACAGCTTACTTGCTGGTTTGTTTTGGCATTAC 1688

Nicotiana tabacum ACATTCACAATATTCCAAACACTATACTTGCTTGCTTGCTTTGGCATTAC 2156

Solanum lycopersicum ACATTCACAATATTCCAAACACTATACTTGCTTGCTTGCTTTGGCATTAC 2156

Oil palm (OsBOR) GCTTTTACCCTTTTCCAGACCGCTTACTTGCTATTGTGCTTTGGAATAAC 213

Ricinus communis2 ATGTTTACAATCTTCCAAACATTTTATTTGCTGATATGTTTTGGTCTAAC 1685

Brassica napus1 ACGTTCACTATTTTCCAGACGATTTATCTCTTAGTCTGCTTTGGCCTCAC 1682




Brassica napus5 ATGTTCACTATTTTCCAAACGGTTTATCTGTTAATCTGCTTTGGCCTCAC 1682

Brassica napus6 ATGTTCACTATTTTCCAAACGGTTTATCTGTTAATCTGCTTTGGCCTCAC 2290

** ** * ** ** ** ** * * ** ***** * **

Vitis vinifera1 TTGGGTTCCTATTGCTGGAGTTCTGTTCCCTCTAATGATCATGCTTTTGG 2178

Vitis vinifera2 TTGGGTTCCTATTGCTGGAGTTCTGTTCCCTCTAATGATCATGCTTTTGG 1750

Ricinus communis1 ATGGATTCCAATTGCTGGGGTTCTATTCCCGTTAATGATCATGCTTTTGG 1738

Nicotiana tabacum GTGGGTTCCAATCGCGGGGCTCCTTTTCCCTCTTTTGATCATGCTTTTGG 2206

Solanum lycopersicum GTGGGTTCCAATCGCGGGGCTCCTTTTCCCTCTTTTGATCATGCTTTTGG 2206

Oil palm (OsBOR) ATGGATTCCTATAGCCGGGGTCCTCTTTCCATTGATGATCATGCTTTTGG 263

Ricinus communis2 TTGGGTTCCAATAGCCGGCGTCATGTTTCCCCTGATGATCATGCTTCTAG 1735

Brassica napus1 ATGGATTCCAATAGCAGGAGTTATGTTCCCTTTAATGATCATGTTCTTGA 1732




Brassica napus5 ATGGATCCCAATAGCAGGAGTCATGTTCCCTTTAATGATCATGTTCTTAG 1732

Brassica napus6 ATGGATCCCAATAGCAGGAGTCATGTTCCCTTTAATGATCATGTTCTTAG 2340

*** * ** ** ** ** * * ** ** * ******** * *

ภาพผนวกท 2 การเปรยบเทยบความเหมอนระหวางล าดบเบสของ cDNA ทไดจาก การเพมปรมาณผลผลตของปฏกรยา RT-PCR ดวยไพรเมอร OsBOR กบล าดบเบสของยน OsBOR ในองน (Vitis vinifera No. XM_002263938 และ FJ263935), ละหง (Ricinus communis No. XM_002519247 และ XM_002515178), ยาสบ (Nicotiana tabacum No. EU599083.1), มะเขอเทศ (Solanum lycopersicum No. EU591513.1) และผกกาดขาว (Brassica napus No. GU827645.1, GU827653.1, GU827646.1, GU827654.1, GU827647.1 และ

GU827655.1)

development of simple and efficiency rna extraction method for … · 2017-10-12 · development of...

Documents