Deteksi butirilkolinesterase varian C5+dengan elektroforesis poliakrilamid

Elly Herwana*, Franciscus D. Suyatna**, Rianto Setiabudy**

*Bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Trisakti,**Bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia

ABSTRACT

Butyrylcholinesterase (BChE) is an enzyme which involved in the metabolism of succinylcholine. Alterationin enzyme activity influenced the duration of action of succynilcholine. The objective of this study is to find outthe distribution of C5+ variant of BChE and its relation to the increase of enzyme activity. Polyacrylamide gelelectrophoresis (PAGE) was used to detect C5+ variant of BChE. The measurement of butyrylcholinesteraseactivity was also done in this study. The study was done on 246 individuals from Javanese ethnic residing inJakarta. Variant C5+ was characterized by PAGE developed by Laemmli, and BChE activity determined by themethods developed by Kallow. PAGE identified 54 individuals (22%) with C5+ and 192 individuals (78%) withC5-. The distribution of BChE activity using benzoylcholine as substrate, ranged between 450 u/l – 1380 u/l, 19individuals (7,7%) had low enzyme activity. Related to C5+ variant, it was found that the mean enzyme activityof C5+ was slightly higher than that of C5-. The average level activity of BChE ( ± SD) of C5+ variant and C5-were 987,77 u/l ± 205,59 and 942,76 u/l ± 168,69 respectively. Statistical analysis using t-test showed that thedifference was not statistically significant.

Key words: Butyrylcholinesterase, PAGE, C5+ variant

ABSTRAK

Butirilkolinesterase (BChE) merupakan enzim yang berperan dalam metabolisme suksinilkolin. Perubahanaktivitas enzim mempengaruhi lama kerja suksinilkolin. Tujuan penelitian ini adalah untuk mendapatkan datadistribusi fenotip BChE varian C5+ dan hubungannya dengan peningkatan aktivitas enzim. Polyacrylamide GelElectrophoresis (PAGE) digunakan untuk mendeteksi BChE varian C5+. Penelitian ini dilakukan pada 246individu suku bangsa Jawa yang tinggal di Jakarta. PAGE dilakukan menurut metode Laemmli, dan pengukuranaktivitas BChE dilakukan menggunakan substrat benzoilkolin menurut metode Kallow. Hasil PAGE menunjukkan54 individu (22%) dari 246 sampel adalah varian C5+, dan 192 individu (78%) adalah C5-. Hasil pengukuranaktivitas BChE bervariasi antara 450-1360 u/l, sebanyak 19 individu (7,7%) menunjukkan aktivitas di bawahnilai normal. Dikaitkan dengan varian C5+ dan C5-, aktivitas enzim pada varian C5+ tampak lebih tinggi dariC5-. Rata-rata aktivitas BChE ± SD pada C5+ dan C5- adalah 987,77 ± 205,59 u/l dan 942,76 ± 168,69 u/l.Analisis statistik dengan uji-t tidak menunjukkan perbedaan yang bermakna antara aktivitas BChE pada varianC5+ dan C5-.

Kata kunci : Butirilkolinesterase, PAGE, varian C5+

PENDAHULUAN

Sejak tahun 1951 suksinilkolin telah digunakansebagai pelemas otot. Pada penggunaannya sebagaiajuvan pada anestesi umum, suksinilkolinmemberikan efek paralisis otot yang kuat, dengan

masa pemulihan yang cepat, dan efek samping yangsedikit/ringan. Setelah obat ini banyak digunakantimbul masalah karena pada beberapa pasiendijumpai pemanjangan efek suksinilkolin yang

1

J Kedokter Trisakti Januari-April 2002, Vol.21 No.1

disertai dengan efek henti nafas yang lebih lama.Kallow dkk.(1,2,3) menemukan bahwa kelainan iniberkaitan dengan aktivitas enzimbutirilkolinesterase.

Butirilkolinesterase (BChE) merupakan enzimdalam serum yang berperanan dalam metabolismesuksinilkolin.(3,4) Pada pemberian suksisnilkolinsecara intravena, dalam waktu satu menit maka 90%obat telah dimetabolisme oleh enzim BChE menjadisuksinilmonokolin dan kolin yang inaktif.(4) Dengandemikian kadar suksinilkolin yang mencapaireseptor motor endplate pada membran sel ototkadarnya jauh lebih rendah dari dosis pemberianobat. Hal ini menyebabkan suksinilkolin mempunyaimula kerja obat (onset of action) dan masa kerjaobat (duration of action) yang sangat singkat. Jikaterjadi perubahan aktivitas enzim BChE, maka halini akan sangat mempengaruhi masa kerja darisuksinilkolin. Bilamana terdapat gangguan afinitassuksinilkolin dengan BChE, metabolisme obat akandihambat. Selanjutnya reseptor menerima kelebihandosis yang sangat besar sehingga efek henti nafasyang pada keadaan normal hanya berlangsungantara 1-6 menit akan berlangsung lebih lama.(3,4)

Sebaliknya bilamana terdapat peningkatan aktivitasBChE maka efek suksinilkolin akan berlangsunglebih singkat.

Ada beberapa metode pemeriksaan yang dapatdigunakan untuk mengukur aktivitas enzim BChEdan mengidentifikasi variasi genetik BChE. Proteinenzim BChE dapat diidentifikasi melaluipemeriksaan elektroforesis yang akan memberikangambaran berupa pita-pita protein.(5,6) Padapenelitian ini akan dilakukan identifikasi BChEvarian C5 dengan pemeriksaan elektroforesispoliakrilamid (Polyacrylamide gel electrophoresis= PAGE).

Penelitian ini bertujuan untuk mendeteksidistribusi fenotip BChe varian C5+ denganmenggunakan pemeriksaan elektroforesispoliakrilamid pada suatu populasi suku Jawa yangtinggal di Jakarta.

BAHAN DAN CARA

SubyekPenelitian ini dilakukan pada 246 sampel darah

yang diperoleh dari donor darah sukarela pria danwanita di PMI DKI Jaya. Kriteria pengikutsertaansubyek adalah pria/wanita dewasa sehat yangdatang sebagai donor darah sukarela di PMI DKIJaya, suku Jawa, dan tidak minum obat apapunminimal 1 minggu sebelum melakukan donor darah.

BahanDari tiap subyek diambil 5 ml darah vena,

darah dicampur dengan 2 tetes Heparin (Leo) 1250unit/ml, dan disentrifus dengan kecepatan 1500 rpmselama 15 menit. Plasma dipisahkan dan disimpanpada suhu -20°C hingga saat pengukuran.

Pengukuran aktivitas BChEAktivitas BChE diukur berdasarkan nilai

absorbans pada spektrofotometer (Perkin Elmer)dari campuran 1,25 ml buffer fosfat (0,355 M, pH7,4), 0,75 ml substrat benzoilkolin (2.10-4 M), dan1 ml plasma (0,3 ml plasma diencerkan dalam 10ml buffer fosfat).

Pemeriksaan elektroforesis gel akrilamidPemeriksaan PAGE dilakukan menurut metode

Laemmli,(7) tanpa SDS (sodium dodecyl sulfate) danmerkapto etanol. Gel pemisah dibuat dari 5 mllarutan akrilamid 30%, 3,3 ml larutan Tris HCl 2M, dan 8,2 ml H

2O, 40 µl ammonium persulfat 10%,

dan 10 µl temed. Gel sampel dibuat dari 0,5 mllarutan akrilamid 30 %, 0,6 ml tris HCl 0,5 M, 3,9ml H

2O, 10 µl ammonium persulfat 10%, dan 2,5

µl temed. Larutan bufer elektroforesis dibuat dari3,03 g Tris HCl, 14,4 g glisin, ditambahkan H

2O

hingga l. Larutan buffer sampel dibuat dari 12 mllarutan Tris HCl 0,5 M. 10 g sukrosa, 0,5 mlbromfenol biru 0,2%, dan H

2O hingga 50 ml. Untuk

setiap sampel yang diperiksa, dibuat campuran 15ul buffer sampel dan 3 ul plasma, lalu dipipetkanke dalam sumur gel. Elektroforesis dijalankandengan aliran listrik 70 mA selama 4 jam pada suhuruang. Untuk pewarna digunakan larutan Fast red.Gel poliakrilamid dilepaskan dari cetakannya dandirendam di dalam larutan Fast red pada suhu ruanghingga terbentuk gambaran pita-pita protein yangberwarna kemerahan pada gel. Dari gambaran pitaprotein yang terbentuk pada gel dapat diidentifikasivarian C5.

Herwana, Suyatna, Setiabudy Butirilkolinesterase varian C5+

2

Penentuan fenotip BChE varian C5 secara PAGEC5- : memberikan gambaran 4 pita protein

pada gel poliakrilamidC5+ : memberikan gambaran 5 pita protein

pada gel poliakrilamid

Analisis statistikDilakukan analisis statistik dengan uji t (t-test)

untuk menguji perbedaan rata-rata aktivitas BChEantara varian C5+ dan C5-.

HASIL PENELITIAN

1. Aktivitas BChEHasil pengukuran aktivitas BChE dengan

substrat benzoilkolin pada 246 sampel menunjukkanaktivitas antara 450 – 1380 u/l. Nilai normal untukaktivitas BChE dengan substrat benzoilkolin adalahantara 690 – 1560 u/l. Sebanyak 227 individu (92,3%) menunjukkan aktivitas BChE normal dan 19individu (7,7 %) dengan aktivitas BChE di bawahnilai normal.

2. Elektroforesis gel poliakrilamidButirilkolinesterase varian C5+ diidentifikasi

dari gambaran pita protein yang terbentuk padamedia elektroforesis. Dengan menggunakan substratalfa naftil asetat dan pewarna fast red protein BChEtampak sebagai pita- pita protein yang berwarnamerah. Dari seluruh sampel yang diperiksa terdapatminimal 4 pita protein dan diidentifikasi sebagaivarian C5-, dan sampel yang memberikan gambaran5 pita protein diidentifikasi sebagai varian C5+.(Lihat Gambar 1).

Hasil pemeriksaan elektroforesis gelpoliakrilamid pada 246 sampel menunjukkan 54individu (22 %) dengan varian C5+, dan 192individu (78 %) adalah C5-. Pengukuran aktivitasBChE dengan substrat benzoilkolin, didapatkannilai rata-rata aktivitas BChE pada varian C5+ lebihtinggi daripada C5-. Nilai rata-rata aktivitas BChE(± SD) pada varian C5+ adalah 987,77 u/l ± 205,59dan untuk C5- adalah 942,76 u/l ± 168,69.

Analisis statistik dengan uji-t (t-test)menunjukkan tidak ada perbedaan yang bermaknaantara aktivitas BChE pada varian C5+ dan C5-(p>0,05).

J Kedokter Trisakti Vol.21 No.1

3

Gambar 1. Hasil elektroforesis gel poliakrilamid

PEMBAHASAN

Analisis kelainan genetik enzim BChE telahdilakukan di banyak negara, tetapi data untukpopulasi Indonesia belum ada. Beberapa fenotipvariasi genetik BChE telah berhasil diidentifikasi.Kallow dkk.(1,2,3) yang pertama kali mengamati halini dan mengidentifikasi varian atipik yang berkaitanaktivitas BChE yang rendah. Untuk mendeteksivarian atipik ini Kallow(1,2) menggunakan ujiinhibitor dengan dibukain. Harris dan Whittaker(8)

menggunakan natrium fluorida sebagai inhibitor danmengidentifikasi varian resisten fluorida. Liddell(9)

menemukan varian S (Silent) dengan aktivitas enzimyang sangat rendah. Bartels dkk.(10,11,12) menemukanvarian J, varian K, dan varian H yang secarakuantitatif menunjukkan penurunan aktivitas enzimakibat perubahan dalam sintesis atau stabilitasnyasehingga terjadi penurunan jumlah molekul enzimdalam plasma. Hampir semua variasi genetiktersebut di atas berkaitan dengan aktivitas BChEyang lebih rendah, dan varian-varian tersebut dapatdideteksi melalui uji inhibitor dengan dibukain,natrium fluorida, propranolol, atau Ro2-0683(dimetil karbamat 2 hidroksi-5 fenilbenzil-trimetil-amonium bromida).(1,2,8,13,14) Fenotip BChE varianC5+ merupakan varian fenotip BChE yang berbedadari varian yang lain. Varian C5+ tidak dapatdideteksi dengan uji inhibitor dan hanya dapatdideteksi melalui pemeriksaan elektroforesis.(5)

Ada 2 macam pemeriksaan elektroforesis yangdapat digunakan untuk mendeteksi proteinbutirilkolinesterase yaitu elektroforesis agar(Agarose electrophoresis) dan elektroforesispoliakrilamid.(5,6) Simpson(15) telah membandingkanpemeriksaan eletroforesis agar denganelektroforesis poliakrilamid untuk mengidentifikasifenotip C5+ pada populasi Kaukasus, Indian, danEskimo. Hasilnya menunjukkan bahwa pemeriksaanelektroforesis poliakrilamid 25% lebih sensitifdaripada elektroforesis agar.

Pada penelitian ini dilakukan pemeriksaanelektroforesis poliakrilamid menurut metodeLaemmli(7) dengan substrat alfa naftil asetat danpewarna fast red. Pada varian C5- memperlihatkan4 pita protein yang dinamakan C1, C2, C3, danC4, sementara pada varian C5+ terdapat pita protein

tambahan yang dinamakan pita protein C5.(5,6,16)

Pada awalnya diduga varian C5+ ini ditentukan olehlokus genetik dari kromosom yang berbeda denganenzim BChE.(4) Lokus genetik yang mengkodeenzim BChE ada pada pada kromosom 3, sementarauntuk varian C5+ semula diduga berasal darikromosom 16. Dengan demikian diperkirakan ada2 lokus genetik untuk BChE yaitu lokus E

1 pada

kromosom 3 yang menentukan fenotip BChE danlokus E

2 pada kromosom 16 yang menentukan

varian C5+. Masson dkk.(17) membuktikan bahwahanya ada satu gen untuk BChE yaitu lokus E

1 pada

kromosom 3, keberadaan lokus E2 untuk BChE

tidak terbukti. Pita protein C5, kemungkinanmerupakan gabungan dari protein BChE denganprotein lain yang belum teridentifikasi. Lokus E

2

mungkin spesifik untuk protein yang belumdiketahui ini.(17)

Hasil pemeriksaan elektroforesis poliakrilamidpada 246 subyek dalam penelitian ini menghasilkan54 subyek (22%) dengan varian C5+ dan 192subyek (78%) adalah C5-. Pada populasi Kaukasusfrekuensi varian C5+ berkisar antara 8-10%.(17)

Harris dkk.(6) mendapatkan frekuensi varian C5+yang lebih rendah pada populasi Inggris yaitu 5%,dan pada populasi Tristan da Cunha didapatkan17 %.

Hasil penelitian ini juga mendapatkan bahwaaktivitas BChE rata-rata pada varian C5+ lebihtinggi daripada aktivitas enzim pada C5-. Tetapipada uji stasistik didapatkan perbedaaan tidakbermakna. Beberapa peneliti juga mendapatkanaktivitas BChE yang lebih tinggi untuk varian C5+,tetapi uji statistiknya menunjukkan perbedaan yangbermakna. Hal ini mungkin disebabkan karena hasilpenelitian ini menunjukkan variasi aktivitas BChEyang terlalu besar. Banyak faktor yang dapatmempengaruhi aktivitas BChE, seperti penyakithati, malnutrisi, karsinoma, obat-obatan, ataupenggunaan insektisida organofosfat.(4,18)

Penelitian Harris dkk.(6) membandingkan aktivitasBChE, fenotip BChE, dan varian C5 pada 248sampel dari populasi Inggris dan 213 sampel daripopulasi Tristan da Cunha. Hasilnya menunjukkanbahwa pada populasi Inggris didapatkan 9 fenotipBChE heterozigot normal atipik dan 13 varian C5+(5%) yang seluruhnya berasal dari fenotip BChE

Herwana, Suyatna, Setiabudy Butirilkolinesterase varian C5+

4

normal. Sedangkan pada populasi Tristan da Cunhatidak dijumpai variasi genetik fenotip BChE tetapifrekuensi varian C5+ didapatkan lebih tinggi yaitu36 sampel (17%). Subjek penelitian Harris dkk.(6)

mencakup jumlah pria dan wanita yang seimbangdari berbagai kelompok usia (0-4 tahun hingga 85-89 tahun). Tidak ditemukan perbedaan bermaknadalam frekuensi varian C5+ antara pria dan wanitamaupun antara kelompok usia yang berbeda.

Pada penelitian ini didapatkan frekuensi varianC5+ juga cukup tinggi yaitu 22%. Penelitian yangdilakukan sebelumnya pada sampel yang sama tidakmenemukan variasi genetik fenotip BChE pada sukuJawa.(19,20) Pada penelitian ini tidak dapat dianalisisperbedaan frekuensi varian C5+ pada pria danwanita atau pengaruh usia, karena sampel penelitianini diambil dari donor darah sukarela di PMI yanghampir seluruhnya adalah pria dewasa.

KESIMPULAN

Pemeriksaan elektroforesis yang telahdilakukan pada 246 sampel dari suatu populasi sukuJawa di Jakarta mengidentifikasi 54 individu (22%)adalah varian C5+ dan 192 individu (78%) adalahC5-. Aktivitas BChE rata-rata pada varian C5+didapatkan lebih tinggi daripada aktivitas enzimrata-rata pada subyek dengan C5-. Tidak terdapatperbedaan bermakna antara aktivitas BChE padavarian C5+ dan C5-.

Daftar Pustaka

1. Kallow W, Lindsay HA. A comparation of opticaland manometric methods for the assay of humanserum cholinesterase. Canad J Biochem 1955;33:568-74.

2. Kallow W, Staron N. On distribution andinheritance of atypical forms of human serumcholinesterase as indicated by dibucaine numbers.Canad J Biochem 1957; 35:1305-21.

3. Kallow W, Gunn DR. The relation between doseof succynilcholine and duration of apnea in man.J Pharm Exp Ther 1957; 120:203-14.

4. Lockridge O. Genetic variants of human serumbutyrylcholinesterase influence the metabolism ofthe muscle relaxant succinylcholine . In: KallowW, editor. Pharmacogenetics of drug metabolism.

New York:P ergamon Press; 1992.p.15-47.5. Harris H, Hopkinson DA, Robson EB. Two-

dimentional electrophoresis ofpseudocholinesterase components in normalhuman serum. Nature 1962; 196:1296-8.

6. Harris H, Hopkinson DA, Robson EB, WhittakerM. Genetical studies on a new variant of serumcholinesterase detected by electrophoresis. AnnHum Genet 1963; 26:359-82.

7. Laemmli UK. Cleavage of structural proteinsduring the assembly of the head of bacteriophageT4. Nature 1970; 227:680-5.

8. Harris H, Whittaker M. Differential inhibition ofhuman serum cholinesterase with fluoriderecognation of two phenotypes. Nature 1961;191:496-8.

9. Liddell J. A ‘silent’ pseudocholinesterase gene.Nature 1962; 193:561-2.

10. Bartels CF, James K, La Du BN. DNA mutationassociated with human butyrylcholinesterase J-variant. Am J Hum Genet 1992; 1104-14.

11. Bartels CF, Jensen FS, Lockridge O, van der SpeckAF, Rubinstein HM, Lubrano T et al. DNAmutation associated with the humanbutyrylcholinesterase K-variant and its linkage tothe atypical variant mutation andpolymorphicsites. Am J Hum Genet 1992;50:1086-103.

12. Jensen FS, Bartels CF, La Du BN. Structural basisof the butyrylcholinesterase H-variant segregatinin two Danish families. Pharmacogenetics 1992;2:234-40.

13. Prester L, Simeon V. Kinetics of the inhibition ofhuman serum cholinesterase phenotypes with thedimetylcarbamate of (2-hydroxy-5-phenylbenzyl)-trimetylammonium bromide (Ro-0683). BiochemPharmacol 1991;42:2313-6.

14. Whittaker M, Britten JJ, Wicks RJ. Inhibition ofplasma cholinesterase variants by propranolol. BrJ Anaesth 1981; 53:511-6.

15. Simpson NE. Polyacrylamide electrophoresis usedfor the detection of C5+ cholinesterase inCanadians Caucasians Indians and Eskimos. AmJ Hum Genet 1972; 24:317-20.

16. Ashton GC, Simpson NE. C5 types of serumcholinesterase in a Brazilian population. Am JHum Genet 1966; 18(5):438-47.

17. Masson. P, Chatonnet A, Lockridge O. Evidencefor a single butyrylcholinesterase gene in

J Kedokter Trisakti Vol.21 No.1

5

Herwana, Suyatna, Setiabudy Butirilkolinesterase varian C5+

individuals carrying the C5 plasma cholinesterasevariant (CHE2). FEBS Lett. 1990; 262:115-8.

18. La Du BN. Overview of pharmacogenetics. In:Kallow W, editor. Pharmacogenetics of drugmetabolism. New York:Pergamon Press;1992. p1-12.

19. Herwana E, Suyatna FD, Setiabudy R. Distribusi

aktivitas butirilkolinesterase pada suatu populasisuku Jawa di Jakarta. J Kedokter Trisakti 2001;20:42-8.

20. Suyatna FD, Setiabudy R, Herwana E, TjandraO. Butyrylcholinesterase and C5+ variant in aJavanese ethnic group in Indonesia. Int J ClinPharm Ther 2000; 38:339-44.

6