Determining feed quality for ruminants using in vitro gas production technique.  

1. Building an anaerobic fermentation chamber 

L. O. Tedeschi*, P. Schofield#, A. N. Pell# 

* Texas A&M University, College Station, TX 77845‐2471 

# Cornell University, Ithaca, NY 14853 

Introduction 

  There  are  several  techniques  to  determine  the  fermentation  pattern  of  feeds  through incubation in rumen fluid. The in vivo and in situ techniques are known for their laborious and expensive methods,  large  variation,  and  difficult  to  standardize  (Huntington  and  Givens,  1995).  Others  have provided extensively discussion of  the advantages and drawbacks of  in  situ  techniques  (Nocek, 1988; Vanzant et al., 1998). 

  Techniques  that  use  in  vitro  incubation with  rumen  fluid  have  been  described  and  used  to determine  the  fermentation  pattern  of  feeds  (Goering  and  Van  Soest,  1970;  Tilley  and  Terry,  1963) mainly because  their ease of use and  cost. The  in  vitro  technique has  its own  limitations. The  single major factor affecting the pattern of fermentation  is  likely to be the  inoculum because of the  intrinsic variability  of  the  rumen  fluid  and  the  collection  schedule.  Other  factors  include  diets  fed  to  donor animals and species of donor animal  (Rymer et al., 2005). The dietary  fiber  in  the donor’s  ration may also affect  the  in  vitro dry matter  (DM) digestibility, even when  chemical  composition of  the diets  is similar (Cherney et al., 1993). When feedstuffs are  incubated with buffered rumen fluid, the degraded carbohydrate fraction may either contribute to CO2, CH4, and volatile fatty acids (VFA: acetic, propionic, and  butyric)  or  be  incorporated  into  microbial  biomass  (Rymer  et  al.,  2005).  Direct  comparisons between  in  situ  and  in  vitro methods  have  been  conducted  by Varel  and  Kreikemeier  (1995).  These authors reported that on average lag time was 3.5 h less, fractional rate of degradation was 3%/h faster, and extent was 6% greater  for the  in situ than  for  the  in vitro method  for determining  fiber digestion kinetics. Therefore, one could use these biases in adjusting in vitro estimates for in situ values. 

  Pell and Schofield (1993) developed a computerized gas production system  in which  individual pressure  sensors  transmitted  data  to  an  IBM‐PC  via  an  analog‐to‐digital  converted  (ADC)  card.  This automated  process  could  generate  several  data  points  for  each  sample  within  an  acceptable fermentation  period.  Their  system  included  an  incubator with  a multiplace  stirrer,  pressure  sensors attached  to  the  incubation  50‐ml  Wheaton  flasks,  and  ADC  card,  a  computer  with  the  Microsoft Windows 3.1, and the Atlantis Software for Win 3.1 as shown in Figure 1. Their system was able to read 16  channels  at  a  time. More  information was  described  by  Schofield  (1996).  Previous  analyses  have indicated  that  flasks volume have no effects on  the  in vitro digestibility of DM and neutral detergent fiber (NDF) (Sayre and Van Soest, 1972), and fermentation pattern and VFA profile (Schofield and Pell, 1995), but they might capture mode information of the fermentation process than small flaks (Schofield and  Pell,  1995)  and  the  size of  the  error  is proportionally  reduced.  There has been  some discussion 

1  

about the  impact of the pressure that builds up  inside the  flasks on microbial growth when gas  is not released (Rymer et al., 2005). 

  The objective of this paper is to describe the development of a fermentation chamber similar to that  described  by  Pell  and  Schofield  (1993)  except  it  was  designed  to  contain  more  and  larger fermentation  flasks.  The  second  objective  is  to  build  a  fermentation  chamber  in which  it would  be possible to record other measurements inside of the Wheaton flasks simultaneously in the future, such as methane and VFA. 

Material and Methods 

  Electronic  circuit  to  supply  power  to  pressure  sensor.  The  sensors  used  by  Pell  and  Schofield (1993), 185PC15DT from Micro Switch (Freeport,  IL) was not available when building our fermentation chamber.  Therefore,  the  sensor  PX40‐15G5V  (Omega  Engineering  Inc.,  Stamford,  CT,  06906‐0669, http://www.omega.com)  (Figure 2A) was used. This  sensor measures 0  to 15 psi  (1 atm),  requires an excitation of 5 V with 10 mA, and returns a voltage signal of 0.5 ± 0.11 V at 0 psi and 4.0 ± 0.11 V. During the anaerobic fermentation, there  is no release of gas that  is produced through fermentation and the pressure sensors report the accumulated gas. There are other systems that release the pressure when it reaches a certain value  (Cone et al., 1996). An electronic circuit was build onto a printed circuit board (PCB) to convert 12 V to 5 V as shown in Figure 3. In Figure 3, Vin is 12 V and Vout is 5 V. The resistance R2  is the  internal resistance of the pressure sensor PX40‐15G5V, which was measured to be 3.6 kΩ. A fixed resistance of 3.6 kΩ was used for R1. Equation [1] shows the calculation of the total resistance. 

1 2 3.6 3.6 1.81 2 3.6 3.6T

R RR kR R× ×

= = =+ +

Ω    [1] 

  Therefore, the Rv that would satisfy the Vin and Vout, given the total resistance of 1.8 kΩ is 2.5Ω (Equation [2]). 

1.81.8

1.85 121.8

2.5

Vout VinRv

RvRv k

⎛ ⎞= ×⎜ ⎟+⎝ ⎠⎛ ⎞= ×⎜ ⎟+⎝ ⎠

∴ = Ω     [2] 

  Electronic circuit to process the signal from the pressure sensor. The ADC used to convert analog signals  from  the pressure  sensors  to  a digital  signal  to be  read  by  a  computer was  a  card with USB connectors  (USB  ADC‐11;  PicoTech,  Cambridgeshire,  UK;  http://www.picotech.com)  (Figure  2B).  This USB ADC‐11 has an  input of 0  to 2.5 V. However,  the pressure sensor PX40‐15G5V  (Figure 2A) has an output of 0.5 to 4 V. Therefore, a voltage divider as shown in Figure 2C was built to provide 2.5 V at the maximum  output  of  the  pressure  sensor.  The  R1  of  the  USB  ADC‐11  is  1 MΩ.  Therefore,  the  total resistance (3.58 kΩ) was calculated as shown in Equation [3]. 

2  

1 2 1000 3.6 3.581 2 1000 3.6T

R RR kR R× ×

= = =+ +

Ω    [3] 

  Therefore,  the Rv  that would satisfy  the Vin and Vout, given  the  total resistance of 3.58 kΩ  is 2.148 kΩ (Equation [4]). 

3.583.58

3.582.5 43.58

2.148

⎛ ⎞= ×⎜ ⎟+⎝ ⎠⎛ ⎞= ×⎜ +⎝ ⎠

⎟

∴ = Ω

Vout VinRv

RvRv k

    [4] 

  Figure 2C shows the PCB with 22 voltage dividers, 11 to convert 12 V  into 5 V  (left) and 11 to convert 4 V  into 2.5 V  (right).  The pressure  signal,  after being divided, was  connected  to  a  terminal board (Figure 2C) (PicoTech, Cambridgeshire, UK; http://www.picotech.com) and then connected to the ADC (Figure 2B) using a RS 25 cable. 

  Incubation  Chamber.  An  wood  incubation  chamber  was  built  to  allow  control  of  ideal temperature for anaerobic fermentation (about 39 oC) as shown in Figure 4. The source of heat was two 100‐W  lamps  and  two  fans  to  homogeneously  dissipate  the  heat  inside  the  chamber.  The  125‐ml Wheaton bottles are placed on  top of plywood  (Figure 4C);  the magnets are  located underneath  the plywood;  and  the  rotors  are  attached  underneath  a  second  plywood  to  rotate  the magnets  so  the stirrers inside the Wheaton bottles can agitate the fluid as the rotors turn the magnets (Figure 4D). 

  Software.  The  PicoLog  is  the  software  developed  and  recommended  by  PicoTech.  The fermentation chamber shown in Figure 4 uses PicoLog to record the pressure signals from the ADC. The version of the PicoLog is 5.16.2. 

  Macro  and  micro  solutions.  The  phosphate‐bicarbonate  medium  and  reducing  solution  for macro  and micro  solutions  for  in  vitro  anaerobic  fermentation was based on Goering  and Van  Soest (1970). The macro solution  is made by mixing the  ingredients  listed  in Table 1  in 1 L of distilled water. The ingredients for the micro solution is shown in Table 1; mix all the ingredients and add distilled water to volumetrically complete 100 ml. Alternatively, the micro solution proposed by Schaefer et al. (1980) could also be used. The formula is shown in Table 2; the ingredients are mixed in 1 L of distilled water. Other media  used  for  in  vitro  of  various  gas  production  techniques were  discussed  by  Rymer  et  al. (2005); different media may affect final pH and volume of CO2 produced per ml of acid. 

  Calibration of  the pressure  sensors. The 125‐ml Wheaton  flasks were  incubated without  feed and rumen fluid to measure the response of the sensor to changes in the pressure inside the flasks. Ten ml of CO2 were  injected into the sealed‐flasks and voltage was measured. This process was repeated 8 times in order to generate enough data points to plot voltage readings on gas volume added. Two sets of flasks (22 flasks/set) were calibrated. The volume of the flasks were determined by adding water at 25oC until full. The volume of the stir and the rubber were discounted from the final volume. 

3  

  Calculation  of  the  volume  from  voltage  and  adjustment  of  the  gas  production  of  the  in  vitro fermentation  to  the gas production of blank  flasks. The raw voltage readings  (V) are converted  to gas volume  (ml)  using  individual  conversion  ratios  between  voltage  and  volume  obtained  during  the calibration of the pressure sensors. Usually, two blanks  (i.e. flaks without feed) are used to adjust the gas production due to fermentation of nutrients contained in the rumen fluid. The voltage measured in the blanks are converted to gas volume and averaged for each time point. This blank volume average is subtracted  from  the  volume  of  each  flask  for  each  time.  Concomitantly,  the  gas  volume  was  also normalized for the same amount of substrate, usually 100 g of DM, as shown in Equations [5] to [7]. 

( )0 , 100t t Blank tt

Adj

Voltage Voltage GasGas

Substrate=⎡ ⎤− ×Δ − ×⎣ ⎦=   [5] 

(,Blank t t tGas Voltage Voltage == − )0 ×Δ     [6] 

1000Adj AFSubstrate Substrate DM= × ×     [7] 

Where Gas is the gas produced, ml; Voltage is measured by the pressure sensor, V; Δ is the change in ml per change in voltage (Equation [13]), ml/V; and DM is dry matter of the substrate, fractional. 

  The  effect  of  adjustment  for  gas  production  was  investigated.  The  exponential model  with discrete lag (Equation [8]) was fitted to 19 gas production profiles of corn dry distillers’ grain (DDG) from 4 different types of DDG. The gas production profiles were either adjusted or not adjusted for the gas production of the mean of two blank flasks. The blank flasks contained media (phosphate‐bicarbonate buffer) and rumen fluid. The nls function (Bates and Chambers, 1993) of R 2.7.2 (R Development Core Team, 2008) was used to converge the data to Equation [8] using the “port” algorithm (Fox et al., 1978; Gay, 1990). 

( )(1 ); 00; 0

b t ca e tVt

− × −⎧ × − ∀ ≥= ⎨

∀ <⎩    [8] 

  A  random  coefficients model  (Littell  et  al.,  2006) was  fitted  to  the  parameter’s  estimates  of Equation [8],  including the sum of square of errors (SSE), to compare the  impact of the adjustment on the estimates using the function lme (Pinheiro and Bates, 2000) of R (R Development Core Team, 2008). The  following  R  code was  used  to  generate  the  lme  analysis,  to  check  for  the  normality,  identically distributed, and independency assumptions of the residuals, and to obtain the 95% confidence interval of the estimates in which type means adjusted or unadjusted values and ddg means the DDG type. 

> # load library nlme > library(nlme) > # mixed model analysis > lme.a<‐lme(fixed=a~type, data=data1, random=~1|ddg) > summary(lme.a) > # perform ANOVA analysis and F‐test > anova(lme.a) > # plot observed x fitted, residuals x predicted, and normality plot > plot(lme.a,a~fitted(.)) 

4  

> plot(lme.a) > qqnorm(lme.a,~resid(.)|ddg) > # compute the 95% confidence intervals for random and fixed variables  > intervals(lme.a) 

Results and Discussion 

  Material and cost. Table 3 has the list of material and cost for building a fermentation chamber with 11 pressure  sensors. The cost of  the  fermentation chamber was $ 4,235.84. This value does not include the material and labor involved in making the aluminum supporters for the pressure sensor and the stirrers ($ 300). Therefore, the fixed cost was $ 4,535.84 without labor. The cost for adding another ADC and additional 11 pressure sensors was about $ 1,044.04. The fixed cost for a 22‐pressure sensor would be about US$ 5,600. Additional fixed cost should be added such as IBM‐PC and accessories. 

  Calibration of the pressure sensors. The 125‐ml flask sets A and B had a linear response between voltage (V) and gas added to the flask (ml). The mean and SD of intercepts and slopes were 0.52 ± 0.02 V and 64.52 ± 3.74 ml/V, and 0.49 ± 0.02 V and 64.31 ± 2.2 ml/V; respectively. The volume of the flasks were 137.5 ± 1.16 and 137.9 ± 0.54 ml; respectively. These measurements were done on the same day. There is no clear evidence why the SD were different between these sets. Pell and Schofield (1993) have indicated a slope of 8.88 ml/V on 50‐ml Wheaton flasks. As discussed above, the relationship between voltage  and  pressure  of  the  pressure  sensor  and  ADC  used  is  0.32  V  at  0  atm  and  2.5  V  at  1  atm. Therefore, Equation [9] was obtained to indicate this relationship. 

Voltage,V 0.32 2.18 Pressure,atm= + ×     [9] 

  The ratio of the CO2 in the liquid phase to the CO2 in the gas phase is computed using Equation [10], using  the Henry’s  Law  to  compute pressure and volume  relationship of CO2  (Pell and Schofield, 1993; Schofield and Pell, 1995) and assuming 20 ml of liquid (media plus rumen fluid) in the flask. 

[ ][ ]

2

2

200.024620

Liquid

Gas

COR T

CO Flask Volume= × × ×

−  [10] 

Where R is the universal gas constant, 0.082 L∙atm/(mole∙K) and T is temperatue, oK. 

  If  X ml  of  gas  is  added  to  a  flask  containing  an  aqueous  solution,  some  of  it will  dissolve. Schofield  and  Pell  (1995) derived  Equation  [11]  to  compute  the  fraction of  remaining  gas  in  the  gas phase. 

[ ][ ]

2

2

1

1 Liquid

Gas

fCO

CO

=

+

    [11] 

  Thus, X ml of gas would produce a voltage change (ΔV) as indicated in Equation [12].  

5  

2.18Flask volume - 20

X fV × ×Δ =     [12] 

  Rearranging Equation [12], one can compute the ml produced per change in voltage as shown in Equation [13] (Schofield and Pell, 1995). 

Flask volume - 202.18

mlV f

=Δ ×

    [13] 

  Hence, assuming a temperature of 39 oC (312 oK: oK = oC + 273) and the flask volumes for set A and  B,  the  [CO2]Liquid/[CO2]Gas  (Equation  [10])  is  0.1072  and  0.1067  for  sets  A  and  B;  respectively. 

Therefore, f (Equation [11]) would be 0.9032 and 0.9036 for sets A and B; respectively, and the ml/ΔV (Equation  [13]) would be 59.7 and 59.9 ml/V;  respectively  for sets A and B. These values are 8.2 and 7.6% below the measured values (64.5 and 64.3 ml/V; respectively). This difference is likely caused by a greater proportion of CO2 going  into solution and differences among sensors. The  individual measured 

values are used to compute ml of gas produced per ΔV of each flask. Adjustments for methane can also 

be made  (Schofield and Pell, 1995); the calculated ml/ΔV values would be smaller than  those without methane adjustment. 

  Figure 5 depicts the fermentation dynamics measured as voltage and volume for alfalfa hay and dry distillers’ grain. The pattern of fermentation was not similar within the same feed likely because the adjustment for the gas production of the blank flasks might have changed the pattern. This may not be a valid direct comparison of the effect of adjustment. It is common to utilized the gas production of blank flasks  (i.e. flaks without feed but with media and rumen fluid) to correct for gas released from rumen fluid  substrates,  allowing  for  comparisons  between  incubations  completed  on  different  days  or  in different  batches  (Menke  and  Steingass,  1988).  Table  4  shows  a  direct  comparison  of  parameter estimates when  fitting Equation  [8] to  the gas production measurement with and without adjustment for gas production of  the average of  two blank  flasks. The unadjusted profiles had greater  (P < 0.01) asymptote (estimate a), fractional rate of fermentation (estimate b), and SSE; but had  lower (P < 0.01) lag time (estimate c) compared to adjusted profiles. Therefore, the pattern of fermentation  is changed when adjusting  for blank  flasks  fermentation. Carro et al.  (2005) have  reported  similar  impacts when adjusting gas production for blanks. These authors concluded that using blanks for correction purposes can  change  interpretation  of  results.  Despite  these  findings,  the  authors  suggested  the  inclusion  of blanks to compare gas production. Similarly, Rymer et al. (2005) concluded the gas production of blanks should not be subtracted from the gas production of the sample being tested because the dynamics of the fermentation are different, including the rate of fermentation (Cone, 1998). 

Future developments 

  Future developments should include more stable double‐function electrodes and measure pH at the  same  time pressure  is being measured.  In  addition,  a  special  electrode  to  concurrently measure ammonium  and  ammonia production  could be  used  to determine protein  fermentation  at  the  same time. 

6  

Acknowledgements    We would like to express our appreciation to the students that have contributed in one way or another with experimental and  laboratorial procedures of these projects. Special thanks for Dr. Judson Vasconcelos  and  Dr. Mario  Chizzotti  for  helping with  the  design  and  construction  the  fermentation chamber. 

Literature Cited 

Bates, D. M. and J. M. Chambers. 1993. Nonlinear Models. Pages 421‐454 in Statistical Models in S. J. M. Chambers and T. J. Hastie, ed. Chapman & Hall, New York. 

Carro, M. D., M. J. Ranilla, and M. L. Tejido. 2005. Using an in vitro gas production technique to examine feed additives: Effects of correcting values for different blanks. Animal Feed Science and Technology. 123‐124:173‐184. 

Cherney,  D.  J.,  J.  Siciliano‐Jones,  and  A.  N.  Pell.  1993.  Technical  note:  forage  in  vitro  dry  matter digestibility as influenced by fiber source in the donor cow diet. J. Anim. Sci. 71(5):1335‐1338. 

Cone,  J. W. 1998. The development, use and application of  the gas production  technique at  the DLO Institute for Animal Science and Health (ID‐DLO), Lelystad, The Netherlands. Pages 65‐78 in In vitro Techniques  for Measuring Nutrient Supply  to Ruminants. Occasional Publication No. 22, Penicuik, UK. British Society of Animal Science. 

Cone, J. W., A. H. Van Gerder, G. J. W. Visscher, and L. Oudshoorn. 1996. Influence of rumen fluid and substrate concentration on fermentation kinetics measured with a fully automated time related gas production apparatus. Animal Feed Science and Technology. 61:113‐128. 

Fox,  P.  A.,  A.  P.  Hall,  and  N.  L.  Schryer.  1978.  The  PORT  mathematical  subroutine  library.  ACM Transactions on Mathematical Software (TOMS). 4(2):104‐126. 

Gay,  D. M.  1990.  Usage  summary  for  selected  optimization  routines.  Computing  Science  Technical Report.  No.  153.  AT&T  Bell  Laboratories, Murray  Hill,  NJ.  21  p.  Available  at:  http://netlib.bell‐labs.com/cm/cs/cstr/153.pdf. 

Goering, H. K. and P.  J. Van  Soest. 1970.  Forage  fiber analysis: Apparatus,  reagents, procedures, and some applications. Agric. Handbook. No. 379. ARS, USDA, Washington, DC. 1‐20 p. 

Huntington,  J. A. and D.  I. Givens. 1995. The  in  situ  technique  for  studying  the  rumen degradation of feeds: A review of the procedure. Nutrition Abstracts and Reviews (Series B). 65(2):63‐93. 

Littell, R. C., G. A. Milliken, W. W. Stroup, R. D. Wolfinger, and O. Schabenberger. 2006. SAS for Mixed Models (2nd ed.). SAS Institute, Cary, NC. 

Menke, K. H. and H.  Steingass. 1988. Estimation of  the energetic  feed  value obtained  from  chemical analysis and in vitro gas production using rumen fluid. Animal Research and Development. 28:7‐55. 

Nocek,  J.  E.  1988.  In  situ  and  other methods  to  estimate  ruminal  protein  and  energy  digestibility:  a review. J. Dairy. Sci. 71:2051‐2069. 

Pell,  A.  N.  and  P.  Schofield.  1993.  Computerized  monitoring  of  gas  production  to  measure  forage digestion in vitro. J. Dairy. Sci. 76:1063‐1073. 

Pinheiro, J. C. and D. M. Bates. 2000. Mixed‐Effects Models in S and S‐Plus. Springer, New York. R  Development  Core  Team.  2008.  R:  A  language  and  environment  for  statistical  computing.  R 

Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. Rymer, C.,  J. A. Huntington, B. A. Williams, and D.  I. Givens. 2005.  In vitro cumulative gas production 

techniques:  History,  methodological  considerations  and  challenges.  Animal  Feed  Science  and Technology. 123‐124:9‐30. 

7  

8  

Sayre,  K. D.  and  P.  J. Van  Soest.  1972. Comparison of  Types of  Fermentation Vessels  for  an  In Vitro Artificial Rumen Procedure. J. Dairy. Sci. 55(10):1496‐1498. 

Schaefer, D. M., C.  L. Davis, and M. P. Bryant. 1980. Ammonia  saturation  constants  for predominant species of rumen bacteria. J. Dairy. Sci. 63:1248‐1263. 

Schofield,  P.  1996.  An  inexpensive  incubator  for  the  biology  laboratory.  American  Biology  Teacher. 58:494‐498. 

Schofield, P. and A. N. Pell. 1995. Validity of using accumulated gas pressure readings to measure forage digestion in vitro: A comparison involving three forage. J. Dairy. Sci. 78:2230‐2238. 

Tilley,  J. M. A. and R. A. Terry. 1963. A  two‐stage  technique  for  the  in vitro digestion of  forage crops. Journal of the British Grassland Society. 18:104‐111. 

Vanzant,  E.  S.,  R.  C.  Cochran,  and  E.  C.  Titgemeyer.  1998.  Standardization  of  in  situ  techniques  for ruminant feedstuff evaluation. J. Anim. Sci. 76:2717‐2729. 

Varel, V. H. and K. K. Kreikemeier. 1995. Technical note: Comparison of  in vitro and  in situ digestibility methods. J. Anim. Sci. 73:578‐582. 

  

 

A B

CD

Figure 1. Pictures of the (A) computerized gas production boxes (blue and red) developed at Cornell University, Ithaca, NY, (B) detail of the inside of the blue box, (C) incubation undergoing in the red box , and (D) detail of the pressure sensor (see Pell and Schofield, (1993)).

9  

     

A

B

 

C

Figure 2. Elements used to build a fermentation chamber: (A) pressure sensor and connections, (B) analog‐to‐digital converter card from PicoTech, (C) built printed circuit board showing the details of the voltage dividers and the terminal board from PicoTech. 

10  

 

Figure 3. Generalized electronic circuit for voltage divider. 

 

11  

 

   

A B

   

C D

Figure 4. Picture of (A) the outside of the fermentation chamber and IBM‐PC, (B) the inside of the fermentation chamber, showing 250‐ml Wheaton flasks, pressure sensors, and cables with a capacity to ferment 22 samples, (C) support for 120‐ml Wheaton flaks, and (D) stirrer’s 

rotors (four) with a switch (top right).

12  

1 2 

3 

4 

5 

Figure 5. Fermentation dynamics of alfalfa and dry distillers’ grain measured as voltage (unadjusted for blank) and volume (adjusted for blank). 

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

0

5

10

15

20

25

30

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48

Voltage, V

Gas volum

e, m

l

Time, h

Alfalfa ‐ Adj DDG ‐ Adj. Alfalfa ‐ Unadj. DDG ‐ Unadj.

Unadjusted

Adjusted

 

 

   

13  

6 7 

Table 1. Macro and micro solutions for in vitro anaerobic fermentation of feeds proposed by Goering and Van Soest ((1970)) 

Formula  Chemical  Quantity Code Price (US$)  Cost (US$/g)Macro solution        Na2HPO4  Sodium phosphate dibasic 5.7 g S 374‐ 500g 74.02 (500g)  0.148   KH2PO4  Potassium phosphate monobasic 6.2 g P 284‐ 500g 44.72 (500g)  0.089   MgSO4.7H2O  Magnesium sulphate heptabasic 0.6 g M 63‐ 500g 98.51 (500g)  0.197     Micro solution        CaCl2.2H2O  Calcium chloride  13.2 g C 79‐ 500g 71.47(500g)  0.143   MnCl2.4H2O  Manganese chloride  10 g M 87‐ 100g 36.90 (100g)  0.369   CoCl2.6H2O  Cobalt chloride  1.0 g C 371‐ 100g 79.98 (500g)  0.799   FeCl3.6H2O  Ferric chloride  8.0 g I 88‐ 500g 104.43 (500g)  0.21

8 

9 

10 

11 

12 

Average cost of the macro solution is US$ 1.51/l and the micro solution is US$ 80.50/l. 

 

 

 

Table 2. Micro solution for in vitro anaerobic fermentation of feeds used by Schaefer et al. ((1980)) 

Formula  Chemical  Quantity Code Price (US$)  Cost (US$/g)

Na4 EDTA  Sodium EDTA  500 mg S 657‐ 500g 125.91(500g)  0.25FeSO4.7H2O  Ferrous sulfate heptabasic 200 mg I 146‐ 500g 92.50 (500g)  0.185MnCl2.4H2O  Manganese chloride 200 mg M 87‐100g 36.90 (100g)  0.369ZnSO4.7H2O  Zinc sulfate heptabasic 10 mg Z 76‐ 500g 56.50 (500g)  0.113H3BO3  Boric acid  30 mg A 74‐ 500g 73.16 (500g)  0.146CoCl2.6H2O  Cobalt chloride hexabasic 20 mg C 371‐ 100g 79.98 (100g)  0.8CuCl2.2H2O  Cupric chloride  1 mg C 454‐ 500 g 112.02 (500g)  0.224NiCl2.6H2O  Nickel chloride  2 mg N 53‐ 500g 78.45 (500g)  0.157NaMoO4.2H2O  Sodium molybdate  3 mg S 336‐ 500g 342.50 (500g)  0.685

13 

14 

15 

Average cost of the micro solution is US$ 0.26/l. 

 

   

14  

15  

16  Table 3. Cost (US$) and material used to build the fermentation chamber with 11 pressure sensors 

Description  Cost  Q TotalWood chamber      1 1/2'' dec choice   1.86  1 1.86   1/2 pt amer acct  3.48  1 3.48   1/2x4x8 blondewood  24.93  1 24.93   1/2x4x8 sheath r  10.38  1 10.38   12‐10awg 8‐10s te  1.88  1 1.88   12'x 1/2'' powerl  7.44  1 7.44   16oz titebond ori  3.98  1 3.98   1x2x4' select pin  1.98  1 1.98   1x2x4' select pin  1.98  3 5.94   1x3x4' select pin  3.30  1 3.30   2'' foam   0.57  2 1.14   2.8 oz silicone I  3.28  1 3.28   2‐1/2 sfty hasp z  2.30  1 2.30   3'' foam  0.74  1 0.74   3'' Trim Roller sh  1.98  1 1.98   3/4X20X48 stain g  18.03  1 18.03   3‐1/2 FM Hinges B  5.88  1 5.88   3‐1/2 hinges sb/p  8.88  3 26.64   4x1/2 ph fl wood  2.95  1 2.95   5 pk 9x11 Bare wood  2.17  1 2.17   5.2 mm type 1 ext  9.69  1 9.69   60ut.1000jsurge  12.46  1 12.46   60W DL clear 2pk  3.28  1 3.28   6‐1/2 pull zn  2.18  2 4.36   Assorted lighted   16.97  1 16.97   Bosch # 1 Phillips  2.78  1 2.78   Cleat receptacle  2.60  1 2.60   Cleat receptacle  2.60  1 2.60   Commercial grade  1.97  1 1.97   Drywall screw fin  4.47  1 4.47   Fan axial 30 cfm 115 v  22.24  2 44.48   Gang nm handy  0.63  2 1.26   Gear motor, 30 rpm 115 vac  41.42  4 165.68   Handy box duplex  0.44  2 0.88   Hole saw 2 1/4''  4.97  1 4.97   Hole saw 2 3/4'' B  17.47  1 17.47   Instant change ut  9.88  1 9.88   Jh .85 Oz Quickse  2.97  1 2.97   Knob rd porcelain  1.68  1 1.68   Large hook  2.97  2 5.94   M‐P Foam tape 3/8   2.88  2 5.76   Qt. amer. Trad ext.  9.97  1 9.97   Resi receptable 2  0.44  2 0.88   Sp Black shield D  9.97  1 9.97   Thermostat/Temp.  control  53.78  1 53.78   Toggle switch  3.96  1 3.96   Toggle, spst  3.82  1 3.82 TOTAL 534.81 CO2 set up      Fitting ss 1/8''  51.25  6 307.50   Tee 1/8" 316ss ea   19.00  4 76.00   Adapter 1/8"x1/8"   6.00  6 36.00   Fitting  hose to male luer    23.00  5 115.00   Tubing viton 1/4x5/16" 25'    66.00  1 66.00   Ratchet tubing clamps  40.00  1 40.00   Needle blunt end 18gx6"  109.50  1 109.50   Fitting adapt.1/8"x1/4" 1/pk  23.00  6 138.00 TOTAL 888.00  

Description Cost  Q TotalChamber electronics  

6' SHLD RS232 M‐F 13.99  1 13.99Hose clamp pincers‐standard  26.10  1 26.10Hose clamps s/s 2.45  1 2.45Hose clamps s/s (pack with 10)  19.55  2 39.10Male luer w/locking nut 3/32''  4.25  3 12.75Mini voltage pressure sensors  60.00  1 60.00Mini voltage pressure sensors  40.00  15 600.00PVC tubing 3/32'' 2.65  1 2.65USB 11/12 with terminal board  287.00  1 287.00

TOTAL 1044.44 Other Electronics  

AC power cable plug 15A 250V  2.68  2 5.36Antex soldering iron g/3u 20.48  1 20.48Antex solder iron tip#8‐1 4.38  1 4.38Box alum 7''x5''x3'' CU‐3008A  8.06  2 16.12Cable 3 conductor 22AWG shield  0.32  60 19.20Hi rel 8 pin socket  0.37  30 11.10Socket solder tail 8dip 208‐G49d  0.11  1 0.11Multimeter m‐3800 3 1/2 digital  49.97  1 49.97Nylon nut 6‐32 0.09  8 0.72Nylon screw 6‐32x3/4 0.09  8 0.72Phone plug min 3‐con 0.66  22 14.52Phone plug min 3‐con 0.60  2 1.20Phone plug min 3‐con 0.60  10 6.00Phone socket min 2‐cond open  0.49  2 0.98Phone min 3‐cond 33‐724 0.62  22 13.64Phone min 3‐cond 33‐724 0.62  11 6.82Protoboard JE‐25 wide for 25‐IC  22.44  1 22.44Protoboard copper‐clad perf bd   6.88  2 13.76Protoboard copper‐clad perf bd   6.88  1 6.88Resistor carb 1/4W 5% (10R‐2M)  0.04  30 1.20Resistor carb 1W 5% (.1R‐10M)  0.19  4 0.76Resistor carb 1W 5% (10R‐22M)  0.04  30 1.20Solder 63/37 .025" kester 10.29  1 10.29Solder iron holder  12.39  1 12.39Switch min toggle 1P on/on 1.5A  1.68  2 3.36Test lead set min clips 6.12  1 6.12Transformer 12vdc 500mA 3.5  6.38  2 12.76Trimpot 15turn 3/4'' 3006P‐1  1.42  4 5.68Trimpot single 200k 3386Y‐1  1.08  30 32.40Trimpot single 5k 3386Y‐1 1.06  30 31.80Washer nylon #6 0.04  8 0.32wire hookup 24AWG 1550 0.08  45 3.60Wire jumper kit 22AWG assorted  17.80  1 17.80Wire solid for wire wrap 0.11  2 0.22

TOTAL 354.30 Laboratory material  

Al weighing dish (F08‐732‐101)  15.30  3 45.90Decrimpers  171.92  1 171.92Gloves ‐ Fisher 19‐048‐557D 268.92  1 268.92Hand crimpers (10‐319‐490) 171.66  1 171.66Lubriseal (stopcock grease) 19.66  1 19.66Magnetic stir bar (F14‐511‐60B)  66.90  1 66.90Needle (14‐826D) 7.93  2 15.86Stopper (06‐406‐11B) 98.32  1 98.32Stoppers ($0.37 x 600) 222.00  1 222.00Aluminum seal (06‐406‐14B) 48.55  1 48.55Wheaton 125 ml (06‐406K) 285.00  1 285.00

TOTAL 1414.69 OVERALL TOTAL 4235.84  

Table 4. Comparison of parameter estimates of an exponential model with discrete lag to gas production measurement with and without adjustment for gas production of the blank flasks for four 

types of corn dry distillers’ grain using random coefficients model 

Item Adjusted Unadjusted SEM P-value AIC σDDG σ a, ml 21.5 29.1 1.75 < 0.001 137 3.45 1.11 b, %/h 9.86 10.8 0.56 0.0032 -213 0.01 0.0092 c, h 0.25 0.01 0.07 0.0001 -6.27 0.106 0.172 Fitting SSE, ml2 98.5 189 35.6 0.0001 422 65.1 63.1

 

16