Students: Ana María Ortiz Gil Estefanía Lopera Velosa

Molecular Biology

III semester UPB

INTRODUCTION

• The recurrent miscarriage is a condition where a woman has had a frequently expontaneous loss of 3 or more pregnancies before the 20th gestational week.

•It has been associated to multicausal factors such as genetic, uterine, thrombotic and/or autoinmune system.

•None of these factors are highly related and they might be found on patients with normal reproductive activity. (1)

INTRODUCTION

1. Genetic factors: -Aneuploidy -Parental anormalities

Factors related to Recurrent Miscarriage

2. Uterine abnormalities: -Structure: Mullerian agenesis Uterus didelphys Bicornuate Uterus

3. Thrombotic factors: -Thrombophilias:

Factor V Leiden and Deficience of APC 4. Autoinmune system factors: Auto-antibodies: laminin-1(4) and GalNAcβ. Antiphospholipid antibodies (2)

5. Environment/ Habits factors: Cigarrete(3), alcohol, cafein

INTRODUCTION

• The antigens are substances which activate antibodies and generate an immune response in the human body, due to it recognizes it as a foreign. They can be exogenous (chemicals) and endogenous (viral toxins and bacteria).

• An Autoantigen is an own body’s molecule that result of a breakdown of tolerance mechanisms. It is recognized as foreign and induces the appearance of an immune response. (4)

Functions:-Induces antibodies activation-Implied on autoinmune disseases

Relation between Autoantigens and Recurrent Miscarriage

During pregnancy, mother is exposed to fetal’s antigens (50% paternal and 50% maternal MCH codominal) but in normal cases these forgein antigens do not activate antibodies or inmune response due to this molecules:

• T regulator Lymphocytes• HLA-G• CD95L

They increase tolerance and low the inmune response to avoid the reject of the fetus.(5)

• There are IgG’s (antibodies) at chorionic tissue. Autoantigens generate  immune response, which produces a cascade of LT defense molecules that destroy the antigen besides the tissue where it is, in this case at the chorionic tissue.

Blood is the main transport vehicle of these molecules which cause lysis / cell apoptosis. So, due to the mother's blood content is mixed with the fetus's blood, it passes these molecules helping to destroy its blood cells and tissues, reducing the oxygen contribution and eventually causing the death of the fetus.

Relation between Autoantigens and Recurrent Miscarriage

OBJECTIVE

MÉTODOS

PurificaciónAuto

Antígenos

AutoAnticuerpos

+Sefarosa

WesternBlot

Muestra de Pacientes

RESULTADOS

SDS PAGE

MALDI- TOF

Purificación Auto

anticuerpos

MÉTODOS

Muestra de Pacientes

•Tejido coriónico 8 pacientes 21-33 años (antecedente RM)

•Almacenaje -70°C

•Plasma sanguíneo 3 pacientes 27-29-33 años(Sin antecedentes RM/ >2 partos) [CONTROL]

MÉTODOS

Purificación Auto

anticuerpos

•Las muestras recogidas fueron lavadas con PBS

•Mezcladas en TBS + Inhibidores de proteasas

•Incubación 4°C 30 minutos

•Centrifugación

•Sobrenadante lavado con TBS y puesto en columna con Proteína G Sefarosa

•Los anticuerpos fueron separados de la columna con GlyHCL-Buffer y neutralizados Tris-HCL

•Se preparó matriz de afinidad. Control: IgG purificada a partir de suero sanguíneo de 3 mujeres sanas (Cromatografía Proteína G+Sefarosa)

MÉTODOS

SDS PAGE

.

•Método electroforésis para separar y analizar proteínas

• Desnaturalización proteínas, pierden su conformación

•Divisiones diferencia peso, tamaño y forma

• Gel de apilamiento: Aumenta [ ] proteínas•Gel de resolución: Proteínas se separen según tamaño•Tris: Buffer extracción•Glicina: Arrastra cargas iónicas•Acrilamida: Polimerización•SDS: Detergente desnaturaliza proteínas• Bromofenol: Azul, marcador avance•Glicerol: Mezcla quede depositada•Coomasie: Azul, colorante de proteínas•Butanol: Disolución recubrimiento gel•Mercaptoetanol: Rompe enlace di sulfuro proteína

MÉTODOS

SDS PAGE

.•Anticuerpos ---> SDS PAGE

•Para detectar autoanticuerpos en los extractos obtenidosestos se lavaron con PBS 3 veces durante 5 min y se compararon con anticuerpos secundarios unidos a horserabish peroxidase

•Incubación de la membrana

•Lavado de membrana con PBS

•Western Blot---> Visualizar proteínas

MÉTODOS

WesternBlot

•Técnica para detectar proteínas específicas en una muestra determinada ej: extracto tisular

• Mediante electroforesis en gel se separan las proteínas atendiendo al criterio que se desee: peso molecular, estructura, hidrofobicidad, etc.

• Luego son transferidas a una membrana adsorbente (nitrocelulosa +) para poder buscar la proteína de interés con anticuerpos específicos para ella.

•Finalmente se detecta la unión antígeno-anticuerpo por actividad enzimática, fluorescencia.

• De esta forma se puede estudiar la presencia de la proteína en el extracto y analizar su cantidad relativa respecto a otras proteínas.

Generalidades

MÉTODOS

Western

Blot

Pasos

1. Se toma la muestra de un tejido ó cultivo celular y se le agrega un buffer de extracción (Tris)

2. Homogenización (Correcta mezcla)3. Centrifugación (obtener proteínas)4. Adición de detergente/ inhibidor proteasas

1. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

MÉTODOS

WesternBlot

Pasos

Se realiza generalmente con SDS PAGE para extraerproteínas por tamaños

2. ELECTROFORESIS EN GEL

3. TRANSFERENCIA

Las proteínas son llevadas desde el gel de poliacrilamida, a una membrana de nitrocelulosa ó de PVDF por difusión ó electrotransferencia

•DIFUSIÓN SIMPLE

Se ponen en contacto las superficies del gel poliacrilamida y de la membrana y en el medio papel filtro + Buffer, el cual ascenderá por capilaridad hacia el papel de filtro arrastrando consigo las proteínas. Al llegar a la membrana, quedarán retenidas en ella.

MÉTODOS

WesternBlot

•ELECTROTRANSFERENCIA

MÉTODOS

Western

Blot

4. BLOQUEO

1. Se incuba la membrana con una solución de proteínas: ASB, leche en polvo y una diminuta fracción de detergente: Tritón X 100

2. Las proteínas en solución se unirán a todos aquellos lugares de unión de la membrana que no estén ocupados por las transferidas desde el gel.

De este modo, el anticuerpo sólo podrá unirse a su antígeno específico reduciendo así los falsos positivos

Pasos

MÉTODOS

5. DETECCIÓN

WesternBlot

Se comprueba la presencia en la membrana de una determinada proteína.

Se emplea un anticuerpo específico contra ella unido a una enzima que catalice una reacción colorimétrica.Al colorearse se hace patente la unión con el antígeno, la proteína y su localización.

•Anticuerpo unido a una enzima

Anticuerpo secundario + enzimas (sustrato soluble->insoluble). De esta forma queda una mancha allí donde esté la proteína de interés.

EJ: peroxidasa de rábano (HRP) HRP-->Luminol

Pasos

MÉTODOS

6. ANÁLISIS

WesternBlot -Detección Colorimétrica: La cuantificación proteica se evalúa

por densitometría (cuan intensa es la mancha) o por espectrometría

-Detección Quimioluminiscente: Se adiciona un reactivo quimioluminiscente a la membrana,

Pasos

MÉTODOS

WesternBlot

En la electroforésis PAGE se utiliza SDS que es una molécula con carga negativa acoplada covalentemente con las proteínas. Al desnaturalizarlas, hace que las proteínas queden con carga negativa.

FUNDAMENTO

.

Después de la introducción de la proteína al gel poliacrilamida y la aplicación de un campo eléctrico desde la parte superior a la inferior del gel, las proteínas son repelidas por el polo negativo (cátodo) y migran hacia el polo positivo (ánodo). Posteriormente las proteínas se dividen en bandas. Las proteínas más pequeñas son las que migran más lejos a través del gel y las de mayor tamaño se quedan en la parte superior.

MÉTODOS

WesternBlot

.

FUNDAMENTO

Para identificar la proteína de interés en la mezcla, se utilizan anticuerpos para que reaccionen con dichas proteínas.

Debido a que los anticuerpos son proteínas grandes no pueden atravesar el gel con facilidad. Por ello entonces se transfiere el gel sobre una membrana de nitrocelulosa que tiene carga positiva, así esta atrapa a las proteínas, quedándose en su superficie.

MÉTODOS

WesternBlot

Esto se logra mediante la aplicación de otro campo eléctrico que dirige las proteínas en modo horizontal.

La transferencia se puede demostrar con anticuerpos dirigidos contra la proteína de interés.

La unión del anticuerpo se detecta empleando anticuerpos secundarios y Anti Ig con peroxidasa de rábano, la cual genera una peroxidación del Luminol, formando aminoftalato que es el compuesto que al producirse emite luz. (6)

FUNDAMENTO

.

MÉTODOS

•Proteínas de los blot incubadas a 4°C con autoanticuerpos biotinilados.

•Las IgG obtenidas del tejido coriónico y las IgG obtenidas del suero sanguíneo se inmovilizaron sobre la HC-Sefarosa 4B de acuerdo con el fabricante de protocolo.

AutoAnticuerpos

+Sefarosa

MÉTODOS

Es el nombre comercial para la agarosa, un polímero extraído de algas marinas.

•Separaciones cromatográficas de biomoléculas • Inmovilizar enzimas, anticuerpos y péptidos a través de unión covalente a la resina.

Sefarosa

MÉTODOS

• Las proteínas coriónicas se sometieron a cromatografía de afinidad junto con la columna de sefarosa + autoanticuerpos

•Los extractos proteicos se incubaron junto con 1mL autoanticuerpos a 24°C 1 hora ----> TBS

•Los anticuerpos con sefarosa fueron lavados con TBS

PurificaciónAuto

Antígenos

Control: proteínas extraídas + IgG aislada (suero) + Sefarosa ->Cromatografía

•Proteínas se separaron de la columna con GlyHCL-Buffer y separadas por SDS-PAGE

•Proteínas fueron teñidas con G250

•Bandas de proteínas apropiadas se sacaron del gel para identificarlas MALDI-TOF

MÉTODOS

MALDI- TOF

Técnica de ionización -> espectrometría de masas.

Se denomina MALDI por sus siglas en inglés Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization (desorción/ionización láser asistida por matriz) y TOF por el detector de iones que se acopla al MALDI y cuyo nombre procede también de sus siglas en inglés Time-Of-Flight.

• Análisis de biomoléculas y moléculas orgánicas grandes que tienden a hacerse frágiles y fragmentarse cuando son ionizadas por métodos más convencionales.

GENERALIDADES

MÉTODOS

MALDI- TOF

•Las bandas individuales de proteínas (PAGE) fueron extraídas y tratadas por digestión en gel con tripsina. • Extracción de los péptidos generados

•Se analizaron utilizando un 4,800 MALDI-TOF/ TOF, espectrómetro de masas.

RESULTADOS

Esquema de purificación de los autoantígenos potenciales en pacientes con aborto recurrente

• En las columnas 1, 2 y 3, las proteínas coriónicas fueron teñidas con Ponco C.

• En las columnas 1’, 2’ y 3’ se muestra el análisis tras haber sido lavado y tratado con anticuerpos IgG conjugados con HRP.

La prueba de Western Blot reveló la presencia de cadenas pesadas y ligeras de IgGs en las muestras de tejido coriónico.

En las columnas 1 y 2 las proteínas del tejido coriónico son delimitadas por los anticuerpos previamente eluídos de las muestras.

Los igG de pacientes sanos junto con los anticuerpos conjugados a HRP solo delimitan péptidos en el rango de 67 kDa.

Los igG tomados del suero de mujeres con aborto recurrente delimitaron proteínas coriónicas aisladas

En la columna 2 se aplicaron igG del suero de pacientes sanas

• Los cinco péptidos analizados fueron posteriormente reconocidos mediante el MALDI-TOF como:

alfa-glicosidasa neutra

(107 kDa)

Endoplasmina(92 kDa)

ATPasa del retículo endoplásmico

transicional(89 kDa)

Proteínas putativas de tipo

endoplasmina(46 kDa)

Actina citoplásmica 2(42 kDa)

DISCUSSION

Spontaneous pregnancy loss has been defined as 3 consecutive pregnancy losses prior to 20 weeks from the last menstrual period.

Baek KH et al., 2007

Among 5 novel potential auto-antigens that we found to be associated with the RM, there is a neutral alpha-glucosidase AB. This enzyme [EC 3.2.1.84] is encoded in humans by the GANAB gene.

Martiniuk F et al.

Another detected auto-antigen is a transitional endoplasmic reticulum ATPase [EC 3.6.4.6], also known as valosin-containing protein (VCP); it is an enzyme that is encoded in humans by the VCP gene

Pleasure IT et al.

Endoplasmin is an abundant molecular chaperone resident in the endoplasmic reticulum, and it plays a critical role in protein folding in the secretory pathway of Toll-like receptors and integrins.

Maki RG et al

Gel electrophoresis is definitely the leading tool for scientists to perform most of their molecular tests. This, due to its utility on selecting different proteins to be either clasified or quantified in a study.

Through this investigation it is possible to talk about 5 potential antigens that respond to determined IgGs present in blood serum of patients with RM.

CONCLUSIONS

Even if this study allows an approach to find the molecular mechanism of RM; more investigation in this field is needed to finally get to the cause and start working on a treatment for the condition.

The main objective of the investigation was accomplished since the experiments held yield the expected results: the identification of 5 novel potential autoantigens present on patients with RM.

• https://www.rheumatology.org/Practice/Clinical/Patients/Diseases_And_Conditions/Antiphospholipid_Syndrome_(Espa%C3%B1ol)/

• http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/cromatografia.htm

WEBGRAFÍA

• 1) Carrel, D. Peterson, M. Reproductive Endocrinology and infertility: integrating modern clinical and infertility. Springler editorial. New York, USA. 2010. pp: 283-288

• 2) Habermann, T. Mayo clinic Internal medicine review. 7Th ed. Mayo clinic Editorial. Minnesota, USA. 2006-2007. pp: 957

• 3) Lerner, H. Miscarriage: why it happens and how best to reduce your risks. Perseus editorial. Cambridge, UK. 2003. pp: 142

• 4) Clínica Universidad de Navarra. Taken from web Site: http://www.cun.es/• 5) Vásquez, S. Bouchan, P. Mecanismos de tolerancia inmunológica en el

embarazo. Revista de Perinatología y Reproducción Humana. Marzo 2011. Volumen 25-1. pp: 39-45

• 6) Delves, P. Seamus, M. Inmunología: fundamentos. 11 Ed. Editorial Panamericana. Madrid, España. 2006. pp: 137-147

BIBLIOGRAFÍA