LUCIAN GAVRILA O IOAN NANET,A

DEscrFnîun TATNELE EREDrrAlrrVOL. I

,:l

-

CoPErtA dE EPAI}TINONDA TIOTIU

Blank page intentionally inserted

4

PREFATA

Nu eristd un alt domeniu al biologiei atit d.e dinamic co. celala gemeticii. lor sncinn de a scrte a &r,te dp Genetied, este' fmr-t'e d,ificild, cdci, m,enfinerea tn acfumlitatn docurnentdrii repre-zintd, o adeudnatd cursd. conhw-crwtnmetru, dabele stiingifice,unele de rutinó,, iar altele foarte noi, sau chinn nebdnuitepnd deunózi, apdrînd Tnintr-ttm adeadmt fenonterL de aualangdinf o,rmnpictrtald.

'Iotodatd, fenvmenul ereditar este ertrem de compler, iar.;tiinîa ereditd{ii reprezin,td, un dameniu în care trecerea de latezd la antitezd. ;i sintezd,, într-o desfdgurare profund dialecticó,es'te un loc cornun.

Ultimul deceniu o însemnat W$i errcrmi în aprofunzdo"r'eastttdiu,lui fenomenului ereditur. Datele mai u,echi despre repli-carrea semiconseruotiud a ADN au fost cornpletate cu rnod,elenoi, dem.anstrînd,u-se realitabm unei replicdri segmenfune, dis-canySinuu. A fast demonstrató, transmitureo, inf ormnfiei ,erediturede la,^tRN la ADN, aducîndu-se astfel u"n s.erios 'omendomentla dogmn centtwld a biologiei rntoleculare. Saau ob$inut rezul-fute rem.arcsbite în stadiul structurii ,rn^oleculotre a .cromozomu-lui de tip eucario't, bsndarea crarnozomnld reprezentînd o ue'ri-tv'bild ,,Ao'r-nbd cu origenK penh'u citogeneticd.

S-o dooedit cd, genele prezintd, secuen{e codificatoore. trsn-scrise ;i traduse ;i secuenfe intercalate printre secuen{ele codi-ficatmre ;i care sînt transcnse dar nu sînt traduse, genele ansîndd,eci o structurd m,ozaimtd,. De asemenea, Ia baci;eriofagi, s-a de-mnnstrnt fenam,enul acoperirii de Eene. S-au descifmt proprie-tófile gemelor sdritosre pi s-a elobstwt ipoúem ootcoEenrei.

Rezultute dc el:cepÍie ou f ost obfinute îmtr-un domnniu noual g,enetùcii mn'lecu.Inre, cel ol mnnipuldrii de Eene cunoscut ;isub d,enumirm de dhginerie g'eneticd. Cu oicasta Genetica ca-pdtd nebúnuite implimiii de ordin ;tiinlific, econotnic, social,polùtic Ei chinr m,aml, im wuele reslizdri epoele din dorneniulingineriei genetice pot fi comptnte ca gwndmte ;i insolit cu

mdrelia pa1i,lor tui Armstrong pe lund,. $tiinfd, cll Wofunder ezonan,te umnniste, Genetica demonstreazd unicifu.úeo fincúruiittdir;i.d umnn, irepetabilitatea .so spafio-temporard. Totodnú.,genetr,ca aduce în discu[ie, de dnta aceasta pe temeiuri mate-rialist-cLialecti,ce, eristenfa unui desbin. $i acest destin se nLbmc;te destin genetic. EL se împline;te cu rígo'we matema;ticd",fdrd a euea însd implacabilitatea destinului ulnfln dl;in mitolo-gía greacd.

Conceputd. dupó rrn plan original, cortea de fatd re-prezhrtd. o încercare, ùt linútele uttui spaf,iu redus, de a dacititorului o imngine integrald asupra fanom,enului ereditar. Înintenlia auborilor a sta't pe d:e ,o fxtrte pre'zentorca cît mai catn,pletd a datelor clqsice si a datelor m.oderne priuittd fenornenuleredit'ar ca ;i o încqcare de interpreffire a datalor dc gvneticd,clasicd, formnld, prin dntele geneticii mo'leculare. Euide,nt, e&r-tea de fald este urn din tariantele posíbile.

Pentru docum,enture ne-ant folosit de posibilttdfile pe careni le-.au oferit biblioteca Facultd,tii de biologie a Uniuersitd'fiidin Bucunegti, bibliotem d,epartarnentului de Biolngxe gi Bíochi-mie al Uniuersitdfii Haruo,rd (S.U.A.) precum ;i scltimbul initer-rwlional de lucrdri ;tiinfifiee, ostÎet încît auborii au auut posi-bilitwtea de a consulta ntulte tuqdri originale de geneti,cd, cla=sicd sau m.odernd.

Autorii erpúmd gratitudine tuturor ,acestor institufii ;i tu-turor celor care le-au oferit, pe o cale sau alta pasibititateadocumentdrii.

Bibliografia este sel.ectiud, gi totodatd. cugnind,e luqdrileprincipale deuqrite clnsice sle genetici,i f,orunnle ;i rrualeculnre.Din ntotiue de spf;iu nu s4 realizat o pennanentó eorelare ocitdrii în tert a autorilor cu Ubliografin firnld.

Lucrarea se adreseazd. speeiali;tilor în geneticd, stud'enfilorfacultd.,tilor de biologie, medicind ;i agronomiie precurn 9i pro-f esorilor de biologie ;i etexilor de liceu. De osemsnea, ea pmte ficonsultatd de oricine este interesat în descifrarea miw,u;Iosuluifenomen ereditor, cuno;tinfele despre eredifute fdcînd Wrte in'tegrantú din ceeo ce se poate numi formnlia intelectuald aomului modern.

AUTORII

CUPRINS

CAP. f. Suhstratul rnaterial al ereditàlii

l. Delinirea ered.itdlii.2. Delinírea substratului chimic aI ereditdlii3. Sl.tuctura acizilor nuclcici.

3.1. Scurt istoric3.2. Structura primarà a ,{.DN3.3. Structura secuudarà a ADN .

3.4. Structuri tautomere3.5. Exceplii de la structura bicatenarà a ADN3.6. Cantitatea de ADN gi informalia ered.itarà3.7. Sinteza replicativà a ADN

CAP. II. Struetura ARN qi transcrierea genetleú

l. Generalildli2. Transcrierea geneti,cà3. ARN nnseger4. ARN ribozomal5. lnN d,e tronsfer6. I RJV nuclear eterogen. .

7. A RN crontozontal8. IRN ttiral9. Reuerstranscrieyea

CAP. III. Organizarea materialului ereditar

l. Organizarea uiralà -

2. Organizarea cclul,ar d

2.1. Organizarea procariotà. 822.2. Organizarea eucariotà 85

2.2.1. Organizarea genelor eucariote 882.2-2. Structura electronomicroscopicà acromatinei

gi a cromozomului eucariot 1042.2.3. Complexul sinaptinemal 106

3. Caracleri,stici,le organizdrii eucariote 1094, Procariote-Eucariote, o comparalie . 1095. Genomul extranuclear lll

CAP. IV. Codificarca biochimieà'gi expresia genieà 116

l. Generalitàli . 1162. Cod,ul genetic ll73. Catacteristicile codului genelic 123

II

ll181Bl82230323335

50

5052576l6673747476

79

7982

4. Biosinteza proteinicd f284.1. DesfAgurarea proc'esului de biosintezó proteinicà. 129

4.1.1. Inifierea catenei polipeptidice l3l4.1.2. Alungirea catenei polipeptidice 1374.1.3. Terminarea catenei polipeptidice 140

cAP. V. Caraeteristleile(genelor)

organizarii qi funcgionóril factorllor oreditnri

l. Ciclul de tiald la organismele superíoare .

2. Caraateristicile genetice ale meiozdi3. Localizarea genelor pe cromozomi4. Descifrareo naturii genomul.ui (gcnotipului) prin stud,iutr

fenotil>ului (analiza geneticd) (Genetica factoriald. sau for-mald)4.1. Ivlonohibridarea .

4.2. Dihibridarea4.3. Bxceplii de la raporturile mendeliene de segregare

4.3.1. Dominanla incompletà sau semidorninanla4.3.2. Supradominanla4.3.3. Codominanfa4.3.4. Alele multiple (polialelia)

5. Factorul Rh6. Variantele electroforetice ;i semnificalia lor7. Interacliunea genelorB. Complementaritate genicd .

9. Gene inhibitoare .

10. Gene epistatice.ll. Gene duplicate cu e.fect cumulatíu12. Penetran!à. gi expròsiuitate genicà13. Determinismul genetic aI ciracterelor cantitatfue11. Gene letale . .' .

15. Pleiotropia

145

146117148

r49152r5B167167168168169t74177t79181182183185186189193195

B

t1

I

)Capitolul I

SUBSIRATUI, MATERIAL AL EREDITATII

Motto:'Spirala este esenfa vie{iir

Goethe

, 1. DEFINIREA ERBDITATII

Îrncà din anul 1863 Spenoer defineEte ereditatea ca fiindproc€sul cìare detenminà asemànar€a dintre pàrinli Ei descen-den{i. IJlterior, la 1885, A. Weis,mann în{elege prin eredita't'e,,'ttransferuù de Ia o genera,,lie la al'ta a unei substanfe cu o con-stitu{ie molecularà definità36. Prin ac+easta Weisrnann devan:-seazà cu aproape trei sferturi de veac, conceptia modernàdespre, o bazà molecularà a ereditàtii, iar oonc€ptul sàu depl asrnrt gerrnirwt't u d, cu ierarhia strl.c t ur al -f unclio nralà determi -nanfi-biofsri-idnrúte-ide, este comparabiù cu cnncephll actualasupra ierarhiei sistremului eredi'tanr care pornegte de la pere-chea de nucleotide qi ajunge Ia genarTr.

Astàzi prin ereditate se înfelege conservarea specificitàliiunui sistrem ibi'olqgic dat, în tÍa:npuù reproducerii s,al€, conser-vare care asirgurà oon,tiuruul în evolufie, legàtuna organicà dintnegenerafii, adicà asemànairea dintre acesúea. Totodatà, pe Iîngàcoarlinutul 'evolutiv, apare ca fenomen biologic fundarnentalnstà,r€,& de neas,ernànane, de discontinuitate evolutivà, adicà vE-riabilitatea, eea mai generatà lege a naturii. Cele douà procese,conservatismul ereditar qi vari'abiùitatea ereditarà sînt douà ùa-turi inseparalbile ,car,e definesc unitatea dialeeticà a organismu-

* Acest panseu al celebrului autor al lui Faust po'ate fi luat, înlipsa uneia exacte, drept definifie a vie{ii. Geniul marelui poet a pà-truns esenfa viefi,i, de vreme ce Tem,a, singur,a planetà pe care sàtàguiegteîn.mod cert Viata se ,aflà într-o g,alaxie de formà spiralà, iar macromo-leculele din interactiune'a càrora irumpe triumfàtorare Viata au li ele înesen!à o fitrucfurà spir.'alà. (L. Gravrilà - Simpozionul, Prognese gi Pers-pective în biologie: Progrese în Genetica molecul.arà Bucuregti, gaprilie 1981.

rlui viu. Fieoare organism are propria sa eredi,tate înscrisà codi-ficat în s,tructuri moleculare specifice sub formà de irrforma-tie ereditarà. Cu studiul ereditafii Ei variabilitàtii se oeupà$tiinfa Ereditàtri numità încà Gsslgriss. Ea studiazà meoanis-mele înregisúràrii, reduplicàrii qi modificarii imforrnafiei eredi-tar,e precum $i aie fun,cfi,onràrii m,aú,eria,lnrlui enedirtar în conr,r.u*luLproceseil.or rbiosintetice din organi:srrt car,e conduc I'a ,contur,ar€acliferitelor caracteristici a,ie arcestuia.

Cuvîntul eredita,t,e este de origin:re 'latinà (lueredibas =- a rno$-teni) qi sem'nificà trransmiterea din gen,era{ie în g'Enerafi'e, oua unor caractere cai ata,re, ci a, capacità{ii. de a dezvoita acestecaractere la d,escend'enfi.

Cuvîn'tul Geneticà, dat acestei gtiin{e de càtr,e W. Batesor,în 1905, provime de la ,,grec€scul genrtao care înseamnà a d,anaEtere, a gen'era. Principiile de 'bazà ale Geneticii au fost for-mulate în anul 1865 de càtre Gregor N{endet în {ucrarea ,,tJtberdie Pflan,zer:r hyb'riden6t Ei au la' bazà, conceptul de factcri ere-clitari (gene) de naturà materialà. Etre au fos,t elaborate' în urmaunor exp€rienfe de hilbridare efectuate îrn,tre diferite soiuri d'emazàre. Fàrà a cunoaqte care este natura chirnicà ,r factorilorereditari, Mendel a starbilit, prin in'terpretarea corectà a nezul-tatelor ,experi,errfelor de hibridare, prin analiza fe,notipi,cà,indirectà a factoril,or ereditari, dubtl artà cle analiza statisticà.comportamentu[ acestor factori ereditari în conrrdifionare,aqi transmiterea ca,racterelor eredi,tare. lli,tate pentru m,ai 'binede trei deceurii, principiile elaborate, de Mendel au fost con'fir-rnat,e ia începutu'l secolului nostru, dovedindu-,s,8 a fi universalvalal:ile în lumea vie. Mendel trebuie astfel consldena,t fonda-torul celei rnai moderure qtiinfe biologice Geneticai. Legîndfactorii er,edi,tari ,mend.elieni de c'roln,o zomi qi dezvol,tîn'd prin-cipiile memcleliene de ereditah, qcoala iui Morgan a e'lucidatclesfàqurarea f enomenului eredit'ar la nivel celular, ,constatÍn-d,u-se ,exis'tenla unui comportam,ent identi,c al factorilor eredi-tari rn€n;delieni qi al cromozomil'or î'n tirnpui diviziunii celulare.Ràmin,ea încà n,edescifratà natura chinnicà a faatoriùor eredi,tari.Deqi în arnul 7924, Feulgen Ei Ross'enbeck ,eviden liazà,, printr-ometodà selectivà de colorare cu leucofux,inà prezenfa la nivelulnucleulrui cel'ular qi ,al croln,ozormilor a acid,ului dezoxi,ritbouru-cl'eic (ADN) nu s-ai putut s'tabiili urici,o ,relaf;ie dintre acas,tà surbstan!à Ei fac'torii ereditari, a càror 'localizare pe cromozorni fu-sese clar dernornstratà de Scoal,a lui Morgan"

10

2. DEFINIT3EA SUBSTRATULUI CHIMICAL BIBEDITATII

În pr,ocesul de transrni'tere a carac,terel'or ereditare de la ogenera{ie la, alta nu are loc o transmitere ,ca atar,e a unui ca-raoùer. Bste de neimagiurat ,bunàoarà transmiterea la nivel'ulzigotului uman a ,,ochilor albaEtri(. Dar la nivelul acestui zigot,roeva" a'fost trans'rris qi acest ,,cevar(( va face ,cE î'n dezvoltaneaulterioaià a embriou:ului uman sà aparà nnaurifest caracterui,,ochi a',libaEtri((.' Ce este acest ,,oeva66 Ei ca,re sînt proprietàlilesale? Fàcînd o paralelà între legil,e fizicii Ei le,gi'tàfi'le feno'me-nului eredita'r, E. Schródingep, în 1943, devansînd concepliamodermà molecularà despre ereditak, a ajuns la concluzi:a càgen'el,e 'îEí pàstr'e à,2à struotura lor de-a lungul generaliilor,deoarece cr'omozomu'l în cane e'le se aflà, repre zintà un fel decristal sta,bil aperiodic, compus dintr-o succesiune de elementeizomerice, caracùe'rizate de peruuneur{à gi a càror naturà exactàeete de fapt.,legatà de codul genetic. i

Trei trepte ,experimentale au dus la descoperirea a,celuif,cevars adicà a subs,tratului material al ereditàtii care s-a do-vdit a,fi s'ubstanta chimicà macrcrmolecularà ADN.

Primp, treaptd, este repr,€tentatà de experienfele mediculuienglez Griffitllr, efectua,ùe în 1928 cu agpntul pneumonieiDiplocoecry . pneur:rnùrnipp sau pneumococ. Aceastà tbacùerie seprezin,tà, su,b forma a douà tipuri diferite: qnul virule'nt qi în-capslllat, altul nevirulent Ei neîncapsulat. Caracterele de viru-lent, qi nevirtr'lent sî'n't ereditare adicà se transurrit constan't d,ela o gengrat-le celuùarà la aLta

fi,pqt virulent a fiost oro,tat cu ,,Slt deoar€€, crescut pe agarformeazà, colonii netede (în englezà sm,ooth-- neted). Celu,lelesale sînt, înconjurate de o capsulà formafta din polizaharidespecifice încît existà pneumococi, de diferite tipuri serologiceSr, S11,, Srrr.

Tiputr nevirulent nu pr,ezi,ntà capsulà Ei for,rne azà pe a€arcol'onii rugoase. El a fost notat cu ,,Rtt (rough - ,aspru).

Îm mod spourrtan form,a S se poa,te trans;forima prin mutalieîn form,a R cu o frecventà foart'e micà dar niciodatà nu areloc mutalia spontanà în sensul .R->S. Rezul,tà deci cà prin mu-talie naturalà tipul R provenit din diferitele tipuri serologiceaile,lui S poate fi Rr, Rrr, Rrrr.

Injectînd la Eoareci pneumo,coci cu diferite variante expe-rimentale, Griffi'th a constatat cà:

1. Tipul viruleurt ,,S* produce rboala Ei animalele mor;

11

r2. Tipul virul,ent ,,Sn ornorit prin fierbene nu produce

boala;3. Tipul ,nevinulent ,,R( 'n-u produce boala;4. Dacà la aeelaqi $oarece se injectEazà simultan tipuriie

dirn variantele 2 Ei 3 animalul pr.ezínl,i,boala Ei 'moar,e. Din ssre-menea animale s-au putut izola celule vii capsulate qi deci 'viru-lente de pnreumococ. Experienla a t'ost riguru,s efectua€n exclu-zîindu-,se posirbili'tatea învierii celule'lor de tip S omorlte prinfierbere, încît s-8 impus o singurà concluzie: celulele vii 'aletipului R nevirulent în amestec cu celulele moarte ale ti:puluiS se transfo'rmà în celule viru,lente. Fenom,enul a fost numitT RAIVSFOR MARE GEN ETIC 4..

Transformarea geneticà se desfàEoarà cu pne'cizie, pàstrîn-du-se tipul serologic inifial: dacà în amstecul iniectat ,au intratcelule de tip Sr omorîte prin fierbere qi celule Rrr vii, dinanimale !-or putea fi izolate celule de tip 51 vii qi cetrule Rn.Dintr-uo asemerlea arnestec ,nu vor putea fi izolate celule de

ti,p S ttt sau Sr rr. Acest lucru ar fi posibil numai în urma unuifenomen de mutafie spontanà, dar un assrn€nea eveninrent esùepe de o parte foarte rar qi necesità P€, de al'tà parte un timpcu mult rnai îndelungat decît dureazà experienfa de 'mai s:tls.

Celulele virulente de tip Sr renrtate prin tnansformarea c€-Iulelor nievir"ul€nte de ti,p Frr aflate în prezen{a celulelor Somorîte prin fierbere 'trsnsmi,t cu fidelitsb, în'generafiile celu-rlar.e ulteiioane, caracùenrl de virul,en!à. Transformar,sa arìe astfelcarac,ter permanerr,t, virulenta fifuld înscrisà în 'baza eteditarà ac,e1,,u,1e1or Rrt. Griffift nu a puhrt da o expLicatle csrespunzà-toare acestui pruces de transforrnare geneticà, dar el are unmerit de,osebit deoarec€ l-a sernrnralat penúru prirnar datà, iimput-sionînd lumea qtiintificà la elucid,area mecanismul'ui sàu.

A doua treaptú în elucidar€a mecanismului transformàriiest,e reprezentatà de experientele lui Al'loway efectuate în 1932

Ei de experienfel,e lui Dawson qi Sia din 1937. AceEtia au r.euEitsà determine tra'nsform'area geneti,cà prfur cr-ll'tivarea cel'ulelor detip ,,R" în mediu lichid la care au fost adàugate extracte filtrateobtinrute din Liza, celulelor de tip ,,S".

Deqi nu au precizat natur,a agentului transformant aceEtiautori au putut astfel excliude implicarea materialului capsularîn pnoces,ul transformàrii. Tnebuia càutatà aità substa,rrfà cupr'opri etàti transfortn an'te .

A trein trmptd qi c€a d'ecisivà în ,elucidarea naturii agentu-lui transformalrt ,este repnezentatà de experienlele americanilorO. T. Avery, C. M. Macleod qi M. MacCarty al'e càror rg2u,ltate

L2

sint publ.icate în 1944 într-s lucrare devenità clasicà. În aceastàlucrare se aratà ,cà în urma cultivàrii eelulelon de tip R ftl pne-rcrtta ADN înaùt purificat, extras de la celulele de tip S se poateobline o transforro,arìe efectivà a cehrlelor rrevirulenrte R încelule virulente, S. Descoperirea era suprinzAtoare (Wabon anumit-o ,,bomba( lui Avery) pe fondul tmei' gîndiri dogmaticedominatà de acceptar'ea generalà a ideii cà sulbstantele pno-teinice au rol de rnateri'al ereditar, f,apt ce a fàcut ca '1a' început

chiar lui Avery sà-i viarà ,greu sà creadà în propri,a sa descope-rire epocalà ! Di,n aceastà eauzà, reznrltatele unei asemenea ex-perienfe trebuiau verificate riguros prin efeetuarea diferiúelorteste. Astfel, testele senoLogice au ,el"iminat posi'bilitatea conta-minàrii 'extracfului de ADN cu polizaharide. Testele proteoli-tice, în Llrma càrora extraetul îEi pàstra activiùatea transfor-mantà au eliminat posibilitatea ca proteilrele sà fie irnpli-cat,e înr, fenomenul transf,or,màrii. În sfîrEit, ;tes'tul de drrgestie cudezoxiri,bonucleazà (errzimà ce hidroLíze,anà rnolecula polimericàde ADN) aratà cà extrashrl îqi pierde proprieúatea transfonm€uî.-tà. Era dovada peremptorie cà agentul transformant este ADN,Prin aaeas'ta s-a pus piatra de ,tqmelie Ia zidirea g,enetici'i rnole-culare, Etiin!à prin care biologia secolului XX qi a celor ct Uvor unna se va înscrie ca un domeniu rerrolu-tionar al qtiintelornaturii. Descoperirea lui Avery qi colaboratorilor sài declan-qeazà o febrilà aetivitate în toate labora,toarele lumii, Se de-monstreazà ro,lul transfor,matrr't aL ADN qi la alte bacùeri.i apoiIa plante qi anima'le, fenomenul ,tmnsformàrii dewnind în celedin urmà e cale prin care este transforrnatà dirijat ereditateain cadrul ingineriei g'ene,tice.

O altà dovadà a rolului geuretic al ADN ra l€prezentat-o des-coperir,ea conjugórii fucteriene de càtre Irederberg gi Tatum în1946. Acesta este un proces na,tural prin care ADN al uneibacterii este direct transferat unei atte rbact'erii. Bacteriile sedeos,e'besc dupà tipul sexua't. Astfel sint bacterii de tip sexuatmascul clesemnate F+ qi d,e tip sexuat fernel, desemnate F- întreel,e fiind un tra,nsfer unidir,ecfional de material gearetic de laF+ l,a F-.

Capacitat'ea d,e a transfera gene o au numai acele bacteriicare posedà un factor ereditar numit frctor de fertilitute (F).Aceasta repnezintà tot o moleculà ADN, localizatà ln citoplas-ffià, adifionalà cromozomuiui bacteria,n principal. El se poateintegra în cromozomul, principa,l devenind ceea ce se numegteu,n episom. În stare integratà faetorul F conferà bacteriei capa-citate,a de a transfera cu o frecventà înal'tà gene la tipul femel

13

$i as€rn€rr€a tulpini au fost desemnate Hfr càci tra,nsferînd ge-nele cu o mare frecven!à determimà totodatà o inal'tà frecvenfade reeorn,bi,nare a gemelor în popul'afia [bacterianà considera'tà.Tnansferul de gene se face într-o manierà ,unicà, s'ecvenfialà qiorientatà, pe ,baza sa stabilindu-se ordinea genelor pe cr€mozo-mul bacterian (cartare,a geuricà) qi totodatà s-a conchis cà ,acesúaare forrnà circularà. Conjugarea baot'erianà explieà rolul pecare î1 are ADN în ereditate, statutul sàu d,e substantà ere-di'tarà.

,În annrl L952, N. Zinder qi J. Ledenber,g descoperà transferulde gene între diferite tulpini bacùeriene mediat prin transduc{iefagicd. Bocteriofagii sînt virusuri ale bacteriilor descoperit'e în-cà din 1917 de cà'tre d'Here1le gi cane se ,mai nurnesc simplufo,gr.Fagii se multiplicà în celulele bacteriene lizîndu-le (ciclulliúic) sau îEi integre azà ADN lor în cromozomul c,elulei 'bacte-ri'ene (-ciclul lizogen). Ciclul litic Ei ciclul lizogp6l sîrnt rever-si-biLe. Integrat în cromozomul bacterian La iegiree din acestaADN fagic poate smulge gene baeùeriene pe care sà le trans-fene la, o al'tà tulpiurà 'bàcteriaura

(Ftg. 1). În aceln+i an, A. H,er-

atI dpdr prototrofr

+--+ SUfftune 5tpresiunealt'ernariL

A 22 (Ohe- f r P- mef r 'lis+,

protof rof i ( phe+ trF+ nef+ hts+ )

Ftllru de

Fig. î. Experienfa de transducfie efectuatà de Zinder gi Lederberg în 1952.Douà tulpini auxotrofice de Salmonella typhimuri%ffi, LA22 qi LAZ au fostplasate fiecare într-un bral separat al tubului Davis de forma literei It. Brafelesînt separate printr-un filtru d.e sticlà care nu permite schimbul de celule darpermitè trecerea mediului lichid dintrun-un braf în celàlalt, astfel' cà cele d.ouàtulpini sînt de fapt crescute pe un acelagi med.iu. Formele prototrofe apar numaiîn bralul care confine tulpina LA22 nu însà gi în acela care confíne tulpina LAz.Cu alte cuvinte un ,,agent filtrabíI" (FA) activ genetic apare legat de tulpinaLAZ care poate produce prothtrofi La22. S-a d.ovedit cà ageutul filtrabil estede fapt un fag temperat care a trecut odatà cu mediul de culturà prin filtnr destidó de tulpina LAz la tulpina LA22 pe care o lizogenizeazà,, transfedndu-igenele de tip sàlbatic (poe+, trp+) d,e la tulpina nelizogenó LAZ gi transformînd-oastfel într-o tulpina prototrofà. Acest fenomen d.e trecere a unor gene de la otulpinà bacterianA la alta imediat d.e fagi s-& numit transducfie fagicà. F*gul

transductant a fost desemnat Prr.

T4

lA Z( phe + lrp, qet- nis- I

i.

o'p-

rta[tà.

$iZO-

;tapeìg_

fonto.r,of.tgicó

.. 32 p ce rntró în ADtl

' 35 S ce intró ínProtetnElscopsrdeu

/-- , -bGCterie"

Fig. 2. Demonstrarea rolului genetic al ADN prin studii autorad.iografice efec-tuate de Hershey qi Chase (1952). a.b. - radioactivitatea însofegte numai ADNqi se deceleazó" în interiorul celulei; c, d. - radioactivitatea însofegte numai pro-

teinele gi nu apare în interiorul celulei bacteriene gazdà.

shey Ei Martha Chas'e, demo,ns'tre azà. rolutr în ereditate a,l ADNfagic, excluzînd totoda;tà orice implicalie dir,ectà a proteinelorin fenome,nul 'ereditar (Fig. 2). Fagii pàtrund în celula bacteri,a-nà unde s,e mu:ltiplicà pe sea,ma componentelor celul,ei gazdà qiapoi, în urrna lizei celulei bacùeriene se elibereazà noiil.e parti-cule fagice. Bacteri'ofagii au a1càtuire foarte simplà. Ei prezin'tào capsidó, proteinicà cane încon'jurà u,n miez de ADN. Auú'oriiau f'olosit bacteriofagi de 'tip T2 ca're conlin coa 400/o ADN $i6A0/a proteine. Capsida proteinicà, î,n interiorul càreia s,€ aflàADN form,e azà, capul rbacteriofagul'ui care se continuà cu ,o

,,coadà33. Cu ajutorul eozii, 'bacteriof,a,gul se ataEeazà la peretelecelu,lar aI celulei bacteri,€n€, coada avînd la partea sa distalào placà h,exagonia[à cu gas€ spini scurfi qi nurnenoase fibrile Eiposdà activita,te li'zozimicà prin care peretele celulei baeterieneeste dizoivat local. Pe a,ceas,tà cale ADN fagic este injectat înrnt'eriorul celul,ei bacteriene, înveliqul proteinic a,l fagului ràmî-nînd la exterior sub for,mà de ,,fantomàí fagicà. Prin experienfe

15

Ide marcare cu izotopi radioactivi, Hershey Ei Chase au de-murstrat carre este funcfia ADN (Fig. 2). Comptrlen,ùele bacterio-fag{ilui au fost marcate ,f rînd, proteinele capsidei cu 3qS qi4DN fagie cu 32P. 35S Ei 32P diferà în intensÍ;tntea energiei ra-diafiilor B pe care le emit fiind u$or de distins. Cu asémeneabacteriofagi marcali au fost infectate culturile ,bacterien,e. Prinurentrifugare au fost î,ndepàrtafi bacteriofagii urea'taqatt iar prinagitare puùernicà s-au putut separa ,,fantomre,le6s fagice. Cînds-au marcat pruteinele cu 35S s-a eonstatat cà ùrtre AO qi g7o/odin 3qS este asociat cu fracfiun,ea proùeinicà a ,,faurtomelors fa-gice. Cînd s-a marcat ADN cu 3ZP s-a consta,taú cà cea mai mareparte a radioactivitàtii apare în interiorul celulei bacteriene. S-atras concl,uzÍa cà îilr. timpul ilrfecfiei fagice ùr celula gazdà nupàtrunde întreg lbacteriofagul ci numai ADN-uI sàu. Ac€sta stàIa tle;za rnultiplicàrii fagului cu aparifia de noi partieutre f'agice.identice cu eea inifialà. Deqi în celula gazdà pàtrunde doarADN, dupà 30 minuúe rezultà panticule vira,le întregi careconlin atît acid nucleie cît qi pnoteirÌe. Rezultà cà ADN con-line toatà furforrrnafia eredi,tarà, atît pentru propria sa sintezàcît Ei penrtru sinteza prote,inelor virale.

Aceste douà cate,gorii de experienfe d,e ,transformare Eide infecfie fagicà au demonstrat faptul, cà ADN-'utr reprczintó,mnfurinlul gtenetzc, substratul chimic al ereditdfii, otît ls, uiru-suri cit fL la sistemele Aiobgice celulare.

Dat fiind faptul cà uurel,e virusuri rùbouiru,suril"e pr,e-zintà ca rniez de acid nucLeic acidul ri,bonucleic (ARN) s-a pusîn mod firesc problema cin'e îndeplfureqúe, în acest caz rolul dematerial ereditar.

Experienlele lui Fraenke,l-Co,nrat, Singer Ei Williams pe d'e.o par,te Ei ale lui Gi,erer qi Schrarnm pe de alta, desfàqurate,între 1955-1956 au adus dovezi sigure, dupà care la ri,bovirusuriARN viral. îndepliureEte rol de material er.editar (Fig. 3). Aceqtiautori au lucr,at'ctl virusuù rnozaicului tutunului (VMT) oare areformà cilindricà în interior aflîndu-se ARN (60/a) ce ,este încon-jurat de proteinà (94o7o| avî,nd o lungime de 300 pm gi o 'làfimede 15 pm. Pe cale chirnicà proúeina viralà poa'te fi separatà deARN. Cele douà compon,ente pot fi astfeL in,ocul,a,te separat laplante de tutun. S-a constatat cà proteiura viralà nu estre capa-bilà d,€' a determina infecfia vira,là pe cîn,d ARN viral are'caracùer infec{i,os.

Cînd Gi'erer gi Sc,hramm au fol,osit ARN pur izolat de laVIW| spre a infeota pla,nte de tutun, BU constatat cà se produce

16

3. STRUCTURA ACIZ,ILOR }IUCLBICI

3.1. SCURT ISTOR,IC

Acizii nucleici sînt acizi ,orga'nieí car'e aonfin f,osfor, r'spre-zerr-tînd substante macromoleculare din grupa,biopolimerilor.

Descifrarea structurii ADN a fost îndelung pregàtita. Înanul 1868, studentul elvelian de numai 24 d,e ani, F. Miescherdescoperà în nucleii celulelor prele,vate din plrroi uman, ,c8 de-altfel qi în lapfii d,e somon qi sperma altor animale o substan!àcu un înalt confinut d,e fosfor pe care a nu'mit-o nucleinrt Ei pecare, în 1872, 'c considerà a fi materialul genetic activ at sper-matozoizilor. Mult timp aceastà idee nu a fost îmtbràliqatà deiurnea biologilor. Abia îrn 1939, Astbury Ei Caspersson, în ca-drul celui de-al VII-le,a Congnes de Geneticà, vor avansa ideeacà acizii inucleici ar servi ca matrifà pentru siurteza proteinelor,asigurînd reproducerea materiei vii.

În 1899, R. Altmann identificà în mucleina d'e d'rojdie o sub-stan!à macromo,lecularà pe care a numit-o acid nucleic. În anul1909, P. Leven,e aratà cà acidul nucleic de drojdie oonfine patrubaze aza,tate: odenina, gunnina, citozinn qi unacilul precum Eiacid fosforic qi o pentozà riboza. În 1930, ac'elagi autor ana-Iiz.eazà cornpozifi,a chimicà a acidului nucleic din 'timus Ei con-statà cà acesta cornline adnnind,, guanind., citozind qi timind, cabaze azotatn precum Ei acid fosforic Ei d'ezstirùbozd. La aceavreme, ,acidut care es,te nucleic de la drojdie a prinit denumireade acid riborw"cleic (ARN) i,ar c.el din timus de vigel a fost numitacid timonucleic, de fapt acid dezoriribonucleic (ADN).

3.2. STRUCTURA PRIMARA A ADN

Unitàlile structurale al,e ADN, rnonomeri, se numesc nr,t -cleotid;e. D'e aceea acizii nucleici se numesc polinucleotide, adi-cà polim,eri de nucleoticle. În anul 7952, Todd a s'talbilit ;tregà-turile chimice dirr-tre co,rnponentel'e de lbazà, ale nlacromolecu-lei ADN. U,n nucleotid este alcà'tuit dintr-o bazà, anotatà, omroleculà de dezoriribozd, Ei un rest fosforic. Bazele a:zofra,te sîntde tip organic, relativ hidrofobe. Ele sînt de douà feluri : puri-nice adenina (A) Ei guanina (G) Ei ptrimidinice citoziura(C) Ei timina fI). Nucleul purinic este ,un dublu heterociclu al-

1B

t

H

C

N,/ùc/r\[ ;lr à..HCs.#Ò-- g /Nil

Fig. 4, Nucleu purinic.

C

x/ù cHtl :ilhtc \ 3-'C H

N

Fig. 7. Nucleupirimidinic.

N Hrr',,r49\c/\''l il cH

HC f.. ,-C--. ,/NN

H

Fig. 5. ddsnina.

Edi|/ \czril

HzN /'c\^-

nJ

\ n\.,

NH

Fig. 6. Guanína.

càtuit din 4 a'tomi de ar'ot (N) Ei 5 atomi de, carbour (C) (Fig. 4).Adenina este o 6.aminopurinà- (Fig. b), pe cînd guanià"-este2-amino, 6-oxipuri,na (Flg. 6).

Nucleul pirimidinic este un heterociclu aroma,tic alcàtuitdin 2 atomi de azot qi 4 atomi de carbon (Fig. 7). Timina este o?,6-dioxi, 5-*gtilpirimidina (Fig. B) iar citozina este o 2-oxi,6-armiuropirimidfutà (Fig. 9). Bazele azota,t'e A, G, T, C, pred.o-minà în ADN de Ia marea majoritate a speciilor. În unele ca-zuri însà, 'bazele azotate obignuite pot fi ilrlocuite de unii deri-vatt ai lor (Frg. 10-13). Astf€I, la grîu circa tlq din resturilecitozinà apar ca 5-metilcitozinà, care are pnoprietàli de îrnpere-chere asernànàtoare citozinei. Acest derivat al' citozinei apare qila alte gramin@,

"* 6ealtfe'1 Ei la mamif'ere.

[,ar fagii de tip T ai ,bracteriei Escherichia co:|,i, (8. coli,) cito-zima este întrocuità compleú ou 5-hidroximetilcitozina care deregulà este conrjugatà cu gil.ucoza. De asemenea, la unele viru-suri se aflà 5-hidroxirneti'1uraci,lu1, iar la unrele lbacterii se afléO-metilpurinà.

Purinele qi piri,midinele oomfin dutble legàturi sau legaturiconjugate, din care cauzà ele se po't pnez'enta sub forme chimice.

NHrlL

C

ollr

**[' -f -cHl

1,.-*'cHH

Fig. 8. Timina.

y1 2 \..cH,iil

or-*-ci-i'

Fig. 9. Citozina.-

19r

v)

A nalcai ai edentfrèí

Fit. 10. Analogi si adeninei : &metilami-nopurina gi 2-emlnopurine.

{ HzN-L-*

NA*zriJt-*A_

6- netrlaninopurìna 2 - anrnopurina

[-t N -c Hl

N

htpoxanfina

\r

n tralog al guaninet

Fig. I î. Amlog alguanineí; hiporen-

tina.

H

rrí\

N

ura c ilul

o

*

5 - fl uorouractÍ

\ \o

HN )ly,

Al5-bronouracil r \.''o**r\Br'o^d "'

5 - h i d r ox t n e ! t i c : !' o z ì n i

NJ H2

N LcH2oH

oLJ

5 - b ro moc tloz;n t

NHrl'

N,ry*lil,,4.'/vN

A na logi ai uret'iluluì

Fig. '12. Analogi ai uracilului. Uracilul ; S-bromouracil ; S-fluorouracil"

5 -nettlcrfoztnà

NHrIL

N*L)NH

cHr

Analogì aì citozineiAnalogi al citozinei. S-metilcitozinà; S-hidroximetilcitozinll; S-bromoci-

tozinl,.

0

.Fig. 13.

20

diferi.te, cun,oscute sub d'enumirea cle structuri fut^ttompre. Ast-fel, rnucleel,e, structurale ale macrornoleculei ADN se caragùeri-zeazà, ,atît printr-o mare stabilitate structuralà, cît Ei prin posi-bilitàti de a se prezenta sub variante structurale. Asemeneààspecle c'o,ntra'dictorii stau l'a baza dialecticii fenomenului ere-di tal'.

Purin'eLe Ei pirimidi'nele pot r'ealiza legàturi chimice cu pen-tozele. Atomii de carrbon ai pentozel'or sînt num€'rotafi l' , 2' , 3',4' gi 5'. Cat'bonul I' a,l pentoz,ei ,s,e leagà cu a'tom'ul dre azot dinpozifia 1 al pirimidinei sau cu ato'mul de arnt dfur pozifia I alpurinei. Prin intermediul restului fosforic s€ rsalizeazà 'lqgà-turi între caflbonul 5' al dezoxiriibozei unui nucleotid qi carbonul3' al dezoxiritbozei nucl,eotidului urmàtor, forrnînd{"r-se seriilungi de asemen,ea legàturi 5'-3' sau 3'-5' în cadru,l polime-rului care stau la baza structurii primare a'maeromol,eculei ADNnepresent'atà de ro catenà polinucleotidicà de 'lungime variabilà,specificà fiecàrei specii. fuegà'turile 5'-3' sau 3'-5' r,eprezintàlegàturi internucleotidice fosfo-diesterice poval,en'te, realizatei,ntre acidul fosforic qi grupàrile hidroxi'lice (oxidrilice) al'eglucidului din pozifiile 3' gi 5', avind loc esteri,ficarea a douàgrupàri hidroxilice al'e restului f'osforic:

Legàturile, fosfodiesterice sînt foarte puternice' Ei deci stabile,pe s'eailt& lor realizîndu-se o structurà f,iniarà, nepr€zen,tînd oadevàratà coloanà vertebralà a monocatenei ADN. În structuramacr,omoleculei ADN iur,trà patru tipuri principale de nucleo-tide: dezoxiadenozintrifosfat (dATP), dezoxitimidimtrifosfat(dTTP), dezoxigu'anozintrifosfat (dGTP) qi dezoxicitidintrifosfat(dCTP). Cînd se asamibLeazà, în monocatena po,linucleotidicàacreste nucleotide ràmîn sub formà de dezoxinucleotid-5'-mono-f'osfat.

Nucleotidul prezintà o regiune specificà, ,r€pnezentata debaza arntatà Ei o regiuure nesp€cificà reprezentatà de dezoxiri-

R1I

oI

C) _-P-OHI

oI

R2

2l

rr

bozà Ei res,tul fosforic. În cadrul macr,omol'eculei, pun{ile fosfo-diesteric,e s€ stabilesc î,ntotdea,una între aceleaEi grupàri caresînt grupàri nespeci,fice, ceea ce conferà acestei pàrti a rn,a,cro-molec'ulei o mare regu,laritate, respectiv uniformitate, ce ca-racterizreazà, ,toate ,moleculele de ADN, d,e, oriee provenien!à arfi. Nu acelaEi lucru s€ poate spune despre bazele azotat€, carerepreziultà r,egiunea specificà a nucle,otid,elor, a càror înqiruirede-a lurrgul catemei pol,inucleotidice variazà de la o m'oleculàde ADN ,La alta, adicà de la o specie la alta qi aceastà orînduire,secverrfà de 'baze, az,otate, specificà fiecàrei specii, r€prezintàmodul în care ,este înscrisà, (surb formà codificatà ibiochimic) îr .^macromoleflila ADN infonnatia geneticà ce dirijeazà r,ealiza-irea diferitelor caractere ereditare.

3 3 STRUCTURA SFCUNDARÀ A ADN :

Pen,tru d'escifrarea struchrrii secun dare a, ADN au fost f o-losite metode precum spectrofotometria, rezonanta m,agneticànuclearà, albsortbfia în ultraviolet, crofrnatografia î,n raz,e X etc.Difrac{ia îm raze X a dat cel,e mai bune rezultate în d'escifrareastructurii secundare a ADN.

Primele cer,cetàri privind descifrarea structurii ADN prinanalíza imaginilor difracfiei în raze X au fost într,eprinse decàtre Astbury în anul 1938. În acelaEi an Astbury qi Bel,l ,arr

aràta,t cà macromolecula de ADN ane ro structurà fibrilarà, iarpe axa sa Lun,gà bazEle azotaúe stau perpendicular, între d,ouàbaze azobte vecine fiind o distanr!à de 3,4 A. Cele mai buneimagini ale difracliei în rare X sînt însà otbfinute în periroada1950-1952 de càtre M. H.F. Wilkins Ei Rosatlind Franklin. Prin-cipiul difracliei în raze X este urmàtorul: un fascicul, de razeX trece priurtr-o substan'tà Ei cade apoi pe o placà fotografi,cà.Dacà substanta prezimtà un aralrja,m,ent ner,egulat a'l unitàfil'orsale structurale r,azele X votr produce pe pJ.aca fotograficà opatà centra'là repnezentînd pozilia fascicului principal. Dacàsubr-rnitàfile substanlei prezintà u,n aranja,ment ordonat, ra-zel,e X vor fi d.eviate îm anumite direclii rnai mult decît în al-úele. Dacà aranjamentul subuni'tàlitor preziurtà un mode,l ce serepetà regulat, pB placa fo,tograficà vor apare benzi foarte dis-tincte între care 'existà spalii fo'arte clane. S-a constatat cà ADNcare provine de la sun$e f'oarte difurite produce prin difraclieîn taze X un model de benzi foarte clar qi aproape Ídentic

22

ceea ce deno,tà aranj,amentul ordonat al rnonomerilor în ca-dnul, macrornoleculei ADN. Ma,i m,ulú, modelul de difracfie înraze X a sugerat cà macromolecula ADN ar,e o struchrrà heli-coldaià (Frg. 14).

De o deosebità importa'n!à în elucidarea structurii secundarea ADN s-au dovedit a fi cercetàrile lui Chargaff dful 1950, princare ,s-a stahilit, contnar pàreril,or oomune dominate de con-

rq A

f O fi ---- )

.Fig. 14. Structura secunsari a ADN Stlonstantele fizice ale mactomoleculei.

23

ceplia ,tetranucleotidului lui Levene (macr'omoleculà ADN/1atoate speciile rezultà printr-o repetare uniformà a celor pa,trunucleotide), cà cele patru baze azotate principale care, 'intrà înstntctura ADN nu sînt prezente în propor{ii e,gale la diferiùelespecii. Mai mult, el a staibilit r€gula echivalenfei dupà care ,t,ot-deauna cantit'atea de adeninà (A) este ega'tà cu ace€a a timineifI) iar canti,tatea de guaninà (G)-este

"Suta cu ac€ea a citozirrei

(C) de unde rezultà un raport T/A-C/Gfoa'rte diferirte precurn Mgcofu:ctqium tubercrrtosis ansium" Soc-charomryces cereuisine, Bos tantrus sau Homn sopnens. Aces:teconstatàri cunoscute qi surb denumirea de legile lui Charga,ff aureprezentat un punct de sprijin de mane importantà pentru ,ela-borar,ea ideii împerecherilor de baze, piatrà de temelie a mode-lului propus de Watson Ei Crick în 1953 pentru structur,a se-cundarà a ADN.

Pe de altà parte studiile de hidrolizà, urmatà de s,eparareacromatograficà a bazelor azotate Ei estimarea lor cantitativà înspectrofotometrie în u'ltraviolet, efectuate de càtre Chargaff gicolaboratrorii în 1949, au aràtat cà ADN d,e la cele patru speciimenfionate anterior are o compontie în baze azotate foarte di-feri,tà, raportul A + T/G + C fiind foarte variabil la acesteorganisme, independent de lesutul sau de individul de la careeste ex,tras ADN

Tabelul îCompozlfin tn baze a AIIN

Specia Proporfia în u/o

alrlclcOm (spermà)Somn (lapfi)Arici de mareDrojdieMycobacterium tuberculosisEscherichia coliVirusul VacciniaBacteriofagul Ta d.e E. coli

31,029,732,831,7l5,l26,129,532,6

31,529,l32,t32,614,623,929,932,6

19,120,8t7 ,718,834,924,920,618,2

18,424,417,717,435,425,120,316,6*

* S-hidroxímetilcitozinà

Apar varia{ii mari în raportul A+T/G+C la di-ferite orga-nis,me (ta',belul nr. L). L'a plante,le Ei ani,malele superi,oare apareun exces de A + T fa!à de G + C. Varia{iile acestui raport nusînt întîmplàtoare. Raportul A + T/G + C este specific fiecàrei

24

speci.i, fiind ,mult mai apropiat la rorg€Inismele înmdite filoge-netic.

Sintetizînd în mod magistral date,le ecumulate în literaturade specialitate, bazafi Ei pe ,experienlel'e proprii incluzînd tno-d,elarea molecutrarà, în anul 1953, Watson qi Crick au propusmodelul de structurà bicateurarà a ADN (Fig. 14). unanim BC-ceptat, reprezentînd una dintre cele mai mari descoperiri dinistori,a Etiinfei, pentru care autorii au primit pr.emiul Nobel.Mod,eluL propus de Watson gi Crick se deos€tbea radical demodelul ,tricat€rr,àr propus de Linus Pauling qi Corey în carebaz'ele erau dispuse la exteriror Ei în care nu existau forte caresà asigure stabilitatea structurii tripiu catenare, iar unele dis-tanfe uan der Waals ,erau prea mici (Wabon $i Crick, 1953).I)e asemenea Watson qi Crick aÌu adus argumente qi îm,potrivamod'eiului tot tricatenar propus de Fraser, înaintat spre pu,bli-care chiar în perioada în care apànea lucrarea 1or. Ei au propusmodelul de structurà ibicatenarà, în cane fiecare catenà heli-calà s,e ràsucneqte în jururl aceleia$i axe virhrale Ei 'constà dilrgrupe fosfodiesterice care unesc nesf,urile B-D-dezoxiribofuralto-zice cu legàturi 3', 5'. Am,bete catene sînt orientaùe dertral,dar s€cv€nfele a'tomilor in cele douà catene sînt ori,en,tate îndir'ecfii opuse. Bazele se aflà spre interiorul helixului iar gru-pele fosfat în afarà. Zahàrul este perpen'dicular pe bazà. Struc-tura, prezin'tà repetifii (pasul eìicei) dupà fiecare 10 resturi pefiecare catenà, adicà dupà 34 A, existînd cîte un rest (baza) pefiecare catenà la fi'ecare 3,4 A. Distanta aùomuLui d'e fosfor fatàcl,e axa fiibrei este de 10 A. Fiind dispuse la exterior, gnrpàrilefosf,at sînt uEor accesibile' cationilor. Aceasta ,este o structuràdeschisà Ei con{inutul sàu de apà ,este mare. Planurile lbazelorsînt perpendiculare pe axa fibrei. Ele 'sînt r.rni'ùer prin pun{i dehidrogerÌ, formînd perechi specifice de b,az'e càci to'tdeau,na arelroc uÈirea unei baie purinice cu una pirimidinicà Ei viceversa.

Astfel, ADN se prezintà ca ,o suibstan!à ma'cro,molecularà rbi-cat,enarà, adicà alcàtuità din d,ouà lan{uri polimerice (catene)ràsucite ;plectonemicul unul în 'jurul celuilalt dupà un ax vir-'tual, rezul'tîurd structurà 'bic,aten,arà he[i'coidalà numità dublunttK*-^t*t

dubtutui helix,este de 204 avînd un pas (spirà)de 34 4.. Fiec,ar,e, spirà a dublului helix ADN cuprinde cîte 10nucleotid'e, ceea ce înseamnà cà dimensiu,nea fiecàrei baz.e estede 3,4 A.

C,e[e d'ouà lanfuri polinucleotidice sînt antiparalele, adicà launu,i legàturil'e f,osfodiest'erice, s,e r,ealizeazà între C 3' al dezoxi-

25

7

dezoxtribozà

guaninà

'' I

delr.ri ri boz6dczoxiribozà

Fig. 15. Perechile specifice de bazà A:Tgi G : Q eare stau la baza structurii

bicatenare a ADN.

rirbozei unui nudleotid $i C 5'al dezoxiri;bozei nucleotidu-lui vecin, pe cî,n'd la niveflulceluilalt lan! polinucleotidiclegàturile fosfodiesterice serearlizeazó, în seos, inver-s C 5'

---v Q 3' . Rapor,tu.l A/T -G/C: 1 a sugerat realizareaunor împ'erecheri, d'or,'eclite afi real'e Si prin modelare mo-lecularà, între A $i T r'espec-tiv G gi C. Împerecherea debaze azotate are la bazà prin-cipiul compl€mentarità{ii, celmai de seamà în organizareaEi funcfionarea rnaterialuluiereditar. Astfel, A se dove-deEte a fi complementarà luiT iar G lui C, adicà hazele

ciîosinà

purinrice prezintà complementaritate chi'mico-spafiatà pentnucele primidinice, iar bazele pri,midiuricre' prezimtà compleme'n-taritate pentru cel'e purinice (Fig. 15). Asem€in,€,a perechi d,ebaze prezin'tà dirnensiuni egal'e conferind ma,cromolecvulei. ADNun diametru uniform pe toatà lungim,ea sa. O împerecher,epurinà-purinà sau pirimidinà-pirimi'dinà ar depàqi sau ar fimai, mica faF de diametrul de 20/^ cît are în mocl nor"m,aldub,l'url he[ix ADN lipsimdu-l de reg'ulari'tate. Îm'perecherile clebarn se realizeazà prin intermediut u:rror punli de hicirogen,douà între A qi T qi trei între G qi C. Î,mperecherile sint, re-ciproce: A-T, T-A respe,ctiv G-C, C-G.

Dar legàturile de hidrogen joacà un rol foarte important înreacfiile biomoleculelor, formîndu-se Ei dezorganizîndu-se cuuqurintà fàrà a necesita surse energetic'e speciale, avînd totodatàrol esen{ial în reacliile car,e imp,licà recunoaqterea de, structuricompleurrentare cum ar fi replicarea, tra,nscrierea Ei reparareaADN ca Ei în traducerea me,sajului genetic.

Structura bica'tenarà a ADN prezintà de regulà o marestabilitate' rizicà, asi.guratà pe verticalà d,e' punlile fosfodieste-rice intraca,tenar,e, iar pe orizontalà de punfile de hidrogen in-tercatenare qi de stivuirea (stacking) perechil,or de baze ,a'za-tate în cadrul dub'lului helix, 't,oa,t,e acestea fàcînd ca ADNduhlu-catenar sà aparà ca o structurà CIarecum rigidà, para-

26

lcristalinà. Caracteristicile structurale finale ale ADN dublu-ca-tena'r sînt dictate însà de moieculel'e de dezoxiribozà care seaEazà cu ,oxirgenul inelului orientat în sus Î,n cadrul unei cateneqi ,orienta't în jos în' cadrul catenei complemen,tare. Din eauzaacestui aranjament opus al moleculelor de dezoxiri'bozà în celedouà catene Ei d'eoarece zahàrul 6e leagà la o pozitie exc€ntricàa b,azei az'otate, întreaga mroleculà de ADN este obligatà sà seràsuceascà, sà se spiraliz'eze, rezultînd nu o s'tructura dreaptàbicatenarà ci una spiraiatà dublul h,eli,t, în care fiecarre p,e-reche succesivà de baze azotate se întoarce cu 36 " în direcfiaacelor',de ceas,onnic, dublul helix fàcînd u,n úur complet (360o) 1"fiecare X0 perechi cie ,baze.

Structura polimericà a macromoleculei ADN permite în-scrier',ea în aceasta, sub formà codificatà, a unei cantitàfi deinformaiie geneticà teonetic nelimitatà. Nu,màrul, permutàrilorposi{bile este de 4n, în ,car,e n reprezin'tà numànrtr nucleotidelorde-a iungul u:n,ei catene ADN. Cunoscînd cà cele mai rnici virr.'-suri au în ADN cel pu{in 1500-3000 nucl'eotide, aceasta fiindlimita inferioarà dirnensionalà a genom,ului pentru sistemelebiologice, pute'm a:vea im,aginea enormei diversi'tàti informa-{iornaie a siste,melor 'ereditare din lumea vie, Ei ne ptrtem ex-plica, de c€ este ,posiibll ca fieca,re specie sà ailbà pnopria sa in-fonmafi,e ereditarà, rdiferità de a altor specii.

Rece,nt douà eohipe de cercetàùori, una americanà condusà deA. Rich de la Massachusetts Institute of Technology, gi altaol,and ezà (J. H. van Boom qi Gijs van der Marel) de ,la Uni-\rersitatea din Leyda au descris la nivelul unor polinucleotidesintetice de tip p,oli d (G-C) duplexuri ADN cu spirala orien-tatà se,nestrLt (ADN de stîn*ga) avînd conformalie dife,rita deADN ,normal cuno,scu't ca ADN de dreapta. ADN de stî,r\ga pre-zintà aceeaEi regularitate internà, 'aceleaqi asocieri de bazeaz,otate ca Ei ADN de dreapta, dar Ei unele difer,ente stnrrchr-rale consid'erabile. Astfel, în ADNT de stînga grupele fosfat sedispu,n, nu dupà uin traiiect rectiliniu, ci dupà 'un tra'iec*t îmzLg-zag, ADN de stînga, numindu-,se Ei ADIV-Z. În ADN destîng,a perechile rd'e ibaze sînt expuse mai spre exteriorul dutbl,u-lui helix Ei pasu[ elicei c,uprinde, nu 10, ci doar 6 perechi deb,aze, din care cauzà, forfe'le de stivuire sînt mai mici iar mole-cula cle ADN-Z apar,e mai fragilà, avînd un dia'metru cevama,i mic.

Plasarea perechilor de bazre' ,azo'tate mai spre ,exteriorul rna-cromol,eculei ADI.{-Z face ca su,bstanlele reactante sà interacfio-n,eze rnai usor cu ibazele azotate. Dacà a'ceste su'bstante sînt can-

27

rI

cerig€re, ADN-Z poate sà condilioneze transformarea rnal,ignàa celulei. StructurA de fip ADIV-Z poate sà aparà în anurnitecondifii chiar în cadrul structurii normale de ADN nativ l'a ni-velul unor anlunite segrnente ale acestuia.

Conformafii sen,estreau fost descrise la nurn,eroase polinucleo*tide sintetioe de 'tip pali-d (GC), poli-d (GC) sau poti-d (AC).poli-d (GT). Se aratà cà structura sen,estrà este accesiibilà ori-càrui segment de ADN cu o s'ecven{à de 'baze alter'native puri-nà-pirimidiurà (Arnott Ei colab., 1980). I)escoperirea, confcrma-{iei senestre a ADN extinde eno'rm limitele structurilor $ecun-dar,e cunosc,ute pentru duplexurile ADN. El,e pot fi implicate înmulte aspecte referitoare la schi,rnibàrile conform,afiona'le ale du-plexu'lui ADN în replicare, dena,turare, transcrier,e. Regiuniledextre Ei s,enestre dintr-o moleculà de ADN pot fi separate dcarde 2 nucl.eotide.

P'e baza datelor de structurà a ADN se poate deduce funcliasa de rnoleculà informafionalà Ei se poate defini unitatea func-fionalà de transrnitere a caracter,el'or ,ereditare care a fost nu-mità gènd,. Genq, reprezùntd lLn se'gmeflt, o por[iune din lnfrero-m,alecula de ADN la tost'e sisternele biologice sau de ARN (l,aribo'uirusuri) de lungime uarinbild care define sub farmd codi-ficatd informn{ia ereditard ce dirije'azd, sinteza unei ca'tene po,li-peptidice. Gena c,on{ine în m'edie între 900 Ei 1500 perechi denu'cleotide. Peste arrrumite limite de temperaturà (într'e 63aC .9i100'C) stabilitatea legàturilor de hidrogen cedeazà avînd iocdesfacerea dublului heiix.

În c'eLe douà catene complem,entare, fenomen ,numit clena-turare termicà. Cea mai scàzutà ,temperaturà de denaturare cu-noscutà este' 65"C qi se Înregistreazà în cazul den,aturàrii poli-nucleotidului sintetic poli d (A-T). Dacà amest,ecul monoc&t,€n€-lor r,ezultate din denaturarea dublului helix de ADN se ràceqtebrusc ele rà'mînd permanen,t separate' gi un asemenea ADN sellumeq.te ADN denntLdtr'at. Dacà amestecul de rnonocatene se rà-ceEte lemt, treptat, are loc o reasocier,e a catene'tror cu refacerealegàturilor de hidrogen di,ntre el,e, r,estaibilindu-se structura bi-cat'enarà a ADN. Acest fenom,en s-a numit rennturareq ADN(Fig. 16).

Temperaturà de denaturare p,oate constitui un indiciu indi-rect privind prooentul d,e baze azotate din struct,ura ADN. thirADN în care predominà perechile A-T, între care existà 2punfi de hidrogen, v8 prezent,a o temperaturà de denaturare maimicà deeît un ADN în' care predo,minà perechite G-C care,prezentÎnd trei punfi de hidrog€D, sînt mai rezistente la dena-

2B

cíe'cturare

-

Fig.

Fit. 17. Temperafura de de-aefurare a ADN de la diferitesurse, avînd un confiuut va-riabil G+C (dupA J. Marsrur

$i P. Doty, 1959).

ilAf,aH

AD I{

z,"qJqnr

"toC*C100

BO

60

?0

0

40

r &4: j: gj:

ADN AR N ir,rlerenicn

16. Denaturar_ea.gi renaturarea aDry (A). Denaturarea gihibridarea molecularA (B).

Hycoba cterrun phlei

29

F-

turare, nec,esitînd pentru aceasta o temperaturà mai ridicatà(Fig. 17).

Prinr denaturare-r€rrsturare se pot rea,liza hibrizi ,moleculariîntre ADN ,ce provine de la diferite specii, putîndu-se apreciagradul de înrudir,e dintre specii pe criterii rnoleculare. Astfel,dacà renaturarea ADN homolog e,ste teonetic de 1000 , renatu-rarea ADN heterol'og (ce provine de la specii diferite) esúe înfr-rrrcfie de apropierea filogeneticà a speciilor (7So7o între ,om Eimaimuta Ei 250/o în,tre om Ei goar,ece, bu'nàoarà)

Hilbrizi moleculari pot fi realizali Ei între ADN Ei ARN, iarcînd aceastà hibridare se realiz eaz,à, in si;tu, se pot loca,liza pecr'omozomi genele care dirijeazà sinteza diferitelor categorii d,eARN celular.

3.4. STRUCTURI TAUTOMERE

Prin deplasarea unor atomi de hidrogen de la un atom deazot sau ,oxigen d'e la o ,grupare l,a alta a nucleului purinicsau pirimidinic, fenomen numit migcare tautomerà apar formeletautomere ale inelului purinic sau pirimidinic care 'trec de la

l-lI

NJ-HI

1;':-/'-\C/\rll \illr'HàFì Cì'.-1 rr/C\ /

r,l NH

Adentna :f orna antnOJ Adentna ( forp; tmíno,

OHI

l^\r,

y/ \ c-c H.

i lL,, J

o=i\ ,/cHNH

Ttornà ( forn.: enoliciI

tautomere.

**r'HC\

NHtiC -N\C

tl \.u,/\-,t'

NNH

'aÚtú

roe ra

,e' -T Aó?''/ il

%,'cxt

O:C

c-cH"t'I --'>

\ ./cHNH

Itnt. ) {rornA: cetonrca)

Fig. 18 Structuri

30

forma amino (NHz) la forma imino (NH). AceIaEi lucru se în-tîmplà ctr atornii de oxigen legali de atomii C6 ai guaninei qitiminei cane au în mod normal forma aeto (C:O) qi care Înurma miqcàrii tauto,mere trec în forma enolicd (C-OH) (Fig. 18,19).

MiEcarea tautornerà creeazà posibilitatea împerecherii gre-site de baze azotate de tip A-C qi G-T, fenomen care poartàîn sine ca'uzele apariliei de mutafii spontane (vezi procesul mu-tagen).

/(

,W,ì4/

- ')n,n,wo

-''

í-- . .-

NHz

6 (nornalà ceto)

,0C r4ornalé anino)

rv N Hz.

G4 (f orna rarà enattrè )

NH

1/\t,---r/

,N \r

Cf r f orna rarà inino;

Fig. I 9. Tranziliile tautomerice d.e la formele comuue, stabile ale bazelor azotate(A, T, G, C) la formele rare, tautometice (A*, T*, G*, C*).

31

N

A ( oornalà antno )

3.5. EXCEPTIE DE LA STRUCTURA BICATENARA A ADN

Cercetàrile lui Sinsheimer (1959) efectuate la bacteriofagutg XL74 a:u aràtat cà ADN la acest virus prezin,tà o structuràcare nu se încadreazà în modelul de structurà bicatenarà. ,El nuprezintà o structurà complementarà, fiind atacat de càtre losf odi-ester'ozo, extrasà din E. col;i, acliunea acnestei enzime fi,iurd in-eficace pe structurile bicatenare de ADN. S-a tras aoncluziacà ADN de q X174 este monocatenar, adicà s€r prezintà în modn,ormal ca structurà primarà, apàrînd ca o mol'eculà ci,rcu'laràde ADN mornocat'enar (Fig. 2q. O situa{ie asemànàtoare s-a evi-denliat gi la atli bacteriofagi precum q^R Ei StB. Asomenea ca-zurí în care ADNT se prezintà îm s,tare naturalà ca strucfuràmonocatenarà ne sqgerc azi cà de fapt la toaùe sistemel'e tbio-logice ar fi po'sibiià înscrierea informaliei ereditare în structurimonocatenare. Starea dublucatenarà nativà a ADN Ia covîrgi-toarea m,ajoritate a 'sist,em,€1,or biologice este o stare redutantà,r'eiteratà. Dar cum înseEi s,tructurile monocatenare devin întimpul replicàrii structuri dutblu-catenaffi', însea,mnà cà naturaa avut o anumità ,,rafiune( de a-gi baza realizarea fenome-nului ,ereditar pe structuri dublu-catenare. Dealtfel natura faceun foar,te interesant joc de duplicitate, începînd d,e la pereeheade'baze azot'ate specifice, structurile du'blu-catenare, structurilecromozomale bicroma,tidice, existenîa structuril,or sernicnomati-

Fig. 20. Bacteriofagul OX 174. a. particule fagice intacte colorate cu ecetat d,euranil ; b. cromozomal circular (ADI{) moîlocatenar de OX 17 4 (dupà Finch,

Dressler gi Wolfson, din Goodenough gi Levine, 1971).

32

dice qi contiqruînd cu existenta a d,ouà seturi de cromozomi îngarni'ttrra diploidà (numàrul, d,e cr,omozomi variazà 'd,e la 1 laprecariote tra cel pufin 2 (Ascorris megaloceplwla uniuq,tm,s) sau4 (HWlopappus gracilis compozità) qi ajurgfnd la ordinul aB, 10, 20,100 qi mai mu,lfi la al,ùe eucariote (Lima-de-Fari.a însà,consiclerà cà oric,e celulà 'eucariotà are de fapt nevoie doar de3 crornozomi: un autoz'o,m pe care sà fie plasat'e majoritatea g€-n'elor, un cromo zom de sex care sà intervinà în determinareas,exului qi un cromozom organizator nuel'ear eare sà posede,genele nucleolare) apoi douà sex,e separa,te, implicînd douà ti-puri Ce gameli diametral ,opuse qi terminînd cu larg raspîndi-tele cazuri d,e simetrii ale naturii (sà luàm doar fiin@ timanà,doi ,ochi, douà urechi, douà nàri, douà mîini, douà pícioar€, . . ,e,te . . .). Complernentaritatea apare ca o condi{ie esenlialà îndesfàgLlrarea multor fenomene ale naturii. În cazuL ADN, com-plementaritatea catenelor din structura dublu-catenabà est'eesenfiaià în procesele de replicare Ei transcriene, iar 'existentaa clouà caten,e apare ca o ,,grijà( a naturii de r asigura ,trans-miterea fidelà a informaliei ereditare în condiliile în carre feno-menul mutagen ar afecta urr-à dintre cele douà catene. Dacà mu-ta{ia afecteazà o structurà monocatenarà gansa d'e a transmitefidel irnformafia ereditarà este practic nmlà, p€ cînd în cazulstructurii dublu-catenare aceastà qansà este de 500/* Dealtfe},vom vedea cà în cazul reparàrii 'leziunilor din ADN induse demutageni, integritatea uneia dintre cele douà catene ale dublu-lui helix ADN devine esentialà, condifie sine qua non a reuqiteirepaieirii. Este d,e la' sine înleles cà aceas'tà ,,gii;à" a ADN, sprea-$i asigura înd'eplinirea funcfiei sale, ru are nimic d'e-a faoecuaspeót"d,eteléologie. ' ''' :l

3.6. c.$urarEA DE aDN gr TNFoRMATTa EREDTTARA

Canr' fuuu relativà de ADN poate fi apreciatà citofoto,metricprin anatifa nucleilor interfazici colonafi cu leueofuxinà (meto-da Feulgen-Ross'enbeck). Cantitatea dp ADN este specificà fie-càrei specii, €a menfinîndu-se consta,rftà de Ia o generafie celu-larà ia alta. În ciclul celular (perioada dintre douà diviziuni suc-cesive alcàtuità din in,terfazà Ei mitozà) se r,emarcà o.trecere acantitàtii de ADN de la ,o valoare considera'tà diploidà .tipicàpentru fiecare specie (2 C) gi care se înregistreazà ,1a' sfîrEituldiviziunii nuclear€,' cînd nucleii fii trec în interf azà; la dubla-

3 - Descifrînd tainele ereditóiii, vol. I 33

rea ac,6tei cantitàti de ADhT (4 C) în timpul interfazei. La ur-màtoarea diviziune nuclearà prin intervenlia aparatului mitoticcantitatea dubtà (4 C) de ADN va fi distrirbui'tà echilibra,t înc,elulele fiice, acestea primind o aceeaEi canti'tate diploidà (2 C)de ADN.

Mitozn apare astfel ca un mecarrism ,bi'ologic fundarnentalcar s asigurà constanta cantitativà a ADN-ului în succesiuneag'enerafiilor celulare. Nlitoza apare astfel ca e permanen:tà le-gàturà între trecut Ei prezent, asigurînd transmi,t,erea unei ace-leiaEi' cantità{i de informalie geneticà de la celula ma,mà lacelulele fi.ice (Gawilà Ei Dàbalà, 1975).

S-a mai constatat cà în gamefi (celule sexuale) cantita'tea.le ADN este r'edusà la jumàtate fa!à de can,titateia dipl,oidà ca-r,acteristicà speciei considera,te (2 C). Din aceastà cauzà, gaffieliisînt haploizi (cantitatea de ADN:lC). Totodatà s-a constatatcà în gameti numàrul de cromozomi,est,e redu's Ia jumàtate fa!àde celulele somatice (toate celelalte celule a1e organismului. Prinunirea gamefil,or de sex opus, în pr,ocesul fecundàrii, s,e re-stabileEte cantitatea, n,ormalà de ADN caracteristicà speci'ei date(1C + 1C=:2C). Ga,melii apar în urma unei diviziuni celulane detip specia'l numità meiozd,, aceasta fiind de fapt o diviziune dereducere (îniumà'tàtire) a numàrului de cromozoml Ei t,otodatàa cantitalii de ADI.I. Meioza apare ca u,n mecanism compensa-toriu al fecundàrii, obligatoriu la or€anismele cu reproduceres'exuatà care previne màrir,ea exponenfialà a cantitàtii de ADN,ce ar avea loc în condiliile unei fecundàri a gamelilor a càrrorcantitate de, ADN nu ar fi redusà la jumatate comparativ cucelule,le somatise.

ADN-uI se caracterízeazà printr-o nemarcabilà c'onstan!àcantitativà riguroasà dea lun,gul generaliilor c.elulare, ceea cen,u 'este eazul altor com,ponente macromoleculare atre' celulei(proteine, acizi ribonucleici etc.) care prezintà varialii canti"ta-tive evidenùe nu numai de-a lungul generaliilor celulare darehiar în cadrul diferi'ùelor ce'lule ale aceluiaEi organ'ism ia unm,ome,nt dat. Recent, s-au adus multe date în sprijinui unorexc,epfii de ]E rqgula cronstenlei valorii canrtitaúive a ADN, înciclul celular, rearlizînd'u-se vari,alii aùe cantitàlii de, ADN prinmecanisme de replicare diferenfiatà a ADN (Nagl, 1978, 1979).

Prin experirenle de marcar,e cu izotopi radioactivi (1tr3, CI4,P31 s-a constatat, cà radioactivitatea odata încorporatà în ma-cromoleeula de ADN (de exemplu timidina tritia'tà timidinaH3 este încrcrporatà în' ADN în locul timinei fiind un pre-cursor al acesteia) nu o mai pàràseEte atîta timp cît celula trà-

34

ieSte, c€ea ce înseamnà cà, odatà sintetizatà, rnacromolecul,a deADN nu ma'i este dezagregatà spr€ a fi resinrtetizatà. Aceasta în-seamnà cà spre deosebire de alte oomponente macromolecularecare sqrferà turnover rapid (degradare Ei resintezà ,cu sctrirnibcontinuu de ,atomi) macromolecula de ADN se caracterizeazà,prfu:tr-o,rnare stabilitate.

Urmàrind cin,etica' renaturàrii ADN-ului denaturat car€ apar-line la specii diferite se coxLstatà cà cu cît specii'le sint rnai apro-piate filogenetic cu atît proeenúul de refacere de strtreturi du-blu-catenare este rnai mare, ac€;asta deoarrece speciile a'propiatedin punct de vedere fiL,ogenetic prezintà într-o proporfie maimare succesiuni similare de baze azotatn în macromolecula lorde ADN, adicà pr,ezintà u,n anumit fond de informafie eredi-tarà co,nnunà. Acest fapt ne face sà gîn'dim cà ,evolufia speciilors-a desfàqurat în principal la nivel molecular.

3.7. STNTEZA REPLICATIVA A ADN

Deoarece ADN confine informatia geneticà a celulei, sintezasa este unul dintre cele mai importante evenimente din via,faacestei,a.

Realiza,tà prin intervenfia unui cornplex aparat errzimatic,sinteza ADN este o reaclie de tip repficativ, fiind ,rrnicul cazdin lumea biomoleculelor în care o substantà îqi dirijeazà prc-pria 'sa sintezà. Complexul de replicare care include aparatulenzimatic Ei molecula, de ADN în replicar'e se num'e$te repli-to%ouotura

tbic,anrtenarà se dov'edeqte €ù avea implicafii ,biolo-gice dintre ,cel,e mai profunde, dar prezintà Ei un foar,'te iqLtere-sant punet de dezbatere filozoficà ea expl,icînd, cel pulin înparte, unele dintre misterele vielii.

In uirso, sintez,a aeí,zilor nucleici (ADN gi ARN) s,e d.esfàqoaràîn trei etape:

a) stnteza precursorilor nucleotid'elor purinice qi pirimidi-nice adicà a acidului uridilic Ei a acidului inozinic (Frg. 2I);

b) sirnteza nucl,e,otidelor propriu-zise care intrà direct în al-càtuirea macromoleculelor acizilor nucleici (dezoxiadenozintri-fosfat (dATP), dezoxiguanozintrifosfat (dGTP), dezoxicitidintri-fosfat (dCTP) qi dezoxiti'midintrifosfat (dTTP) pentru ADN;ad'enozintrifosfat (ATP), guanizintrifosfat (GTP), citidintrifosfat(CTP) qi uridinúrifosfat (UTP) pentm ARN;

35

Acid uridilh ( UMP,

lnterconrersbpirimidinnudeo-

tldicó

Ì

I

I)l=!crloI

itl

2É.

f u'io;nlrilosfot ( Uf P)

Citidintritosfot (CTP)

Guonosintrifosîot (GTP)

Adencíntrrfosfot (ATP)

Dezoxitimidintrifosfat (dTTP)

Dezoxicitidintrifosf ot (d CTP

Dezoxíguonosintrifosfot (dGTP).

Dezoxiodenozintrifosfot (dATP)

Acid inosinic ( IMP)

Fig. 2l . Cóile bioslntezei nucleotidelor.t

c) polirn,erizarea ordona,tà a nucleotidelor într-o secventàcamplementarà unei matrife (dupà modelul semiconserl'ativ) subcataliza unor enzime polimerazice celulare.

Sinteza in uitro a ADN a fost realizatà de càtre A. K,orn-berg, I. Lehma'n,n, M. J. Bessman Si E. S. Simms în 1'J56, însisterne acelulare folosind un echipamern't enzimatic polim,era-zic extras de la E. coli (ADN potimeraza I sau enzirna lui Karrl-berg) în prezenfa ionilor Mg++ $i a unei matrile ADI{ înait-poiimerizatà.

Sinteza in uitro a ARN a fost realizatà pentru prima Catàde càtre Marianne Grunberg-Manago Ei Severo Ochoa de LaUniversitatrea din New York, în anul 1955. Pentru aceasta aufolosit un sistem ,enzimatic ARN polimerazic, ionii metalici ,bi-valenli (Mg++) Si un segment ADN ca matri!à.

Mecanismul de replicare ssmiconseruatiud, a ADN pr€:supunesepararea ca,tenelor complementar,e prin desfacer,ea punlilor de

36

lnFrcqrversieprrh-rruc.leo-

hidro'gpn, fiecare catenà servind drept matri!à pentru sintezaunui noi catene, complementare, refàcîndu-se a,stfel structurabicatenarà a noilor macromol,ecule ADN care vor avea astfelcîte o cat,enà veche Ei alta nou sintetizatà,. Acesta este modelulsernicanseruatiu de replicare a ADN. Prima dovadà experimen-tatà în spriiinul m,odelului semiconservativ de replicaró a ADNeste aclusà ia nivel cromozomaì de càtre H. Taylor (1957, 1958)în sistemele eucariote qi în acelagi timp, la nivel molecular', decàtre meselson qi Stahl (1958) în sistemel'e procariote (8. coli).

+vrIncà din anul 1950 Srvift aràtase cà replica'rea ADhl încelulele eucariote este restrînsà doar la inteif azà, la un stacliupe care Flowarcl qi Pelc l-au numit stadiu ,,So', separat cle ctivi-ziunea pr,ecedentà printr-un stacliu G1 (de gol sintetic) qi urmatde trn stadiu G2 în care, de asemer€a nu se mai sintetize'azàADN. G1 este f'oarte varia,bil durînd de La 3-4 ore, la zile, sàptà-mîni qi luni, depinzînd de tipul de celulà gi starea fizioiogicà(Gavrilà gi Dàbalà, 1975) . G2 este mult, mai constant, clurînd2-5 or,e iar S clureazà 7 -B ore. Pregàtirea nucleului pentru re-plicarea A.DN se face . în Gt, fapt demonstrat de expuner,e,a,prin transplant a nucleilor, Ia citoplasma celulelor aflate înGr (nu qi în atte f.aze) care aratà cà ace;ti nuclei i,ntrà de îndatàî:n stadiul,S, de sintezà a ADN. În 1957 Taylor, W.oods $i }lughesau efectuat experienfe ,autoradiografice la cromozomii cle Viciafaba, folosind timidina tritiatà (3H) precursor al timinei. Radi-celele crescute pe mediu cu timidinà

-3g au pr,ezen,tat crorrt:o-

zomii uniform rnarcali pe toatà lungimea 1or. Ele au fost apoitransferate pe rnediu fàrà timidinà tritiatà (mediu ,,rece'(). Iì,a-dicele au frost tra,tate cu colchicinà pentru a fi prevenità for-marea fusului de diviziune astfel cà produgii replicàrii fiecàruicrom,ozom ràmîn unili la nivelul centromerului. S-au efectuatpreparate citologice pentru cromozomi dupà un ciclu cle divi-ziune, dupà douà cicluri etc. Cînd au fost analizat'e autoi'aclio-grafic aceste preparate, autoradiogramele cromozomiior" clinradicele cultivate pe m,ecliu cu timidina tritiatà prezentatr am-bele crornatide marcate radioactiv (FiS. 22). Cînd s-au efectuatpreparate din raciicele cultivate pe rnediu radioactiv qi apoitransfera.te pe mediu neraclioactiv (fàrà timidinà

-lH), pentru

un singur ciclu celular (o si;ngurà diviziune). cromozomii dinaeeastà a doua rnetaf azà, statrn'ochineticà cl'e clupà mal'careprezentau o cromatidà rnarcatà qi alta nemarcatà. Aceasta afost prima dovadà experim'entalà certà în sprijinui modeluluiserniconservativ de replicare a ADN. El a fost dovedità gi laalte organisrne veg€tale pi:ecurn Crepis gi Belleuolia. Dar ela

37

r

:/

a doua nefafaúsf afncchineticàdrp; mdi'ca re

( o c í'ona f ,,Cà rna rcafí' si a rf a na narraté I

Fig. 22. lVIodelul replicórii semiconservative a cromozomuiui eucariot (duplt(Taylor, Woods gi Hughes, 1957)

o d,ovadà inclirectà a replicàr:ii ADN, prin care de 'fapt s,e do-vedea replicare,a semicons,ervativà a cromozomi'lor.

Dovadà directà, la ni.vel m,olecular, a replicérii semiconser-vative a ADN a fost adusà în 1958 de càtne Mese,lson Ei Stahl,prin experienfe de transfer izotopic (FiS. 23). Autorii au cres-cut pentru multe genera{ii ceLular.e E. col,i pe mediu în car'e în

Mode(e de obsorbfre UV dupòcentrilugort

Aspcctut. -totogrcfterit tn

UV

Crenerofic 1

ADN extros din!,octerii trons-f r:rote pe mecíucu lltN

Fig.23. Reqrezentarea graficà a experieufet lui Meselson Si Stahl (1958) .L - light: u$or'i"S;tilr J" ;^ó:Tffi*i:t(til ffi ilHPir#r.-

heavv

3B

duprcare ctt :[:#,!;:::í;3 c,tpticare ràrilintdinà frÌtrafà dupà marceie linrdinà frifíatà

(anbele cranalidenarcaf e )

:ffi

lnbrptltqrein tcrm6É deruptrcore

ccmiatìserntivó

J^/\,r!

sursa, de anlt (NHrrCl) iurÉra nu azotul normal' 11'N ci iz t,opulsàu greu 15N, astfel cà în macromolecula ADN atomii cle Nerau r€prezentanli de 15N. În prealabil s-au fàcut cercetàri deultracentrifugare qi s-a constatat cà ADN cu 1r'N bande azà di-ferit (mai sus în tubul de centrifugà) fata de ADN cu 15N carehande azà la un nivel inferior, spre fundul tubului de centri-fugà. Dupà cre$terea bacteriei pe mediu cu 15N pentru rnult,egenerafii, celulele sînt transferate pe mediu cu t4N pentru adesfàgura un singur ciclu de diviziune (a càrui duratà eraprecis deterrninatà 90 minute). S-a extras ADN Ei s-a ul'tra'-centrifugat. S-a c,onstatat cà a,cest ADN ,bandeazà la un nirtelintermediar în,tre 14N qi 15N. Cu alte cuvinte acesta era un ADNhibrid, în care o catenà prezenta ca atomi de N, azotul normal14N iar catiena complementarà prezenta izotopul greu al, acestuial5N. Dupà douà generafii celulare d€ 'la transfei pe mediu cu14N se constata cà prìopor{ia de ADN hibrid 14N

- 15N scade la

jumàtat,€, cea,laltà jumàtate fiind repr€z€ntatà de ADN cu 14N,

dupà trei generalii raportul dintre' cantitatea de ADN hibricl qiADN c,u 14N este de 1 : 3 q.a.m.d. (Mode1 semiconservativ dereplicar€ s ADN propus de càtne, Wafuon gi' Crick în 1953)"

Mod'elul semiconservativ de replicare a ADN asigurà ocontinuitate a fenomenului ereditar, càci cele douà noi' mole-cule bicatenar'e de' ADN sîn,t identice pe de o parte între ele,iar pe de altà parte sînt identice cu uurcromolecula inilialà(parentalà) de ADN ca,re $i-a ,,topit(( iidentitatea în sintezarnoleculelor fiice. Primul eveniment a} replicàrii ADN ,estedesfac,erea, separ,area catenelor complementare aLe dublului he-lix din care cauzà molecula de ADN }'a punctul de replicareare formà de U, aceastà structurà fiind,,, numità bifurcagie dereplicere. ADN este replicat cu ajutonil unui complex multi-enzimatic nurnit' ,,aporat de rep1icare66. Ansamb,lul de eveni-rneur,te care realizeazà, replicar,@ ADN a fost conve,nfi,onal îrn-pàrlit în inifierea, continuarea Ei terminairea replicàrii, etapecare se pot întîlni Ei în sinteza altor 'rnacrornolecule informa-fionale' (ARN Ei pro'teine). ADN natural se aflà sub formà destructurà ter{iarà, structurà în car€, el este superspiralizat. Laeucari,ot,e tururile superspiralizate din ADN liniar rezultà înurrna asocierii sale cu proteinel,e bazice, hist;one; pe cîndla procariotele, Ia care macromolecula ADN ,este circularà, tu-rurile superspiralizate sîn't formate prin intervenlia unei en-zime speciale care s-a nu,mit ADN Eirazn, aceasta aclionîndchiar din, m,omentul replicàrii. Tururile superhelicale pot sàaparà Ei'ca rezultat aI desfacerii (desfaquràrii) dublului helix în

39

rtirnpul replicàrii. Din cauza vitezel mari cu care ar€ loc. des-ràsuci{ea dublului helix în fata bifurca{iei d'e replicane, rnaiales ia moleculele :ci,rcular, .închise rse forrae azà o supe,rspirali-zare, astfel cà o ,etapà' necesanà, în replicarea ADN ,€ste ,îftd,o.'.pàrtarea structurilor terfiare superspiializate, În scast, ,procesintervin enzime care, ralaxeazà, tensiunea de ,,:ràsucire, ,princrestat"ea unei catene înaintea 'bifurcafiei gi astupapea ;acesteicrestàturi dupà ce s:-a reaLizat relaxarea. Aceste erìZime, s:€runumit enzim,e de crestore-,ast'ttpw€, descrise atît la procariotecît qi ia eucariote. S-a mai descris Ei ,enzirna Al)N=topoízorne-TazQ, o enzimà care introcluce ,o crestàturà morl,ocatenarà tran-zitorie în duplexul ADN, oferind astfei LtR pivot pentru clespi=raliz.area superhelicelor. : ì

Pentru desfacerea, ,punfilor" de hidrogen dintre ca'tenele corn,-plementare în veder,ea replicàrii inlervine o enzinrrà destabili-zatoal"e a dublului helix care a fost numità unusindszd.,

Catenele compl,ementare separate funcfiori.eazà ca rnatrifàpentru sinteza de noi cate'ne complementare. Nucleotideie 5'*trifosf at libere din mediu se aliniazà pe matri{à, împerechín-clu-se cu bazele complementare d,e pe aceasta cu italbilireaunor Punli cle hiCrogen. Enzima ADN polimerozq dependen,tàde ADiV catalizeazà formaiea legàturilor covalente : fosfodies,terice dintre nucleotidele învecin",ate. Inilial a fost descrisà €rrrzima polim,erazicà. ADN polimnraza I sau enzi'ma tui Kot*rt-berg ca avînd rol esen{ial în replicsr'e, dar cercetà,ri ulterioarqau stalbilit cà ea intervine ,nu*ui într-,o etapà ulterioarà a pr.o-cesului ar'înd rol esenfial în sinteza rep.ara,torie. As tàzi estgurnanim acceptatà, interve'ntia în etapele inifiale a;le,. neplicàr:iica Er în alungirea catenei nou sintet íz,a'te a enzim,ei polim,era-zice dese,m;natà ADN pol,imeroaa III. ,

Toate enzimele polimerazice eu capacitatea de a alungi nu-mai catene polinucleotidice deja existent,e,,rlu însà'Ei de a ini-tia sinteza ,,de no'vott ,a unei cate,ne. Pentru aceasta ele rl€ce-rsità un elem'ent ajutàtor prin car,e se: primeazà (i,nifiazàl o as,e-rn€rr,ea sintezà. În calitate de primer poate fi folosi,t ,un micsegment de ARN lung de cîteva nucl,eotid'e. De aceea primule'v"eniment în replicare dupà destabilizarea (,,topirea{t) dubtruluiheiix este si'nteza prin in,tervenfia enzimei ARN pattmerazd, 'aunu$ ARN primer. Acesta oferà ADN polimerwzei un capà't3'-OFI liber al càrui nuclmtid,este împerecheat cu,o bazà oorn-plementarà din matrifà. Acurn, ADN pcttimero,za, catalizeaz,&reacfia de cond,ensare a acestei grupe 3'-OH a prim,erului ,$ia gr.upei 5'-f,osfat a', primului nucleotid 5:-trifosfa.t a,l.iniat pe

40

rnatritrà,'',cui realizarea primei ,le,gà'turi covalente f,osfodiesterice.Replicarea ,ADN este ,astfef ini{iatà. Are loc alungirea noiicatene, ;capàtul ,3f-OlI al fiecàrui, nucle,otid aliniat servind defiecare datà ca prim,er, din care eauzà catena de ADIV nou sJn-tetizatà' se mai numeqte Ei ADN primer. Proeesul continuàpînà 'ce es.te f,olosità întreaga matri!à avînd loc sinteza cîteunei caterr-e complementare matri$el'or cu forrnàr€a,

. €t douà rno-lecule fiice identice de ADN.

' Toate' ,ADN pólimerazele dependente de ADN pot catalizaadàugarea de nucleotide Ia o càtenà primer numai ca ràspuns(în virtutea eomplementaritàtii bazelor azotàte) Ia secvenla d,ebaze pe'care or gàsesc pe o a doua catenà, batena matri!à. Ast-fel daeà un grup 3'---OH lib,er de pe o catenà primer stà 'opusun'ei tirnine pe catena matri{à (ternplate) polim eraza va, per-mite atagdrea numa,i a unui dezoxiadenozintrifosfat (dATP) laca,tena ,pfim€r chiar dacà dCTP, dTTP qi dGTP se aflà fur :me-diu. Cîttd în mediul de reactje' sé aflà un 'ànnestec confínÍndADN ,polimeraze gi nucleo ztd-trifosfafi împreunà cu fragrnentedE ADN; ''aceste 'fragrnente pot servi atît ca primer cît qi carn6itfità,. . , ;

Polaritatea opusà a catenelor-matri{à, 3'-+5' a uneia Ei5'+3' a celeil,alte a, ridicaú problema existentei ,a douà poli-meraze cane sà dirijeze potiùerizar€a, rtna în- direclia 5':r3' ,alta în 'directia' 3'+5i, Aici s-a înregistrat dilema centralà a

r. -.' a. ' '

replicàrii ADN dat fiind faptul cà nu au fost descoperite douàenzime' p-olimeraziee care sà polimeriz'eze în direcfii opuse.Cercetàri' recente au stabilit însà cà în repliea,re intenvine osingurà enzimà esen{ialà , ADN polimereza III, car,e are speci-ficitate de direc{ie, nu de se,cven!à de nucleotide. Astfel, ,aceastàenzimà se deplaseazà numai în direcfia 3'-+5' pe anlbele ca-tene-rna,tri!à, determinînd polimerizarea noilor catene (replici-lor) numai în direc{ia 5'--+3'. Comportamentul polimera'zei IIInu este în acord cu m'odelul ini{ial d'e replicare propus deKornbefg, în qare s,e acorda rol ,esenfial enzimei ADN polime-raza, I, enzimà care ar fi determinat o sintezà continuà a noi-Ior catene.' Experienle1e de fftfrrcare pulsatorie (pentru scurt!imp) cu timidi'na tritiatà ef'ectuate de càtre Okaiaki Ei colab.fntr-e ,19:59-1970 au adus dovezi ,pentru existenta unui modeldiscontinuu de r,eplicare în care, noile catene sînt sintetizate pesegmente micicleotide, cpre'apoi sîn! urrile prin punli fosÎodiesterice eovaLen-te ,Frip 'aetivitatéa enzimei, ,ADN-ligwo în segmente mai mariqi în ultimà instan{à:,reZUltà,'o'catenà continuà nou sintetizatà,

4t

i

I

I

I

III

I

I

replieà a matri{ei (complem:enta'rà ,ac'esteia). În aces.t caz, sin-teza fiecàrui fragment Okazaki este prim,atà d,e urr segm,ent d.eARN primer sintetiza't prin intervenfia ARN polimerazei. Dupàsin,teza fragmentului O,kazaki, ARN primer este excizat. Golulràmas în urma exciziei este umplut prin activiúatea polim'era-zei f. La 'nivelul ,bifurcafiei de replicare sinteza fr,agmentuluiOkazatki se continuà de pe o catenà pe cealaltà, ADN polflme-raza III sàrind de, pe .o ca'tenà pe cealaltà Ei det'ermi,nînd pli-meriza,rea pînà ce întîIneqte originea ,replicàrii în cazul pri-mului s,egment replicat sau bariera segmentului ADN dejar,epJicat în cazul urmÉúoarelor segrnente replicate. În ,acest cazintervine o ,enzimà grtdonuclewicd, care deterrninà o incizi.e ,rno-n,ocatenarà în segmentul ADN nou sintetlz.at ce s'e continuà depe ,o catenà pe cealaltà în urma càreia apare un capàt reactantS'-OH fàcînd ca procesul de replicare sà s,e continu€, iar bi-furca{ia de replicare sà se deplas,eze secvenfial de-a lungul în-tregii matrife avînd loq o progresivà desfàEurare a dublului-helix (Fig. 24A). Acesta este modelul ,,cufitului qi furcul,itei"propus de R. Barzilai qi C. Thomas ca o variantà a modeluluipr'opus d'e Okazaki qi colafboratorii în ca,re în cadrul sintezei

A?

B3'

,"/ 5'

g t'/y,,/

3',

tit 5'

3;

1'jr 3'l

Ictt

'lt3'f

"5{

Fùg. 24A. Replicarea ADN dupó mod.elul Okazaki-Kornberg. Se prezintà osecvenfà de evenirnente (a-d) de despiratizaÍe 9i de replicare segmentat5- lanivelul bifurcafiei uuui dublu-helixADN.ADN-polimeraza catalizà;sinteza ADNnumai în direcfia 5'-+-3', d,eplasîndu-se pe ambele catene-matrifó d.oar în direcfia3'-;-5', sórind., 1a nivelul hifrrcafiei de pe o catenó pe celattà, a) Despíralizareadublei-elice (blocurile negre reprezintó puncte de inifiere a segmentelot Okazakiputînd fi scurte fragmente de ARN-prímer). A gi B reprezintà catenele-matflla.b) Pe mà,sura despiralizàrÍi, o po$iune din catena B ràmîne tenporar sub formàînonocatenaró pînà ce o nouó moleculà de ADN polimerazó pàtnrnde la nivelulbifurca$iei spre a umple golul. c) ADN polimeraza determinà pe catena A (cate-na hdding : "**;,:1!fi#;fl:r ;nHffiJf ,:**,*,:ffi:'

B (tagging :

42

discon'tinue se sintetizeazà segmente scurte de ADN ataEate lamatri{à numta,i prim intermediul punfilor de hidrogen. Dupà oscurtà perioadà de sintczà, pe una din matrife, un segment mo-nocatenar al, celei de-a doua catene parental,e (matri!à) stàexpus. Intenrine o & doua molec,ulà de, ADN pol'im,erazà. la ni-velul bifurcafiei qi copiaz.à acest sqgment expus al celei de-adouà ''maf'rite''în direcfie invensà fata de prirna matri!à (datafiind plari'tatea lor opusà) dar în aceeagi direefie ehimicà per-misà, adicà 5'+3' ca pe prima matri!à.

Mode.lul de replicare discontinuà propus de Okazaki a fostunanirn aca€ptat qi s-a dovedit a fi aplicabil la toatq siste,melebiologice. Este posi'bil ca repficarea pe o caùenà sà fie înaintatà(sau unires segrnentelor Okaraki sà fie mai rapidà) iar pe cate-rur comple,mentanà sà fie rnai întîrziatà (Fig. 248).

Replicarea este' reac{fa' cea mai importuntà din lumea vie Eidesfàqurarea ei cade, dupa cum este Ei firesc, sub incidenlaunui strict control celular. Controlu,l este efectuat la mairnulte nivele. L.a, nivel molecular existà mecanisme care asiguràoorecfia repli,càrii càci o bazà azntatà, greEit î,mperechea,tà cub,aza complementarà din ma,tri!à face ca desfàqurarea polime-rizàrii sà nu fie continuatà pîd c€ nu este îndepàrta'tà bazaaaotatà gregit împerechsatà. La beza unei asemenea activitàtide corecfie stà re pare activitatsa ADN polimerazei f. Greqetilede încorporare datorate acfir.rnrii unor agenfi mutageni sau iare-fieaciúàîii în corecfie a ADN polimerazei I stau l,a baza unuiadintre ,mecanisme,le de apari{ie a m'utafiilor.

Dacà la ,:ptrocariote (bacteriii , astilLomicete) replica,rear nusste restrînsà la o f.azà, anume a, 'ciclului' celular, €B fiind po-tenlial continuà în condilii optime de'mediu pe parcursul între-gutui ciclu :celular, la eucgriote replicarea este restrînsà la of.azà, b,inó delimitata a ciclului celular plasatà în interf azà. Eicare a fost numità fazo de sinúezd ,S. Durata fazei S este va-riarbità nu nurnai 1,& diferitele specii dar Ei în cadrul aceluia$Iindivid la nivelul celulelor afliate în difeite stadii de dezvol-tar,e, fiind mai scurtà în stadiile timpurii ale em,briogene zeifatà de celulele somatice diferenfiate. I),e as€rr€nea faza S pre-rnergàtoare meiozei este foarte lungà comparativ cu aceea dinciclul mitotic.

Cnornozornii euca,riotelor reprezintà totodatà structuri com-plexe în care ADN este permanent complexat cu proúeine ba-zice de tip histonà. Replic,ar€,a, cromozornului eucariot se reali-znazà, asincron nu num,ai între diferiti cromozomi n@mologi aicomple'm,entu'lui cromozomal al unei oelule dar chia,r la urivelul

43

SrpiìiJft3 cafenelo,c

T toroftint rtP' 3''5')

loooitomeratJ finN grretà)

Ftla.xarea AI)N-

ARtí Pnmen -

E longerea,t2/erter

î,0*tderra tovalcnti Ittle nei

tte lirerò

3' 5*

- Probrn desbÚi lita foars

Í aheiiwlui A0N {fr0P)

-

Frt,nîld (frùlîutd rin':tî 'n

, nrornlhr molr/- ''( n"o"'na dna 8J

A tl N ,toliate,'du fi

- * fltt; l{

('P ilt tt H ; e x tt:;utfea Í,tSlalîh'P'súm€rttù t'ì

- l'8 tl pilìnenta !

-l- t Dtt liyn

Sryerspinali taretI 0/1/

-fr-,1,/;i,:r":,:í:. i.Èb J l't-^).íol"r-r-, \$,'(,ii,í,.7).,,J;

Fig. 24. B. SCHEX,IA COM?LEXULUT ENZTMATTC CARE pAnrrcipìt./N REPLICAREA ADN.' pentru simplificare se aratà" în detaliu doar sintezacatenei. succesoare (,,lagging") eare, spre ,deosebire de catena directoare (,,lea-9irg") are o direcfie de sintezà opusó direcfiei de migcare a bifurcaliei de replicare-In dreapta schernei se redà d,enumif,ea proteinei sau enzimei particlpante în ,re-plicare, iar în stînga se trece funclia pe care aceasta o ind.eplinette. În paran-tezI- este trecntà denumirea enzimelor sau proteinelor detectate la bacteria'F..coli.

Relaxarea ADN este neeesarà spre a permite înaintarea bífurcafiei tlo repli-'9a1e, îngreunatà de torsionarea duplexului circutar ADN. Aceastà torsionare esteîndepàrtató prin ac!íunea unor enzime care au capacitatea cle a introduce crestó-turi monocatenare tranziente în duplexul ADN eeea ce perrnite rotatia liberà înjurul celeilalte catene. Aceste enzime s-au nurnit inifial swivelazà (pivota za,l ,enzirnà de crestare-închiclere, enzimó de relaxare a ADN sau unwind,azd, daracum poartà numele de topoizomerazd, ADN, însemnînd enzimà ce deterninìlschimbàri în conformalia macromoleculei ADN. Topoizoyneya,za, are d.ouà subuni-tàti ce constituie un tetramer. Una din aeeste subunitófi funclioneazi ca topoizi-rnerazà- propriu-zisó adicà ca enzímà de relaxare, fiind sensibilà la acid nalidixic-un foarte eficient inhibitor al replicàrii ADN, pe cînd cea d.e a d.oua subunitatea topoizonerazei acfioneazà ca ADN girazd, sau proteinà, omega, introd.ucînd tururisuperhelicale în ADN nou sintetizat.

Hel'icaza ADN realizeazà separarea catenelor prin ruperea punfilor d.e hidro-gen folosind energia provenitó prin defosforilarea ATP dependentó d.e ADN.

44

unuia qi aceluiaqi cr:orn,o z,o,m. Crom'ozomul eucariot este deci ostructurà multirepliconicà, prezentînd la nivelul sàu mai multepuncte C,e ini{iere ,a replicàrii.

tlu,bermann qi Riggs (1968), extragnnd ADN din celulele,,Hela(i marcat pulsatoriu, au màsurat lungimile varia'te aleseqmentelor marca'te pulsatoriu reuEind sà calculeze cà vitezade repii,care este de L pm/minut (la E. eoli aseasta este de 301rm/minut). IJn cromoz,om 'uman de lungime medîe ane circa30 000 um ADN iar cromozomul eucari,ot are a singurà mole-culà de ADN. Dacà neplicarea ar fi iniliatà la un capat al er,o-mozomului qi s-,Br desfàEura secventral spre celàlalt capàt arfi necesare 500 ,ore pentru replicar,ea ADN al unui crorn,ozom.Dar se gtie cà replicarea are loc în 6-8 ore. Aceasta a adusîncà c clovadà cà la eucari,ote cromozomul ,are un numàr marsde unitàli de replicare de lungimi diferite cu un aornporta-ment retrativ independent în replicar,e (Fig. 25).

Distribufia produEilor cle replica,r,e (cr,ornozomii fii) se reali-zeazà, La eucariote prin intervenlia unui complex mecanismmit,otic care este strict controlat ereditar. Replicarea ADN estesupusà unui control riguros, la nivel molecular, dar €a cade

<-

Helicaza de E. coli se numegte protcina re/, qi ea se deplaseazó pe monocatenaADN în direcfia 3'* -5' îndepàrtînd catena complementaró, pé cînd helíca.zc IIIse deplaseaz[ în direcfia 5'+-3' avînd. aeeeagi acflune. Acfiunea lor complementerlleste facilitató de prezenfa proteiuelor neenzimatice unafindoze FIDP) sau protei-ne d.e topire a duplexului ,.tDN. Aceste proteine asigutó stabilizatea monocatererlor spre a putea servi ca matrife.

Sinteza fragmentelor Okazaki este iniliatà prin sinteza unui ARN prirnercatalizatà de enzima ADN primaza (ARN polimeraza) prod,us al genei dna Gcare acfioneazà sinergie cu produsul proteinic al genei dna B. Proteina dna Beste o AîP- azd depend,entó de ADN care se deplaseazà pe matrife folosind energiaeliberató priu defosfotilarea ATP. Ea marche az6, la anumite distanfe pozifiilepentru sinteza primerului de càtre ADN primazà,, din care caazà, s-a numit ,,proîno-tor mobil".

Dupà primare se realizeazà, elongarea catenei (polimeizarea uucleotidelor)sub catalíza ADN polimerazei lff. Elimiuarea primenrlui ARN se face sub acfiu-nea RNceai I{ sau a activitàfií exonucleazice 5' a ADN polimerazni f.Golul rAmasdupà excizia primerului este umplut prh acfiunea polímerizatoare a ADN poli-vnerazei f . Intervine apoi ADN ligaza care tealizeazà, închiderea covalentà acatenei (unirea prin punti fosfodiesterice a fragmentului Okazaki recent sinteti-zat cu cel preced.ent, realizind.u-se astfel treptat sinteza unei catene urticecatena nou sintetizatà sau replica). Dupó teahzarea replicàrii intervine ADNgiraza sau proteina omega spre a conferi moleculei fiice d.e ADN starea supespirali-zati, stare care este normalà, stabilà, fiiud. cerutà se pare d.e funcfiorarea saîn replicare, transcriere gi recombinare (Dupà WACKERNAGEL, 'W'. 1980

Replication (in :) Progress in Botany, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg,NewYork, 154- 170).

45

F

. puncf -

ount r[ -" " terninallernrnàll ca nui.,

gún clt ^rninal

I untlatea dP t unilaf ea de ,FreplicarelT'-- repticare Z -1calena nou stnlelizatà

t

l#.r ;îffilF

,-ÉSffit*'

Fig. 25. Modelul lui Huberman gi Riggs (1968) d,e replicare a, ADN eucaîiot.Sînt reprezentate douA unitAfi de replicare adiacente care apar ad.esea $í în imaginile autoradiografice ale fibrei de cromatfutà. Cele douà unitàfi de replicare desem-nate I gi 2 au fieeare cîte un pnnct de inifiere a sintezei ADN 11, respectivfr, la nivelul càroîa se corctituie în timpul replicàrii buclele de replicare {ochi dereplicare) corespunzAtoare. Fiecare unitate de replicare are un punct terminusindicat prin baie transversale. a) Inainte de reptcare. b) Replicarea a începutîn unitatea 1 dar nu încà. în uuitatea 2. c) Replicarea este completà ùr unítatea1 ti a început în unitate a. 2. d) Replicarea este completó în ambele unitàfi. e)Dublu-helixurile fiice separate în punctul terminal comun dar sînt încé unitecu segmentele ad.iacente. În d.reapta se îeprezintà, schematic , ,grainuritre" obser-

vate în autoradiografie.

Si sub incidenfa un,or semnale venite din citoplasmà. În urrnaulÌ,or fuziuni cel,ulare dintr,e celule a'flate în S Si GL are loc osintezà prernaturà de ADN în nucleul aflat în GL urmatà deoondensar,ea prematurà a cr,omozomilor. Condensarea crornati-nei crom,ozomale poate duce la aooperirea $i deci la reducer€anumàrului unor punct,e de inifiere a replicàrii. Cr'omatina con-d,ensa,tà numità heter'ocr,omatinà prrezintà o replicare tardivà înfaza S comparativ cu cromatina difuzà eucnomatina.

46:

IiIi

IF

tt

L

ADN are capacitatea de a exercita un anumit autocsrrtrolai replicàrii sale, prin care este prevenità reactivarea secven-lelor de inifiere imediat dupà ce acestea au funclionat în r-.epli-care. În acest proces de autoc.ontrol un rol esenfial se pare càîl au diferitele fracliuni de ADN saúelit (secrien!,e simple deADN, dar înalt repetate localiza'te de regulà la nivelul regiuni-lor centromerice) dar mai ales ADN cu secvenfe mijlociu re-pelate, incluzînd secvenf,ele repetate cu simetrie rotatorie in-versà numite palindroarne de tip ABC XY C'B'A', precum gisecrrente poli

- (AT) de vreme ce ADN satelit nu se afla Ia

toate speciile. Un rol esenfial în replicarea ADN îl joacà sin-teza ARN sub cata"liza ARN polirnerazei, acest ARN condifio-nind inifierea repl.icàrii ADN, fiind se pare vorba de un ARNmde ini{iere la ,eucariote. Replicarea ADN este însofità gi de sin-teza d,e proteine histonice.

Cei mai important este însà reglajul genetic al replicàrii.La eucariote existà un control i"ntracromazornnl aI rephcarii.

Tofi repliconii dintr-un cromozom eucariot, avînd dimensiunidiferite, trebuie sà funcfioneze în cadrul aceleiagi perioade Sdin inberfazà, repliconii de la nivelul heterocromatinei (bogatàîn AT) funclionînd spre sfîrgitul acestei perioade S, ,pe cindcei d,e la nivelul eucromatinei (bogata în GC) funcfioneaza laînceputul acesteia. Cromozomul Y de drosofilà, care este încea rrrai mare parte heterocromatic, se replicà mai tîrziu fa!àde ceilalfi cromozomi gi acest lucru este valabil Ei atunci cindare loc trarrslocarea unor pàrfi ale sale în cromozomi ,eucrotna-tici. Acreasta înseamnà cà pàrlile cromoz,omului Y confin in-formafia care regleazà timpul replicàrii 1or.

La eucariote replicarea ADN nuclear Ei extranuclear estereglatà gi Ia nitselul celular. Pentru replicarea ADN este nece-sarà enzima tirnidinkinnzd. care este sintetizatà înainte de mi-tozà qi este hidrolizatà sau inactivatà dupà realizarea repiicàrii.Sinteza ADN inceteazà cînd s-a atins nivelul 4 C, ceea c€ pre-supu,ne un mecanism fin de control celular al replicarii ADN.

În dezvoltarea timpurie a ovulelor are loc replicarea nu-clearà fàrà a avea loc replicarea celularà. Toate cazurile deendoreduplicare, poliploidie Ei polinemie aratà absenfa uneicoordonàri replicare ADN - diviziune nuclearà sau celulara.

Faptul cà replicarea ADN este dependenta de factori cito-plasnatici este demonstrat de constatarea cà nucleii dfun neu-ronii adulli nu sintetizsazà ADN ln mod nor,mal. Daca însà

17

acesti'nuclei sînt transplantafi în ovule activate partenogene-tic ale.aceleiaqi specii, in aceEti nuclei are loc replicarea ADNla numai o orà de la transplantare. De asemenea, cînd nucleidin blastula medie care sintetiz,eazà ADN sint transplant'aliîn ovocite in creqtere care nu mai sintetizeazà ADN, nucleiitransplantali înceteazà sinteza ADN.

Cînd 1à celulele ,,HeLa" se asociazà experimental nuelei qicitoplasmà din stadii diferite ale ciclului celular sinteza ADNeste iniliatà numai dacà nucleii din G1 sînt piasali în cito-piasma aflatà în faza S.

S-a tras conluzia cà citoplasma S trebuie sà oonlinàunul sau mai mu1!i factori care promoveazà sinteza ADN nu-clear. Este posibil ca aceqti factori citoplasmatici sà aibà ori-gine nuclearà.

Replicarea ADN este reglatà de asemenea la niuelul ,tesutu-rilor gi organelor. Sînt date. dupà care evenimentele desfà$u-rate la nivelul rnembranei nucleare pot influenla sinteza ADNnuelear. Desfàqurarea mitozei, frecvenla diviziunii, orientareafusului mitotic, incapacitatea anumitor cromozomi sau pàrti dincnomozomi de a se distribui în timpul miùozei, frecvenla re-oqmbinàrii mitotice ca qi distribufia cromozomilor în meiozàîn urma sinapsei cromozomale sînt controlate genetic.

Antplif icarea genícd. sau extrareplicarea anumitor segmentedin ,$rrori, in special a genelor riibozomale, se desfàgoarà atîtîn celulele diploide cît qi în celulele endopoliploide ducînd lasinteza unui ADNr amplificat, labii metabolic, fiind degradatdupà ce Ei-a îndeplinit funcfia de transcriere (sinteza AIINr).Reoent, Mihàescu Ei Gavrità (1980) au evidenfiat fenomenul deamplifioare a genelor ribozomale în celulele de rnamifer înculturà infectate cu adenovirus, tratate în prealahil cu tioace-tamidà. Uneori ADN amplificat nu este transcris aga cum estecazul cu ADN de la nivelul pufelor insectelor Scinride sau dacàeste transcris, ARN sintetizat nu este transportat în citoplasmà,aoest ADN arnplificat, r,epetitiv, l.,ocalizat de regulà la nivelulregiunilor heterocromatice ale genomului putînd juca în prin-cipal rol reglator.

Hormonii animali gi fitohormonii pot juca un rol importantîn determinarea unei replicàri diferenliate a ADN. Cromome-rele cromozomului eucariot al càror ADN suferà o replicareamplifioa€ de ADN s-au numit arnpliconi. Amplificarea ,si sub-

48

replicarea nu sî:rt fenomene alternative, ci coexistente. Astfel,în celulele suspensorului embrionar de la Phoseolzs se aflàcromozomii politeni, la nivelul càrora apar,e un fenomen deamplificare genicà a ADN satelit. În acelaEi timp apare unfenomen de subreplicare a segmentelor ADN car,e cuprind ge-nele ribozomale. Conlinutul total de ADN nuclear apare însàca un multiplu al valorii diploide.

{ - Desclfrlnd taiuele ereditàlii, vol. I

F

Capitolul II

STBUCTURA ARN $I TBANSCBIEREA GENSIICA

1. GENENALTTATI

ADN are douà funclii pri,mare: funclia autocatalitica, reali-zatà în proeesul replicàrii saùe gi fu,nclia heterocataliticà realizatàîn procesul de sinteza de molecule specifioe, în spetà proteine.

Dacà ADN reprezintà substanfa macromolecularà cu fiurc-lie primarà ereditarà, ARN este implicat în realizarea decodi-ficàrii informafiei ereditare care are loc în procesul de biosin-tezà proteinicà, cînd secvenla de nucleotide din ADN este maiîntîi transcrisà în ARN mesager gi apoi tradusà în secvenla deaminoacizi a catenelor polipeptidice. Incà din anul 1952, A.Dounce a aràtat pentru prima da,tà cà ADN îqi îndeplineqtefuncfia heterocataliticà în douà etape: transcrierea qi tradu-cerea mesajului genetic.

Ca qi ADN, ARN este o substan!à rnacromolecularà, poli-mer al unor ribonucleotide, avînd de regulà structurA mono-catenarà. Axui principal ai monoca'tenei este reprezentat de oooloanà glucidofosforicà ia care sînt ataEate hazele azotate (Fig.26). Ca pentozà, în ARN intrà D-ribozo care spre deosebire de2-deoxi-D-riboza din structura ADN, are patru grupàri hidro-xil. Bazele azotate din ARN sînt douà Tsurinice Adeninn qí Gua-nirn qi d.ouà pirimidinice Citozina qi Uronil. Deci locul timineieste luat ín ARN de uracil (U) care prezintà complementarita,tepentru adeninà. Legaturiie fosfodiesterice creeazà o anumitàpolaritate a monocatenei ARN care va prezenta un capàt 3' Eialtul 5'.

ln structura ARN, în afa,ra rbazelor tipice ma'i pot intra Eialte baze, unele modificate dintre car€ oomun este nucleotidulpseudouridina qi dihidrouracilul mai frecvente în u,nele tipuride ARN. În cazuri foar,te rane, în structura ARN indrà Ei ti-mina.

50

ccdtut s' ,--*-illó *.\ Jt )^ Adeninè

t 'N- -l.lO-P-O-Cl+ I

J' t'..1\-i4 NHr

I I Hc-coN

? ot ,è. -A- citozinó

oGP-o-cH, 'N- ìd' ir...lI\-,4 ?

I I rN',/\Nu

''r-lrJt'A*oé-*"ó, (l!À Àr tf"-ì*

o'É- o - Ct*j*-N'c-'o

ri

Gucni;rè.

Urocil

00HI

O -p- O-CHe

ót j*,ó,u'r'

Fig. 26. Formula chimicà a uaui poliribonucleotid,

Spre deosebire de ADN, ARN prezintà o mare heterogeni-tate structural-f uncf ionalà.

Degi în general structura ARN este m,onocatenarà, acestapoate prezenta prin pliere în urma potrivirii de secvenfe com-plementar,e, regiuni bicatenare l,a nivelul càrora apar perechide baze azstate unite prin punli de hidrogen.

Unele riibovirusuri prezin,tà în mod normal ca miez de acidnucleic ARN bicatenar cum este cazul reovirusului. De aseme-nea diferitetle tipuri de ARN celular înspecial celribozonwl qi

51

Fl.

de transfer pot prezenta regiuni bicatenare, separate de regiunimonocatenare.

Datà fiind structura principial monocatenarà a A.RN pro-porfia de baze complementare A-U Ei G-C nu realizeazà deregulà raportul unitar. Monocatenele ARN au formà liniarà,nefiind încà decelate molecule circulare de ARN. Numàrul denucleotide ce intrà în structura diferitelor tipuri de ARN va-riazà între 75 qi 10.000.

Se pot distinge douà categorii esenlial diferite de ARN:AIIN uiroZ

- materialul ereditar al ribovirusurilor Si ARNcelukr

- molecule care intervin in decodificarea informa{ieiereditare qi traducerea sa in secvenle aminoacidice în proce-sul de biosintezà proteinicà celularà.

ARN uiral. Este ARN care ca Si A"DN este inzestrat cu func-lie geneticà primarà qi anume funcfie de depozitare a informa-tiei ereditare Ei transmiterea sa în generafiiile virale succesiveprin replicare. Se întîlneEte la unele virusuri vegetale, (\IMT),la unii bacteriofagi (Qf3, R 17, MS,;), unele virusuri animale(polio, virusuri poliedrale citoplasmatice de la insecte etc.).Cantitatea de ARN viral reprezintà I0/o din greutatea particu-lei virale cum este cazul virusului influenza sau 6olo î,n ca-zul VMT.

De regulà ARN viral este monocatenar (VMT, virusul gri-pal, polio, fagi Qp, R17 ; F2) sau bicatenar cu catene corr*pì.emen-tare (reovirus).

ARN celular. Acest tip de ARN nu codificà informalie gene-ticà qi este sintetizat pe matri!à ADN, adicà transcrie infor-matia geneticà. Niciodatà î,nsà ARN celular nu îndeplinegtefuncfie de matri!à pentru pr"opria sa sin'tezà, deosebinclu-seprincipal de ADN sau de ARN viral. El îndeplineqte însà func-{ia de primnr în replicarea ADN.

2. TIìANSCRIEBEA GENETICA

Transcrierea geneticà reprezintà un prooes complex desfà-qurat în mai multe etape, în care pe matri!à de ADN se sinte-tizeazà. mon,oca'tene ARN, asigurindu-se transferul informa-liei genetice de la ADN la ARN. În cadrul procesului enzimanumità AP"N polimerczd,

- dependentà de ADN - recunoaqtesecvenle specifice de pe matrila ADN gi catalizeazà polime-rizarea unor ribonucleotide trifosfat libere, aliniate pe matrila

52

ADN in virtutea complementaritàlii de baze azotate de tipA-U, T-A, G-C, C-G, primul partener a1 perechilor fiindlrerze azotate di,n ADN, al doilea fiind baz,e 'azotate ce .sînt in-cluse in catena polirilbonucleotidicà. Matrifa Ei catena poliri-bonucleotidicà nou sintetizatà formeazà un hibrid molecularADN-ARN temporar, prin intermediul pun!ilor de hidrogendin'tre bazele compl.ementare. Ca substrat pentru ARN polime-razi servesc cei patru ri,bonucleotidtrifosfati ATP, GTP, CTPEi UTP. ARN polimeraza, spre deosebire de ADN-polimerazAare capacitatea de a inilia sinteza ,,de novos a unei catene po-linucleotidice fàrà a neoesita prhTter. Cel mai bine studia,tà esteARN polimeroza bacterianà.

ARN polimeraza bacterianà este o enzimà compl'exà alcà-tui,tii din 2 su'bunitàti a, o su,bunitate B, o subunitate $' Ei fac-torui alosteric o. Ba are o greutate molecularà de 495.000 dal-toni. Holoenzima se poate separa în miezul enzimatic gi facto-rul o. Factorul o este factor de inifier,e, ,el fiind acela care re-cunoaEte ,o secvenfa specificà din ADN (promot'ord), condi{ion'îndform,area comptrexul,ui ADN-ARN polimwazà,. Dupà iniliereasintezei ARN factorul o se desprinde de pe holoenzimà Ei sepoate asocia cu un alt miez'enzimatic càruia îi oonferà specifi-tate pentru matrita ADN.

Procesul de transcriere cuprinde ca qi în cazul replicàrii.ADN o fazà de ini{iere a catenei ARN, o fazà, de elongane Ei ofazà de terminare a transcrierii. Fiecare fazà se desfàqoarà prininlervenlia anumitor factori de inifiere, de elongare qi de ter-minare. ARN polimeraza esùe dependenta de ADN, ceea ceînseamnà cà ea func{ioneazà numai în prezenla matritei ADN.Caiena din duplexul ADN care funclioneazà ca matrifà în sin-feza ARN, care 'este deci transcrisà, se numeEte catend sena.

Procesul de inifiere a ,transcrierii pnesupwre mai întîi pre-inifierea în care are loc formar,ea unui complex molecular ADN-.ARN polimerazà, enzima recunoscînd prin facúorul 6 o sec-.ientà specificà din matrifa ADN cu care se asociazà intim.Urmeazà apoi formarea complexului de iniliere propriu-zisà atranscrierii Ei în care este iniliatà polimerizarea secvenlialà aribonr-rcleotidelor cu desfàSurar€a alungirii catenei polirlbonu-cleotidice (ARN), prin formarea de punli fosfodiesterice suc-cesive. Transcrierea poate fi prezentatà astfel:

ATP -i- GTP + CTP + UTP :matri!à ÀON - ARN

ARN polimerazà+ PPt (pirofosfat)

53

Creqterea catenei ARN are loc prin formarea punfilor fosfo-dieterice succesive în direc{ia 5'-> 3', adicà prin* adilia unuiribonucleotid-5'-fosfat la capàtul 3'-OH al ri,bonucleotiduluiprecedent.

Formanea punfilor fosfodiesteriae (alungirea catenei ARN)este catalízatà de miezul enzimatic al ARN polimerazei.

Ribonucleotidul inifiat 5' al unei catene ARN este de obiceiun ribonucleotid trifosfat purinic (ATP sau GTP) care îgi pàs-tr€szà toate grupele fosfat. Aceasta înseamnà cà în rnatri!à, l,asitul de iniliere a transcrierii diferitelor catme ARN se aflàfie dezoxitimidinmonofosfatul, fie dezoxicitidinmonofosfatul,ceea ce înseamnà cà o glupare de pirimidine în ma,trita ADNa,r putea c,onstitui situl de ini{iere a transcrierii ARN, recu-noscut de càtre transcriptazà prin facùorul o.

Situl dín ADN la care se atageazà ARN polimeraza qi a cà-rui secventà este recunoscutà în rnod specific de factorul o s-anumit pro,motor. El reprezintà o regiune micà dfur matrita ADNde pîlrà la 50 nucleotide lungime, localizatà imediat înaintcagenei sau grupului de gene a càrei informa{ie geneticà hrelbuietranscrisà în ARN. De refinut cà secvenfa promotorului nueste transerisà în ARN. Studiimd inifierea transcrierii ARNmspecific pentru enzirna p-galactmid,azd., Gilbrt qi Maxarn austaibil,it în 1973 secvenfa de baze din punctul de inifiere a sin*tnz,ei ARNnz care este urmàtoarea:

I5',..... TGGAATTGTGAGCCGATAACAATTTCA 3'

3',

Inifierea sinúezei ARNnz pentru F-golnftozidnzd este indi-catà prin sàgeatà. Se poate cons'taú.a cà s;ec'venfa de baz"e, cores-punzàtoar,e sitului de iniliene a transcrierii este bogaúà în pe-rechi A-T. Inilierea transcrierii poate fi ur-hirbatà în mod spe-cific de anti,bioticul rifampicinà la procariote sau a-amanitinàIa euoariote.

$i alti factori sînt impl,icafi în controlul inifierii transcri'erii,cel mai important pentru bacterii fiind factorul proteinic CRP(proteina rreceptoa,ne a cata,bolitului) numità încà factor CAPcare reprezintà proteína receptoare a AIVIP ciclic, acest nucLeo-tid monofosfat ciclic avînd rol important qi multiplu în, reacfiilebiochimice lega,te de deoodificarea informaliei genetice. AibsenfaCRP sau chiar a AMP ciclic duce Ia descreEterea vitezei deinitiere a transcrierii qi ca urmare a sintezei ARN.

54

Desfàqurarea ,transcrierii (elongarea catenei ARN) se reali-zeazi cu o vitezà, de 60 ntrcleotide pe secundà, dar viteza detranscriere poate fi influentatà de lnsàqi secvenfa car,e tnebuietranscrisà, acesta fiind chilar un rnecanism de reglare a franscri-erii. ElongaÍea catenei ARN este inhibatà specific de catre anti-bioticul streptolidigina, care ar'e afinitate pentru ARN polime-razÀ, inactivînd-o. Aaelaqi efect are acliuniea acúinomiciÍtzi D.Terminarea si;ntezei ARN esúe dírectà, condilionaÉ de întîlni-rea de càtre compl,exul tripartit de ,transcriere ADN - miezulenzimatic al ARN polim,erazei

- ARN nàscînd, a unui sit detgrminare din cadrul secvenlei ADN ce este transcrisa cu eli-berarea catenei ARN adicà a transcriptului qi dezorganizareacomplexului de transcriere. Transcriptul ARN începe la capà-tul sàu 5' cu o aga-numità sectsenló ghid sau cozducdtmre (lea-der) care poate avea pînà la 150 de ibaze $i include qi comple-mentul operatorului (vezi reglajul genetic) sau al unei pàrli aaeestuia.

T,erminanea transcrierii însà poate avea l,oc prin intervenfiaunui factor proteinic care a fost desem,nat factorul de termi-nar€ q (rho) care este alcàtuit dín 6 subunitàli identice aranjateîn cerc gi care are capacitatea de a se lega Ia ARN pli.marozó.spne a înceta transcrierea la nivelul unor bariere naturale al.etranscrierii care apar în ADN reprezentate de secvenfe speci-fice de nucleotide localizate fie în cadrul secvenfei unei gene,fie intre gene adiacente. Sinteza ARN se desfàqoarà polarizat.Transcrierea începe la capàtul 3'-OH al matrifei ADN qi sin-teza ARN se d,esfàEoarà în direcfra, 5' -+

3'. Rezultà deci, càatrila gi transcriptul sînt antiparalele. În vederea transcrierii

are loc ,o desfacere localà a dublului helix ADN î:r zona ce ur-meazà a fi transcrisà qi apare astfel a$a-numítul ochi, de fiqrn-sqie:re. Pe màsurà ce transcrierea se desfàgoarà, în urma se re-face structura dublu-catenarà a ADN Ia parametri sài inifiali.Desfaoerea localà în transcriere poate fi folosità Si în rreplica-rea ADN.

In uiuo transcrierea este ,asimetricà adicà doar una din celedouà caúene ale dublului helix ADN serveqúe ca matri!à pentrusinteza ARN. Dar acest lucru nu însea,mnà cà în toate cazurileuna gi aceeaqi catenà ,a ADN este activà î,n transcriere ian cea-laltà este inactivà. Pentru o genà datà sau un grup de gene(vezi operonul) o catenà ADN este activà în transcriere iar ca-terra complementarà inlactivà, pe cînd, pentru altà genà sau altgnup de gene aceeaqi ca0enà ADN poate fi inactivà iar catenacomplementarà poate fi activà în transcrier,e. Dar dacà un

55

sqgrnent al unei catene ADN este activ în,transcriere segmen-firl corepunzàtor de pe catena oomplementarà este în mod ,de-terminat inactiv î:r transcriere. Altfel s-ar sintetiza douà ,trans-cripte care prezentînd oompl'ementaritate ar duce la formare destructuri bicatenare ARN, de regutà inaetive în dirijarea sinte-zei pro0einice. Faetorul o joacà rol esenlial în selocfia cateneiactive; càci în absenfa sa miezul enzimatic al ARN polimerazeinu prezintà specificitate de secventa Ei catenà, putîndu-se l,egala orice secven!à a oricàreia dintre cele douà catene ale ADN.În prezenla factorului o însà, ARN polimeraza capàtà capaci-tatea de a recunoagte secvenfa specifieà de p mtena selÉ cetrehuie transcrisà.

În naitocondrii s-a stabilit existenfa r,rnei transcrieri gen,eticesirnetrice, am'bele ca,tene ale ADN mitocondrial fiind ac"tive întranscrie're, dar int'ervine Ei aici un mecanism specific car',e de-grad.ea,zà rapid unul din cele douà transcripte.

I"a procariote produsul imediat al' transcrierii s-.ecvenfelordin ADN ce specificà sinteza diferitelor proteine este un ARNrnesaEer policistronic, adicà care conline transcrisa informafiag_enetiqS pentru mai multe proteine, sistemele dc transcrierg $ide traduc€re fiind intirn cuplate (FiS. 27), f.apt care Du se. evi-

Fig. 27. Transcrierea gi traduceîea mesajului genetic la procatiote sînt freev'efiLtrt'l ,'. .,:'

56

E8-,..

6f;"':r::r

ientiazà la eucariote unde transcrierea are loc în nucleu iart:aducerea mesajului genetic are loc în ciúoplasmà, la nive--u. ribozomil.or. La eucariote pr,oduEii imediali ai transcrieriisint mult mai mari decît produEii maturi astfel cà ei sînt su-pugi unor prelucràri posttranscripli,onale prin care sînt pe de..' prrte modificate unele baze azotate (metiiare, acetilare etc.)

-'r sint ,excizate anumite secvenle de baze azotate iar uneoria:iugaie unele secvenle specifice de ,baze (adenilare). În urmaai-€s[oi prelucràri posttranscrip{ionale, ARN rrlesagter frrea.ffsore:::ariotic clevine un ARN masager mnnocistronic ma,tur carejeline informalia ce specificà o singurà catenà polipeptidicà.!: :'eglarea transcrierii intervin factori inductori Ei repnesori:ine evidenfia{i mai ales la procariote. La eucariote transcrierea-lDli din cromozomi este dependentà de starea decond'ensatài:::erfazicà a cromatinei, starea condensatà a cromozomilor mi-:c:i,-'i sau a heterocromatinei nepermi!înd transcrierea ADN. În',-elelea transcrierii la nivelul cromozomilor condensali ar,e loer.l:r proces d'e deslînare localà, cu aparilia de ptle sau inelefuJbiani în cazul cromozomilor politeni de diptere. Sinteza-lRN ale loc pe parcursul întregii interfaze qi continuà gi înpiofazà cind inceteazà, reîncepînd în telofazà. Din 'aceastà cau-zà s-.ì tras concluzia cà ea este condilionatà de integritateamem'branei nucleare Si a nucleolului. Aceasta poaùe fi justifi-cai pentru sinteza ARN riboz'ornal, nu Si pentru alúe categoriide ARN. Mai sigur este cà sinteza ARN este condili,onatà des:area difuzà, deconderr.satà a cr,omatinei.

Prcpor{ia din ADN la bacterii care este transcrisà 'este deo:'C:.nul a B0-1000/o pe cînd la eucariote aceasta este mult maimi-'à \2-2007r) Ei este dependenta de tipul celular qi de orga-nismul considerat. Transcrierea la eucariote nu este cuplatàri--i :emporar qi nici spalial cu traducerea mesajulúi genetic.

Transcrierea a fost vizualizatà electr,onomicroscopic atît lap:ccariote cît qi la eucariote (FiS. 28 A, B, C) d,e càtre Miller1; coia'b. (1970).

Difelitele categ,orii de ARN celular intervin în etape speci-!:ce aie decodificàrii informaliei ereclitare.

S: pot distinge mai multe tipuri de ARN celular: ARN rne-scger', ARN ribozomal, ARN de transfer, ARN heterqen qi-{iìN cromozontal. Primele trei tipuri de ARN celular intervindiret-c în procesul decodificàrii.

3. ARN mesager (ARl{m) a mai fost numit ARN d,e infor-n:.aiie. If.oleculele cle ARNm sînl componente centrale în ex-presir genelor structurale. ARNrn reprezintà 20/s din ARN ce-

37

(,co

/

AON

o geno

II

ARN m ( Nu sirrt vrz rbrte

polrpeptrdele sr ARI'it)

Fig, 28. l. Transcrierea geneticà. la pro-cariote. Interptetate dúpó electronografie.

ARN

tolrmcrozo,/

g$)q"*--:-aDN .'/ strrl .Jc rnrtrere

f '. Gl tr3f,scrlpt'cr

,' aìn -

Fig. 28. B. (a) - ulr fragruerrt de ADN de ,8. col,i avînd atagate mole-cuÍe ale enziurci ARN-polinrerazei qi ribozonri; (b--c) - diagranazo-uei de initiere a trartscrierii cu red.area deplasórii secventiale a ARN-polimerazei spre stînga determinînd sinteza de ARNzra pe mattifaenx. La aceste molecule de ARNm. se atageazà tibozomii, la cape-tele lor 5', traducînd secvenla sa polinucleotidicà într-o secventà deaminoacizi a polipepticlelor pe màsurà ce aceasta se tleplaseazà sprecapàtul ,,în ciegtèró" 3' al mesagcrului; (d) Degradatea ARNm începecu- capàtul 5' gi astfel ru ruai *:rl"r?."r"qarea de ribozomi care se disa'

//

/'\fj

$

. lo)

srl tèrnlnot nroleculo deARN

(br ot l

s'l de tnitlere-ARN '),d ;1 î.

Fig. 25. C. Trauscrierea la eucariote. (a). Electronogtafia unei secvenf€ ADNîn-procesul de trauscriere în ovocita de Triturus airidescens. Moleculele de A'RNtranscrise pofnesc radiar din axa ADN. La intersecfia unei catene ARN 9i axeiADN se ailó un grauul proteinic dens care cel mai probabil teprezintó moleculed.e ARN polimeri,zó b-f. Secvenfa de evenimente redatà diagramatic care ducla transcierea unui segment ADN. (b).O moleculó de ARN polímerazà ($l)se ataqeazà [a un sit de iniliere pe o secven!à d.e ADN ce trebuie transcrisàla un moment dat. (c). Molecula de eRN polimerazà se deplaseazà,pe catena ADNttanscriind-o întt-o secvenfà ARN. Dupà ce polimeraza + I s-a d.eplasat pe unanumit interval, se atageazà polimeraza * 2 la situl de inifiere gi lucepe_ 9i eatranscrierea, g.a.m.d.. asifel ca pe cînd molecula de ARN asociatà cu ARN poJi-rneraza, nr. I reptezintó o secvénfó complementaú" la aproape întreaga lungimea unei catene ADN, celelalte asociate cu ARN polimerazele 2, 3, 4 etc. sìnt pro-gresiv mai mici. La termina*i$'ffT'i'ii

irlilJ;J:-eraza este eliberató împre'

luL,ar, avînd duratà scurtà de via!à. El tra,nscrie informafia ge-neticà de pe un segment al unei catene a dublului helix ADNaonespunzàtnr unei gene care trebuie sà funcfioneze la un mo-ment 'dat Ei funcfioneazà. ca m,atri!à pentru sinteza sa- &gmen-tul din ADN care serveEte ca matri!à pentru sinteze ARNntpoate cor,espunde la o genà sau la mai multe gene care delininforma,fia geneticà pentru sinteza unor proteille sau enzime

59

înrudite ce controleazà un acelaEi caracter sau rnrervln înaceeaEi cale metatboiicà.

Dimensiune'a diferiteior: molecule de ARNrn este în functiede màrirnea mesajului pe care ît poartà, adicà corespunclesecvenlei de baze a diferitelor gene pe care le transcrie, genecare au la rîndul lor dimensiuni foarte diferite Ei care speci-ficà în consecin!à catene polipeptidice de lungime varia'biià.

As'tfe1, cons'ta,nta de sedimentare a diferitelor moleculre cleARNrn cle ia acelaEi organism variazà între B S qi 45 S.

ARNrn pentru ovalbumi'nà cuprinde cca 1890 nucle,oticle.llnul dintre cele mai mari tipuri de ARNnz est,e cel pentrufibroina firului' de màtase din glanda posterioarà de Bambyrmori. Acest ARNnz are constanta cle sedimentare de 32 S (Tay-lor, 1979).

Durata de r,ta!à a ARNrn la procariote este de 2_.1 rninute"De îndatà ce au f,ost traduse, moleculele de ARNnr sînt distrtr-se, evitîndu-se astfei aÌteràriie posibile clin structura sa ceìrear cluce Ia modificarea mesajului genetic gi la sinteza cìe pro-teine modificate, sau la traducel'ea unui ARNnr care nì-r esteîn eonformitate cu cerinfele de mecliu celnlar care se -.chlrnbàrapid de la o perioadà de ti'rnp la alta.

Cele rnai multe tipuri de ARNm prezintà la capàtul 3' al mo-noca,tenei o secven!à poi[ (A) care este adàugatà posttranscr'lp-fional gi este implicatà în conturarea duratei de via!à a AF!.N'r.. Complexul enzima'tic care clegradeazà ARNm procariot, are

capacitatea de a distinge diferitele tipuri de ARNnx pe cir,re iedegradeazà în mod specific, degradarea fiincl cupiatà cu tr"a'clu*cerea mesagerului.

La eucariote, la care ciurata de via!à a celulei este mai mare+i durata de via!à a ARNnz este mai mare, de cca 1-4 ,ore.

Atît la procariote cît Ei la eucariote existà situalii ín careARNrn are o duratà de via'!à mai mare. Este cazul celul,eior" cleBacillus cereus irnduse sà devinà spori în care ARNnr clureazàcca 6 ore Ei reticuiocitelor mamiferelor în care 900/o diri sin-teza proteinicà este reprezentatà de sinteza hemoglobinel i:rrcînd .se maturiz'eazà, pierd spontan nucleul, nemaifiind der.:i \ireomatri!à pentru sinteza ARI{nz pentru hemoglo;binà. Cu toateaceslea, sinteza hemoglobinei este continuatà pe seama ARNrzsintetizat' încà din s,tadiul nucleat Ei care persistà Ei funclion ettzàrnulf timp (cîteva zile) dupà ace,ea.

În cazul dormanlei adoptatà de mul.te ouà 1a anirnale qiseminlele de plante, ARNrn este menlinut într-o for:mà sta-bilà pentru luni qi chiar a,ni.

60

Moleculeie de ARNrn cu durata lungà de via!.à, cum sîntEi cele din ovulele de ,broascà care sînt pàstrate multe Ìuniînainte de a fi traduse, sînt protejate fa!à de atacul enzimelordepolimerizatoare ribonucleaze prin asociere cu categorii spe-ciale de proteine. Asemenea asocieri ARNrn proteine laeucariote care apar înainte de trece,rea ARNrn din rnucleu încitopiasmà unde se asociazà cu ribozomii

- sedii a,le sintezeiproteinice

- au fost numlte informozomi sau informnfere.La bacterii, genele aflate în raport de contiguitate gi înru-

clite rnelabolic (legate de aceeagi cale metabolicà) formeazà ounita'te reglatoare care s-a numit operon. Ele sînt transcriseîntr-un ARNm policistronic ce poartà mesajul genetic pentrumai multe proteine. La scurt timp de la inilierea sintezeiARNrn bacterian, ribozomii se ataqeazà la aceasta Ei se depta-seazà de-a iungul sàu în urma ARN polinterazei, spre a asi-

- gura traducerea mesajului genetic.De regulà, la eucariote ARNm este monocistronic Ei trans-

crie gene care dirijeazà sinteza de polipeptide. Aceste gene sîntde regulà reprezentate de secvenfe unice, nerepetate din ADN.ARNnz eucariotic se sintetizeazà sutb forma unui precursor he-terogen - numit qi ARN nuclear he,terogeru care are o ,greutatemoiecularà de 5 X 105 - 107 daltoni. S-a mai numit pre-ARNnz.Precursorui ARNm este supus prelucràriior posttranscripfional'eîn cadrul càrora vor fi eliminate nueleotide, de la capàtul 5'aImoleculei Ei totodatà vor fi adàugate la capàtul 3', 50-200resturi adenilat formînd un segment de acid poliadenilic carecond.i{ioneazà durata de via!à a ARNm

La procariote ARNm reprezintà copia exactà a secvenlei ge-nice,, fàrà a-i lipsi anumite segmente. La eucariote în cazulunor gene apar por{iuni (secven{e interpuse sar-r spa{iatoare încadrul secvenfei genice codificatoare) care sînt ,transcrise înARNrz dar nu sîtnt traduse. O situalie sirmilarà apare în cazulunor virusuri anirnale.

Asertenea secvenle spaliatoare apar în genele pentru catenaf3 a hemoglobinei, h genele pentru imunoglobulinà, ovalbumi-nà qi în genele ARNú Ei ARNr. Secvenlele spaliatoare sînt im-plicate se pare în reglarea activitàfii genice. Ele pot fi transcri-sp în ARNrn, dar ulterior sînt excizate. Este admisà Ei posibili-ta,tea ca la eucariote ARNrn sà fi,e sintetizat segmentar, segmen-tele fiind ulterior unite într-o monocatenà unicà de ARNnz încare nu sînt incluse qi secven{ele spafiatoare.

4. ARN ribozomnl (ARNr). ARNr r'eprezintà cca 800/o dinARN celular total qi intrà în structura ri'bozomilor care ;sînt

61

particule ribonucleoproteinic,e implicate în biosin teza proteinicà.Ribozomii confin 40-600/o ARNr qi proteine tbazice ribozomale.Ri:bozomii apar în citoplasma tuturor celulelor procariote gieucariote avînd un diametru variabil. de 140-230 À. Proteineleribozomale în numàr total de 53 la procariote Ei 70-80 la euca-riote se leagà de ARNr prin legàturi necovalente, migurîndstabilitatea structunalà a ribozomului permi!înd totodatà ataqa-rea altor tipuri de ARN la riibozom. Prin ataqa,r'ea de ribozomipe monocatena ARNrn se pàstreazà, conformafia monocatenaràa acestuia propice decodificarii - traducerii mesajul.ui ,gene-tic. Ri'bozomii se ataqeazà la, ARNrn formînd poliribeotrri saupolizarni, între ei fiind o distanfà de 50-150 À.

Ribozomii procariotelor au constanfa de sedimentare 70 S(subunitali 30 S gi 50 S) pe cînd cei eucariotici citoplasuraticiau constanta de sedimentare B0 S (subuniffifi 40 S Ei 60 S) fàràca ri'bozomii eucariotici sà constituie un grup uniform ,,80 S6c

càci greutatea lor moleculara variazà de la 3,9 X 106 daltoni laplante la 4,55 X 100 la mamifere, sohimrbarea masei rirbzomalebazîndu-se în special pe variafia dimensiunii subunitafii mariribozomale (60 S) de Ia 2,4 la 3,05 X 100 daltoni, variafle ca,reeste cleterminatà de varialia cantitativà atît, a ARNr cît qi aproteinelor ri,bozomal,e asociate. Subunitatea rirbozomalà micà(40 S) a ri'bozomul.ui eucariot nu s-a schimbat aprecia,bil încursul evolufiei eucariotelor. Ri'bozornii organitelor celulei eu-cariote, cloroplastici qi mitocondrial,i sînt de tip procariot avîndoonstanta de sedimentare 60-70 S. Prin scàderea ooncwttrafieiionilor Mg2+ sub 0,35 ffiM, riibozomii bacterieni disociazà însubunitàtil,e 50 S qi 30 S.

Greutatea molecularà a prroteinelor bazice structurale ribo-zomale este de 25.000-26.000 dattoni. Proteinele ribozomalesînt heterogene fiind descrise douà categorii, urla S, corespun-zàtoare su,bunitàlii ribozomale mici qi alta L c\orespunzàtoaresubunitàlii ribozomale mari. Fiecare categorie de proteine ri;bo-zomale are rnai multe fracfiuni Sr-Szr gi L1-L32. Ia, euca-r:iote fracfiunile celor douà categorii de proteine ribozomalesî,nt mai numeroase. Ele sînt esentiale în funcfionarea rirbozo-milor. Proteinele riibozomale Lt Qi Lp au proprietali contractileqi se pare cà sînt implicate în translocarea aminoacizilor întimpul sintezei proteinice.

Asamblarea ribozomului realizatà l,a rrivelul nucleolului este,cel pulin ùr parte, ur proces autodire4ionat, deci nedireclio-nat de alte structuri celulane pneexistente. Sînt date dupà careunii ribozomi pot fi specific mesageri, cu funclie informalio-

62

@"^6(=ù

^D9p6fi@>"'

Fig. 29. Ciclul ribozomului. Subunitatea 30S se asociazà cu ARNrz dupà careare loc atagarea subunitàlii 50 S.

nalà. Se pesupune cà ARNr posedà in uiuo un mesaj tradus,specific pentru sinúeza proteinel'or ribozomale (Rieger qi co-lab., 1968, 1976). Interesant este cà ritbozomii ca qi cromozomiieucariotici sînt organite celulare, lipsi'te de memibrane deiimi-ùante, care prezintà totoda,tà - spre deosebire de alte organitea1e celulei _- irn ciclu caracteristic de organizare Ei desfacereîn vederea funcfionàrii. Existà astfel un ciclu ri'boz'omai (Fig.29) (vezi Ei sinteza proteinicà) Ei un ciclu cromozomal (vezi .or-ganizarea geneticà).* În celulele eucariote care sintetizeazà pro-teine pentru secrefie-export, majoritatea ribozomilor sînt eta-$ati la nembranele reticuiului endoplasmic prin intermediulsubunitàtilor mari 60 ,S: Rirb62o*ii lirberi neatagafi la membra-nele reticulului endoplasmic sintetizeazà pruteine care ràmîn încitoplasma celulei. Se admite cà în acest proaes de selecliede cà'tre ribozomii ataqafi sau neataqa'F la reticulul endoplasmica unui ARNrn particular spre a fi tradus, un ro1 important î1joacà secvenla lider din ARNrn ce poate fi recunoscutà în mocldiferenliat de càtre cele douà tipuri de ribozomi. De asemenea,proteinele destina,te nucleului sînt sintetizate pe ribozomii cito-plasmatici neataga{i la neticulul endoplasmic. Dupà sintezà,acest'e proteine sînt pompate sau suctiornate în nucleu. Se admi-te cà Ei la procariote ARNrn ce codificà proteine speciale sînttraduEi în locuri speciale qi prorbabil de càtre ribozomi speciali.As,tfel, la Bacillus sinteza proteazei neutrre, care este secretatàîn mediu, afie loc pe ribozomi localizali la periferia celulei.

În subumitatea ribozoma'Ià micà intrà ARNr de tip 16 S laprocariote Ei 18 S la eucariote.

+ Reunirea stùunitàfi'lor ri,bozomale spre a constitui particuie ribo-zontatre funcfionale este aleatorie, ceea ce înseamnà cà reciclarea sub-unitàlilor ribozoma,le într-o nouà rundà de sintezà nu presupune aso-cierea aceloraqi subunitàfi care au constituit ribozomii func{ionali airundei precedente.

63

F

În subunitatea ribozomalà mare intrà ARNr de tip 23 S laprocariote qi 28 S ta eucariote.

Atît la procarioùe cît Ei la eucariote asociat subunÌtàtii ribo-zomale mari mai intrà qi un tip aparte de ARNr, care are con-stanta de sedimentare 5 S. În plus, la eueariote, s-a descris giun alt tip de ARNr care are constanta de sedimentare 7 S qicare intra în componenla subunitàtii mari a ribòzomului, exis-tînd la eucariote deci 4 tipuri de molecule de ARNr (Wool,1e7e).

Toate m,o1,ecu1e1,e de ARNr atît la procariote cît qi la euca-riote s'e sintetizeazà sub formà de molecule precursoare deARNr' (pre-ARNr) care, dupà transcriere, sùrt supuse, prelucrà-rilor posttranscriplionale. Acestea includ pe de o parte metila-r:ea resturilor rirbozà la cca 5oA dintre nucleotide, deterrriinînddiferenlieri calitatíve în func{ia catenelor poliribonucleotidice,iar pe de altà parte clivar,ea unor secvenle (eliminarea) ducîndla reducerea lungimii pre-ARNr gi delimitarea unei rnoleculemature de ARNr. Dupà pr,elucrarea posttranscripfior,ra'là struc-tura primarà mronocatenrarà a ARNr poart.e suferi cqrúorsionàrispaliale cu realizarea de regiuni bicatenare gi cu aparifia unormodele spaliale caracteristice.

Genele (ADNr) pentru cele trei caúegorii de ARNr sînt dis-puse în'tandern (policistroni) în ADN (genom) gi sînt tnanscriseîn ordinea 16 S - 23 S la procariote. Aceste gene apar de ase-menea strîns lincate, Ia eucariote fiind dispuse în'ordinea 18 S

- 28 S qi transcrise ca un pre-ARNr unic care are o:constantàde sedimentare 45 S. Acesta va fi separat prin prelucràrile post-transcriptionale ulterioare în cele trei tipuri de ARNr matur.

La eucariote, genele pentru sinteza ARN 18 S. qi 28 S s'e

afià în regiunea orgwuizator nucleolard (NO) Iocalizata la nive-lul constricliilor secundar,e implicate în formarea nucleolului.Rezu1tà cà aceste gene ri'bozomale sint gene nucleolare. EIe sîntr,egiuni vital,e ale genomului de vreme ce mutantele de Xeno-pzs desemnate D-nr.r fur stare homozigotà tripsite de nu'crleolnu sînt capabile sà sintetizeze ARNr gi mor. Genele pentruARN 5 ,S, prezente qi ele în copii multiple la eucariote sîntneLincate cu celela,lte gene ri'bozomale, fiind distrirbui.te pe di-verEi cromozomi, în spetà în regiunea teiornericà a lor. Deqinelincate cu genele ri'bozomale LB S qi 28 S, genele ri'bozomale5 S sînt transcrise coordonat cu genele pentru ARNr 18 S Ei 28 S.S-a constatat cà prezenla ARN 5 S în subunitatea mare a ribo-zomului este esentialà în funclior.ar€a normalà a rÍhozomuluiîn sinteza proteinicà.

64

ARNr din cloroplaste gi mi,tocondrii prrezintà greutàfi mo-lecuiare mai mici decît molecrrlele c€respunzatoa,re din cito-plasrnà.

Nu se cunoaqte deocamdatà cane este firncfia particul,anà aARNr. Se admite cà bazele neîmperechearte din ARNr ar par-ticipa, intr-un fel sau altul (posiibil tot pe principiul comple-mentaritàtii qi for'rnàrii de punfi labile de hidrogen) la inter-acliunea cu oelelalúe oategorii de ARN celular spr€ a deoodificamesajul genetic purtat de ARNnz. Are loc o al,iniere corectà adiferitelor tipuri de ARN c'elular cerutà de o fidelà traduoerea informaliei genetice într-o secvenfà corectà de amînoacizipentru sinteza unui polipeptid norma'l. Un rol prfurcipal în rea-lizarea acestei alinieri revine ionilor de magneziu (Mg2+1 carejoacà de asemenea un rol important în asamblarea unitàfilorribozomale.

Existà diferenle semnifica,tive în structura ribozomilor laprocarioúe Ei eucariote, diferenle care formeazà ceea ce WooI(1979) a denumit dilema centrald, a rùbozomalui. Astfel, ribozo-mii eucariotici sînt apreciabil mai mari decît cei procariotici,conlinînd un numàr mai mare de proteine ribozomale (cca 80,fa!à de 53 l,a procariote) qi au o mol'eculà în plus de ARN.Totodatà moleculel,e de proteine rilbozomal,e Ei de ARNr sîntmai mari la eucariote fa!à de procariote. Diferenla în dimen-siune este un paradox deoarece ribozomii eucariotici îndepli-nesc aceeagi funclie generalà - cantonarea sinrtezei pr,oteiniceoa +i ri'bozomii procaniotici. Se admite ca peurtru a ju.stificaaceste diferente dimensionale la ri,bozomii eucariotici trebuiedesooperite funclii noi. Unele proteine ribozoma,le suplimen-tare pot fi specializate pentru inúeracfiunea cu reeeptorii dinreticulul end'oplasmic numili ribophorine I Ei II, altele pot fiimplicate în reglar,ea mai complexà a traducerii ARNm. Nece-sitatea suplimentarà pentru anumi'te proteine ribozomale, ne-implicate în biosinteza proteinicà poate fi determinatà de panti-cularitàlile biogenezei organitului: proteinele ribozomale sîntsintetizate în citopiasmà qi tra,nsportate în urucleol uurde sîntasamiblate în subunità!ile ri'bozomale prin atagarea lor la pre-cursorii ARNr pe cind acegtia sînt încà tr,anscriEi de pe ADNribozom,al. Pre-ARNr va trebrui prelucrat qi ARNr 5 S'transcrisdin alte situri în nucleu trebuie sà fie î:rcorporat în subr:nitateamane ribozomalà. Cele douà subunitàfi rirbozomale tnebuie trans-portate din nuctreu în citopl,asmà. În acrest prooes extrem decomplicat de transport bidirecfional nucleu citoplasmà arputea fi implicate proteinetre ribozomale suplimerrtar,e ale rirbo-

S - Descifrind tainele ereditófii, vol. I 65

zomului eucariot. Ele de ase,menea pot participa la asamblareasubunitàlilor ri,bozomale ca qi în 'transportul lor spre cito-plasmà.

Proteinele ribozomale ale organitelor celulei eucariote mito-condriale Ei cl,oroplastice sînt codificate în ADN nuclear qi sin-tetizate pe ribozomi citoplasmatici. Din aceastà cauzà la euca-riote cu mitooondrií qi cloroplaste sînt sintetizate în citoplas-mà circa 200 de proteine riibozomale care trebuie distribuite înnucleol, mltooondrii qi cloroplaste. Cum se reaùizeazà aceasrtàdistritbufie nu se cunoaqte. S-ar puùea ca toate aceste proúeinesó fie fil,trate prin cele trei organite, fiecare relinînd grupulcorect de proteine ribozomale. S-ar putea ca proteinele supli-mentare ale ri,bozomilor eucariotici sà condilioneze ele înseleaoeastà distriibuire. În sfîrqit, nu poate fi exclusà nici posibili-tatea ca proteinele ri,bozomale suplimentare de la rihozomiieucariotici sà nu a,ibà ,o funcfie specialà sau sà nu îndeplineascànici ofuncfie. Existà mutanfi de Bocillus suúilis qi B. megate-úum rezistente la ttriostrepton qi ca,re sînt lipsi{i de proùeinaribozomalà L 1L Mutantul de Ia prima specie spre deoserbire deacelra de la a doua specie de BacilZzs nu prezintà nici un felde deficientà. Concluzia care se desprinde este cà proteina L L1la B. wbtilis. mu îndeplineEte \n€o funcfi,e ribozomalà sau însinteza proteinicà, dan nu poaùe fi orclusà posi,bilitatea ca rolulsàu sà fie preluat de al,te pr,oteine ri'bozomale prezente la acestmutant.

5. ARN de transfer (ARNí). A mai fost numit qi ARN so-lubil (ARNs), ARN accegttor de aminoacizi sau AIÌN adn@r.Sînt molecule adaptoare sau de racordare la care se ataqeazàdiferiti aminoacizi carìe sînú transferafi la ribozomi în timpulbiosintezei proteinice. Ac'este moiecule de racordare se atageazala rîndul lor în mod specific la grupàrile cetonice qi aminice li-bere de pe monocatena ARNrz pe principiul împerecherii com-plementare de hlazr azotatn cu formarea unor punfi temporarede hidrogen. ARNú foacà rol cheie în ,biosinteza pr'oteinicà.

Perntru fiecare aminoacid existà ce1 pufin cîte o moleculàspecificà, diferità de ARNú. Greutaúea mol.ecularà a ARNf estede circa 25.000 daltoni avînd o oonstantà de sedimentare de4 S. Lungimea molecutrei ARNú este de 73-90 nucleotide. Re-prezintà 7A-150/o din cantitatea totalà de ARN celular. Ca giARNr, ARNú nefiind purtà'tor de mesaj genetic are, spre de-osebire de ARNnz o duratà de via{a mare, prrezentînd o stabili-tate metabolicà mare, diferitele molecule ARNú putînd fi re-ciclate de nenumàra'te ori. Capàtul iiber 3' al monocatenei se

66

úerminà la toate tipurile de ARNú cu secvenfa CCA pe cîndla oapàtul, li'b,er 5' se aflà secvenla terminatà în G. MoleculeleARNf prezintà o mare stabilitaùe rneta,bolicà cane derivà toc-mai din prezenfa guaninei (pG) Ia capàtul 5' al monocate'neisale. Aceasta faoe oa ARNú sà nu fie supus aga cum este supusARNrn digestiei enzimartioe, ,gua,nfura stabilind punti de hidrogencu ,Lraza opusà din ttrlpina dublu-catenarà a structurii trifoliarea ARNf. ARNú conline qi unele nucleotide areo iqnuiúe pnecumacidul inosinic (I) care poartà purfura hipoxamtilra gi care nuformeazà aceleaqi per,echi de baze azotate ca oele formate deA Si G. Alte nucleotide neobiqnuite aflate în ARNú sùrt acidull-metiliinosisric (I-) acidul l-metilguanú,lic (G-) gi acidul NlN-di-metilguami,lic (G-) la care, prezenta gmpàrilor mgtil determinàformanea de perechi cu oricarre aùte tb,aze azotate. Tot ca bazà,neobiEnuità intrà în ARNú gi aeidul pseudouridilic (ìf) la careinelul pirimidilic uracil este ata$at lra ribozà nu prin azotul sAuN1 ca în acidul uridilic normadt ci prin carjbonul sàu 5. Aci-dul ,riiboti,midilic (T) esúe de asemenea o riibonucleotidà neorbiq-nultà ce intrà în ARNú qi care este LegaÉ de convertirea ura-cilului în timfurà în urma unei metilàri a uracilului la C 5. Maiexistà Ei o altà bazi'neorbi.qnuità în ARNú qi anume acidul d[-hidrouridilic (Ui) sau DHU) în care uracilul poartà hidrogensuplimentar la C 5 qi C 6. ln realitate dihidrouracilul nu esteo pirimidinà deoanece legàtura dintre C 5 gi C 6 nu este opunte durblà ci, uina simplà. Nucleotidele neobiqniuite nu pot fiintroduse în pnecursorul ARNú în timpul transcrierii, prin niciun mecanism de împer,echere de baz.e complementare. Ele aparîn urma modificàri,lor posttaranscriplionale a nucleoúidelor nor-m,ale, deja prezente în pre-ARNú.

Prin plierea monocatenei rezultà rqgiuni dublu-catenare înzonele ùr car,e ,bazele azatat'e se împenecheazà compl,ementar cuformar,ea d,e punfi de hidrog'en. Din ara,nfamentul spatia,l al re-giunilor bicatenare qi a1 r,egiunilor monocatenare rezultà ostructurà secundarà care este cunoscutà ca m,odelul frunzeid'e trifoi (FiS. 30). Structura secundarà ,bidimensionalà po.atefi la rîndul ei supusà plierii sprc a da o str-ucturà terliarà tri-dimerr.sion,alà caracteristicà de forma li'terei T (Fig. 30c).

În structura unor tipuri de ARNú inúrà gi inosina (I) maiales în secvenla antioodonului pen'tru codomii serinei (UCU),leucinei (CUU), pr,olinei (CCC), argtrinei (CGC), izoleucinei(AUA) ,etc., în care inozina (I) intrà în pozifia 3 antiparalelà(deci pozilia L în citire dir,ectà). Neputfndu-se împereehea, ba-zele metilate deiimiteazà regiuni'le bioatenare ale monocatenei.

67

l9 ig'au i,rq,.!r

u c6o

r, i,

ù ruhU

@e-G\g\lg'Ir'

'iG

G\

Éln

"l'{sG2o

hrtoHq.

(b,lr'

I6 .ogót'/ 3oH,

-brllul daq:l9roa

èlu o ordmcrdduhollt al f ia&:rt

bÈlo l,r'nr' irlCli?!ota mitrf:.ftú!)

Fíg. 30. Structura ARNI. (a). Secvenfa celor 76 nucleotide din macromoleculade ARNI pentru alauinà de la drojdie prezentatà în modelul birlirnensional alfnrnzei de trifoi. Se indicà cele patîu bucle majore incluzînd gi bucla anticodonuluica.re are secve[ta A-A-A gi care se pottivette prin complementaritate cod,onu-lui din ARNz fenilalaninà U-U-U. Bazele încercuite cu linii continui ocupàaceleagi prclzílii în toate moleculele de ARN care au fost analizate pînà in prezent.Bazele încercuite cu linii înherupte sînt .ìiferite la alte tipuri de ARNf. Numero-tarea bazelor începe de la capótu1 5'. Nucleotidele aeobignuite gàsite la ARNúsÎnt: lU: DihU: dihid.rouridina, Y:pseudouridina, mx : nucleotide metilateti î - timina (un uracil metilat în pozifia 5 în inelul pirimidinic). (b). Diagra-ma schematicà care indicó maniera în care ARNtFtea poate fi ràsucit spre a pro-duce unele dintte relafiile fizice observate între diferitele pàrfi ale moleculei. Li-niile subîiri indicà punfile de hid.rogen ce apar între baze în cadrul structuriitertiare pliate. (c). O reprezentare trid.imensionalà a ARNú redatà dupó studii

de difracfie în raze X.

Descifrarea secvenlei de baze din structura primarà monoca-tenarà a ARNú pen,tru alaninà la drojdie precum qi a structuriisale secundare - c€nfiguraîia spatialà cu negiuni monoca,tenareqi bicatenare - au permis lui HolLey $i colaboratorilor sài sà

68

.€m AUA6mA

àl

lc)

I

G

9cùU

elab,oreze modelul frunzei de trifoi pentru aceastà configuraliespafialà eare s-a dovedi,t a fi valalbil pentru úoate tipurile deARNú. Pentru aceastà realizare Holley a fost distins cu pre-miul Nobel. Folosind datele de secvenfiere a ARNú pentuu ala..ninà extras de La drojdie, Khorana qi colaib. au nealizat pe calechimicà, prima sintezà a unei ,gene, gena care dirijeaza sintezaARNú pentru alaninà.

ARNf se sintetizeazà pe maúri!à de ADN prin intervenliaARN-polimqoaei qi apare mai îrntîi ca moleculà pr,ecursoarecare, dupà transcriere, este supusà prnlucràrilor posttranscrip-fionale. Moleculele precursoare la ARNú ca Ei la ARNnz pre-zintà la capàtul 5' o secven!à suplimentarà numità secvenlaconducàtoare sau din cap (leader) iar la capàtul 3' altà sec-verr!à suplimentarà numità secven{a din coadà (troiler). Deas€rnenea, precunsorul ARNú pnezintà secvenfe interpuse incadnul secvenlei care va constitui seeventa ARNú matu'r func-fional. Printre prelucrarile posttranscripfionale unele deùerminàexcizia unor nucleotide din pre-ARNú sub acfiunea' enzimeiRN-aeò P (P de la precursoare) pe cînd ,altele determinà adi{iala capàtul 3' al monocatenei a-secvenlei 5' NìCf A 3', impli-catà în aminoacilarea ARNú. Implicarca secven!,ei CCA în ami-noacilarea ARNú (atagarrea aminoacidului activat - vezi sin-teza proteinieà) a fost dovedità în experienle de îndepàrtare aacesteia folosind fosfodiestntaza, din venin de qarpe care aclio-neazà numai asupra acestui capàt monocatenar ,al moleculeiARNú. ARNú lipsit de secvenla CCA de Ia capàtul 3' pierdecapacitatea de a accepta aminoacizi. Capacitatea acceptoarepierdu,tà a unui ARNú tratat cu fosfodiesterazà poate fi redo-bîndità dacà acest ARNf deficient este pus lntr-un amestec dereacfie care confine o enzimó specialà (terminaltransferaza) ceare capacitatea de a ,adàuga nucl,eotide terminaie fàrà a ne-curge la împerecherea complementarà de baze cu o matri!àpolinucleotidicà qi substraturile sale CTP qi ATP. Alte pre-lucràri posttranscriplionale sînt cele care realizeazà modifi-carea chimicà a unora dintre nucleotidele ràmase. Printre mo-dificàrile ehimice mai importante sînt metilarea gi formareapseudouridinei.

Modificàrile chimice ale nucleotidelor obiEnuite (incluse înca,ùena pre-ARNú în timpul transcrierii sale de pe matrila ADN)care due la convertirea lor în nucleotide neobiEnuite sînt cata-liza,te de enzime speciale existente atît Ia procariote cît gi 1aeucariote. O astfel de enzimà convertegte grupul NHz de pecarbonul 2 al acidului adenilic din pre-ARNú în grupul OH

69

F

creind astfel un rest inozinà la un.ele situri ale catenei pre-ARNú. Atrt€ enzime transferà grupul nretil (enzimele se numescîn cqnsecinfa metilaz,e) la hipoxantinà, guaninà sau uracil dinpre-ARNú spne a da I*, G', G- sau T. În sfîrqit, alte enzimerearanjeazà legàturile dintre inelutr pirimldinic qi ri,bozà spne aconverti uracilul în pseudouracil sau spre a hidrogena inelul,convertind uracilul în dihidrouridinà. Asemenea prelucràriposttranscripfionale au putut fi sfirdiate Î,n cazul microinfec-liei nucleului de drojdie de ,bere în ovocita de broascà.

Prelucràrile posttranscriplionale implicà în cazul precurso-rului ARNú (pre-ARNú) pentru tirozinà de la drojdie, elimi-n:rrea secvemfelor inrùerpuse din pre-ARNf (descrisà prirna datàde càtr.e Goodmatr Ei colarboratorii în 1977), excizia secvenlelorsuplimentarè 5' Leader $i 3' trailer, adàugarea secventei CCAla capàtul 3'. Toate aceste prelucràri au loc în nucleu. Tot înnucleu mai sînt modificate, în cazul ARNú pentru tirozinà de ladroidi,e sintetizat în ovocite de broascà microinjectate cu nu-cleu .de drojdie, cel pulin Sapte ribonucleotide înain,te ca ARNúsà fie transportat din nucleu în citoplasmà (Melton Ei colab.,1980). Aoeste modificàri ce duc la formarea în pre-ARNú a 5metil-citozinei (m5C), 1, metil-adenozina (-lA), pseudouridi-na (rÍ) 9i dihidrouridina (DHU) apar în nucleu. O singurà mo-dificare apare în ciúoplasmà qi anume a guaninei. S-a constatatcà modificàril'e apar într-o ordin'e pnecisà, strictà, cane 3e core-leazà cu schimbàrile din dimensiunea precurff)rului ARNú de-terrninate de eliminarea secvenlelor leoder qi trailer. Astfel, deînd,atà ce secvenf"a leader este eliminatà Ei este adàugat 3'CCA,U din regiunea antioodonului este modificat în pseudouri-dinà (tY).

Determinarea secvenfei ADN corespunzînd Ia 4 din cele B

gene ARNú pentru tirozinà (ú ADNúyr) de la SacchmwnVcescereuisiae a condus l,a consta,tarea cà aceste gene ARNú pentrutirozinà conlin o secven!à interpusà de 14 baz'e adiacente anti-codonului car'e nu este prezentà în ARNú rnatur qi deci ea esteeiiminatà în cadrul prelucràrilor p'osttranscripfionale.

Maturarea precursorilor ARNú diviza'tà în mod oonvenlionalîn douà proc€se separate - reduoerea dimensiunii Ei modifi-carea de ibaze reprezintà u,n proces unic, càci cele douà aspeotesînt inúim legate, desfàqur,flndu-se conoentr,an't. Succresilrneaordonatà a etapelor de prelucrare posttranscripfionalà a ARNîn general qi a ARNf în'special, sugereazà cà enzimele de ma-^uurafie care condilioneazà transformanea pre-ARN îrr ARN ma-tur au capacitatea, unele de a recunoaqte precursori cu sec-

70

venF 5' leadq, iar aitele de a recunoaqte gi accepta ca suíb-strat pre.ARN fàrà aceastà secventà 5' leader. Este posib,ii caîn aoeas'tà capaciúaùe de recunoaqtere sà joaoe un €utumit rolqi secvenfele interpuse. Ar trelbui sà fie un numàr de cel pulin61 tipuri de A-RNÚ care sà traducà mesajul genetic (vezi eodulgenetic) qi care ar corespunde celor 61 aodoni sens din ARNrn.Ta E. coli sînt 30-40 tipuri diferite de ARNú specificagi degene limitat redundante. La eucariote, genele pentru ARNfsînt înralú redundante.

Teoretic ,ar trebui sà fi,e un numàr de 64 tipuri diferite deARNf care sà traducà m,esajul genetic (vezi codul genetic). Aufost izolate în stare purà aproape toate tipurile de ARNú, iarla pesùe 20 dintre ele a fost stabilità secvenla de nucleotide amonocatenei (structura primarà). Genele pentru ARNf ca gic,ele ribozomale sînt prezente atît Ia procariote cît gi ia euca-rioúe în copii multiple (40-80 la procariote, 32A-14A0 la eu-cariote), în unele cazuri fiind distribuite grupat în genom for-mînd aqa-numitii clasteri. Fieca,re aminoacid are cel pulin unARNú specific care intervine în activarea sa în cadrul biosin-tnrei protcinice. Uneori, acelagi aminoacid poate fi activat dedouà tipuri, diferite de ARNú care s-au numit ARNf isooccep-úori. Specificarea unui aceluiaqi ,amfuroacid de douà tipuri deARNú ar fi o màsurà elaboratà în cursul evoluliei de a asigurarealizarea biosintnzei proteinice în condifiile în care ]a nivelulunuia dintre ARNú isoaccepùori s-a manifestat felomenul mu-tagen.

Fiecare moleeulà de ARNú prezintà rogiuni specifice de in-teracfiune cu alte molecule, negiuni, în care nu apar împe-recheri de ,baze prezentîndu-se ca bucle Ia nivelul càrora ba-zele sînt expuse avînd posibili,ùatea interacliunii cu alte ele-mente. Astfel, secvenfa CCA de la capàtul 3' al moleculeiARNú este implicatà în ataEarea aminoacidului corespun zàtorla molecula ARNf, h vederea transportului sàu. Fiind aceeaqila toate moleculele ARNú, secvenfa CCA nu este implicatà înspecificitatea a,taEàrii aminoacidului la ARNú.

Molecula ARNú prezintà însà o regiune care conferà speci-ficitate ARNú prin care acresta r,ecunoatte în mod specific unaminoacid dat. Aceastà regiune es.te variabilà la diferiteletipuri de ARNú. De asemenea, molecul'a ARNf mai prezintà oregiune de recunoaqtere a ri'bozomului reprezentatà de primabuclà din modelul frunzei de trifoi, alcàtuità din 7 baze ne-împerecheaúe, numità bucla TìI'C, precum qi o rcgiune de re-cunoaqtere a codonului din ARNm, regiune care s-a numit

7l

F

anticodon sau nodoc (opusul lui codon) qi car,e este formatà,ca gi eodonul din ,trei bazp, ,azotate (tripleta). Ea se aflà în'bucla antioodonului. Regiunea anticodonului este specificà fie-càrui tip de ARNú gi ea courdifioneazà recunoagterea cprectà acodonului din ARNrz cotrespunzàtor aminoacidului purtat deARNf gi- care este specificat (codificat) de càtre oodonul dinARNm. Între prima buclà qi bucla anticodonului se aflà obuclà micà numità ,,ciot6'.

Recunoas.terea codonului de càtre antioodon se bazeazà peprincipiul complementaritàlii bazelor azotate de tip (A U A -L23codon

- U A U anticodon; C G A codon - G C U - antico-321 12 3 321

don etc.) care se asociazà tempor,ar prin formarea unor punfid,e- hidrogen. Codonul qi anticodonul sînt ,orientate antipar,alel(5'-t3' codonul, 3'+5' anticodonul).

Împer,echerea corectà codom-anticodon condilioneazà plasa-r.sa în catena polipeptidicà oe se sintetizeazà. ,a unui aminoaciddat Ia l,ocul corespunzàtor, sintetizîndu-se astfel o proteinà nor-malà structural qi funcfional.

Dar, potrívit ipotezei oscilàrii (u:obble) elarboratà de Crickîn 1960, une'ori un flntlpit tip de ARNf are capacitateoa de arecunoaqte prin ,anticodonul sàu mai mul{i codoni (triplete)care însà se deos,ebesc doar prin cea de-a treia 'bazà,. însearnnàcà in cad'rul internelafiei codòn-anticodon, esenfialà în d,escifra-r,ea, decodificarea (traducerea) mesajului genetic transcris înARNrn, primele douà perechi de baze prezintà o mai mare spe-cificitate a împerecherii pe cînd c,ea de a treia capàtà caracteroscilant. Astfel U aflat în conformitate cu antiparalelismuiimperecheril,or cle ,baze pe primul loc în secvenfa anticodonu-iui (altfel, ea ocupà tot locul trei în acesta dacà consideràmorientarea generalà de la stînga l,a dreapta) poate sà se împe-recheze cu A dar Ei cu G afiate în codonul ARNrn ca cea dea treia'bazà.

Tot astfel G din antioodon poate recunoaqte, în aceleaqicondifii tipologice atît C cît qi u, iar hipoxantina poate recu-noaEte u, c si A aflate în pozilia a tr,eia în codon. Nu acelagilucru este pentru C qi A a,flaúe în pozifia ulrtimà (considerîndsensul gen,eral stînga+dreapta) în an,ticodon. Acesùea nu potrecunoa$te qi nu se împereoheazà decît cu bazele oomplemen-tare conespunzàtoare a,flate în a treia pzí\ie în codon qi anum,eGqiU.

72

Cea de a patra buclà din modelul frunzei de trifoi conline6-12 tbaze neîmperecheate. Ea s-a numit bucla dihidrouraci-lului, fiind implicatà în legarea ARNú la o,minmrilsintetozd,enzimà activatoare specificà pentru fiecar,e amimoacid.

Inifierea tuturor catenelor polipepti'dice (tradueerii mesa-jului genetic) se realiznazí, prin intervenfia aq€FnumituluiARNú i,nifiator. Aoesta este ARNú ce transferà N-formilm'etio-nina (ARN/M"') l,a ,bacterii, virusuri, mitocondrii qi cloroplasùeqi ARNú ce transferà metionina (ARNtue\ la eucariote.

Func{ia ARNú este în esen!à legatà de decodificarea mesa-jutui genetic. Dar ARNú mai poate juca rol qi în alte procesecelulare, mai ales la baeterii cum ar fi negl,area activitàlii ge-nelor (operoni) care dirijeazà sinteza unor aminoacizi, transpor-tul unor aminoagizi necesari formàrii punlilor interpeptidicedin perelii celulari ai bacteriilor, sin'teza am.inoacilfosfatidilgli-cerolului, adilia terminalà a resturiior aminoacizi la protei-ne etc.

În cazul în care Eenel,e pentru ARNú suferà mutatie se sin-tetiz.eazà ARNú la care este alteratà specificitatea de recu-noaqùere de càtre ,antioodon a codonului corespunzàtor datoritàmodificàrilor ce apar în bucla antic,odonului sau adiacent eÍ.. IJnasemenea ARNú va putea sà recunoascà codoni rLonsens saumissens, care condilione'azà fie terminarea la'nfului polipepti-dic în primul caz, fie încluderea în lanful polipeptidic a unuiaminoacid necor,espunzàtor datorità modificàrii prin substitufiea secvenlei de bazà în cel de-al doilea caz.

ARN nuclear heúerogen gi ARN crornozomnl.La eucariote se mai descriu qi alte d,ouà tipuri de ARN

celular. Esúe vorba de ARN nuclear heterog'sn Ei ARN cro-mozsmnl.

6. ARN nuclear heterogen (ARNhn) reprezintà o clasà demolecule ARN cu greutate molecularà variarbilà într,e 105 qi2 X tÙz daltoni cu dur,ata de via!à scurtà (5-10 minute) fiindinstabil. metabolic. ARNhn repî'ezintà cca 3olo din totalul ARNoelul'ar. Fiiurd sintetizat pe matrila ADN are o compozifie deibaze eomplernentarà ADN. Are un con{inut G + C de cca4A-450/o cu mult mai mic decît cel aI ARNr care este de cca700/0. Est€ localizat î:r afara nucleolului.

Din ARNhn derivà, în urma prelucràrilor posttranscripfio-nal,e ARNzn, din care cauzà, ARNhz s-a mai numit ARN pre-rnesager sau pre-ARNrn. Partea din ARNhn care nu nepnezintàARNnz este transcrisà de pe ADN care prezfurtà secvenle re-pertate de nucleotide qi care se pare cà sînt implicate în me-

73

7

canisme de reglare. Aceastà parte a ARNhn poate prezenúa oconformafi,e caracùeristicà sub formà de ac de pàr numità struc-turà lwirpin qi care se formeazà prin împerecheri intracatenanede baze complemerrtare.

7. ARN crarLozatnol (ARNc). Este un tip de ARN comple-mentar unor secvenfe specifice din ADN cromozomal al euca-riotelor. O parte din acest ARNc reprezintà molecule precur-soare ale ARNzn, ARNr, gi ARNú. ARN crorìoZohd, pe de altàparte se cr,ede cà reprezintà o categorie de ARN celular legatàde interacliunea ADN-proteine càreia îi conferà specificitatede secven!à, acest tip d'e ARN legîndu-se covalent I'a proteinelecfomozomale histone.

Greutatea molecularà a ARNc ,este mai micà decît c€a aARNú càci cuprinde doar 30 pînà La 50 rrucleotide. Confine pînàla 270/o dihidrour,acil. Nu se $tie încà dacà ARNc este într-ade-vàr un tip aparte de ARN celular sau repr,ezintà un produs dedegr,adare a ARNhn. Sînt date dupà care ARNc intervineîn,tr-un mod specific în reglarea activitàtii genice la eucariote,avînd efect derepresor asupra geurelor represate prin comple-xar,ea ADN cu hisúonele.

B. ARN airol. La unii fagi oa Ei la unele virusuri vegetale Eianimaie miezul de acid nucleic este reprezentat de ARN, PUt-tàtor în aoest oaz de informafie geneticà primarà din cane cauzise mai numeqte Ei ARN geneti,c. ARN uiral poate fi mon,oca-tenar (bacteriof,agii Fz $i R17, virusul moz,eicului tutunului, vi-rusul gripal qi polio). Reovirusurile au ARN 'bicatenar. Mole-culele ARN sînt liniare, niciodatà circulare.

ARN airal îndeplineqte atît rol de matrifà pentru replicareasa în veder,ea multiplicàrii panticulelor viraie cît qi rol de ARNrnesryer pentru sinrteza de proteine virale specifice. Genomulviral ARN îndeplineEte deci o funclie dublà, gen'omul qi tran-scriptul fiind într-un anume sens unul qi acelagi lucru giaceeaqi enzimà numità replimzd, sau tronscriptazd,, de fapt oARN polimerazà servind atît funcfia de replioare cît Ei func-lia de transcriere.

Cel mai bine studiat este ARN al fagilor QP $i R17 la cares-a realizat secvenflenea nucleotidelor în cea rnai mane pa,rte.Astfel cromozomul fa,gului R17 alcà,tuit dintr-o monocatemà ARNconline cca 3510 mucleotide, purdînd informafia pentru sinrtezaa 3 proteine Ei ràmînînd încà 580 nucleotide, primele 100 uru-cleotide de la oapàtttl 5' nefiind niciodatà traduse în pr"oteinàca dealtfel nici cele 50 nucleotide oare pneced capàtul 3'. Ca-pàtul 3' al catenei confine secvenrta 5' . . . CCA CCCA-3' qi se

74

PPP G:CA:UU:Ac =G6=CU:AA

A--Uc =G

G

A

U

A

A,

c

PPP

,OHV. A ::U:.5

\----w.-J

RF

G

A,

U

L

nrptirazi.+[,(a tena -naîrtlà)

(-) u

A

A

C

A

PPP

^lJ' ARN progen

forma, replicativA

^ REPL'T A2 A

" pr,"r",;;;;iU t+t

AoH

Fig. 31. Replicarea ARN viral. RF -dublu-catenaró.

admiùe cà aceastà secven!à este recunoscutà specific de càtreenzima replicazà. Pe parcursul secventei ARN apar posi'bilitàîide împerecheri complementare intnacatenare cu formare destructuri buclate de tip hairgnn, structuri impliaate în confe-rirea de stabilitate monocateil]ei ARN în timpul infecfiei, înîmpacheúarea sa într-o formà mai c€mpactà în capsida fagicà.

În vederea sintezei proteinelor virale moleculele de ARNviral,, acfi'onînd ca ARNnz se ataqeazà, la rirbozomii celulei gazdàformînd poliri'bozomi.

Im,ediaú dupà injectarea ABN viral în celula gazdà Ei lega-rea sa de riib,ozomii celulei gazdà este sintehzatà ,e!ìzima ARNsinfu,tazd (ARN-re plicozd) care catalizeazi formarea unei c:a-tene complem,entare nealizînd astfel replicarea ARN viral(Fig. 31). Dacà se considerà oatena inifial'à, care pàtrunde încelula gazdei drept ca;tena ,,*tt ea se,rye$te ca matri!à pentrusinteza caùenei complernentare ,-u pe principiutr împerecheriide baze complementare cu formarea de punfi cle hidrogen, rea-lizîndu-se pemtru un anumit timp o structurà bicatenarà ARNnumità tormd replicatiud, (Rtr'). Au loc a,poi multe runde dereplicare ale formei replicative bioaúenare. Unele din catenele+ nou sinúetizate acfioneazà ca ARNnr dictînd sinteza dereplicazà qi pr'oúeine ale capsidei. Alte oatene f , dar nu esteexclus ca Ei unele din acelea cìare au participat la sinteza pro-

75

Fig. 32. Dogma centralA revizuitàa biologiei moleculare. Diagramaredà relaliile de transfer de infor-mafie dintre mecromoleculele in-formafionale: liniile gtoase - re-latii dovetlite pînA ln prezent;linia subfire continuà - lagganis-mul special de transfet de infor-maJie de la ARN la ADN (re-verstranscriete) care are loc incelulele infectate cu oncovirusuri ;liniile întrerupte - transfer deinformafie nedovedit pînà îu pre-

zent.

teinicà, devin împachetaúe în capsida proteinicà a noilor par-ticule fagice, corrrstituind cromozomul viral.

Iatà deci cà avem aici de-a faoe cu o dualitate în careaoeeaqi rnoleculà de ARN viral poate funcliona atît ca mate-ri,al genetic cît qi ca ARNm.

9. Reuerstmnscrierea. Pînà acum ,aîn analizat tnansferulinformaliei genetice de la ADN la ADN in procesul replicàriiADN de l,a ADN la ARN în procesul transcrierii gi de Ia ARNla ARN în replicarea ARN viral.

Pînà în anul 7970 a dàinuit ideea, cristalizatà în a{a-numitadogmrt 'a biologiei mpleculare (Fi'S. 32), potrivit càreia transmi-terea informafi,ei ereditare se f,ace unidirecfional în sensulADN--*ARN-+proteine. În anul 7970 Temin gi Mizutani pe deo parte gi Baltimore pe de alta au descris o ADN polim,erozddependentà de ARN izolatà din uirionii virusurilor onoogeneARN (ri,bovirusuri oncpgìene din farnilia Retrouirifue) Si dincelule infectate cu asem€n€,ar virusuri ca gi din celule transfor-matre malirgn. Aceastà enzimà ar€ capacitatea de a transcrieARN natural sau sintetic qi de a sintetiza astfel, folosind camatri!à ARN, o c€pie oomple'mentarà ADNc. Este deci oviolare a dogmei centra,le a biologiei moleculare càci în acestcaz ernzima ADN-polimerazd,, dependentà de ARN, condifio-neazà transferul informaliei genetice de Ia ARN l,a ADN. Dinaceastà oauzà a fost numità inuertazd, reuertazd sau reuers-transcriptazd i,ar procesul sintezei unei oopii ADN pe ma'tritàARN s-a numit inverstranscriene sau rwqstranscriere.

Reverstranscriptaza folosegte ca substrat dezoxiribonucleo-tid-trifosfafi, este depende,ntà de o matrifà ARN Si pentrureacfia de polimenzarc ureoesità un ARN gnim,er cu rol de ainifia sinteza catsnei ADN la oare se leagà printr-o legàturà

76

covalentà fosfodiesúericà. De as€imenea enzima necesiúà pentrur'e'acfia neverstranscrierii ioni bivatlenfi de Mg qi Mn. Drpàadàr,rgarea primului dezoxiribonucl'eotÍd la gfupul 3'JH alprimerului ARN, reacfi,a de reverstr,anseriere se desfàgoarà prinadàugarea succesivà de dezoxiriboqlucleortide, oane se împe-r'echeaaà cu 'bazele comple'rnentare din matrila ARN, întredezoxiribonucl'eotide statbilindu-se legàhrri oovalente fosfodi-esterice. Monocatena ADN astfel sinúetizatà, copie a matrileiAFIN, formerazà cu aceasta,, prin interm,ediul punlilor de hidro-gen dintre bazele oomplemenùare o structurà tbicaúenarà hi,bridàARN-ADN, Intervime se parre o ribonucleozd. H care hidroli-zeazà. ARN dirrr hilbrid astfel, ca mourocatena ADN poate servica matri{à pentru sinùeza unei catene complem'entare. Rezultàun ADN bicaúenar purtàtor de informalie geneticà viralà qicarìe se poate inf,egna în oromozomrul. oerlrulei gazdà sub fonn,aa oeea ce a fost numit prwirus. Fàrà a duce la \in oeluleiinfectaúe, pB oalea reverstranscrierii, celula gazdà este însàtransformatà malign. La un momeurt dat, sub influenfa dife-ritilor faotori mutageni, fizici, chimici sau rbio,logici (infectia cu{rn alt virus) provirusul ADN se desprinde din cromozomulgazdé qi poate transcrie molecule de ARN viral, asi'gurind ast-fel multiplícarea virusului oncogen.

ADN proviral se integreazi în cromozomul gazdà în regiuni,om,oloage, inùegrarea fiind oondifionatà de o enzimà numitàintegrazd. pe cînd în excizia sa pe lîngà inúegr,azà intervine qio erciào,nazd. In'tegrarea gi excizia ADN pr,oviral sînt în esmrfàfenomene reoombinatorii de tip rupere-reunire (vezi recombi-narea geneticà).

Virusurile oncogene prezihtà un genom repreuen'tat de ARNrnonocatenar avînd o constantà de sedimentare de 78 S, carecuprinde patru gene simbolizatn g@g, onc, i.rw qi poZ.

Gena gog specificà proteineLe virale interure avînd ca pro-dus primar o proteinà cu masa molecularà de 76 000 dalúoni.Gena otzc specificà o proùeinà implicatà în inducerea tramsfor-màrii maligne a celulelor în creqtere. Gena inu esbe legatà desinteza glicoproúein'ei de la suprafala înveliqului virio.nului, iargena pol specificà sinteza inve'rstnanscriptaa,ei (reverstranscrip-taz'ei).

În 1969, Huebner gi Todaro au elaborat ipoteza oncogenei,potrivit càreia toate celulele contin în ADN o uirogend, adicà,o genà oare oonfime informafia geureticà a urnui virus incluzîndqi ,aceea pentru transformarea malignà a celulei gazdà, adicà

77

oncog€na. Virogena este replicaità qi transmisà odatà cu ADNgazdà dsa lun€ul generafiilor celulare. În mod normal oelulaa elaborat mecarrisme de represi,e a virogenei. Cînd mecanismulde represie este alterat virogena se exprimà qi duce prin acti-vitate'a onoogenei la transformarea malignà a celulei. Altera-nea meoanismului de represie apare în urma ac{iunii diferililoragenti fizici, chirrici sau biologici.

Desi'gur virusurile onoogene pot fi ribovirusuri (ARN) saudezoxiriibovirusuri (virusuri ADN). Reverstranscrierea este î'nsàspecificà ribovir'usurilor oncogsne.

Capitolul III

ORGANIZAREA MATEEIALT]LI]I MH}ITAR

Sisùemel,e biologice cuprind douà tipuri fundamentale deorganizare Ei e,nume orgonizorea ui,w'ld qi orgm,iznrea celulord,.La rîndul sàu orgamizarea celularà cuprinde douà tipr:ri diver-genùe de ,organizare: organizarea procariotà Ei organiza,rrea eu-cariotà, precum qi un tip intermediar, organizarea ntezwriotd(Gavrilà, 1978).

1. ORGANIZAREA VIBALA

Asupra concepttrlui de virus a fost etraborat neoent un ex-celent studiu critic (7nrnea, Ei Herlea, 1974).

Statutul particular af sisternului viral poate fi desprinsde expresia aforisticà a lui Lwoff care în 1957 afirmà cà,,virusurile pot fi oonsiderate ca virusuri, din cauzà cà viru-surile sînt virusurir(. Virusurile se caracùeriznavÀ prin existentaîn structur'a lor a unui singur tip de acid nucleic (fie ADN,fie ARN, niciodatà ambele tipuri d,e acid nucleic). Virusurilenu cresc, DU se divid qi nu posedà aparat enzimatic pentruproduoere de energie. Prin aceasta virusurile se deosebese esen-fial de toate celelalte sisteme bioLogice existente actual-mente în natura. Dar virusurile pot fi oonsider,aúe toúuqi sis-teme biologice prin faptul cà ele pr'ezintà caracterlstici struc-tunale qi dimensiunri cpnstanùe, pot suferi rnutafii qi recomibi-nane geneticà qi pr'eziurtà o ontogenezà, precisà în care pe seamamaterialului biologic ail celulei gadà, materialul lor genetiedirijeazà formarea noilor particule vira,le, asigurînd astfel per-petuarea lor.

Viruzurile au orgranizare acelularà. Particul,a viralà com-

79

pletà numità oirion sau virusul infeclios matur reprezintà ounÍta,te de structurà qi funcfie atcàtuit dintr-un îmveliE protei-nic - capsida $i un miez de acid nucl,eic. Miezul de acid nu-cleic este reprezentelt de ADN la d.ezoúriboairusuri qi de ARNI'a ribatirusuri. Acizii nucleici virali nu sînt asociafl cu pr,oteinecu exceptia unor cazuri îur care se descrie exisùenfa în interio-rul capsidei a unei proùeine implieatà în împachetarea (supra-spiralizarea) acidului nucleic viral obligat sà fie cantonatîntr-un spa{iu foarte restrîns. Alte tipuri de proteine virale,,interne( au rol enzimatic (replieaza sau reaerstrans*i.pfuzade exemplu).

Miezul de ,acid nucleic viraù. se mai numegte crarnozo'm ui-rol. Virusurile sînt par,azilt obligali de nivel gearetic, deoarecevirusurile, nu se reproduc de sine stàtàtor, ci ele se reproducpe searna componentelor oelulei ,gazdà dupà planurile anhitec-turale furscrise în informa{ia ereditarà viralà depozitatà înmiezul de acid nueleic ADN sau ARN.

Datoriúà acestui fapt marea majoritate a virusurilor rnani-festà o înaltà qi striotà specificitate de gazdà: un virus oe in-fecteazà Eseherichia coli bunàoarà, în mod normal nu va pu-tea infecùa o al.úà specie de bacterie, ba mai mul.t prezintà pre-ferfur,!à pmrtru o ,anumità tulpinà de E. eoli. O singurà exoepfiese impune a fi amintità. Este vonba de virusul PIV? care in-fecteazà peste 40 de specii, diferiúe de planrte Ei chiar o insectà.

În afarà de virion, virusul se mai poate afla sub formà devinus vegeú,artiv crorespunzînd eromozomului viral aflat liber încitoplasma celulei gazdà în ,timpul mul'tiplicàrii sale sau subformà de provirus cînd este integr,at în eromozomul gazdà. încazul dezoxiri,bovirusurilor, ADN poate fi dublu-catenar (li-niar sau circulan), sau monocatenar, circular. Acesta din urmàdevine dublu-catenar în timput nepticàrii.

La ri'bovirusuri precum ,ba,c,teriofagii 8p, Rn pi fz, VMT,unele vimsuri 'animal,e (influ'enza gi alt poliomelit€i) ARN estemonocatenar qi devine dublu-c,atenar în timpul replicàrii. Reo-virusul are un ARN duiblu-oatenar chiar atr:nci cînd es,te înstare de virion. virusurile planúelor au în gener,al un ARNduiblu-c'atenar. La reovirus qi alte virusuri animale genomulviral este segmeùltat adicà ARN esúe rreprez*ntafi prin mai multepiese de z4,R.fú bicaúenar. Genomul ARN al virusului gripal ,estedisc,onúiuruu. El este monocaùenar si format din g fr,agmenteavînd o greutaúe molecularà cuprinsà ùrtre 105 gi 106 dalúonirealizînd o m,asà molecularà de 5,5 X 106 dalùoni.

80

Virusurile gripale, paragripale qi rabdovirusurile se numescvirusuri cu catenà negativà deoarece ARN-ul lor nu are funcliemesagerà, $i pàtrunzînd în oelula gazdà,, nu poate induce sin-teza proteinelor virale specifice, din asemenea virusuri nepu-tîndu-se extnage ARN viral infectant. În particulele virale aleacestor virusuri existà enzima transcri,ptazd care asigurà tran-scrierea unei catene ,,*tt pe catena inilialà ,,-sc. Transcriereaqi replicarea ar putea fi reaLizatà de aceeagi enzimà ARNtrarrscriptazà,, sau enzima de transcriere este modifica,tà prinadilia unei proteine din celula gazdà astfel cà ea d,evine oreplicazà.

Dimensiunea genomului viral variazà între 3000 nucieotideqi peste 10 000 nucleotide, codificînd între 3 Ei 10 proteine cu osecvenfà de cca 140-160 arnin,oacizi. Bacteriof,agii ARN repre-zinti unele dintre cele mai mici virusuri avînd cca 3300 nu-cleotide care cor,espund la 3 gene priurcipale, douà specificîndproteine structurale al'e virusului iar a tr,eia specificînd ARN-sintetaza.

Adenovirusurile mai mici prezintà o macromol,eculà d,e ADNsub formà circularà atît la nivelul virionului cît gi în formasa replicativà, pe cînd în cele mari, la nivelul virionului, ADNse prezintà ca o moleculà filamentoasà lungà de 6 pm Ia fagulqzg ee infecteazà bacteri,a Bacillus su,btilis gi de 47-52 pm lafagii de tip Tz $i Ta ai bacteriei E. coli. Virusul variolei aviareare o moleculà de ADN lu,ngà de 93 pm.*FÀglI

l. al bacteriei E. coli ,ar,€ o moleculà de ADN lungàde 16 pm qi care prezintà la oapete prelungiri monocatenaredin care cauzà aceste ca,pete sînt ,,lipicioase6r sau ,,adezivea,adicà au secvenfe oomplementare pe seama càrora moleculabioaúenrarà linianà de ADN se circuLanzeazi in aitro ca qi întimpul cînd se aflà în celula b,acterianà.

$i fag'ii Tz, Ta, Te $i T7 pr,ezintà secvenle terminale repe-tate în moleculele limiare dublu-caten'are de ADN dar ele seaflà la n,ivelul unor regiuni dublu-catenare, neputîndu-se rea-liza circularizarea.

Forma circularà protejeazà macromol,ecula ADN de ataculexonucleazelor.

De regula însà la nivelul ADN viraù nu se aflà secventerepetate de baze.

Se cronstatà cà virusurile car,e au acid nucleic reprezentatde o moleculà monocatenarà în virioar aceasta devine dublu-catenarà în timpul replicàrii. Monocatena reprezintà rnesagerulIa fagi pnecum QF qi f2 oar€, patrunzînd în celula gazdà poate fi

81$ - Descifrtnd tainele ereditàfii, vol. I

7

direet tradusà de maqinària de sinte'zà proúeinicà a celuleigazdà. În aL,te cazuri, caúena caÌre pàtrunde reprezintà comple-mentul mesajului, aqa cum este cazul lui p X 174. În aoest @2,neplicarea rnonocaùenei este primul eveniment qi numai dupàaceasta aparatul genetic este disponibil pentru tra,nssriere.

În ,eoncluzie se po,ate spune cà informafia geneticà a viru-surilor se aflà codificaúà în cnomozornul viral care este nepre-zentat fie de ,q,,DN, fie de ARN gi care se aflà sub formà dem'olecule liniare sau circul,ane rbicatenare saru monocatenare.Moleculele monocatenare d,e ADN sau de A.R,N ,capàtà în tim-pul replicàrii formà bicatenarà, reprezentînd inúermediari r,e-plicativi sau forme replicative.

2. OBGANIZAREA CELULABA

Toate sistemele biologice cu excepfia virusurilor pnezin'taorganizarre celularà. Organizarea celularà a nepnezentat o etapàesenfialà în organizarea qi evolufia ma'teriei vii care a oferitenorme posibilitàti qi perspective evolutive. Deosebirea princi-palà dintre virusuri Ei celule courstà în faptul cà niciod,atà oparticulà viralà nu va pute,a da naqtere direct la alte douàparticule virale prin diviziune. În cazul celulelor, oricît desimple ar fi ele, chiar arflate la limita superioarà dimensio-,nailà a particutreilor virale, cum sînt 'micr,oplasmele

gi ricketiile,multiplicarea presupune diviziunea unei celule preexistenteprin care nezultà douà celule fiice identice. La berza, multipli-càrii celulare stà o finà coordona,re între replica'rea ADN qidistribu{ia produqilor de replicare în celulele fiice prin inter-verrfia unor mecanisme specializafre qi extrem de diversificate.

Toaúe celulele au de asemenea ambel,e tipuri de acizi nu-cleici qi un sistem propriu de sintezà proteinicà.

În cadrul organizàrii celul,are se deose,besc douà tipuri oar-dinale de onganiz,ar'e geneticà

- procariot gi eucariot qi un úip

intermediar - mezocariot.

2.1. ORGANIZAEEA PROCABIOTA

Aoest tip de orga,nizare car,acteriz,e,azà. bacteriile, actinomi-cetele qi al'gele albastre-verzi ururnite incà cianobacterii, prezen-tînd toàte atributele sisùemului biologic oelular, inclusiv auto-

82

r,eproduoerea si morfogeneza autonomà. Materialul ior ereditareste reprezentat de o moleculà circularà dublu-catenarà deADN care se mai numeqte crom ozom bacterian. Cor,espondentulm,orfologic a'l crorîozcmului circular bacterian este Àucleoidulbacterian care prezintà la nivel ultrastructural ca Ei geuoforulalgelor alibastre-verzi fibrile fine de ADN care au un diam,etrude 25 A lGavrilà qi Tàciurà, 1978).

Nucleoidul bacterian nu este separat fa!à de citoplasmà,de càtr,e o structurà mem,branarà, astfel cà aoeste organismenu au un nucleu ,adevàrat. Materialul genetic nu esté închisîn,tr-un spafiu genertic definit, astfeL cà r,àporturile sale cu cito-pl,asma sînt directe. La procariote relafia- ADN-cromozom estede toúalà omologie. cromozomul bacterian cuprinde, urr setcomplet de determinanli genetici (gene) ai tuturor caracterelorunei celule bacteriene, pentru me,taibolism energetic, biosintezec'elulane, creqtere qi diviziune ca gi penúru regl'area activitàlilorintracelulare. ADN bacúerian nu se asociazà de regulà cuproteine tbazice histonice. Date recente indicà prezenla, la bac-teria E. coli Ei ],a cianobacteriile Annbaena qi Aplwno&psa, aso-ciate la ADN, a unor proteine 'bazice d'e tip hisùonà cu greu-tate moleoularà micà de 10.000 dalto,ni. Structura supercpira-liza;tà a ADN bacterian este menlinutà de càtre ARN.

Cnomozomul circular bacterian reprezintà suportul fizic alunicului grup de înlàn{uire a genelor, toate genele bacterienefifurd úransmise în bloc la descemden{i. El reprezinrti cea mairDBr€ mol,eculà descrisà pînà în prezent în'tr-un sístem ibiologiecuprinzînd un numàr de coa 2000-3000 de ,gene. Are un peri-metru de 1400 pm. Circularitatea cromozomului bacterian îlpnotejeazà fafà de acfiunea depolimerizatoare a unor enzimeprecum dezoxiribonucleaza. Date asupra circularitàtii cromozo-mului ibacteria,n au fost obfinute, prin urmàrirea proc€sului

" de

conjugare bacterianà. S-a constatat astfel cà în cadrul acestuipnoc€s transfenrl, de gene de Ia celula donor l,a celula receptorse face cu o secvenfialitate precisà qi determinatà în rtimp(Jaeob qi Wollman, 1961). Ulùerior Cainns (1963) aduce doveziooncludente electronomicrpsoopice qi autoradiografice care pro-beaeà, circularitatea, cnomozomului baetrerian. Toate ibacterlile,cu o posibilà excepfie a bacteri ' Psqud,omonos, prezin,tà cro-mozom circular. Se cunoagte încà putin despre organizarea unorasemenea inele de peste 1000 pm lungime, aflate în celul,e acàror lungime nu depàEeqte l-2 pm. Crom,ozornul ,bacterianpnezin'tà un punct de ataqare pe membrana celularà, iar ata-garea aceasta reclamà sintezà proteinúcà. Sînt date dupà cane

83

situl de ,ataryare la membrana celularà corespr:nde unei negiunidim cromozomul bacterian bogatà în secvenle A-T. De regulàfiecare celulà tbacterianà are un singur cromozom dar fur cazu-rile cînd replicarea cromozomului nu este urmatà de diviziu-nea celul,ei pot apare 2-4 cromozomi. Dar aoeqti cromozomimultipli nu aduc o informalie geneticà suplimenúarà, ei repre-zentînd copii identice ale crromozomului original. Condifia nor-malà a celulei bacteriene este haploidia, càci ea prezin,tà unsingur set de determinali ereditani (gene).

în ,afara cromozomului circular - suportul grupului prin-cipal de gene în citoplasma celulei bacteriene se pot efla unasau mai mulùe structuri eneditare adifionale, extracromozo-m,al€ (separ:ate fizic de cromozomul principal) confilrînd fiecarecoa 0,5-2010 din ADN total al oelul,ei, cane au fost numiteplasmide. Ele se replicà indepemden,t de cromozomul principalbacterian qi sint moqtenite sta,bil. Ele sînt r,epliconi tipici. Plas-mida (termen introdus de Lederberg, fur 1952) reprezi,n'tà o mo-leculà circularà de ADN ',bicatena'r, mult mai micà 1lo/o) co,m-panativ cu c\ea a cromozomului ibacterian. Plasmida poartà6-10 geille fiind de f,apt un cromozom bacterian miniatural.'Ca exemple de plasmide pot fi considerafte factorul de ser (F),

Jactorul de rezistm.fd la ontibiotice (R), factorul colícinogeni,c(col), fagti temperafi cum ar fi fagul î,, care în stare de profag,se integre'azà in cnomozomul gazdà tot astfel precum se poateintegra qi factorul F. În stare integratà asemenea structuri,poartà numel,e de episomi.

Unele plasmide au fost numiúe conjugoni, datorità proprie-tàfilor de a se comporta ca factori determinafi ai conjugàrii,fiind tr,ansmisi'bile de la o c'elulà la a'l'ta în procesul oonju-garii.

Datorità tra,nsferului de plasmide de la o celulà la ,alta,ca gi a pierderii spontane a unora dinrtre ele, celula bacterianàse aflà într-o stare permanentà de variabilitate genotipicà asi-gurîndu-se astfel o mai bunà qi uruanlatà adaptare a acestorala mediul lor de via!à. Datà fiind implicarea plasmidelor în fe-nomenele de rezisten!à la antibioticre, studiul 1,or a càpàtat unmare impuls în ultimul timp cînd au apàrut tulpini ,bacterie'nemultipiu r,ezisten,te. Dar în prezenú studiul plasmidelor bacte-riene este intensificat qi prin ace'ea cà aceste structuri mole-culare s-au dovedit a fi excelen{i càràugi ai unor fragmenúe deADN euoariot, reprezentînd un fe} de ,,cal trnoiams prin care

84

est'e introdus intr-o celulà bacterianà un fnqgmenú d'e ADNpurtàùor al unei gene eucarioùe. Esúe vor"ba de realiTÀrea aqa-zizului ADN recombinant.

2.2. ORGANIZABEA EUCARIOTA

Cu exceptia bacteriil,or, aetinomioetelor gi cianobacteriitlor,toate sistemele hiologioe celulare au materia,lul ereditar în-chis intr-un spafiu genetic - nrucleul - delimitat de pr'oc€-sele fuurdameartale ale citoplasmei prin intermediul unei mem-brane duhlà electronooptic qi prevàzutà cu pori (anuli) princar,e se realizeazà schimbul reciproc material-informa{ionalnucleu-citoplasmà.

La nivelul nucleului m,aterialul ereditar este organiz,atîntr-o substan!à numità cromntind.. Aceasta r,eprezintà formainterfazicà a un,or stnrcturi oaracteristice care la eucariotelesuperioare apar doar îur timpult diviziunii nucleare qi care s-aunumit cromnzqrni. Cromatina prezintà douà stàri funclionalealternative qi reversiibile: euqomntinn qi hetqocromnti,na. Eu-cromatina prezintà proprietàli de oolorare normale cu color,anfii.b,azici qi un ciclu de c'ondensane súandard (condeursare în divi-ziune; deoondensare în inrùerfazà). I;a nivelul r€ucrromartinrei deregulà se aflà secvenle unice d,e ADN. La nivelul eucromatineiADN se replicà timpuriu, la începutul fazei S. Eucromatinareprezintà partea activà genetic (în rtranseriere) a cnomatin'eiinùerfazice, la nivelul, sàu aflîndu-se c,ea mai mare parte dinprotefurele nonhistone cane oondifion'eazi func{ionarea materia-lului ereditar in replicare sau transcriere.

Hetenocromatina prezintà un ciclu atipic de condensare(alociclic) reprezentînd cromatina care esúe condensatà qi îninterfazà, apàrînd sub formà de cnomooentri. La nivelul sàureplicarea ADN este întîrziatà,. Esúe inactivà în transcrier,e qisuferà sulbreplicare. Heúerocromatina constitutivà, localizatà înregiuni specifioe al,e cromozomilor cuprinde ADN, care prezin-tà secvenfe repetate de nu,cleo,tide. Prin heterocromatinizareadiferenfiatà a eucromatinei rezultà heùerocrornatina faculta-tivà.

Heterpcromatina se c€lor€:azà, în tot timpul cicluluÍ celulardin care cauzà se spune cà ea mamifestà heteropimud, pozi-tivà. Între eucromatinà si heterocromatfurà apar diferenlieri qila nivelul structurii fizice. Astfel, pe cînd eucromatina are ea

85

elemente ulrtnastructunale pnedominante fibrel,e nucleohistonicede cirea 100 A dia,rretru, la nivelut heterocromotinei ,se af]àfibre nucleohistonice de 250 A, deoareoe aoesúea apar mai coill-densate, mai oonrtractante, de unde qi r'eacfia lor Fzulgen-pozi-tivà mai in'tensà.

Dacà euctomatina cuprinde genetre majore, heterocromatinaprezintà mai ales funcfii reglatoare oontrolînd activitatea gene-lor din eucrpmatinà qi raùa muta{iei, moditicînd specific acliu-nea unor gene, penetran{a, expresivitatea gi specificitatea 1or.Rolul structural a,l heterocromatinei este legat de stabilizareastructurii centr'omericre qi a capetel'or cromozomului (telomer,e),de împerecherea cr,ornoZomilor în naeiozà, contrplul schimbu-lui reciproc de gene între cr,omozomi omologi (crossing-over).Rolul funclional al heúerocromatinei este legat Si de controlultransportului substaurlelor prin membrana nuclearà ca gi decontnolul diferentierii celul,are. Cel. mai evident rol al hetero-cromatinei este legat de inactivarea (represia) activitàlii ge-nice în mecanismul compensa{iei de dozà.

Se disting trei categorii principale de heterocromatinà:

- heterocromntínd constitutiud, prezemtà tot timpul qi întoti nucleii celulelor unui organism fiind looalizatà în regiunispecifice ale cromoz,omilor iar în nucleul interfazic se poaùeaglomera într-o masà cromaticà evidentà numità crorno-centru;

- heúerocromatind facultutiad, legatà de oompensarea dozei

de gene la oele douà sexe ale mamiferelor prin care unul, dintrecromozomii de sex X este inactivat genetic prin heterocroma-tinizar,e, realizîndu-se un echilitbru între genele sexlincate lacele douà s'exe la mamif,ere;

- heterouomntinn condtensatd, distribuità diferenfiat de latesut la lesut, apàrînd în cursul maturàrii celulare printr-unproces care hlocheazà,o anUrrrità informa ie geneticà în anumiteoelule.

Diferiúele úipuri de heterocroma'tinà constitutivà pot fievidenfi,ate prin metode m,oderne de colorare a cromozomilormetaf,azici in care se produe experimen'tal regiuni d,iferenfiatoolorate sau fluorescenúe care apar sub forma unui model debandare specific fiecàr''ei specii qi identic pentru cr,omozomiiomologi.

Sînt douà aategorii majone de m,odele de bearzi:

- bandnre C eviden{iatà prin eolorare cu Giemsa dupà r:npretratament specific cu alcalii qi acest m,odel de bandar.e evi-

86

denfi,azà heterocromatfura oonsúitutivà aflatà de o parte gi dealta a oentromerului;

- bondure G reprezentind zonele heterocnomatice in'ter-calare dispuse deci de-a lungul bralului crornozornului qi carese evidenliazà în urma unui pretratament cu tripsinà (hidro-Li'zà sau denatunare enzima'ticà) qi apoi colorare cu Gi'emsa(bamdare G propriu-zisà) cu quinacrinà fluorescentà (benzi Q).Deocamdatà nu existà o explicat,ie cuprinzàtoare a naturii chi-mic'e a bandàrii cromozomale.

Compozifi,a chimicà a cnomatinei, respectiv cnomozomiloreucariotici este reprezentatà în special din ADN qi histoneaflate în pr,oporlii apnoximativ egale. Îm plus se mai arflà can-titàti variaúe de proteine nonhistone Ei o micà cantitate deARN, ca gi lipide, polizaharide Ei ion'i metalici precum Ca+*qi Mg*f , ultimele compo,nente putînd fi eventual cont,ami-nanfi oelul,ari.

ADN cromozomal formeazà componenta esenfialà structu-ralà qi funcfionalà a cromozomului eucariot. Date reoente de-mons,treazà echivalenfa o moleculà de ADN - un cnomozomeuoariot, stabilindu-se astfel universaùitatea rel,a{iei atît la vi-rusuri gi procariote cît $i la eucari,oúe.

La eucariote ADN pnezintà trei tipuri distincte de secven!à:secvenle unicre sau nerepetate, secv'enfe mitlociu repetate qisecvenle înalt repet'ate.

Secvent€le mijlociu nepetate sînt secvenfe simple cu lun-gimea de 100-500 perechi de ibaze care sînt nepeúaúe de 102pînà la 104 ori ce se furterpun între secvenle unice, nerepe-tate.

Sewenfele înalt repetate sînt secvenfe simple, repetatede 106 ori. În urma denaturàrii, ADN cu asemenea secvenleprezinta o vitmà mare de reasociere a monocra,tenelor spne aforma structuri bica'tenare (renaturare) ceea ce nu apare încazul ADN eu secvenfe unice sau ADN viral qi procariot. ADNre,petitiv se aflà de regulà în regiu,nile heterocr'omatioe dispusela oapetele cromozomului eucariot (tel,omere) sau în regiuneacentromerului. ADN repetitlv este de regulà inactiv transcrip-fiona,l.

ADN cu secvenfe mijlociu (intermediar) re'petate cuprindeln par,te genele ribozom,ale qi pentru ARNú qi oonstituie sub-súratnl fizie al arnplificàrii (reitndrii) genice.

ADN cu sesvenfe unice, nerepetitiv, cuprinde informafia ge-neticà pentnt slnteza di,feritelor proteine celulare.

8T

Cantitatea de ADN repetitiv variazà de la 20 la 800/o dfu.r

totalul ADN. La unele specii secvenfele înalt repetate sîntreprezentaùe de 6-13 perechi de baze gi în acest caz prinultracentrifugare în gradient de CsCl sau sucrozà asemeneafracfiune de ADN îna,lit repetitiv se separà ca o bandà apartede frac{iunea principalà de ADN, formînd oeea ce se numegteADN satelit.

Genomul eucariot apare ca un genrorr d,e tip intuspers încare secvenfele unice alterneazà, cu secvenle înalt sau mijl'ociurepetate.

ADN mirjlociu nepetitiv codificà informalia pentru sintezaARNr, ARNú, ARN 5S qi histonelor, dar funcfia ADN înaltrepetitiv nu este pe deplin erxplicatà. Se admite cà acesta arreprezenta o încàrcàturà excesivà a genomului, 'un rbalast evo-lutiv, dar mai ales ar interveni în reglarea diferitelor funcliigenetice, în conservarea formei cnomozomilor, ar servi în spa-fierea genelor, ca dealtfel $i în crearea de noi gene.

ADN repetitiv diferà de restul ADN prin conlinutul sàumai mare în G -p C sau mai mare în A + T.

Organismele eucariote superioare, ptrante gi animale conlinîn genomii lor o cantitate de ADN suficientà spre a codificamai mult de 1 000 000 de proteine diferiúe. Dar sînt date co{rr-vergente spr€ concluzia cà mumai o parte din între,gul genomnuclear poa'te codifica proteine.

La Drosofila, pe baza unor ana:lize genetioe qi biochimiceexacte s-a estimat un numàr minim de 5-10 000 de gene struc-turale. La animale toate lesuturile pr,ezintà un set comun degene funclional.e de ,,întnefinere( d,e citeva mii de tipuri dife-rite pe lîngà a,lte cîteva mii sau multe rnii de gene ,active cef un clion eazà, dif erenfiat.

La plante numàrul de gene active este estimat de la 3-4000la drojdie la 13-14 000 Ia pàtrunjel 9i orz, pînà la 27 000 latutun. Asemerrea date au o valoar,e pur orientativà.

2.2 I. ORGAN IZAREA GEN ELO R EU CARIOT E

Dezvoltarea tehnologiei ADN reconxbÍnanú care a permis clo-narea de gene eucariote în oeluil.a 'bac,ùerianà a drrs la aprofuar-darea cunoEtinlelor privind organizarea genel,or euoario'te. Peaceastà cale s-a stabilit cà genele eucanio'te au o structurà mo-zatcatà, în care secvenfele lor oodificato,are respectiv regiunile

8B

care vor fi în final tr,aduse î:r secvente de arninoacizi nu sîntcontinui ci sînú intrerupte de secvente de inserfie sau de in-tercalare netraduse, numite cu un termen general ADN silen-fios. Cel mai bine studiat caz de organizare a unei gene euca-rioùe care se încadreazà, îur aces,t tip este gena pentru ovalhu-minà, o proteinà din albuEul de ou. În acest caz, s€cventa ge-nicà codificatoare a secvenlei de aminoacizi din ovalhuminà estesepanatà de 7 regiuni neaodifica'toane de lungimi vaniabile inter-puse în oadrul secvenlei oodifieaú,oare gi separînd-o pe aceastaîn mai mulùe segmemte. Secvenga codificatoare de baze car,eva fi exprimatà, deci tradusà în secvenfa de aminoacizi estedeei divizatà in regimni care au fost numite de càtre Gilbert(1978) ertroni, sau eÍùni pe cîn'd regiunile interpuse, neoodifi-catoane, transcrise în ARNm dar netraduse în proteinà s-aunumit introni. Asemenea organizare genicà a fost eviden$atàEi la alte geme precum: gene pentru ARNú de Ia drojdie, genepentru histone, gene pentru ARNr de la drosofilà, gena gnobi-nei de iepure Ei Eoareee, genele imunoglobulinei Ei genele mi-tocondriale de la drojdie. Se pare cà asemenea organizare estecvasiubicvitarà Ia' eucariote.

Gena F-globinei de la goarece prezintà douà inserfii, unade 116 Ei alta de 642 perechi de baze. Gena B-globinei de iepurepnezintà 'o ,organiz,ate asemànàúoare cu ac€ea de Ia gena F-Slo-binei de goarece cu excepfia secvenlelor d'e inserfie care pre-zintà'o puternicà divergen!à evolutivà.

În cazul genelor pentru hemoglobinà qi ovalbuminà introniicuprfnd secvenle unice sau de pufine ori r,epetate, genele struc-tunale fiind repr,ezentate ca regulà de secvenle unice, n,erepe-tate de ADN.

În cazuL geurelor hemogl'obinei s-a demonstrat 'transcriereaintnom.ilor în ARNnz precursor (pre-ARNm) sau ARN hetero-gen (hnAP.N) care va fi supus pnelucràrilor posttranscriplionalespre a d,a naEùere ARNrzl mntur cel care va fi:ncfiona ca mesa-ger în sinteza proteinei.

În cadrul ARNrn matur qi fun,cfional în traducere nu maiapar secvenfele intronice, ceea oe îmseamnà cà ele sînt excizateùr oadrul prelucràrii pre-ARNnz. Preluerarea posttranscripfi'o-nalà a We-AP"Nne se re'alizeazà surb acfiunea unor enzime spe-cifi,o€, de tipul RN-azei P. ,care taie, excizeaza intronii qi apoi,atrùe enzirne, 'posúbil de tipul ligazei ARN numite de alùoire, li-pesc extronii spre a genera ARNnz mahr (Herdeld gi Kiper,1.979). În cadruL prelucràrilor posttranscripfionale al,e pre-ARNrn intrà Ei poliadeniL,anea sa la capàtul 3' gi mod'ificarea

B9

(ì€ronr L

AONjntroni

Genot2

ovolbum in ei3/.5

c0E5.-- 3,

IFFe ARNm.

3'g6o,enp rièrl

?m Gppp

Wlwtt-

rzz? r8zUAA

Tc|minorcgtîo(hrctr

tíg. 33. OtgqnlTassa genel ovalbuminei.

chimicà posttrarnscripfio,nalà a nucleotidelor prin metilare suibactiunea unor enzime specifice metilaze. Aoeastà metilare sead'mite cà are ,loc la nivelul exonitor care astfel dervin rezis'tentila acfi,unea enzimelor exonucleazioe. Eorzimele de clivare ,actio-neazà asupra secvenfelor intronice cu,re nu au suferit metil.areaqi asffe1 au ràmas sensibile Ia enzimele de clivare. Se nerali-z,eazà, apoi trnirea segme'ntelor exo{rice sub actiunea unor enzimespecifice de 'legare sau altoire (splicing). Modelul acesta (Fig.33) admite cà regiunile codificatoare din pne-ARN care vor de*rleni adiacente în cadr,ul ARNnz vor fi aduse în nemijlocitàcronti,guitate prin ibuclarea secvenf elor intronice. Regiunile exo -nice eontigui vor fi u,nite ,covalent, printr-o reacfie de ligare

90

oosttron*notio- -VrXthatri o Pra.lnlm Y/7Dnt)oúodcritoreo to Y! ;.31 nEtilorco aoniloq t(t'bl.tlotco.crcizb intronibtC sudoreo exonilor) ciftelchdrcó trrnimeo eronilor 11-7;+i o irrroóto? (A 6) h nunibalc n$Fotide

l,ntracateararà. Bruclarea reglunilor intronioe, excizia lor qi liga-r'ea ul.terioarà a regiunilor extronice apar oa rezultat al inter-acfiunilor compl,exe acid nucleic -

proteine.Fl,eoent, Lerner gi colab. (1980) au implicat în excizia intro-

nilor Ei unirea exonilor din pnecursonrl ARNm (pne-anNm) ooa'tegorie de molecule mici, discrete, stajbile de ARN mic nu-cl"eor (snRNA) a càror lungime variazà între 90 qi 220 nucleo-tide. Acest ARN nuclear mic este asociat cu proteine formîndpartibule mucleare mici ribonucleopnoùeinlioe (snRNP). Pe bcizaobservafiil'or cà secvenfa de nucleotide de Ia capatul 5' al uneiss€ilreo€e categorii de sn RNA prezintà complementaritate cujoncliunile introni-exoni de la diferite tipuri de ARNnz pentruinsulinà de qo,bolan (5' Exon CAGGUAUGU + IntronCUACUUCCAGG Exon 3') catena ò2 a imunoglobulinei, catenaB de gl,obinà de Soarec€, ovalbumina de gàinà gi firbroina firuluid,e màùase de la Bmnbyr, aoeqti oeroetàbor,i ,au impl,icat snRNAîn excizia intnonilor qi unirea exonilor spre a forma ARNnrmntu,r, În ultimut timp se conferà intronilor anumite rolurifuncfionalre în prelucràrile pne-ARNnz. S-a stabilit cà gena mi-úooonflrialà pentru citocrpmul b de Ia drojdie are Ei ea o struc-turà rnozaicatà cu exoni qi introni. Mutafia poate afecta a'tîtregitrnea exonicà cît Ei cea intronicà, ,evidenfiindu-se peste 200muta'nte care au afectatà gena ci,tocromului b. Mutafia atît lanivelul intronilor cît Si la nivelul exonilor duce la alterareastructurii gi fun$iei citocromului b. Dacà nntr-o experien{à decompl'ementa$ie geneticà participà la încruci,$are o tulpinà Acu mutalia la nivelul exonului qi o tulpinà B cu ,rnutafia lanivelul intr,onului (ambele tulpini incapabile de a simtetiza ci-tocnom b qi de a fermenta gluooza) la nivelul zigotului apareoomplementalia Ei se realizeazà, sinteza citocromului b func-{ional.

Slonimski a demonstrat cà exonii n,ormali furnizali de ce-lula de tip B cu mutalie intronicà servesc la si,nteza citrocro-mului b în zigot iar intronii normali furniza{i de c,elula tip A,cu mutalie exonicà, furnizmzà informafia geneticà neoesarà ali-pirii exonilor în ARNrn matur. S-a stabilit astfel, fàrà echivocfuncfia intronilor în lipirea exonilor.

Echipa lui Slonimski considerà cà intronii servesc ca un,,model de asamblare( spre a permirte enzimei (enzimelor) declivare qi unire sà realizeze excizia intromilor Ei legarea exoni-1or. O porfiune din intr,on oferà o secvenfà-ghid care formeazàcu alte elemente oomptrementare din pre-ARNrn o structuràtranzitorie capabilà de a menfine adiacente extremitàfile exo-

91

urilor alàturafi. Ori, mutafia la nivelul intnonilor îm,piedicà for-marea de asemenea structuri rtranzittorii. Este positbiil oa smvenfaghid sà fie oferità de acele molecule mici de sn, RNA desprecare s-a vorbirt mai înafurte. Existà Ei ipoteza cà intronii codi-ficà ,,proteimele mesagere(, diferite de cele codificate de exoni.Aceste proteine au fost tbotezaúe ,,ARN-motltrazeK. Se admitecà primul intron furmizeaz.à o proteinà de alipire, ARN-matu-taza, pe cînd ceilalli furnizeazà ,,secven{ele-ghid66 ale ARN.Proteinele mesagere sau proteinele-m ar avea o secvenfà deamino'acizi care la un capàt numit globul eronic este hidnofilà,iar la celàlalt capàú, coresprmzînd la intron, este hidroftrbà,prinzîndu-se de anvelopa nuclearà, Iàsînd capàtul hidrofil (g1o-bu1 exonic) liber.

În procesul de traducere a mesajului, rihozomul se ,asocia,zàcu exonul nr. 1 din ARNrn qi îmcepe sà se formeze o catemà po-lipeptidicà identicà la un, capàt cu globul'ul exonic al protei-nei-rn. Aceasta porfiune a proteinei-nz ar servi în inúliereaea,tenelor identice polipeptidice sintetizate pe ribozom prin tra-ducerea aceleiaqi molecule de ARNnz.

Se mai admite cà anvelopa nucleara confime enzimele ne-cesare prelucràrii pre-ARNrn, ma,i ales cele necesare excizieiintronilor Ei alipirii exonil,or în ARNnn martur care va fi trecutîn ciùoplasma. Aceste ipoteze nu se exclud gi mai degrabà secompleteazà. Este de relilrut cà aceastà structurà mozaicatà agenelor eucariote este specificà lor qi este legatà de separareacelor douà proc€se esenfiale ale decodificàrii informaliei €re-ditare, transcrierea Ei traducerea în spalii diferite, primul înnucleul, al doilea 1n ci'toplasmà. Trec,erea mesagerului prinmernbrana nuclearà este obligaúorie qi aceastà trecere se dove-deEte a fi un proces foarte complex.

R,eoent s-a constatat cà gena insulinei umane conline douàsecvenf,e de interealare, una în cadrul regiunii transcrise În-tr-un segment netradus 5' al ARNzn qi alta care întrerupe re-giunea codi'ficatoare C-peptidicà (Bell Ei colab. 1980). Compa-rarea genelor insulinei urnane Si de $oarece araúà existenla deregiuni potenfial reglatoare în cadrul segmentului de ADN ceprecede gena sugerîrrd cà forma ancestralà a genei insulinei aavut douà secven{e de intercalare. Dealtfel, la mamifere s-audescris douà tipuri de organizare a genei pentru insulinà: g,enapentru insulinà la om qi qobolan II prezintà douà secvenle in-terpuse pe cînd gena de qobolaqr I are o singurà secven!à in-terpusà. Semnifica{ia acestei organízàn a genelor eucariote estedeosebità. Se admite cà prezen$a secvenfelor interpuse (introni)

92

a putut accelera evolutia càci a perrnrs construlrea de noi pro-teine din segmente ale genelor deja existente (Eaton, 1980).Potrivit acesùei ipoùeze, secautlele codificatoare (eroni) co-r,espumd pàrlilor func{ionale ale proúeinei.

Trebuie precizat cà la procariote ADN necodificatnr (silen-fio's) nu apare în interiorul genei ca la eucariote, ci între gene.

ADN al cromozomilor eucariotici este replicat semiconser-vativ qi bidirecliona\ fiecare cromozom avînd numeroase uni-tàfi de replicane (cca 2-10 X 104 pe eelulà), care sînt aranjate întandem eare funclioneazà asincrpn gi a càror lungime vaúaràîntre 20 Ei 70 pm. Replicarea ADN cromozomal se desfàEoaràmult mai îarcet decît a ADN bacterian avînd o vitezà de 0,5-2,0 pm/minut, fa!à de 30 pm/minut cît este la bacterii.

FteplÍcarea ADN eucariotic neeesità sintezà proteinicà si-multanà.

ADN ce se replicà timpuriu este relativ boga,t în G + C pecînd cel care se replicà tîrziu, de ,obicei fiind localiza,t în hetero-cromatina constitutivà centromericà, este bogat în A +î.Membrana nuclearà joacà un rol important în inifierea Ei des-fàgurarea replicàrii.

Asociat cu ADN cromozomal qi interacfionînd cu grupelefosfat ale acestuia prin forfe ionice qi electrosta'tice se aflà pro-teinele cromozomale histonice care au caracter bazic prin caresînt neutra,lizate grupele acide fosfat.

La eucariote existà o cerin!à strictà ca ADN nou sinteti-za,t sà se asocieze cu histonele astfel încît sà formeze complexeurucleohistonice. Acest fapt este demonstrat de intima asocierea sintezei ADN qi a histonelor în aceeaEi fazà S a cicluiui ce-lular.

Histonele nou sintetizate se ooncentreazà în vederea aso-cierii cu ADN nou sintetizat în imediata veciinàtate a bifurca-liei de replicare

Histonele joacà pe de o parte rol structural în menlinereaEi controlul conformafiei cromozomului eucariot în ciclul ce-lular, în spiralizarea qi condensaxea cromatinei, iar pe de a,ltaîn reglanea,genicà grosierà care duce Ia diferenlierea de modelede represie genicà cu specificitate de,lesut în timpul dezvoltà-rii.

Histonele aclioneazà astfel ca r€pr€s,orii generalizafi ai acti-vità{ii ge'nice càci, condilionînd condensarea cromatinei Ei su-perspiralizarea ADN, determinà inhibifia stericà a transcrieriiîn aceastà stare cond,ensatà ADN neputînd funcfiona ca maúri!à

93

I

în transcriere, numai cr,omatina difuzé prezentînd ,o intensàactivitate de matrifa.

Au fost descrise 5 tipuri de histonà simbolizate Hr Hza,Hzb, H3 Ei Htt. Dupà oompozifia în aminoacizi se deosebeschistone rbogate în argininà (HB fi H4), hisùone bogate în lizinà(Hr gi Hzb) gi histone cu confinut aproxima'tiv egal de argininàEi lizinà (Hza). În structura cromatinel aceste fracliuni histo-nice, cu exceptia H1 intrà în cantitàli echimolar,e. Studiile desecvenliere fl aoestor fracliuni histonice au evidenfiat lipsaunei specificitàti de lesut a I'or dar mai ales înaltul conserva-tism aI secvenlei lor cu exceplia francfiunii HL car€ prezintào mai mare variabilitate.

S-a realír*r't o im,agfure simplistà în ceea ce priveEte conser-vatismul sewenfei hisúonelor miezului nucleozomic H*, Hzb,Hs gi H4. Astàzi s-a neurunfat la ideea cà aceste francfiuni histo-nice sînt înalt conservate (Isen'berg, 1979). În cadrul fiecareiadintre cele ciurci clase de histone Ht, Hza, Hzb, Hs 9i Ha secven-fa de aminoacizi poate prezenta anumite varia{ii. Exlstà decisubtipuri ale aoestor clase hist'onice, fie în embriogenezà, fieîn timpul maturàrii unor oelule specializ,ate. Variabilitatea his-tonei H1 se datoreqte modificàrilor pos,ttraducàùoane. Variabili-ta'tea celorl'alte clase de histone se baz,eazà. pe divergente evo-lutive semnificative. În cadrul unei clase particulare de histonàexistà suibtipuri care au struc'turi primare diferite.

Histona Hzb reprezintà un hibrid ,evolutiv càci la ,aoeasta

cca prima treime a moleculei este varialbilà, restul fiind foarteputernic conservatà. Hisùona Hs de la vitel Ei plante prezintàdivergenle de secven!à fa!à de H3 de la Tetrahymenn gi droj-die. Ha de la vifel diverge fa{à de Ha de L'a Tetrah'gmena. Aoes-te divergenle sînt insà mul't mai mici oomparativ cu cele alealtor proteine, astf,el cà histonele H3 Qi Ht, trebuie încà sà fieoonsiderate ca proteine înalt conservate. Histonele H3 qi Ha aupantea,bazicà amino qi partea globularà carboxil. Pr,esiunea se-lectivà a conservat regiunea globularà, în parte din necesitateainúeracliunii hisúomà-histonà, aceste imteracfiuni avînd I'oc întreregiuni globulare. Nu se cunoaqt'e de ce ,8u fost conservateqi pàrfile bazice. Este posibit ca aceste pàr{i baziee sà fi fostoonservate în vederea staloilirii interacliunii cu ADN car€ aPBr€ca substan!à acidà.

La Sacchnrom,gces ce/rwisiae se aflà patru clase de histonedar nu se gtie dacà este qi histona H1. Mai mult, histonele H2oH2b qi H3 de la aceastà drojdie se deoseb,esc de clasele cor,es-pondente de histone de la plante Ei animale. H3 de drojdie de

94

exemplu preziartà o mai mare mobilitate pe geluri de acid-uree Ei nu posedà nici cisteinà gi nici metioninà.

Micronucleii de Tetrahgmena au numai clasele histoniceHya, H2b gi Ha, fiind lipsite aparent de histonele H3 gi Hr.

În cromatina ciupercilor se aflà histone care se deose,bescfa!à de cele de la alte euoariote, eritrociúele nucleate de pàsàriconfin o singurà fracfiune histonicà desemnatà F2C i'ar în sper-matnznizi

- celule foarte specializate care nu sintetizeazà. ARNsau proteine

- locul histonelor este luat de protamine (pro-teine foarte ,bogate în arginiarà). Rolul histonelor în represiagenicà generalà este demonstrat chiar Ei prin acest caz al eri-trocitelor nucleate de pàsàri, al càror nucleu este nefunclional,ADN-uI sàu fiind represat prin interacliunea cu histona FzCsau H5. Mamiferele au ales o altà alternativà evolutivà a aces-tei represii - enuclearea eritrocitului matur.

Histonele sint supuse unor modificàri posttraductoare (post-sirr,tezà) qi anume metilare, acetilare qi fosforilare. Prin acetila-rea resturilor aminoacilice din histonà este reglatà interac{iu-nea histonelor cu ADN, permifînd funclionarea acestuia ca ma-úrità în transcriere. Alte modificàri sfurt implicate în realizareacomplexelor nucleohisùonice dintre ADN nou sintetizat, gi histo-nrele nou sintetizate sau în modificarea spiralizàrii cromozo-male, ea qi în alte feuromene (schimbàri în activitatea cromozo-malà în tfunpul ciclului celular sau diferenfierii, menlinereaconforrnafiei corecte a histonelor fata de ADN). FosforilareaH1 în special a fost implicatà în condensarea cromozomilor,Schinrbàrile în organizarea structuralà a cromatinei sînt nece-sare peu:tru progresarea eiclului cromozomal (eondensare-de-condensare) Ei se crede cà sînt reglate î:r special prin modifi-carea proteinelor cromozomaJ.e precum fosforilarea, acetilarea,metilarea Ei poli (ADP-rihozil)-area. Fosforilarea histonei H1este se pare cel mai important factor care regleazà condensareacromozomalà (Matsumoto qi colab., 1980). Forma fosforilatà aH1 este deci implicatà în inifierea condensàriii cro'mozomale.Activitatea H1 fosforilate este strîns corelatà cu activitatea mi-toticà ,a celulelor iar fosfokinazo histonei H1 este imptícatà înini{ierea mitozei.

Rolul specific al'variatelortipuri de histone în structura qifunclia crornatinei este încà neprecis stabilit. O modificare aHxo sub forma de A2a apane a fi preferenlial localizatà în re-giuni inactive ale gmomului. S-a mai descris Ei metil'area Eirirbozilarea histonelor, fàrà a se cunoaEte semnificalia acestormodificàri.

95

Genele pentru diferitele fracfiuni histonice sînt prezente înmai mulrte cupii per genom gi rele pot fi dispuse fur úandem peacelaqi segment ADN. Repetivitatea genelor pentru histone este:erutà de necesitatea unei sinteze bogate de histone într-uninterval scurt de timp ce corespunde fazei S cînd ane loc gisinteza ADN. Histonele sînt sintetizate în citoplasmà qi apoitraarsferate în nucleu. Cînd este blocatà sinteza proteinicà d,arnu qi a ADN, histonele parentale se leagà numai la wrul dintreduplexurile fiice. Sinúeza histonelor este intim asociata cu sin-teza ADN. Cînd sinteza ADN este ,blocatà, sinteza histonelorsoade rapid, deoar,eoe poliribozomii mici asoeiafi cu ARNn pen-tru histone, satre este de tip 7 S-g S, sî:rt preferenlial dezorga-nizagi. Numai histona H5 din eritrocitele de pàsàri nu se sin-tetizeazà coordona,t cu sinteza ADN. Ea este sintetizatà înti,mpul maturarii eritrocitelor, proba'bil spre a bloca majorita-tea genelor nucl,eare, làsînd funcfionale doar cîteva, in spetàgenele hemoglobiurei aviar.e. Cea mai importantà canacteristicàa genelor pentru histone este gruparea lor sùfnsà, lincajul strînsdintre genele ce dirijeazà sinteza tipurilor de histonà (Kedes,1979). Cele mai intens studiate sînt genele histonice de la dro-sofilà, dar mai ales de la ariciul de mare. Ele au fost clonateîn celula bacterianà prin tehmica ADN recombinant. Genelepenrru histone s-au d,ovedit cà, pe lîngà lincajul l,or în tandemîn ordinea H4, Hs, H2a, Hzb, Hr, ele sînt repetitive, printre sin-gurele gene codificat,osr,e de proteine care sînt repetitive. Re-giunile codificatoare ale gemelor histonice sînt interdigitate cusecvenle spa,tiartoa,ne necodificat'o,arne. Prin hlbridare ARNnz his-tone (9 S) cu ADN de arici de mare, s-à aràtat cà genele pen-tru histone sînt reiter,ate de cîteva su'te de ,ori în genomul dearici de mare. S,ecvenfe).e codificatoare sînt bogate în per,echiGC, pe cînd secvenlele spafia'toare sînt bogate în perechi AT.Secvenlele codificatoar,e pentru hisùone r,eprezintà 0,20/o dinADN úotal d,e arici de mare, pe cînd secvenfele spafiatoare re-prezintà 0,50/o din gen,omul haploid.

La numeroase specii de arici de m'are s-a reugit alcàtuir.eahàrfilor unitàlilor de repetilie a genelor pentru histone. S-ademonstrat pàstrarea topologiei (loca1izàrii gi iungimii) regiu-nilor spafiaùoare. La Drosophi,la melanogw,ster, genele pentruhistoure se carteazà în regiunea 39 D-E din braful stîng alcromozomului 2. ARNnr. pentru histon,e de arici de mare, mar-cat radioactiv, hirbrideazà în aceeaqi regiune. La oh, genelepentru histon,e au fost cartate pe cromozomul 7, banda nega-tivà G1 q 34.

96

Genele pentru hlstone de la drojdie au o organizare cel'adif,erirtà de aceea a genelor hisrtonelor de arici de m'are gi dro-sofi1à.

În afara histonelor, în structura cromaúinei mai intrà gi pro.,teinele nonhistone numite tncà hqtone, inoorect numite pro-teine acide deoarece punctul izoelectric al lor variazà din zonaacidà pînà în zoma bazicà. Ele reprezintà enzime ale metabo-lismului cromozomal cum ar fi ADN polimeraza, AII,N polime-ro,za, NAD - sintetnza, nucleosidtrifosfateza, apoi diverse alteproteine cu caracter acid precum molecule proteinice implicateîn activita0ea genieà, activatori qi represori ca gi alte proteinecromozomale. Proteinele nonhistoniee sînt sintetizate în cito-plasmà Ei apoi transferate în mucleu. Ele sînt foarte variabile,heterogene, atît ca structurà cît gi ca funcfiune, preze,ntînd ovrfiezà mult mai mare de sintezà $i de degradare (turnovt) com-parativ cu histonele. Greutatea lor molecul,arà variazà între10.003 qi peste 150.000 de daltoni pe cînd a histonelor este cir-cumscrisà în limitele a 10.000-20.000 dalto,ni.

Proteinele nonhistonic,e se caracùerizeazà, prin specificita,tede lesut gi specificitate de speci'e. Aceste proteine sînt impli-cate în reglajul fin aI activitàlii genice, din intenacfiunea lorcu histonele rezultà derepresia unei gene date qi transcriereape s,egmentul corespunzàtor din ADN. Ele pot ileteracliona nunumai cu histonele dar gi cu ADN Ei ARN. Zonele din genomactive în transcriere sînt mul't mai ,bogate în pnoteine nonhis-tone clecît cele inactive în tramscriere. Aoel,agi lucru este valabilpentru celule Ei lesuturile tn care au loc sinteze active gi careprezintà o cantitate mai mare de proúeine nonhis'tonice.

În reglarea transcrierii gemice un ro1 important ît foacà fos-forilarea pnoteinelor nonhistonice. Prin aceastà modificare aproteirnelor nonhistonice histonele pot fi scoase din complexelenucleohistonice ale unui segment dat din genom, làsînd posi-bilitatea ca gena saru genele din acea regitr,ne sà fie transcriseEi deci sà func{ioneze.

Definàtori ai informa{iei ereditare, cromozomii sînt în nu-màr, màrime Ei f,ormà caracteristici fiecàrei specii. Totalitatsacromozomilor unei celule formeazà oomplementul sàu crpmozo-mal numit încà genaffu Numàrul de cromozomi al oricàrei celulesomatice la indivizii ce se reproduc pe cale sexuatà este dublu(dipl,oid) fa!à de complementul crom,ozomal' al eelulelor repro-ducàtoare (gamefi).

La microscopul optic crom'ozomii apar ca structuri sfericesau baghetiforme, cu dimensiune variabilà între 1 qi 30 pm.

97/ - Descifrînd tainele ereditàfii, vol. I

La organismele c€ se r.'eproduc pe cale sexuatà în cornplernen-tul cr.omoznmal cromozomii se a'flà sub formà de pereche, fiinddoi cîte doi omologi, la mivelul fiecàrei perechi un cromozomfiind de origiare paternà (adus de spermatozoid în timpul fe-cundàrii, la formarea zigotului) iar aiúul fiind de origine ma-ternà (adus de ovul la nivelul zigotului). Din unirea garnituri-lor haploide ale garnefil.or î:r procesul fecundàrii se reface înzrgot o garniturà diploidà oare prin diviziunile mitotice *succ€-sive ale acestuia va fi transmisà fiecàrei celule a organismu-lui ce rezultà.

Cromozomii omologi au aceea.gi structurà qi funclie (poartàacel'eagi g€{ne, aceea;i informafie 'ereditarà). Omul are de exem-plu în gernitura diploidà a tuturor celulelor somatice cîte 46de cromozomi, dintre care 23 de provenien!à maternà qi 23 deprovenienfà paternà. Aranjamentul cromozomilor, prin dispu-nerea lor ordonatà în per,echi de cromozomi, considerînd numà-rul, forma, màrimea qi orice altà caracteristicà specificà com-plementuL cromozomal al u,nei specii sau linii celulare duce laob{inerea cariotipului acelei specii sau linii celulare.

Cariotipul uman a fost stabilit în anul 1956 de càtre Tjioqi Levan, a fost standandizat prin conferinlele de la Denver,Londna qi Chicago gi definitivat ulterior, pe baza studiului rn'o-delelor de ,bandare (colorare diferenfiatà a cromozomilor) laConf,erinta de la Paris din anul t971.

Metodele de 'bandare au permis nu numai identificareaexactà a omologilor din cadrul fiecàrei perechi de cromozomi,care se poate face cu o anumità dozà, de relativitate datoritàsubiectivismului cercetatorului qi prin metodele clasice dar, pebaza oomparàrii modelului de benzi al omologului matern qi alomologului de origine paternà, s-€u putut stabili rnodificàrileexacte, structurale, ale cromozomilor, modificàri' care au statla ,baza evoluliei cariotipului ce a însofit evolulia speciei saustau la ba,za diferitelor maladii numeric Ei mai ales structural-cromozomale. În cadrul fi'ecàrei perechi de cromozorni, modelulde benzi trebuie sà fie identic la cei doi omologi în condiliinormale.

Cari.otipul uman este a1càtuit din 22 perechi de autuzomi(cromozomi identici la ambele sexe) gi o pereche de cromozomide ser sau heterozonti, identici sau omologi la fem,eie (XX) qiureidentici, neomologi, nepurtînd aceleagi gene 1a ibàrbat (XY).

Cromozomii dirr per,echile 13, L4, 75,21 Ei 22 sînt crom'ozomiorganizatori nucleolo,ri (NO) din care cauzÀ, sînt afirmafii dupàcare la origiu:e, specia umanà ar fi un pemtaploid. Maimulele

98

drrtnopoide au un cariotip asernànàùor oarecum oelui uman. Cim-panzeul, cel mai apropiat de om are 48 de crpmozomi Ei seadmite cà dintr-o specie oomunà au putuú deri;va specia umanàqi primatele prin remanieri numerie qi structural cromozomalede tip fu,ziune-fisiune csntricd sau qrrcuploidii.

Prezenla unui crornozom suplimentar în perechea 21 condi-lioneazà un sindrom foarte grav a:1, tri.somiei 2t sav rrlùngolis-ntul.

Aproape toate anomaliile numerice care af'ecteazà cromc-zomii sînt corelate cu aparilia de grave sindroame cu defectefizice gi psihice.$i aber,a{iile structural eromozomale sînt extremde grave. Delelia parlialà a bra{ului seurt al cromozomului dinperechea a 5-a condilioneazà, sindromul cri-Cu-chat (tipàtulpisieii) cu înapoiere mintalà a copilului Ei moarte prematurà.În leucemie este de asemenea implicatà o translocalie întrecromozomii I Ei 22. Studiul cari,otipului este deci de interesmajor atît la plante cît Ei la animale incluzînd omul. La porumbexistà o garniturà dipl,oidà de 20 cromozomi care alcàtuiesc 10pereehi. Deci îri fiecare celuià se aflà douà seturi identice decrornozomi. Crcinozomii de la nivelul unui set sînt însà ne-omologi, sînt diferili ca m,orfologie qi dim,ensiune, puntînd Eigene diferite. La'organismele diploide informalia ereditarà apa-re astftì tedundantd.

Crganizarea multicr,omozomalà a genomuluir eucariot estererutà gi de particularitàlile realizàrii reeomhinàrii genetice laeucariote cu implicafii în oonferirea unei mai mari flexibi,litàtievolutive.

Cromozomul eucariot prezintà douà unitàfi structural,e lon-gitudinale care au fost numite cnomntide, libere pe toatà lungi-mea crornozomului cu excepfia unei. regiuní care s-& numitcons'tric,tie primnrd I,a nivelul càreia este loc,alizat centro,m'qul,o zonà. specializatà a cromozormului pentm atagarea sa la fi-brele fusului de diviziune. Reginrnea centromericà constà dinnurneroas'e fibne cromatice, aqezate laturà pe laturà, ce pottreoe de la un bra! la ,altul croma'tidei (fibre intercromatidice).

Morfol'ogia cromozomului eucariot este determfuratà de pla-sar,ea constricliei primare de-a lungul acestuia. Astfel, cromo-zomul este m.etacent-ric, pnezentind douà brafe egale cî,nd oen-tnomerul este localizat în pozifie medianà. Cînd centromeruleste plasat în afara regiunii mediane apar douà 'brafe cromo-zom,ale in,egale Ei cromozomul se numeqte suAmatrcentric. Cîndcentromerul se aflà deplasat spre un crapàt al cnomozomuluiapar douà ,brate inegale dintre care unul foarte lung gi altul

99

foarte scurt, izodiarnetric gi cromozomuL se numeqte subtelo-centric. În sfîrgit, aùunci ,cînd centromerul se af1à pe capàtulcrom,ozomului, deci terminal, existà un singulbra! cromozorqlalEi cromozomul se numeEte telocentric.

La nivelul cromatidei au fosi descrise filamente spirale,reciproc încolàcite care s-au numit cronl,o'trem,e qi care prezirrtàdin I'oc în 1'oc îngrogàri care s-au numit cromomere. Cromo-mer,ele conf'erà cromonemei un aspect moniiiforrn foarte evi-dent în tirnpul profazei din mitozà, dar mai ales din meiozà,ar,anjamentul qi numàrul cromomerelor fiind o caracteristicàde specie.

Structura bicromatidicà a cromozomului eucariot metafaziceste caracteristicà perioadei cuprinse între aparilia cromozomi-lor la debutul, diviziunii nucleare gi sfîrEitul metafazei.

La nivelul fiecàrei cromatide-surori din cromozomuL m,et,a-f.azic se aflà cîte un du'blu-helix ADN. Monomemia sau unine-min cromozomului eucari'ot a fost dovedità pentru prima datàautoradiogra,fic în 1957 de càtre Taylor gi colaib. (1957) Ei apoiprin cercetàri rbiochimice pe ADN din cromozomii de drosofilàde càtre Kavenoff qi colrab. (1973). AceeaEi uninemie apare încromozomul anafazic echivalent de fapt cu o cromatidà a cro-mozomului metaf.azíc. Ipo'teza unin'erniei cromozomu'lui eucarioteste susflnutà de dovezi ,biochimice, ultrastructurale si genetice.Recent, Okada Ei Comings (1979) au evidenliat la nivelul cro-mozomilor metaf azícl de hamster chinezesc tratali cu acetat dearnoniu 4M qL întinqi pe s,uprafa{a apei distilate, existenfa uneiorganizàri de un ordin mai în,alt a ADN, care în urma unuiasenrenea tratameurt este eliberat sub forma unor serii regulatede rozete conectate de porliuni liniane de ADN numite inter-rozete. Lungimea medie a regiunii în care moiecula ADN ca-pàtà oonfiguralia de r,ozetà este de 14 pm care este apropi,atà delungimea medie de 10 Fm a ADN cromomeric din cromozomiipolitenici de drosofilà. Segmentul interrozetà are o iungimemedie de 4,2 pm. Proteinele matrixului nuclear nehistonice careinclud qi cantitàli semnifica'tive de octind qi tubulind sînt iem-plicate în formarea rozetelor.

C'ea mai lungà piesà de ADN descrisà în nucieii eelulelorumane are 22.0A0 1rm. Tayl'or Ei Hozier (1976) au stabiiit càunitatea de replicare la celulel'e ovariene de hamster chine-zesc este de 4 [m lungime, ceea ce implicà cca 550.000 situri deiniliere în nucleul diploid (2.200 000 um : 4 Fm). Complemen-tul uman diploid con{ine 6,9 X 10-12 gm de ADN. Împàrlindaceastà valoare cu 3,L4X10rs gm/prm de dubiu heiix ADN se

100

calculeazà 2,2 metri (2.2A0.000 pm) de ADN per nucieu ciipì,oiduman (Bahr, 7977).

Caracteristic pentru eucariotele evoluate este existenla unuiciclu cromozomal numit ciclul condensdrii Ei decondewórii qo-rnozorrnllui. Cromonemele sau cr,omonemata - cel.e douà fibri-le longitudinale ale cromozomului euoariot -

prezintà proprie-tatea de a se spiraliza mai mutrt sau mai pulin (spiralizare ero-mozomalà) ceea ce determinà varialii în forma cromozomilorîn timputr ciclului celular. Spiralizar,ea cromonemelor este în-solità de condensar.ea cromozomului, procesul a,tingîncl maxi-mum în metafazà cînd cromozomul prezintà cea mai constantàmorfologie. În timpul diviziunii cromozomul apare sub forrna satransportoare, formà cerutà de o repartizare echilibratà a in-forma{iei ereditare în celulele fiice. Dupà realizarea acesteirepartizàri care are loc în anafazà gi desàvîrEità în telof,azàcromozomul trece de la forma transprortoare la forma sa func-fionalà în cadrul nucleului interfazic. În forma funclionalà cro-mozomul atinge gradul maxim de spiralizare a cromonemei,or,însoliúà de decondensarea qi desigur pierderea individualitàliicromozomului. Materialul cromozomilor se va organiza sub în-fàtiqarea cromatinei interf azice. Se pare cà cloar cromonemeleîqi pàstreazà continuitatea atît la nivelul cromozomilor cît qila nivelul, nucleului interfazic. Se cunosc puline iucruri desprecauzele qi, mecanismele spiralizàrii qi despiralizàrii cromozo-mului eucari'ot. Cercetàritre din ultimul timp pun pe seama fos-forilàrii proùein,elor cromozomale histonice, în spe!à à Hr eon-densarea cromatinei la debutulr diviziunii.

Nucleul inùerfazic este metalbolic activ, la nivelul sàu avînclloc intense sinteze ale componentelor majore ale celulei gi înprimul rînd sinteza ADN gi a proteinelor cromozomale histo-nice. Durblarea eantitàlii de ADN esùe o condilie necesarà des-fàquràrii mitozei Ei impune diviziunea. Cînd replicarea cromo-zomilor nu este urmatà de diviziunea nucleului qi ulteri,or a ci-toplasmei iau naEtere diplocrorrtozomi, cromozo'mii fii nese-parîndu-se în ciouà celule fiice, rezultînd o eelulà care esteendoploidà avînd o cantitate dublà, sau corespunzînd la unmultiplu aI cantitàlii dipl'oide de cromozomi, depinzînd de nu-màrul de cicluri de replicare desfàqurate fàrà interpunerea mi-tozei. Un caz interesant este oferit de celulele glandelor saÌi-var,e de diptere în care endociclurile duc 1a formarea cromo-zomilor politeni. Prin politenie se înfelege desfàEurarea de run-de multiple de replicare a cromozomilor, fàrà ca cromatidele

101

fiice sà se separe în nuclei fii dif,erili. Ràrnînînd asociate elereaiizeazà o -structurà cr,omoz,omalà politenicà în care alúernea-zà ,henzi clare qi benzi întunecarte dispuse transversal, perpen-dicul;ar pe iungimea bralului cromozomal. Cromozomii politenireprezintà astfel forma interfazicà a cromozomiLor obiqnuifi lanivelui càr,ora s-au desfàEurat multiple runde cle replicare. Di-rnensiunea unor as,emenea cromozomi ,este de peste 200 ori maimare ca a cromozomilor obiqnuili din care derivà. Deoareae areIoc un pioces de împerechere somaticà 'a cr,ofiìozomilor omologiîn timpul politenizirií lor, numàrul cromozomilor politeni apa-rent reprezintà iumàtate din acela ai cromozomilor obignuili.

Din asocierea intimà (împerecherea) la acelaEi nivel a cno-momei'elor iclentice ale celor doi omologi rezultà un model debandare specific fiecàrei specii, pe baza càruia se poate alcàtuio cariare citolog'icà a gen'el,or, admi!înd cà fiecàrei benzi îi co-respunde o genà. În anumite regitini benziie (cromomerele)prezintà o dispunere laxà, deslînatà a fibrilelor, rezultînd struc-turi caracteristice care s-au numit puf e, iar cele car€ au o ex-tindere mai mare au fost nurnite inele Balbiani. La nivelulaces0or structuri a fost evidenliatà prin experienfe autoradio-grafice cu 3H-uridinà, desfàqurarea unei intense transcrieri ge*netice. În cursul dezvoltàrii ontogenetice pufele apar într-oanumità ,ordin,e, indiciu cà ar'e loc o activare diferenliatà, eqa-lonatà a geneior, în funclie de necesitàtile de moment alecelulei.

Cromozomii poiiteni au fost descriEi gi la angiosperme, pro-tozoare, în unele celule transformate maiign. La plante cromo-zomii. politeni nu sînt împerecheafi, prezentînd o structurà gra-nularà, fàrà a prezenta benzi distincte.

Cromozomii politeni apar în celulele înalt diferenfiate carenu -se mai divicl gi deci care reprezintà punctul terminus alunei iinii celulare date. Astfel, cromozomii politeni nu vormai r.eveni niciodatà la forma o,biqnuità, celulele în care se a,flà(de exemplu cele clin glandel'e salivare ale larvelor de diptere)funclionînd foalte intens într-un moment precis circumscris alo,ntogeniei dupà care mor (glandele salivare ale ,adultului sedezvoltà ulterior din celule care ,au crornozomi obignuifi). Poli-te,nia ajutà tocmai în realizarea unei asemenea funclionàri laparametri metabolúci maximi.

În timpul meiozei în nucleul ovocitei primare, mai al,es labatracieni dar si alte verterbrate qi nevertebrate s-a descrÍs untip special de cromozomi care apare mai ales în stadiul de di-

ra2

ploten pr,elungit. Acest tipde sromozomi numit larnP-bru.sh (în perie de sticlà clelampà) este specífie aces-tei faze Ei este reversibil.càci în fazele ulterioareale meiozei el revine laforma tipicà de crornozomlspe'cificà acelei specii.Acest tip de cromozomiapane qi în spermatogene-zi la Drosaphila. Dimen-;iunea CIromozomului lamp-bnsh poate depàEi pe a-ceea a cromozomului poli-ten ajungînd la 1 m,rn, dardiametrul sàu este foartesubfire. Din cromomerelesale stnt pnoiectate late-ral bucle în perechi avînddiferite forme qi dimen-siuni (Ftg. 34). Aceste bu-cle au o axà finà repre-zentatà d,e ADN $i din easînt proiecta,ùe flbre earesînt acoperite de un ma-trix c€ este alcàtuit dinARN gi proteinà.

Aflîndu-se în mijlocul profazei primei meioze se înlelegecà fiecare cnomozom lernpbrush neprezintà de fapt un bivalent,adicà doi cromozomi omologi împerecheali. Bucia lateralà apareîn acest caz ca unitate de iransóriere. Fiecare buclà apare asi-metricà în sensul cà la nivelul uneia dintre inserliile sal,e încromomerà este finà qi lipsità de fibre reprezentînd capàtul sàugol, urud, de la care se remarcà un gradient de lungime al Íii:re-lor ce sînt proiectate din buclà, ia început scurte Ei de','enindprogresiv mai lungi pe màsurà ce se apropie de eelàlalt capàtal buclei unde se inserà în cromomerà. Este posibil ca lanivelul capàtului gol sinteza ARN sà fie blocatà sau asimetriasà aparà ca un rezultat ai polarizàrii formàrii buciei. Buclelesînt considerate a reprezenta modificàri reversibile al'e struc-turii crornozomale la nivelul unor gene active, acest fapt fiind

' ..tl

Fig. 3a. Cromozomi ,,iampbrush" din ovo-eite de Tritutus uiridescens. Ei reprezintàbivalenfi (cromozomi omologi) qi deci douAstucturi bicatenare d,e ADN prezentînd

regiuni strîns spiralizate-cromomerele.

103

demonstrat gi de reducerea sau anularea lor atunci cind seac{ioneazà, cu inhitbitori ai transcrierii genetice. La unele ur'o-Cele (salamandrà de exemplu) din unele bucle care sînt omo-loage pufelor cromozomilor politeni, se desprind continuustructuri circulare care confin ADN qi care reprezintà nucleoliiextracromozomali, rezulrtafi în urma unuí proces de extrare-plicare care se numeqte amplificore genicd. Printr-o asemeneaextrareplicare, cantitatea de ADN se màreEte considerabil,uneori depàEind chiar ca'ntitatea de ADN a cromozomil,or în-EiEi.

Între cromoz,omii politeni gi cromozomii larnpbrwh aparuD,eI€ asemànàri cum ar fi amplificarea genicà, fenomenul depufare

- respectiv ,buclare, structura cromomericà, împere-chere,a omologilor (în primul caz este vorba de o împeredreresomaticà, în al, doilea de o împerechere norma'là meioticà).

Marea deosebire din'tre aceste douà tipuri particulare decromozomi, dar de excepfionalà importantà în înlelegerea fe-nomenului ereditar, este cà în eazul cromozomilor politeni, spredeosebire de cromozomii la,rrtpbrush, transformarea (rnetarnor-fozal este ireversi,bilà. tri nu vor mai reveni la forma rrormalà,tipicà a cromozomilor obiqnuili ci funcfioneazà într-un stadiucritic al vielii celulei, respectiv individului (stadiul larvar III)cînd sînt necesare sinteze de proteine, nespectiv enzime aleglandetor salivare. Dupà îndeplinirea rostului 1or, celul,eleglandelor salivare se autolizeazà qi odatà cu ele Ei crornozomiiuriaqi -

politeni.Cromozomii tmnpbru,sh, dupà ee îqi îndeplinesc funcfia tor

de sintezà inteursà de ARNr revin, începînd din diochinezd. qimai ales în me'tof'azo I a meiozei, la forma normalà de bivalenfiasigurînd continuitatea geneticà în linia germinalà.

2.2.2. STT|UCTU RA ELECTRONOMICROSCOPrcA A CROMATINEI$r A cRoMozoMuLUr EucARror

Cercetàrile de microscopie electronicà asupra cromatinei in-terfazice € qi a cromozomului metafazic au stabilit cà unitateade structurà a cromatinei eucariote este nucleosomul, o struc-turà periodicà, repetitivà de hisùone qi ADN. Fibra de croma-tinà este flexirbilà $i pe ea se aflà particule sferice dispuse pre-cum màrgeiele într-un girag. Nucl'eosomii se aflà deci atît în

104

cromatina interfazicà, cit Ei în cromozomul metafazic, în eucro-rnatina qi heterocromatinà, pe aceastà bazà putîndu-se ,explicacontinuitatea structuralà la nivel celular a materialului gene-tic la eucariote.

Particula nucleosomalà are un cliametru de 70-110 A.Nucleosomul este alcàtuit dintr-un octamer histonic în careintrà în cantitàli egale fracliunile histonice H2a, Hzb, Hs gi Hadar în dublu exemplar. Octamerul histonic ar.e o greutate mo-lecularà de 110.000 daltoni. El se asociazà cu ADN de lungimecorespunzînd la 200 perechi de ,baze. ADN stà l,a periferia octa-merului înfàqurat ca o superhelice platà (Fig. 35). Între parti-culele nucleosomice se aflà de asemenea ADN, lung de 1,8-3 nm, neasociat cu histone. Nu se qtie încà cum participà frac-fiunea hist,onicà H1 la structura cr'omatinei.

În ciuda unor deosebiri de vederi privind forrna qi di-mensiunea nucleozomului, numàrul de perechi de baze ,asociateacestuia Ei lungimea ADN intercromozomal este cliar cà nucleo-zomul este o unitate de bazà a cnomatinei eucariote. Dimensiu-nile sale sînt de 70-1,25 A, formà de disc (se mai numeqte giplatizom\ sau sfericà, fiind înfàquna't de 2 ,orí Ei jumàtate în-tr-o dispozilie încr.elità de o lungime de ADN care are 140-200 de perechi de nucleotide. DupàGottesfeld Ei oolaboratorii (1975) num'aiportiunile inactive ale ADN sînt orga-nizate în nucleozomi. Histona H1 esteimplicatà în superspiralizarea nucleo-zomilor qi a ADN internucleozomal qiîmpachetarea lor în fibra de cromatinà(Rahr. i977).

Fig. 35. Relafía dintre structura ADN, oligomerihistonici gi fibtile de cromatinà de diferite dimen-siuni (grosimi). Duplexul ADN de circa 25 Ldiametru este suptaspbalizat în interiorul subuni-tófilor cromatinei (NUCLEOZOM.I cu un pas (îuà1-

fime) de 504, spte a da o fibrà de 100 A. aga cumapare la microscopul electronic. Întregul complexnucleohistonic este din nou spiralizat (înfagurat)cu uu pas de 500 A qi o razó d.e 130 A spre a dao flbrà d.e 200 A *t. cum se vede la 'nicroscopulelectronic. Potliunile (întind.erile) de ADN liberdintre nucleozomi în mod normal sînt mai lungi

decît este aîAtat îu aceastA schemìl.

50

l'li,ciecsl-,

--l

tIIIIIIIl,-"^ Ql3LsA

I

I

iII

lt

i!

loo*-!Èl iI ':ti200 A

105

ln fibra de cromatinà ADN se aflà sub forma superspirali-zatà raportul lungime ADN : lungime fibra de cromatinà fiindde cca 30 la 1. Nucleozomii sînt mesllinufi în fiibra de croma-tinà prin cooperarea proteinelor specifioe cum ar fi histona H1,nonhisbonele Ei proteinele contr,actile.

Cînd celula trece prin stadiul postreplicativ G2 aI cicluluiceiular, cele dor-rà fibre replicate în stadiul precedent de sintezàS al interfazei se condenseazà sprc a forma jumàtatea unuicromozom (cromatida), pliindu-se în cromatide surori. Fiecarecromozom este pliat într-o oonfiguralie specificà în metafazà.

Structura electronornicroscopicà a cromozomului eucariotrelevà natura fibroasà a fibrei nucleohistonice care nu prezintàcapete iibere.

Cercetàri recente efectuate de càtr,e Loemmlú de la Univer-sitatea Princeton din New Jersey aratà cà 'organizarea cro-matinei în cromozomul metafazic are la bazà o re{ea de pro-teine nonhistonice. Îndepàrtînd histonel'e qi majoritatea pro-teinelor n,onhistonice din cromozomii metafazici umani a ajunsla constatarea cà ADN cr,omozomal ràmîne într-o structuràorganizatà qi compactà care apare ca un miez central ce pre-zintà morfologia cromozomilor metafazici intacfi, fiind încon-jurat de un halou de ADN. Structura miezului central estedezorganizatà, în urma tratamentului moderat cu tripsinà. Prro-duqii de digestie au fost analizali electroforetic. S-au eviden-liat peste 30 fracliuni de proteine nonhistonice. Aceste ceroe-tàri aduc date noi referitoare la structutra cromozomului euca-riot Ei ,aratà cà aceasta se bazeazà, în primul rînd pe existentaunei matrice de proteine nonhistonice care eonferà cnomozo-multri metafazic forma s,a caracteristicà. Aceste oercetàri ur-meazà sà fie confirmate.

2.2.3. COMP LEXU L SINAPTIN EM AL

În meiocite apare ca structurà caracteristicà prezentà doarla eucariote cotnplerul sinaptinemal (C. S.) descris pentru pri-ma datà, în-1956, de càtre Moses. C. S. este,o stmcturà tripar-tità (Fig. 36) eviden{iatà numai eleetronomicroscopic, prezenùînddouà componente laterale Ei o regiune centralà mai putinelectrondensà numità spaliu de împereehere. Regiunea centnalàane o là{ime constantà de 1000 A, reprezentînd qi distan}a din-

106

Fig. 36. Complexul sunaptinemal (CS). A. în spermatocitele de Philaenusspumariws se remarcó dimensiunile complexului sinaptinemal în absenla materia-lului cromatic. Màrire r 78.000. B. complexe sinaptinemale n:,ultiple, în lega-turA directà cu membrana nuclearà, r 48.000 (dupà Maillet gi Foillot, 1965).

tre cromozomii omologi în pa.chiben, indiferent de lungirneacromozomilor omologi qi conlinutul de ADN din aoeEtia. În re-giunea centr,alà se aflà elementul central, care are 200 A d;a-metru. Spaliul dintre regiunea centralà Ei eiemen'tele laterale€ste traversat de filamente fine. La làcuste Ei asoomicete, com-ponentele laùer,al,e apar cq o structurà ba,ndatà cu o periodici-tate de apnoximativ 100 A. Cromatina crom.ozomiloi omologivine în contact cu elementele laterale ale C. S., pe întreaga lortrungime. Ambele capete ale bivalentului sînt ataqate la mem-br,ana nuclearà prin tel'omerele 1or. La formele la care în pa-chiten apare o distribulie în ,buchet a bivaien{il'or, ambel'e ca-pete ale bivalenlilor sîn,t atasate într-o regiune restrînsà a rnem-,branei nucleare, adiacentà centriolului. Formarea CS începe cusinteza unei componente laterale în spaliul dintre crornatideie-surori ale fiecàrui cromozom leptotenic (încà aflat sub formàde univalent, neîmperecheat cu omologul sàu) gi capetele fie-càrui cnomozom leptotenic (avînd între cromatidele sale unelement lateral), sînt ataEate la membrana muclearà. Are localinierea relativà a cromozomilor om,ologi pe un spafiu de cca3000 A, fàrà a se cunoagte mecanismut Érin care Àe realizeazàaceastà împerechere prea}abilà a omologll,or. Elemen'tele lateraleale c. s. ce aparlin omologilor se asociazà avînd lroc asambla-rea C. S. care determinà o împerechere foarte exactà, cromo-merà la cromomerà, punct la punct a crelor doi cromozomi omo-logi cu f,ormarea 'bivalen{ilor. Pmtru asamb}anea c. S., elemen-

fi7

tele lateraLe ale fiecàrui omolog suferà o transpozilie dintrecromatidele surori spre exterior, depì.asare determinatà derotirea cromatidel,or surori fa!à de componenta lateralà. Esteposibil ca componenta centralà a C. S. sà derive din elemen-tel,e laterale omoloage prin existenfa unor fibrile dar Wester-gaard Ei Wettsùein (L971, 1972) admit cà elementul central alC. S. ar fi sintetizat în nucleol de unde migreazà la Locul deunire a elementelror laterale. În diplotenul tîrziu C. S. se dez-'organizeazà iar omologii sînt respinqi de l,a nivelul bivalentuluifàrà însà a se separa, ràmînind unili la nivelul chiasmelor -semnuL citologic al schimbului intercromozomal (cr,ossing-over),C. S. mediind schimbul dintre moleculele de ADN ale omolo-gilor.

C. S. apare ca o structurà ri,bonucleopr,oteinicà. Aceastàaser'{iune se bazeazà, pe rezultatul digestiei enzimatice cu DN-azd care dizolvà cromatina bivalentului fàrà a altera structuracomplexului sinaptinemal.

Rezultà cà ADN nu este un component major a1 C. S., Pu-tînd fi pnezent însà în cantitàli imfime. In schimb, ribonucle,azadezorganizeazà regiunea centralà gi cea mai mare parte a ele-mentelor laterale.

Prezenfa componsntei proteinice în C. S. este dovedità derezuitatul digestiei cu enzime proteolitice (tripsina). Elementelelaterale dau reac{ii citochimioe care indicà prezenla în ele deproteine bazice de tip histonà, r,egiunea centralà dînd reacfieciiochimicà diferità de aceea a elementel,or 1atera1e.

Existà unele afirmalii dupà care ADN ràmas nereplicat înfaza S premeioticà qi replicat în zigoten (Stern gi Hota, 1969,Hota qi Stern, 197I) ar media împerecherea cromoz,omilor omo-logi d'ar dupà al{i autori (Westergaard Ei Wettstein, 1972) în-sàEi componenta lateralà a C. S. poartà informa{ia pentruîmperecherea sit 1a sit a cromatidelor cromozomilor omologi.

Complexele sinaptinemale mediazà formarea de heteroduple-xuri ADN. Dupà uneLe ipoteze ar exista gene care codificà sin-tnza unor proteine alosteriee de imperechere, capabile sà seataqeze la anumite secven{e cle nucleotide. Ar exista douà ti-puri de asemenea proteine de împerechere, unele caracteristiceregiunilor e.ucromatice, alt,ele caracteristice regiunilor hetero-cromatice. Dupà altà ipotezà, ar exista gene de fuziune care ardirija sinteza unor proteine de împerecher'e bivalente speci-fice celor doi cromozomi omologi ai fiecàrui bivalent. Acesùegene ar fi derivat printr-un crossing-over inegal între cromo-zomi omolo.gi.

T.OB

3. CARACTBRISTICILE ORGANI.ZAR,IT EUCARIOTE

1. Închiderea materialului ereditar într-un spafiu geneticreprezentat de nucleu.

2. Asocierea permanentà a ADN gi histonelor cu formareafi,brelor nucLeohiston iae.

3. Prezenfa a trei clase de secven!à în ADN: secvenfe uni-ce, secven{e moderat r,epetate Ei secvenle înalt repetate.

4. Dif,eren{ierea a douà stàri funclional'e ale cromatinei -eucromatina qi heterocromatina.5. Evo1u{ia unui ciclu de condensare Ei decondensare a

cromatinei.6. Organizar,ea unui fus de diviziune eare asigurà reparti-

zarea echilibratà a produgil,or de replicare.7. Specializarea la nivelul cromozomului a unei regiuni de

atagare la fibrele fusului de diviziune centromer (cineùo-chor).

B. Organizarea nucleolului ca structurà intranuclearà spe-cializatà în sinteza ARN riboz,omat. El este asociat cu regiuneaor,ganizator nucleolard, (N. O.) a unuia sau a mai multor cro-mozomi.

9. Aparifia unui centri.ol cilindric cu formula ultrastructu-ralà I X 3 fiiamente, implicat în organizarea fusului de divi-ziune.

4. PROCARTOTB-EUCARIOTE, O COMPARATIE

Procariotele prezintà ADN necomplexat cu proteine bazicehisùonice (cu unele exoeplii - E. coli, Anabaena, Aphonocap-sa). ADN procariot nu prezintà secvenfe repetate (excepfie generib,ozomale prezenbe în cîteva copii). Nici ADN viral nu pre-zintà, secvenle repetate de baze cu exceplia fagilor din grupaT parà (Tz, T4, T6) al càror cromozom prezintà repetilii de baz,ela fiecare capàt. Procarioùele nu au materialutr ereditar încadratîntru-un spaliu genetic defi,nit.

Cantitatea de ADN este mult mai mare Ia eucariote, cores-punzînd unei cantitàfi mai mari de informalie eneditarà (ta-belul 2).

109

Tabelul 2

Datc crntitatlve prlvlnil genomul vlral 9l eelular](ilupà J.E. Taytor)

PoliomapX t74fagul T 7fagul ),fagul T 4Vinrsul Fowlpox

E. coli LarkE. coli Cairns

0,45 x l0-r

0,001580,001860,01220,01720,0520t60,0930t6

1,5301,400

6.1215,64

850,007.480

18.020

32.130

7t4-782986- 1054

1054- 1428I I90

1.020

DrojdieNeurospora

Chlamydomonas

Raphanus sstiYunVicia fabaLílium longfflorumXanthorhizeAquitegia

Drosophlla melauogasterChironomuspallidivittatus

3 x 10-r 10,200

1,8 x 10-r4,6 x 10-t

153153

2,522,053

0,450,45

61,268,0

0,180,20

Pegti (specii diferite) 0,7 -2,8 238-95217.00042.160

1.666

8.364

Dípnoi: ProtoptenrsLepidosireu

50124

4,9

24,6

94,5

2,1-2,32,9-3,1g,t-4,23,53,0

AmphibiaBufoSalamandraPlethodonNecturus maculosusReptileOrd. SquamataOrd. CrocodyliaPAsàriMatnifere-hamsterOm

Angio-sperme

Neverte-btate

Vertebrate

110

1

IIIII

I6

t2

r87

l3

l3

t2

18-232t

23

Eucariotele conlin de cca sute de mii de ori mai mulú ADNdecît virusurile gi de mii de ori mai mulrù decî,t bacteriile.-tixistà însà mari varia{ii cantitative chiar în cadnrl aceluiaqigrup de organisme eucariote. Drojdiile ibunàoara, eucariote ti-pice, conlin o cantitate de ADN nu cu nurlt mai mare decîtbacteria E. coli, pe cî,nd în nucleii unor dinoflagelate se aflàmai mult ADN decît la om. Nru existà deci o relafie simplà, d,i-rectà între cantitatea de ADN qi aceea d,e informafie eredi-tarà. (ADN nerepetitiv).

5. GBNOMUL EXTRANUCLEAR

La eucariote, în afara nucleului se aflà molecule informa-lionale de ADN oanton'ate la nivelul unor organite specificeprecum mitocondri.ile qi clwoplastele ca Si în kinetozomii, de laciliate, granulii bazali ai flagelilor organismel,or flagelate qikinetoplastele de la Trggnnosamidre. Din ace,astà cauzà celulaeucariotà apare ca o strucùurà multigernornicà î:r care, alàturide un genom nuclear existà cel pufin al{i doi genomi diferifiextranucleari

- genomul cloroplrastic specifie celulei vegetale

Ei genomul mitocondrial, comun cel.ulei vegetal.e qi animale(Fig. 37), ADN orgamitelor, localizat în matrixul acestora, pre-zintà. un aspect ultrastructurafl. simitlar aceluia al, nucleoidriluibaeterian sau cionobacterian, în car'e se r€m,arcà o retea tridi-

slendard

Fig. 37. Fractiunile de ADN celular delaEuglenagracil,is. (a) Bandarea care apaîe în tubul decentrifugà care conline ADN de Euglena gracilis(centru gi dreapta) gi ADN de fag SP 8 folosit castandard (stînga). (b) Analiza spectrofotometricóln ultraviolet a be[zilor. Banda cu densitatea1,743 corespund.e ADN martor SP 8. Bandaprincipaló din centru corespunde ADN nuclear.ADN mitocondrial bandeazà la 1,691 iar ADNcloroplastic bandeazà la 1,686 (greutate mole-

cularó 9,2 x:106 d.altoni).

zo

oorúIU

.îltcfDI(J

(,s6

=)c

.g-oo14.o

ADNfoiitocondrie/ADNc loroplastic

r.69r ì.0c6

greu dens;latee(9 crf) uîot

111

mensionalà de fibrile fine de ADN cu orientare randomizatà,avînd un diametru de cca 25 A. Înseamnà cà gi în acest cazeste vorba de lipsa asocierii ADN cu histonele.

De regulà. ADN extranuclear se prezintà ca molecule cir-culare bicatenare de ADN, dar gi sub formà de moleeule li-niare. ADN extranuclear se replicà dupà modelul semioons'er-vativ qi relativ independent de replicarea ADN nuclear avîndechipament enzimatic propriu de r,eplicare gi de transcriere.Organitele celulei eucarioùe, cloropl,astele gi mitocondriile, pre-zintà un sistem autonom de sintezà proteinicà echipament enzi-matic propriu cu ribozomi specifici de tip procariot (70 S)qi cu ARNú specific. Existà însà o strînsà independen!à întrefunclionarea genomului nuclear Ei a celui cioroplastic sau mi-tooondrial. ADN mitocondriatr este o structurà circulrarà dublu-catenarà care are o greutate molecularà ce varlazà, între 1X 107

Ei 5X107 daltoni. EI are o dimensiune mai mare la ciuperci,pr'otiste gi plante superioare. Mamiferele au un genom mito-condrial mie de 1 X tOt daltoni.

I"a drojdie, ADN mÍtocondrial are 5 X 102 daltoni ceea cecorespunde Ia 75 [<ilo,baze. PrÍmele gene cane au fost desem-nate a codifica cCImponente ale maEinàriei de sintezà protei-nicà miùoeondrialà au fost desemnate gene sg7, $i el.e includ ge-nele pentru ARNr qi ARNú mitooondrial (Tzagoloff Ei Macino,L977). La Soccharom,yces cereaisine s-au descris cel pu,Ln 30tipuri diferite de ARNú mitooondrial. Numàrul toùal de speciiizoaccepùoare de ARNú este în acord cu ipoteza usobble (vezicodul genetic). La Socclwromgces nu este necesar importul deARNú citoplasmatic pentru sinteza proteinicà pe ribozomi mi-tocondri,ali. La Tetrahgmena însà numai ARNú pentru leucinà,fenilalaninà, triptofan qi tirozinà sînt sintetizati pe matrifà deADN mitooondrial, restul fiind importafi din cit,oplasmà, avîndorigine nuclearà. Aminoacil sintetazele mitooondriale, factori deinifiere a sintezei protein'elor în mitoeondrii Ei cele mai mulùeproteine ri'bozomale sînt produgi ai genelor nucleare sinte'tizatipe ribozomi citoplasmatici.

Mutafia ,,pokytt de la Neurospora cmsso apare ca rezultatal absenlei unei pr,oteine specifice a subunitàfii ribozomalemici (30 S) a ribozomilor mitooondriali. Aeeastà pnoteinà a fostdesemnatà uar I qi este codificatà de o genà mitocondrialà. Adoua cl,asà Ímportantà de gene mitocondriale a fost desemnatàgenele mit Ei crodificà pnoteine ce funcfioneazà în tnansportulelectronilor qi fosforilarea oxidativà. Mutaliil'e mit afecteazà

tL2

trei complexe ale membranei interne, eitocromoxidaza, coen-zima QHz-citocrom c, reductaza Ei ATP-a,m oligomicin sen-sibilà.

Din totalul a nouà prot'eine sintetizate în mitocondrii qases-au dovedit a fi specificate de ADN mitocondrial. S-au descristrei grupe de complementafie mitocondrialà ori 7, ori 2 Ei ori3 care intervin în codificarea subunitàlilor citocromoxidazelorsfurtetizate în mitocondrii. Mutafiile din grupul de complemen-tatie cob sînt deficiente în ciùocromul b. Un grup de mutantemitooondriale deficiente în ATP-azd desemnate pho 2 pre-zintà leziuni în componenta proteolipidicà a ATP-azei.

La S. cereuísioe mutantele citoplasmatice spontane ,,petite66prezintà unitàli genomice mitocondriale în care un segmentexcizat al genomului parental de tip sàlbatic (normal) a fostamplificat în tandern. Acest segm.ent excizat devine unitatearepetatà a genomului ,,petite66. Acest genom ,,petite( la rîndulsàu, deqi produsul unui eveniment mutafional poate suferi cie-I,efii care duc la genomuri ,,petite( secundare, avînd unitàlirepetate mai scurte (Gaiiland qi colab., 1980). Studiul mutante-1or spontane ,,petite( aratà cà în mod frecvent capetele seg-mentului excizat corespund la secvenfe scurte ale genomului detip sàlbatic care sînt extrem de bogate în GC. Astfel, clu,sterii.(grupàri masive) de GC sînt localiza!í în segmente lungi ,bogatein AT. Repetifii de secvenle s-au dovedit a fi prezente atît laniveLutr clu,sterilor GC cît qi a spapiatorilor AT, ceea ce facepnobabilà posibilitatea ca excizia sà se realizeze prin'tr-un me-canism de recombin'are nelegitimà cu specificitate de sit, întresecvenfe omoloage.

Combinarea metodelor de eartare geneticà qi de cartare fi-zicà a dus la cartarea markerilor mit- Ei de rnezisten!à la anti-biotice din genomul mitooondrial de la S. cereaisine.

Pe oalea analizei co-retenfiei qí co-delefiei alelelor mutantefur Ei din ADN mitooondrial al mutantel'or peti.te (qJ Ei a ana-lizei produqilor de recomrbinare (analizà gen'eticà) din încmci-qàri bi- qi trifactorirale, s-a sta{bilit circularitatea hàrfii geneticemitocondri'ale, unicul grup d,e lincaj genic mitocondrial avîndca suport fizic molecula circularà dublu-eatenarà de ADNmitocondrial.

G'enele ribozomale mitocondriale Ei pentru ARNú mitocon-drial au fost cart"ate priur hitbridarea acestor produgi eu frag-mente de ADNmt de la tipul sàiibatic $i de la tipul p- $teti.te)gener,ate prin restrielie cu endonucleaze de restricfie.

8 - Descifrind tainele eredità|ii, vol. I 113

Harta geneticà mitooondrialà evidenfiazà o oonsiderabilàdispersie a genelor care ooclificà funcfii înrudite. Cele trei genestructurale car,e codificà citocromoxidaza sînt separate d,e sec-venfe care conlin genele sgn qí mit.

Geurele ARNr, ARNú qi ATP-caei sînt de asemenea distri-buite împràqtiat în tot genomul mitocondrial. Aoeastà distribu-fie specificà a genelor mitocondriale eltiminà posibilitatea expre-siei lor ooordonate contr'olatà prin simteza unui ARNrn poli-cistronic, gsnele mittooondriale, spre deosebir,e de oele de pro-cariote, apar a fi transcrise individual, caracteristicà specificàqi genelor nucleare euoariote.

Clor,oplastul plantelor superioare conline un numàr marede molecule circulare, identice cu ADN cu o greutate mole-culiatrà de cca 9 X tOz da,l,toni. Fiesarc nro.lpculà oonline furfor-mafia geneticà totalà a orgarnitului (Bórner, 1980). Ca urmane,numàru1 de copii ale fiecàrei gen,e cloroplastice per celulà poateajunge 1a cîteva mii, depinzînd de numànr,l de cloroplaste percelulà Ei de cel al moleculelor de ADN per cloroplast.

Cu ajuùorutr endonucleazelor de restricfie s-a stabil.it hartafizicà s, ,g€Doffiului clonoplastic qi au fost cartaúe genele pentruARNr, ABNú, subunitatea mare a frracliunii proteinice I gi pen-tru unele polipeptide neidentificate. S-a stabilit cà geneleARNr sînt localizaúe în cadrul unor r'egiuni cu secvente repe-tate din ADN (in cadrul a douà repetifii inversate la spanac,porum,b qi Chlotrydommtas gi în cadrul a trei repetifii în tan-dem mai mici.7a Euglenn). Pe ribozomii cloropl,astici sînt sinte-tir.ate mai mult de 90 po'lipeptide distfurcte, incluzind gi sub-unitaúea mare a fracliunii proteinice I (ce participà în catalizaenzimaticà a fotosintezei), trei surbunitàli ale factomlui de cu-plare CFt doi factori de elonga{ie qi ciúocromii. Un numàr marede proteine clonoplastice sînt si,:rtel:zatn pe riibozomi citoplras-matici qi includ enzime ale ciclului Calvin, enzimele sintezeipigmentului ADN polim erazal polipeptidel,e tilncoidelor qi mem-rbra,,nele anvelopei cloroplastului. Polipeptidele sînt evident sin-tntizate în citoplasmà, ca precursori avînd ,o secven{à semnal.Aceastà secven{à adifionalà permiùe transportul specific prinanvelopa cloropiastul,ui dupà care este eliminartà. În membranaanvelopei cloroplastului se aflà receptori specifici pentru sec-venla semnal a moleculelor pr,ecursoare, facilitînd trecerileprin membranà.

Recen,t, au fost izolafi crùÍLmomi cloroplnstici intacfi de laalga Euglenn ca qi de Ia numer,oase plante superioare Ei s-a

114

constatat cà aceEtia sînt circulari, avînd o circumferifà de cca45 [rh, ceea ce cor'espunde la cantitatea de ADN de la fagiiT2 sau Ta.

S-a oonstatat cà genele cloropLastice care codificà diferiteleenzime sau proteine ce participà în fotosintezà sau în morfo-geneza organitului sau ,genele mitocondriale ai càrnor produgidirijeazà sinteza unor enzime ce intervin în lantul transporto-rilor de electroni sau a unor protein,e structurale suferà mu-tafie gi recombinare. Ele alcàtuiesc ca Ei la pruoariote un sin-gur grup de înlànfuire.

Cercetàri de hibridare molecularà au demonstrat lipsa uneiomologii între ADN nuclear qi ADN extranuclear. O analogiemai mare apare între ADN extranuclear qi ADN bacterian sauciano'bacterian, de unde s-a tras concluzia cà organitele celu-lei eucariote ar fi derivat prin endosimbioza unor stràmoqi detip prooariot

- bacteriile pentru mitooondrii, cianobacteriilepentru cloroplaste (Gawilà, 1978). Existà gi alternativa ca ce-lula eucariotà sà derive prin transformar€a progresivà a ce-lulei procariote, organitele citoplasmatice ale celulei eucarioteprovenind prin transformarea mem'branelor tilacoide Ei princompartimentaiizarea genomului inifial în genom nuclear, mi-tocondrial, cloroplastic etc.

Capitolul IV

CODIFICAREA BIOCHIMICASI EXPRESIA GENICA

1. GBNERALITATI

Gena reprezintà un segment din macromotrecula ADN acàrui secven!à de nucleotide deline, sub formà oodificatà bio-chimic, informalia geneticà necesarà pentru sinteza unei catenepolipeptidice. Aceastà informalie este transmisà în prooesulde transcriere unei monocatene ARN car€ poartà astfel mesa-jutr genetic ce dirijeazà includerea în catena polipeptidicà aaminoacizilor cor'espun zàtorí. Secvenfa genicà codificaúoare esteprecedatà de ,o secven{à necodi.ficatoare de circa 50 nucleo'tidecare s-a numit regiune promotor, r'eprezentînd situl de aùaqarea ARN polimerozei în vederea transcrierii. De as€rt€rlea încadrul genei se mai aflà o rqgiune implicatà în r'eglarea tran-scrierii genei qi care a fost numità regiune operatoare. Uneoridouà sau mai multe gene care defin informafia geneticà ce di-rijeazà sinteza unor enzime ce intervin în aceeaqi cale meta-bolicà pot avea acelagi promotor qi acel,aqi operator. În acestcaz asemenea gene sînt tr,anscrise sub forma unui tr,anscriptcomun care poate fi apoi clivat în diferite caúene ARNrn pur-tàtoar,e al,e mes,ajului genetic pentru fiecane catenà polipepti-dicà.

Gene1e care delin inf,ormafia geneticà pentru sinteza poli-peptidelor se numesc gene structurale. Tr.anscriptele 1or repre-zentate de ARNrn sînt traduse în pol,ipeptide.

Genele car'e delin informalia geneticà pentru sinteza ARNrse numese gene ribozqmnle. Transcriptele lor nu sînt traduse.

Conversia (traduoerea) mesajului genetic din limbaj de acidnucleic construi,t din cele patru nucleotide într-un limbaj pro-

116

teinic, construit din cei 20 aminoacizi principali este mediatàde un sistem de codifioare-decodificare cunoscut sub numele decod genetic. Aceastà conversie se realizeazà la nivelul riibozomi-lor - iocul sintezei proteinice - qi are ioc prin participareacelor trei categorii principale de ARN celular: AItNm, ARNúqi ARNr.

Ideea prof'eticà a lui E. Schródinger din anii L944-t945despre natura relafiei dintre actzii nucleici Ei proteine formu-latà în termeni de codificare biochimicà s-a dovedit realà Eicristaiizatà sub denumirea dogmei centrale a biologiei mole-cul.are elaboratà în anul 1956 d,e càtr,e Crick. Dogma centralà abiol'ogiei molecular,e a admis transferul unidireclional al infor-mafiei genetice ADN + ARN -> pr,otein,e. Ulterior, descope-rirea reverstranscrierii a adus coreclii dogmei centrale a biolo-giei moleculare, demonstrînd posibilitatea unui transfer inversde infor,mafie geneticà de la ARN l:a ADN.

2. CODUL GENBTIC

Codui genetic repnezintà un sistem biochimic prin care sesta'bileEte relafia dintre acizii nucleici Ei pr,oteine.

Relafila dinrtre muúafia uurei gene Ei blocarea unor eùape spe-cifice aie unui lan! meta,bolic 1a Neurospora a fost stabilitàînainte de 1944 de càtre Beadle gi Tatum su,b formula meta-foricà: o gemd,

- o enzirnd. Colineoritatea gend, -

polipeptidda fost ulterior d,emonstratà în numer'oase cazuri. Astfel, în1957 Ingram Ei Husit au aràtat cà hemoglobinele de tip A qi Sau o structurà primarà car,e diferà printr-un singur aminoacid(fig. 3B). Hemoglobina S este ,o hemogl,obinà mutantà. S-a trasconcluzia cà mutafia a alter:at pozilia nucleotidelor la nivelulgenei iar aceastà al,terare a fost tr'adusà printr-o alternare apoziliei unui aminoacid în catena polipeptidicà. Veridicitateacolinearitàtii nucle'otidel,or de Ia nivelul genei cu aminoaciziide la nivelul oatenei polipeptidice a fost demon;stratà experi-mental de càtre Yanofsky în t964. Anaiizînd mutantii armotrofide E. coli induqi prin iradiere UV, deficienli în proteina A atriptofansintetazei, proteinà care reprezintà o catenà polipepti-dicà de 267 aminoacizi, autorul a constaùat cà în pozili,a 2t0,mutanta A2s ,at€ arginina iar mutanta Aa6 are acidul glutamicpe cînd tipul normal prezintà în pozilia respectivà glicin,a. Pe

Itr

HbA HbS

I

t,4 .

-Y\./ti\/.-.\

153 i-11,

i9&\ () /dà}i,3

d""t %o*

Fig. 38. Comparatia cromatogramelor peptid.elor produse prin digestie cu tri-psna a hemoglobinei normale 6ffe; gi h.e-moglobtnei din celule falóiforse (I{bs)

din care teiese modifiss3sa ln pozifia peptidei 4.

aeeastà tlelzà, s-a tr,as comcltuzia cà o schimbare în secvenfa denucleotide determinà înlocuinea unui aminoacid cu altul, deunde dovada oolinearitàfii nucl,eotide - anninoracizi, respectivo colinearitàtii genà-proteinà.

fur an'ul 1952 Doumce $i apoi în anul 1954 Gamow, bazafi pedesooperirea lui Astlbury gi Bell din 1938 care au constaúat princeroetàri crisúalografice cà spaliul dintre urucleotide l,n ADNeste aproximativ egal cu spa{iul dintre aminoacizi în ca,tenapolipeptidicà, emit ipoteza potriviú càreia secvmfa, lùniarà denueleotide d,in ADN determinà secventa liniarà a arninoacizi-lor din catenele polipeptidice ale moleculelor proteinice.

Gamow a analizat s'tatlstic relafla dintre polinucleotide, re-prezentînd cuvinte lunagi scrise intr-un alfalbet cu patru iiùere(cele paftru ibaze azotate) gi poli,peptidice, reprezentînd cuvintelungi scrise într-un alfabet cu 20 litere (reprezentate de crei 20amin'oacizi prineipati). Dacà seevenfa de nucleotide din acidulurucleic determinà secven{a de aminoacizi dilr polipeptidà sepune problema relafiei dintre cele 4 herze azota'te gi cei 20 ami-noacizi principali în termeni de determinare cantitativà: cîtebaz,e azotate determinà un aminoacid?

Dacà se' admiúe cà o singurà bazà azotatà deùerminà(specificà sau codificà) un singur aminoacid atunci în vir-tutea relafiei 4L:4 nu vor putea fi specifica{i decît 4 amino-aqzi. Tot astfel eombinàri de cîte douà 'baze azotarte, potrivitrela!Íei 42:16 sînt instrficiente spr,e a specifica toti cet 20,ami-

118

ts

noacizi principali. Doar combinàri de cîte 3 baze azotate(43 - 64) pot sà ofere posibilitatea specificarii tuturor celor 20aminoacizi principali qi sà mai ràmîmà încà qi alte posibilútàtisuplimentare de specificare.

Relalia nucleotide-amin,oacid a fost dovedità experimentalstudiindu-se mutafiile induse de càtre acidul nitros la VMf,. acàrui capsidà constà din 2L50 catene polipeptidice ideurtice,fiecare confinînd cî'te 158 amimoacizi. Mutatiile indtrse de càtreacidul nitros sint tmnzifiii de tipul A. + G sau C -+ U (vezi,mutageneza). În urma aparifiei acestor mutalii la nivelul nu-cieotideloldin ARN genetic al, \[VIT, care îndeplíneqte qi rulde ARNrn, apar modificàri qi în catena polipeptidicà. Acestemodificàri sînt de tipul unor substitufii de aminoacizi:

Prolinà -> Serinà -+ Fenilalaninà sauProlinà -> Leucinà - Fenilalaninà.

S-a dedus cà Prolina esúe specificatà de un codon la care ceÌpu{in douà nucleotide sînt fie A, fie C. Tranzifia A -+ G sauQ + U a unei,a din ac,este nueleotide trebuie cà genereazà codo-nul Serinei, respectiv pe acela aI Leucinei. În oodonul Fenilala-ninei ambele mucleotide trebuie sà fie G sau U.

Pe seama unor deducfii asemànaùoare qi a analizei varian-telor hemogtobinei umane, Nir,enlberg a descifrat în 1961 codulgenetic.

Efectuîndu-se studii genetioe €supra mutantelor induse cuproflavinà la bacterinfagul Ta s-a dernonstrat experimental càunitaùea care codificà un aminoacid este tripleta de uruclEotidecare s-a numit codon.

Asemenea studii în care s-au aplicat teste de recombinarecu tipul sàlbatic au conrdus la ooncluzia cà în urm,a acfiuniiproflavinei are loc fie adifia, fie delefia de baze din secvenfapolinueleotidicà. Astfel, existà mutante inifiale nota,te conven-lional cu ,,-(ú qi mutante naturale de reversie notate cu ,,f c.

O secventa initialà, normalà de nuclieotide va fi citità dintrei îrr trei baze azotatm spre a dirija de fiecar,e datà plasarea furlanlul polipeptidic a unui aminoacid.

Dacà se admite cà secventa de nucleotid,e reprezentind ca-drul de citire începe sà fie citità dintr-un punct fix, delefia uneisingure perechi de urucleotide va duce la schimbarea tuturortripletel,or, modificînd cadrul de citire Ei atunci în oatena poli-peptidicà r'or fi încluqi cu totul alfi aminoacizi decît în cazulnormal' Are loc citinea greEità a aodului. Astfel, dacà cadrulr

119

normal de cirtire est'e GACG. GAG. GAG. GAG, insmlia uniuisingur C Ia nivelul sàgefii va determina urmàtorul cadru decitire: GAG. GAC. GGA. GGA. etc. Tot astfel dele,tia lui A vaproduce de aseme,nea schimbarea cadrului de citire GAG. GAG.GAG. GAG Ei atunci secvenla de triplete va fi GAG. GGG.AGG. AGG. etc. În ambele cazuri este sehim,bat totalmente ca-drul de citire mai ales dacà asemenea alrteràri se produc la în-ceputul genei. Se sintetizeazà o proteinà anormalà, mutantà saunefunclionalà.

Dacà în urma mutafiei, dupà ce a avut loc inilial o delefiea unei perechi de baze azotate, va avea loc adifla unei alteperechi de baze ,azotate îur porliuni 'adiacente a,le aceùeiagi genese poate restabili ordinea ur'ormalà a nucleotidelor (se refacecadrul de citire) Ei ea va fi citità normal. Astfel, considerîqrdpolinucleotida GAG, inserlia lui C urrnatà de delelia lui A varefaee cadml normal de citire, va avea loc o citire corectà asa $i se va sintetiza ur-r polipeptid normal:

GAG. GAG. GGA. GGA. GGG. GAG. GAG...chiar dacà cîteva triplete pe portiunea în care se realizeazà adi-tra qi dele{ia vor fi modificate. Delefia sau adilia uneia, a douàsau a patru pereehi de nucleotide nu reface ordinea normalà anucleotidelor respectiv a codonil,or qi are loc sinteza unei pro-teine mutante.

' În anul 1961 Nirenbeng qi Matthey pe de o parte qi Ktro-rana pe de alta, folosind ARNrn sintetizafi artificial ce aonfi-neau o secven!à cunoscutà de nucleotide, au r,euEit sà sinteti-r,ez,e i.n uitro diferite polipeptide în sisteme aceiulare care oon-lineau ribozomi, factori proteinici necesari pentru sinteza poli-peptidicà precum qi tot setul de ARNf. S-a analizat apoioompozilia polipeptidelor sintetizate. Astf,el cînd au folosit unhomopolimer poLiribonucleotidic format numai din uracil@oli U) a fost sintetizatà in uitro polipeptidul polifenilalanina.Astf,el, s-a demonstrat cà tripleta UUU specificà aminoacidulfenilalanina. Cînd s-a f,olosi;t poli-C s-a sintetizat polúprolin,a.Poli-A determinà sinteza polilizinei. Numai poli-G nu a pututfi verificat inifial càci formeazà între nesturile guaninà puntlde hidrogen care determinà aonformafli spaliale multicatenarespirale la care rirbozomii nu s,e pot ataEa. Ulteri,or s-a stabilitcà GGG codificà glicin;a. Experienlele de verÍficare a proprie-tàtilor de oodificare al,e polimeritror au fost oontinuate luîndu-seùr considerane oopolimeri. Pe aceiastà bazà. s-a stabilit cà poliA-G deùerminà încorporarea lizinei într-o catenà polipeptidicà

120

pe cînd poli C-G determinà încorporarea într-o catenà poh-peptidicà a alaninei, argininei gi prolinei. O secvenla repetitivàCUCUCU determinà sinteza unui polipeptid în care leucinaalberneazà cu serina. Au fost folosifi ,aPoi oopolimeri cu 2 ,bazeazota,te in proporfii diferite qi cu 3 rbaze azotate diferite reugin-du-se sinteza de polipeptide artificiale în care erau incluqidivergi aminoacizi. Prin asemenea experienfe s-a putut de'ter-mina direct relalia de specificare a aminoacizilor de càtre nu-cleotide. Dar prin ele nu se putea stabili ordinea nucleotidelorîn cadrul tripletelor. Pentru aceasta a fost sintetizat artificialun ARNm alcàtuit din douà nucleotide diferite dar la care segti'a care este ordinea acestor nucleotide. De exempliu s-a oon-struit un ARN,rn artificial de tip UGU-GUG-UGU-GUG etc. qis-a constatat cà el dirijeazà sin,teza unui polipeptid în carecisieina alterneazà cu valina" Pe aceastà cale s-a putut deter-mina experimental ordinea nucleotid,elor celor mai multe tri-plete. Ulterior, pe ,baza unor tehnici sofisticate care au inclushidroliza ritbonucleazicà a ARNrn, ultracentrifugare,a fracfio-natà Ei electroforeza I'izaùelor, cromatografia pe hîrtie cu sta-bilirea Jingerprinú-urilor diferitelor oligonucl'eotide,'analizaspectrofotometricà în ultraviolet Ei analiza ,,de vecinàtates princare se poate stabili p'ozllia radicalilor fosforici s-a putut de-terrnina ordinea nucleotidelor în diferitele triplete.

În studiul codificàrii bi'ochimice a fost apliaatà Ei metodaidentificàrii aminoacizilor - ARNú fixali pe ribozomi sub in-fluenla unui codon cunoscut. Aceastà metodà ca Ei cel,elalteprin care s-a descifrat codul genetic s-au bazat pe constatareacà ionii Mg++ în ooncentrelie mare împiedicà disocierea ribo-zomilor 70 S în subunitàtile sale Ei permit acestora sà iniliezetraducerea fàrà oodonul inifiator AUG. Astfel, în 1964, Niren-berg a sintetizat trinucleotide cu secven{e de baze cunoscute,acesfea au fost asociate cu ribozomii Ei s-a urmàrit care dintreARN' se leagà l,a un ras€ít€o€a complex. De exemplu, trinucleo-tidul 5' GCC 3' legat la rirbozom a determinat ataqarea la oom-piexuÌ. format doar a ARNf pentru alaninà dintr-un amestee dediferill ARNf. Tot astfel, 5' GUU 3' aclionînd ca A-RNrn, de-terminà Legarea la ribozomi doar a ARNú pentru valinà. Peaceastà cale s-a putut stabili direct semnificafia de codificarea fiecàrui codon. Astfel, s-a rezolvat semnifica{ia d'e codificarea trei izomeri UzG: UUG-leucinà; UGU-cistenà; GUU valinà.Folosind aceastà cal,e s-a reuEit descifrarea în totalitate a co-dului genetic. Crick a sugerat aranjarea codonilor într-r-rn ta-be'l c,ane sà reprezinte grafic oodul genetic. Semnificatia acestui

t2l

tabel pentru Biologie este cpmparabilà cu ,8c€€è a tarbeluluiperiodic al elementelor pentru Chimie.

Au fost studiatc de asemenea mutafiile car€ determinà sub-stitufia unor aminoacizi dÍn mol.ecula unor proteiure birrecu-noscute ca sesvenfà de alninoacizÍ cum sînt hemoglobina, trip-tofansintetaza de E. coli, qí proúeina \lAdT.

Mutafiile de su'bstitufie afecteazà de regulà o singurà nu-cleotidà din catena polinucleotidicà. O mutafie de substituliecare apane cu mane frecvenfà la hemoglobfura umanà duce laînlocuirea valinei cu izoleucina. Cum valina este codifica'tà deGUU ian izoleucina de 1 A 2U s-ra, tras eonehrzi,a eà ,ordineanucleotidelor îm tripleta izoleucineí este AUU, codonul va}ineidevenind prin sutbstitufia G cu A codonul izoleucinei. Printr-oanafizà de acest fel s-au putut d,ovedi experimental raporturilede oodifi@ne gi s-a descifrat oodul genetic (fig. 39). Cea mai,neambigua validare a codultui ggnetic stalbilit prin experienfe

Fig. 39. Reptezentarea codului genetic ARNza. Codonii se formeazl ponrinddin centnr spte periferie. La periferia cercului sînt dispugi sminsa,gizií codlficaflde eodonii corespunzàtorl. Ala : alanina; Ary : argininl; AsP : acidaspartlc; lsy'-Nlfr : ssParagina; Cys : cisteina; Gkt : aciil glutanric;GIr-NII' - glutarnlna; Gly : glicina ; Mct : metionina; Phe : fenilalanina;Pro : prollne i Scr : serÍna; Tht : treonina; Tr! : triptofan; Tyr : ttrozi-te; Yol : ynlilg. Codonii ocr*, amber V ofal desemnafi cu un ceîc îregru dntc.od.onii îlor$rerur, eare nu specificó nici un ntninoacid, teprezentînd. codoni terrnii{natori ai catenei polipeptidice. Codonii desemnafi cu us, triuaghi sînt codon'tniliatori ai catcnei (AÙG gi GUG). Cu un pétrat sint dese'.'nali alinoacizii codi-

ficali de codoni tltferiti care se deosebesc dupé prima bazé.

t22

qJ

3)

,ca

JO

Fig. 40. Un fragmsn! rlin ARNz de R17'cu co-donii care specificó dilerifi aminoacizi d.intr-unfragmenl at proteinei interne & capsldei. Sec-venfa d.e nucleotítle din ARNllerRlT ca gi cea dea,minqsqizi 6in proteina capsidei au fost însé to-tal stabi[te, lenaîcindu-se colinearitatea nucleo-tlde-arnheagizi 9i în acelagi timp veridicitateacodonilorflstabilifi prin experiente inclirecte (dupó

Goodenough & Levine, 1974).

in uitro a fost r,ealizatà prin compararea secvenfei de ,amino-acizi din pnoteina capsidei fagului R17 cu secventa de nucleo-tide a ARNnz de .R17 în r,egiunea moleculei care dicteazà sin-teza proúeinei capsidei.

Seevenfa teoreticà, stabilità prin experiente in uitro s-aconsúatat a eorespunde exact cu secventa de amirroacizi dinpr'oùeina capsidei (fig. 40.)

3. CARACTERISTICILE CODULUI GENETIC

Sînt posibili 64 de codoni sau tripleùe potrivit relaliei43 :64. Dintnc aoestia doi sînt eodonii de inifiere gi anumeAUG $i GUG, care mareheazà începuhrl uo€ii caterte polipep-tidice. Ei deterrninà initienea oatenei polipeptidice prin fureor-porarea formilmetioninei la E. coli qi metionfurei la eucarioùe.Alti trei codoni nu oodificà nici un aminoacid (sînt oodoni

,"u À i\ tn./u' 'c\<U Ù)

_ AlIr u l.r.cr, i A tJ J

'.C C i- li-, g lo'.meljU A.r

LT A. I[L , lire

;sn i A U _l

I n i.J_j

|-A ! irentr,'ulU i-:-J

Lu G-l[c c lararir I n Ul!U AI[c c it'eserl C GJ.Lr, AliU .A lasnrgiG cliC Ul

.-, f-G C |te,"lillo cr''" Lu c

t23

nonsens), ei indicînd însà sfîrgitul unei catene polipeptidice(codorú sfop). Acegtia sînt codonii ocru- UIAJ{, arnbrd: IIAGqi azw: UGA. Codonul UGA separà genele în cadrul unuimesaj genetic policistronic.

Codul genetie are cinci canacùeristici esenfiale: este univer-sal, neacoperit, fàrà virgule, degenerat gi ambiguu.

Caracterul de uniuersalitate al codului genetic ne aratàcà r:n anumit codon codificà un acelagi amimoacid. la orice or-ganism, indiferent de treapta evolutivà pe care se aflà, de lavirusuri pî,nà la om. Prin mutafle codul genetic il'tu se sehimbà;este schimbatà informalia ereditarà, iar în traducerea acesteiaîntr-o proteinà mutantà funclioneazà acelagi cod care functjo-neazà Ei în traducerea informaliei er'editare normale de la tipuinormal (sà,l'batic).

Universalitaùea codului geuretic a fost demonstratà experi-mental în cazul sintezei proteinice desfàgurarte în sisteme ,ace-lulare provenite de la ,bacterii qi mamifere sub influenla unuiaeeluiagi ARN,nz sintetizat ,artificial, cînd se oblin aceieaEiproteine, indiferent dacà sistemul aoelular este provenit de labacterie sau de la mamifer. Hemoglobina de iepur,e a pututfi sintetizatà artificial folosindu-se ribozomii qi ARNnz dinreticulociùe de iepure gi ARNú de E. coli. Experienfele de ingi-nerie geneticà (prin care gene de la m,amifer pentru insulinà,pentru hennoglobirlà, pemtru hormonul de cre$tere, pentru o?L-giotensittd, II precum qi g,ene ritbozomale sau pentru histonà dela arici de mane qi drosofilà au fost introduse în celula rbacte-riarrà E. coli) au aràtat cà poate fi dirijatà sinteza de produqige,nici specif,ici eucariotelor, folosindu-se aparatul tbarcterian detraducere - ribozomul. Este dovad,a clarà a universalitàlii co-dului genetic. Dar, pro'ba,bil cea mai evidentà dsmourstrare auniversalitàîii oodului gernetic a fost realizatà de J. Gurdon,care a puri,ficat ARNnz pentru hemoglo,binà din reticulocite deiepure gi I-a injectat în ovocite de b,roascà unde aparatul desin0ezà proteirnicà, de traducere a mesajului gen,etic al broaEteisintetizeazà he,mogl,obinà stabilà de iepure, chiar dacà celuleleovocitare nu simtetizeazà niciodatà hemoglobinà. Mesajul ge-netic al oricàrui sistem biologic poate fi tradus de maginàriade traduc€re a .oricàrui alt sis'trem rbiologic. Codul genetic estedeci universal.

Neacoperirea cod,onitor. Codonii succ€sivi, vecini, în oarese organrz,eazà,,o secventa de nuoleotide a ,unei gene ce speci-ficà o proteinà da,tà nu se aooperà, nu-qi împrumutà nucleotide,nu au nici o nucleotidà comunà. Ei reprezintà unitàti de codi-

t24

îrcar'e de sine stàtàtoare, nesuprapuse. De asemenea, întresfîrEitul unui codon Ei începutul codonului urmàtor nu existàspalii sau nucleotide. Codui genetic este agadar fàrà virguìe,lipsind semnalele speciale care sà marcheze sfîrgitul unui codonqi începutul codonului urmàtor. La fagul cp X 174 gene diferite,adiacente însà îgi împrumutà nucleotide sau codoni fàrà însàca aceqtia sà se suprapunà.

Douà caracteristici ale codonului genetic sînt foarte impor-tante în traducerea mesajului genetic. Este vorba de degene-rarea qi arnbiguitatea codului genetic.

Carocterul de degenerare a codului genetic ne aratà cà inunele cazuri un acel,aqi aminoacid este specificat de mai mulficodoni. Astfel, feniltala,nina este specificatà de UUU dar gi d'eUUC. Serina este specific'atà de 6 oodoni: UCU, UCC, UCA,UCG, AGU, AGC. Tot astfel leucina este codificatà de 6 codoni:UUA, UUG, CUA, CUC, CUU, CUG. Dar codonii în care pre-dominantà este guanin,a (ce determinà aparilia de structuri secun-dare) sînt de regulà ineficienli în biosinteza proteinicà. Dife-ri{ii codoni care au însà primele douà nucl.eotide identice potspecifica acelagi aminoacid. $i aminoacidul argininà este codi-ficat de 6 triplete. Numai metionina gi triptofanul sînt codificalide cîte un singur codon (AUG respectiv UGG).

Ambiguitstea codului genctic este redusà. Ambiguitatea în-seamnà recunoaqterea de càtre antioodonul dintr-un ARNú amai multor codoni din ARNm Ei deci posibilitatea ca un codonsà specifice mai mulli aminoacizi. Astfel codonul AUG esterecunocut atît de càtr,e antictdonul' lui rtFtNúmer (cînd este îninterionrl mesajului - cadrului de citire) cît Ei anticodonul luiARNúrme' (cînd este I.a începutul oadrului de citire). Tot la fel,codonul GUG poate specifica atît formilmetionina cînd este laînceputul cadrului de citire cît gi valina cînd este în interiorulmesajului.

Amin,oacizii cu proprietàfi structurale similare au tendinfade a avea codoni înrudifi. AEa se face cà acidul aspartic qÍ aci-dul glutamic prezintà codoni similari GAU gi GAC în primulcaz, respectiv GAA Ei GAG în al doilea caz. Tot astfel amino-acizii aromatici fenilalanina, tirozina qi triptofanul sînt codifi-cali de triplete care încep cu U. Se admite cà aceastà proprie-tate de oodificare a fost stabilità în decursul evolufiei, ea pre-zentînd avantaje errolutive càci înlocuirea prin mutalie a unuiaminoacid cu altul în catena polipeptidicà este cu atît maipufin dàunàtoare cu cît aminoacizii înlocuifi au proprietàli

725

5' Acfl

ARNrn ( codoni)

Anticcdoni drnAFìr\{i

Fig. 41. Decodificarea informaliei ered.itare (complementa-ritatea qi antipolaritatea tripletelor rtin ADN, codonilor din

ARNza.gi a anticodonilor din ARNú).

mai asemànàtoare, ceea ce face ca proteina mutantà sà poatàfi încà funclionalà.

Crick a elarborat ipoteza oscildrii (utobbte) spre a explicaambiguitatea. Astfel, U aflat în pozifia a 3-a în tripleta antico-donului, la capàtul 5' al acestuia se poate împerechea atît cuA cît qi cu G. Astfel, primel,e douà nucleotide sînt cele rnaisemnificative $i mai exacte în codiîrcare, pe cînd cea de-atreia bazà a codonului este oscilantà. Flexibilitatea celei de-atreia baze a unui codon a prezentat de asemenea avantaje se-lective minimalizînd consecinfele erorilor.

În cadrul interacfiunii codon-an'ticodon (fig. 4l) interac-lioneazà mai întîi nucleotid,a capàtul,ui 5' al codonului cu nu-cleotida capétului 3' al anticodonulrui. În al doilea rînd inter-aclioneazà nucleotidele plasate la mijlocul codo'nului qi antico-donului. Dupà Criok, se admite cà, odatà împerecheate primeled'ouà baze, cea de-a treia bazà, din codon Ei anticodon prezintào oarecare oscilalie în împerechere. Astfe1 baza purinicà ino-szrzo (I) car€ prezintà proprietàli strueturale asemànàtoane gua-ninei se aflà în unii anticodoni qi se poate împerechea în modnormal cu citozfura (C) din codonul ARNrn. Cînd însà I ocupàpozilia a treia in anticodon ea se poate împerechea cu U sau cuA aflate în pozifia a treia în codonul ARNrn. Asemenea împe-recheri de baze se numesc perechi de boze oscil.onte (wobbl,e).O moieculà de ARNú ce ar€ ataEatà serina qi avînd anticodonul

L26

3'-AGf-5' va interacgiona cu codourii ARNm pentru serinàUCC, UCU, qi UCA. Tot astfel U plasat în pozifia a treia înanticodon se poate împerechea atît cu A cît gi cu G plasali înpozilia a treia în eodonul ARNrz.

Regulile,,wobbler pentru împerecherea codon-anticodonatestà existenfa a numai 54 anúicodoni care sà se împerechgzecu 61 codoni deoarece baza A nu se aflà miciodatà în primapozitie a anticodonilor. Absenfa lui A din prima pozifie a tu-tur,or an,ticodonilor cunoscufi se crede cà este rezul,tatul acfiuniidezsrninazei anticodonale care schimbà adenina la hipoxan'tinà,antiaodonii care încep cu inozina (I) fiind caracteristici amino-acizilor care sînt codificafi de mai mult de doi codoni aqa cumeste valina (Jukes, 1977). Absenla unui antioodon IAA penúrufemilalaninà se explicà prin elúminarea sa din cauza letaiitàliicàci s-ar putea ,,împerechea greqit( cu UUA (teucinà) qi cu atfioodoni ce specificà cu totul,a$i aminoacizi. Jukes apreciazà càmai curînd dezaminarea anticodonukri gi nu ,,oscilarea( explicàde ce nu se întîlnesc 61 tipuri de ARNú.

Unii anticodoni din moleculele ARNú confin baze modificateîn pozifia I, altele decît hipoxantina. Asemenea modificàri mà-rese oscilarea codon-anticodon fàrà insa a genera ambiguitateîn îurcorporarea amilroacizilor în timpul sin'tezei polipeptidice.

Eaolugia cod,ului. Universalitatea codul'tri genetic la organis-mele acttrale este un indiciu pe de o parte a vechimii sale, iarpe de alta cà e} a ràmas, neschimbat în cursul evolugiei. S-auemis douà ipoteze cane ar explica aceste aspecte: ipoteza ste-r*shimicà gi ipoteza accidentul,ui înghefat.

Ipoteza stereoelti.micd admite existenfa unei relafli stericedintre codon, respeetiv anticodon qi arninoacidul specificat.Stebilitatea evolutivà a codului ca gi struetura sa au derivatdin stereochimia preordonatà a elementelor saùe.

Ipotem accidenhúui înghefat admite cà structura coduluigenetic a evoluat prin hazard dar, din momentul în care în ce-lula ancestralà comunà ,tuturor formelor prezente actuale aufost stabilite relaliile exacte de codificar,e, acestea au devenitvitale, încît o evolufi.e ulterioarà a codului a devenit imposi-bilà. Orice mutalie în relafiile de codificare a devenit letatàpentru individul biologic l,a care ac€asta a apànrt.

Prima ipotezà nu es'te probatà de experienlele în care ala-nina ataqa,tà la ARNú pentru cisteinà a fost inclusà în catenapol,ipeptidicà în locul cistein,ei. Aceasta aratà cà aminoaeidul nueste ,,vànat( de codonul din ARNrn în etapa de asamblare apolipeptidutui. Sînt date care araúà cà aminòacidul'nu este re-

721

cunoscut de càtre anticodon în etapa de activare a amrnoacidu-lui. Este însà foarte prdbabil ca asemenea nelafii stereochimicesà fi fost de mare importanfà în etapa timpurie ,a istoriei vieliiînainte chiar de apari\ía aminmcil-ARNt sinbetazelor, ca,re auînaltà specificitate ca Ei înainte de aparifia însàgi a adaptoruluiARNú. Sinteza proteinicà 1a început, dupà Crick qi Woese a fostun pnoces imprecis, desfàgurat cu un grad scà2t de speeifici-tate funclionalà, în proteinele protoorganismelor putînd intraoricare dintre amin,oacizii unui gnrp care sirr-t similari struc-tural. De exemplu, unul qi aoelaEi codon ar fi putut specificaalanina qi glicina, ,al'tul treonina qi serina. În oodonii tripleliambigui primitivi numai primele douà nucleotide participa înrealitate în procesui, de recunoaqtere. Ulterior, cea de a tneiaurueleotidà a fost inclusà în procesul de recunoajqtere deqi la unnivel mai scàzut de specificitate decît cea admisà prin ipotezaoscilàrii.

Ipoteza accidentului înghefat este pe de o parte dificil derespins Ei pe de altà parte gr,eu de sprijinit cu date actuale.

4. BTOSINTEZA PROTEINICA.

Proteinele joacà un rol cheie în meta,bolismul ceiular. În-sàqi func{ia materialul,ui ereditar este condifionatà de funcfio-narea proteinelor cu rol enzim'atic sau structural. Enrzimeleparticipà la replicarqea ADN gi ARN, la transcrierea geneticaetc. Proteinele structurale intrà în structura cromatinei, încomponenla membranelor, a altor componente oelulare qi par-ticipà la asamblarea însàgi a ribozomilor. Toate r,eacliile chi-mice din celulà sînú cartalizate de regulà cle ,enzime. Enzimele

- proteine tipice -

participà în însàqi sinteza proteinicà. Ast-fel, cîteva sute de molecule de diferite proteine sînt necesarepentru sinteza unui sin,gur lan! polipeptidic. Este o reînnoitàpovarà pentru celulà sà sintetizeze o catenà polipeptidicà, darea este cerutà de o traducere exactà a mesajului genetic.

Proteinele sînt polimeri de aminoacizi.Toli aminoacizii, cu exceplia prolinei, au o structurà de

bazi comunà, prezentînd un radical R, o grupare COOH Ei ogrupare NHz. Prolina are doar gruparea COOH Ei un atom de Ninclus in radical. Unii arninoacizi sînt b,azici (iizina, arginina qihistidina). Lizina poartà un rest NHz în cadrul radicalului.

L2B

Acest rest are tendinfa de a accepta protoni devenind -NHt.Alfi aminoacizi sînt acizi purtînd la nivelul radiea'lului resturiCOOH care au tendinla de a pierde protoni. Existà Ei amin,o-acizi aromatici care prezintà inele nesaturate de carbon în ra-dicaiii lor. Doi aminoacizi poartà un atom de sulf în radical(cisteina, metionin,a).

Legarea aminoacizil'or între ei (polimerizarea) se face înurma inter,acliunii grupu,lui a-NH2 al, unui a,tninoiacid cu gru-pui a-COOH al celui de-al doilea aminoacid cu elirberarea unei

OHilt

molecule d,e apà. Se formeazà, o legàturà peptidicà A-C-N-.Prin polimerizarea aminoacizil'or rezultà o ca,tenà polipeptidicàcare are un schelet de N qi C sub formà de zig-zag analog schele-tului glucido-fosforic al catenei polinucleotidice cu radicalii Rproiectafi în afarà într-o manierà alternativa.

Distribuirea liniarà a aminoacizilor în caúena polipeptidicàreprezintà stu:uotura primarà a potrifptídei oonsideratà. fn a,nu-mite condilii fiziologice, de temperaturà sau de pH ,Er€ iocinteracfiunea diferililor aminoacizi din catena polipepticlicàprin intermediul unor punti de H, al, unor legàhrri bisulfidice(S-S) clucînd la configuralii spafiale bi- sau tridirnensi,o-naie. Prin punîi de hidrogen dintre aminoacizi vecini rezultào structurà secundarà regulatà numità aonfigura{ia u-helix, aicàrei modei a fost elaiborat pentru prima datà de càtre 1,. Pau-.Iing înainte de 1940.

Proteinele pot fi alcàtuite dintr-o singurà catenà polipepti-clicà (mioglo,bina, histonetre, ADN-polimeraza etc.) sau din 2, 3sau n catene polipeptidice în care caz ele prezintà o str"ncturàcuaternarà. Astfel, hemoglobina ,este alcàtuità din patru catenepolipeptidice separate numite globine, douà catene cú Ei douàcate'ne B, rasociate într-un mod complex. ARN polimeraza de E.coli este o proteinà oligomericà alcàtuità din 6 subunitàli poli-peplidice.

4.1. DESFASURATiEA pnocnsur,ur DE BrosrnrnzÀI'ROTEINICA

Ribozomii joacà un rol esen!Íal în ibiosin't'ez.a proieinicà, adi-cà în decodificarea informafiei genetice. Ei condili'oneazà in-teracfiunea speciflcà, codon-onticodun, fapt evidenliat prin eln-

$ - Dr:;cifrind tainele ereditatii, vol. I 129

perient€ în care s-a urmàrit ac{iunea streptomicinei. S-a con-statat cà acest antibiotic poate altera procesul de decoriilicarea ARNnr. Streptomicina reduce de trei ori rata de încolpcrarea fenilalaninei în polifenÍi'alaninà cînd se folosegte un sistemacelular de sintezà proteinicà în care în calitate cle AIìirTr:i. est'eutilizat poli-U. Reducerea ratei de încorporare rr fenilai.anineieste însà înso{ità de încorporarea leucinei (CLTTJ), izoleucinei(AUU), tirozin,ei (UAU) qi serinei (UCU). Con:luzia e.ste cà pre-zenfa streptomicinei permite altor tipuri de ARNú, altele decîtARNú legitim pentru fenilalaninà sàr ràspundà Ia codonii tlUUîn traduc€rea ARNm poli-U. Citirea greqità a codului geneticeste determinatà de interacliunea streptomicinei cu ribozomiidin am,esúecul d.e re,ac{ie a sistemului acelular de sintezà pro-teinicà. Situl de acliune al streptomicinei este subunitatea ribo-zomalà 30 S, fapt dovedit de experiente de asamblare a parti-culelor ri'bozomale din subunitàîi 30 S de la tipul mutant rezistent la streptomicinà gi subr.rrnitàti 50 S de Ia tipul nornnalsensirbil. Asemenea ribozomi sub acfiunea streptomicinei nucondifioneazà o citire greqità a mesagerului genetic. Nomura aefectuat experienfe de disociere a subunitàtilor 30 S extrasede Ia bacterii rezistente qi de la ,bacúerii sensi'bile la strepto-miein^à qi a separat proteinele ribozomale din aceastà subuni-tate (21 proteine ribozomale S) prin eL,ectroforezà,. Dupa 6ceeaa reconstituit suibunitati rirbozomale 30 S prin amestecarea devariate combinafii ale celor 2L de proteine ribozomale S cu mo-lecule de ARNr 16 S. Subunità{ile 30 S reconsti,tuite au fostamestecate cu subunitàîi 50 S gi au rezultat ribozomi care aufost folosifi în sisteme acelulare de sintezà proteinicà. Nomuraa constatat cà sensibilitaúea sau rezistenla ribozomilor recon-stituili la citirea greqità indusa de streptomicinà a mesajuluigenetic confinut de ARNnz depinde în întrqgime de faptul dacào singurà proteinà ribozomalà S, qi anume proteina ribozomalàS12, derivà de Ia subunitàti 30 S a'le rbacteriilor streptomicino-sensi'bile sau streptomicino nezistente. La formele sensi,bile iastreptomicinà, acest antitbiotic se combinà cu douà situri dinARNr 16 S blocînd sinteza proteinicà. Tulpinele rbacteriea-re re-zistente la streptomicinà au proteina Srz modificatà, ceea ceface sà fie ascunse cele douà situri de legare a streptomicinei.Dovada, suplimentarà cà proteina ribozomalà S12 participà înprocesul de recunoaqtere codon-anticodon a fost adusà de con-statarea cà unii supresorÍ nonsens care sînt eficienfi ]a tipulsàlbatic, normal streptomicino-sensitbil sînt ineficien{i la mu-tan$ii streptomicino-rezistenfi. Secven]ier'ea aminoacizilor pro-

130

teinei ri'bozomale Srz a evidenliat faptul cà la tiput str,epto-micino-rezistent apar substítufii de a,minoacizi în pozifiile 42sau 87. Iatà deci cà o simpla substitutrie de aminoacizi în oa-tena polipeptidicà Srz interferà cu fidelitatea cu car€ oodoniiARNm sînt împerecheafi cu anticodonii ARNú în procesul de-oodificàrii mesajului genetic. Desfàqurarea procesului de bio-sintezà proúeinicà presupune inifierea, alungirea qi terminareacatenei ca qi în cazul sintezei polinucleotidelor

4.I.I. INITIEREA CATENEI POLIPEPTIDICE

Catena polipeptidicà ,este sintetizatà treptat înoepînd cu unarnin,oacid N-terminal qi terminùrd cu un aminoacid C-termi-nal. ARNrr, care poartA mesa{ul peurtru sinteza unei catene po-lipeptidice qi care deci dicteaza secventa de aminoacin a aces-teia este citit stadial de càtre aparatul de sinúezà protefuricà,cîte un codon la fiecare moment, începî:rd de la capà,tul 5' sprecapàtul 3', fiecare oodon fiind r€cunoscu,t de catre antioodonulcor,espunzàtot din ARNú, aoesta din urmà purtînd un aminoacidcorespunzàlot codonului dfut ARNm. Zamecnik gi Hoaglancl auajuns la concluzia cà prima etapà în biosin,tez,a proteinicà esteactivarea aminoacizilor cu ATP catalizatà de càtre enzime orni-noaeilsinúetnze specifiee fiecàrui aminoacid. Ac,este enzime aufost descoperite de càtre Paul Berg de l,a Standford University.Ele se mai numesc amino-orcil-ARNú-sizúefuze qi reprezintà fac-torii celulari care ,,cunoscc eodul genetic, deqi însàgi secvenlalor Ce aminoacizi este codificatà în ADN.

Aminoacizii nu se ataqeazà direct la matrileùe ARNmciprininterrnediul ARNú care repr,ezintà o moleanld adaptmre de ra-cordare specificà, recunoaqterea oodon-anúicodon avînd loc peprincipiul împerecherii de baze complementare cu f,ormare depunli temporar,e de hidrogen. AtaEarea aminoacidului la adap-tor ,este catalizatà de enzima amirwacilsintetozd care foloseEtee'nergia rezultatà prin hidroliza ATP. Enzima se ataEeazà tragruparea lateralà a aminoacidului (fiecare aminoacid are en-zima sa specificà de activare) Ei Ia molecula adaptorului (buclaa patra a dihidrouracilului). Aminoacidul, (AA) se combinà laînceput cu ATP. Înúre fosfatul din AMP qi grupul carbonil alaminoacidului se realizeazà. o legàturà (-P-O-C-) sta,bilà,rezultÌnd produsul intermediar AA "., AMP. Acesta se leagàferm de enzima activatoare pînà ee se întîlneEte cu o moleculà

131

de ARNú specificà, corespunzàtoare amirroacidului re-cpectiv.Între riboza adenozinei terminale a gruparii CCA de la capàtuÌ3' a,l ARNú gi gruparea canboxilicà a aminoacidului se stabileîte

- sub cataliza aceleiaqi enzime aminoacilsintetaza - o legàturàcovaltentà, macr@rglcà. Energia pusà 1a dispozilia acestei legà-turi de càtre ATP va fi folosità în formarea legàturii pepti-dice.

Evenimentele de activare a aminoacidului pot fi astfel re-prezentate:

r AAl +ATPaminoacilsintetaza (AA, - AIIP)Er*@-@.

II (AA, - AMP)+ARlrll aminoacilsintetaza AAr - ARNtr+ AMP.

Legatura AA - ARNú de tip (-C-O-C-) se stabileqteîntre riboza acidului aderrilic terminal aI, grupàrii CCA-3' gigrupul carbonil al aminoacidului. Iatà de ce aminoacidul nutrebuie sà ajungà niciodatà pe matrifa ARNm. El trelbuie numaisà se ataqeze corect la un ARNú corespunzàtor l,ui. Dacà areloc ata$area gregità a unui aminoacid la un ARNú care nu îieste specific (de exemplu prolina se atageazà la ARNf peurtrufenilalaninà) intervine ARNú sintetazn pentru fenilalaninà careface ca prin hidrolizà prolina sa fie eliminatà. AmÍnoacil-ARNtsintetrc,a este la rîndul sàu recunoseutà (sau recunoagte) bucladihidrouracil a ARNú, care este diferità la diferitele tipuri deARNf de unde qi explica{ia specificitàfii arninmxil-ARNf-sin-tetozd-ARNú.

Degi exista mai multe tipuri de ARNú pentru un acelaEiaminoacid, din cîte se cunoaqte pîlrà acum exista doar o sin-gurà aminoa,cit-ARNú sintetvzd pentru fiecare aminoacid.

Aminoacilarea ARNú catalúzatà de aceste enzime trebuie sàfie controlatà cu extraordinara precizie càci o încàrcar',e gre-$ità a unui ARNú eu un aminoacid necorespunzator lui areaceeaqi valoare ca mutafia, fiind inserat tn catena polipeptidicàln creqtere un aminoacid gregit (Sdrimmel, 1979). A devenitastfel clar cà ARNú este implicat în reglarea expresiei genicecàci concentrafia de aminoacil-ARNú serveqte ca semnal, pen-tru intrarea sau scoaterea din funcliune a diferitelor gene, in-tervenind în tnanscrierea genicà la un sit dintre promotor giprima genà siructuralà (vezi reglajul genetic). Deoarece sinte-

732

taeele eatalízeazà aminoacilarea ARNf ele sînt direct sau in-direct irnplicate în reglarea expresiei anumitor gene.

Ataqarea unui aminoacid la ARNf specific este evenimentulîn cursul càruia informalia din acidul nucleic este confruntatàcu aminoacidui pentru prima datà.

Froblema recunoaqterii aminoacid-ARNú este încà departede a fi clarifîcatà. Ea este însà extrem de precisà cle vreme ceschimbarea numai a unei baze azotate din secvenla ARNú afec-tcazà proprietàlile de recunoagtere ale acestuia.

Bucla GTìI'CG a ARNú se împerecheazà prin baze cu o -sec-ventà complementarà din ARNr 5 S qi aceasta pare a fi regiu-nea responsabilà pentru ataEarea la ribozom a ARNú încàrcertcu aminoacidul activat. Lungimea constantà de I'a capàtul

-CCA 3' al ARNú la bucla opusà a frunzei de trifoi se presu-

pune a fi în legàturà cu pozi$ionarea corectà a aminoacizilor învederea formàrii punlilor peptidice.

A treia etapd în inilierea sintezei pr.oteinice se desfàEoaràpe ribozom. Acesta are suprafefe specifice de legare stereo-ctrimicà corespunzàtoare a ARNm, a AA-ARNf gi a lanfuluipolipeptidic în creqtere. Rirbozomul asigurà de a$a mani,eràasocierea acestor elemente astfel încît anticodonul sà poatàrecunoagte codonul corespunzàtor ducînd astfel la o corectàdescifrqre a mesa$ului genetic. Nu se Etie exact care din com-ponentele ribozomale (proteine ribozomaie sau ARNr) îndepli-neqte rolul esenfia'l în înlesnirea apoziliei corecte a ARNnz gia ARNú, dar recent s-a stabilit cà proteina ri,bozomalà con-tractilà 51 are capacitatea de a determina deplierea ARNn invederea interacfiunii sale cu rirbozomii, legînd apoi ARNnr lasubunitatea 30 S (Blumenthal Ei Carmichtetr, 1979). Ea se leagàln ribozom la capàtul 3' al ARNr 16 S, dar în ribozomi activiea se aflà la un sit diferit. Avînd o greutate molecularà micà(70.000 daltoni) se admite cà proteina 51 func{ioneazà, în con-formalie alungità.

Descifrarea mesajuiui genetic determinà traducerea sa în-tr-o secven!à de aminoacizi asambla{i într-o cat,enà pol,ipepti-dicà. Înainùe de a începe sinteza polipeptidului riibozomul sedisociazà în subunitàlile sale sub aefiunea factorului de inifi,erefF.1. ln cadrul formàrii complexului'de ini{iere ARNrn se leagàde subunitatea ribozomalà 30 S prin secvenfa sa Leader carenu este tradusà. Apoi are loc asamblarea particulei ribozornalefunclionale prin atagarea subunitàlii ribozomale mari 50 S.

Aminoacil-ARNú se asociazà cu subunitat,ea 50 S a ribozo-mului. Subunitatea 50 S are douà situri: unul a fost desemnat

133

situl amirwacil (A) qi în el pàtrunde aminoacil-ARNf corespun-zàtor codonului din ARNm recunoscut, prin anticodonul dinARNú qi al doilea sit a fost des,emnat situl peptidil (P) aare ac-ceptà moleculele de ARNú numai dacà au trecut prin situlaminoacil, (complexul aminoacil-ARNú trecut prin situl' A su-ferà probabil modificàri conformalionale care permit accepta-rea sa in situl P). Ini{i'er,e,a propriu-zisà a catenef lpolipeptidiceare loc atunci cînd situl A aL unui ribozom expune reacliei derecunoagtere codon-anticodon acel codon de inifiere AUG dinARNrn. Acest codon de iniliere corespunde primului .amino-acid din catena polipeptidicà. Sitlrl A este ocupat în iniliere deun ARNt pen,tru formilmetioninà la pr.ocari,ote sau metioninà1,€r €ucariote, care prirn anitioodonui sàu 3' UAC 5' recunoaqtecodonul iniliator 5' AUG 3' din ARNrzr.. Acest ARNI are ata-Eat aminoacidul formilmetioninà respectiv metioninà. Dupà re-cunoasterea codon-anticodon, ARNú care are ataqat primulaminoaci.d al catenei potipeptidice se deplaseazà În sittll P,miEcare realizatà prin înaintarea ARNrn prin ri,bozom sau in-.rer:., prin înaintarba ri,bozomului pe ARNm (miqoare de trans-la!ie), ceea ce face ca situl aminoacil, sà vinà în dreptul urmà-torului codon din ARNrn. Se înlelege cà miEcarea de translafiese face de fiecare datà pe o distan!à ce corespunde la un codon.

Toate catenele polipeptidice înoep cu aminoacidul metioninà.La procariote toate catenele polipeptidice incep cu N-formil-metionins, car€ este astfei un aminoacid ,blocat de grupul for-mit. Dupà sinteza pofipeptidei, grupare,a forrmil poa'te fi elimi-natà. Metionina .este specifica,tà de codonul 5'-AUG-3' dinARNzzz, recunoscut de anticodonuL din ARNt'er si acest{ftxr1met este un ARNf de inilier,e.

Principiui citirii codonului de càtre anticodon est'e urmàto-rul: dacà un codon din ARNrn este 5'-UUG-3' el va fi recu-noscut de càtre un, anticodon din ARNú scris în dir,ec{ira inver-sà adicà 3'-AAC_.5'.

Atît metionina cît qi formilmetionina au ca anticodon 5'-CAU-3'care se va împerechea cu codonul 5'-AUG-3'qiacest oodon AUG reprezintà codon de ini{iere. Deqi codonulAUG poate fi localizat Ei în interiorul monocatenei ARNm,ARNf de iniliere (iARNt'"') are afinitate rr-umai pentru codonulAUG localizat la capàtul monocatenei ARNm, sau acest codonde inifiere este clispus pe un segment din ARNTa a). o structuràsecundarà proeminentà de tip buclà (lwirpin)"

În cadrul inilierii (fig. 42) evenimentele se deruleazà. astfel:o subunitate ribozomaià micà imteraclioneazà cu un codon ds

134

lormor€o complcrufuicle inilicrt

ilctori dc initìtfe ARNmARNtr-md) '

@

tronslocotioARNÍ'm't î; situt

pcptidil ínsotitó ordeplosorro r'r5oro-mutui AFNm

Jsit omhoocil

t go?co ARNi'u #corc vineîn iitut l\

-

(blori dcchngotic)

oFig. a2. Schema sintezei proteinice. Decodificarea mesajului genetic începe eucítirea codoaului de iniliere.{.UG de cAhe ARNf'-tt Si se terminà cu codonul determinare UAA. Codonul AUG în mod obignuit nu este plasat exact la capAtul5' al ARNmr ci el este precedat de un rrurrAr de alte nucleotide, dar el ocupà opozilie specifica pe cateua ARNzr putînd fi recunoscut. Tot astfel codonultenniuator UAA nu este îu mod obligatoríu ultimul codon din macromoleculaAR.Nza. TJneori aceeagi moleculà ARNz posedà mai mulli codoni de iniliere gicodoni terminatori condifionînd sinteza mai multot catene polipeptidice. În cazul

ologoco subunitòtiì

135

r la€oreo fiotaculc;

aRnrtFt" "firl

A*

tronscriereo ARNte--.--_.--.-----.ce conline pcptidotq sttui P

continuorco etop?loî

grecedentc pcntru f iccorecodon ARNm Pînó cc tstaotins codonul tcrmrnoîor(UAA, UAG, UGA)

tlr

@,iuf.met

5ffi f"

ARì{rz care specificà prote'ruele triptofansintetazei la E. coli, codonul de terml-nare, peglnl gena trp B cstc pattial folosit drept codon de inifiere pentru gena

trp A (UGAUG). Transferarea aminoacil-ARN, din situl A în situl P este însofltlde s schimbarea conformatiei spafiale a moleculei sale (dupà Strickberger, lg70).

ini{iere AUG qi cu un iARNt*et, caîe poartà deci metionina. Se

formeazà u,n complex metioni,I-t-ARNfo AtlG numit compler,de ini[iere: Formar,ea oompJexului de initiere implicà interven-fra a trei factori proteinici de inifi,ere care au fost desemnafiIFL, IF2 gi 1F3. Rolul exact al acestor fac"tori nu este cunoscut.IF3 împiedicà asocierea subu,nitàfiùor ribozomale 30 S qi 50 S,cînd ribozomul nu este angajat în sinteza proteinicà. Bner,gia ne-

136

dlsoctcr?o+rìbolomutra

etiberoisocoteF€'r oolixDddrce

I.>I\,

tCu

t lr|cl

Itîtb"

t.incr

o

c€sarà în inifiere este eliberatà prin hidroliza u,nei molecule deGTP car,e este qi ea considera,tà facùor de ini{iere aúunci cînd seleagà la fmet-ARNú fàrà a fi hidrolizat. Complexul de inifierese asociazà apoi cu o subunitate ri,bozomalà mare (reac{ie carenecesità potasiu), rezultînd ribozomul funcgional (70 S la pro-cariote qi B0 S la eucarioùe). Din asocierea ARNr-ARNrn sedelimiteazà în subunitatea mare a ribozomului douà situriominoacil (A) Ei peptidil (P). În momentul asam;blàrii particuieiribozomale funcfionale ARNm este relinut într-o adîncituràrezultatà din pozilia ceLor douà subunitàli rirbozomale. ARNmexpune în situl A codonul iniliator AUG oare va permite pà-trr:rrderea în aeest sit a ARNú inifiator JMet - ARNtt^"t. IFzaclioneazà apoi ca translocozd. care ca'talizeazà translocafia fmet

O**1tmet Ei regiunea corespunzàtoare codonului AUG dinARNnz din situl A în situl P. Reacfia necesità energie eliberatàdin hidr'oliza GTP. Translocarea elibereazà situl A care va pU-tea agc€p1s alt AA - ARNú corespunzàtor noului codon dinARNrn. Astfel, ARNú funclioneazà nu numai ca un càràug deaminoacizi la ribozomi dar Ei ca mol'eculà adapùoare care sec-venliazà aminoaeizii în catena polipeptidicà potrivit instmc-fiunilor date de ARNnz.

4.7.2. ALU N GINEA CATEN EI POLIPEPTIDICE

De îndatà ce a avut loc ini{ierea ca,úenei polipeptidice prinalinierea codonului iniliator AUG cu antioodonul metionil -iARNún''"' gi formarea unei particule rib,ozomale complete, acti-và în sinteza proùeinicà, situi P al ribozomului este ocupat deiARNúmeriar situl A este liber sà primeascà al doilea aminoacil

ARNú cor€spunzàbor celui de-al d,oilea codon din ARNm.Palticula ribozomalà se deplaseazà pe monocatena ARNm, careîgi expune astfel succesiv codonii spre a fi r'ecunoscu{i de anti-codonul diferi{ilor ARNú. Legarea aminoacit-ARNf la situl Aeste catalízatà de un factor proteinic ? care foloseqte de ase-menea energia eliberatà de GTP.

La nivelul sitului P, grupul, a-COOH pàràseqúe legàturacu ARNú qi formeazà o legàturà peptidicà cu grupul a,-NH2al aminoacidului legat de ARNú intnaú în situl A. îrecereaaminoacidului de la legàtura cu ARNú la legàtura peptidicà serealize'azà, prin intervenfia enzimet, peptidiltrmsfemzd, legatà

137

de subunitatea mare a ribozomului. Form'area legàturii pepti-dice este catalizatà de enzima peptidilplimnrazd, sau amino-acid-polim.erazd. localizatà pe subunitatea mare a ribozomului,Se formeazà un dipepticl, iar ARNf din situl P ràmîne fàràaminoacid Ei pàràsegte ribozomul, al doilea ARNú purtînd d,oiaminoacizi unili printr-o legàturà peptidicà (un rest dipeptid)trece din situl A qi intrà în situl P. Aceastà trecere din situl Aîn situi P, condifionatà de formarea legàturii peptidice a ARNúse numeEte úronslocaf,ie (fie. a2). Ea 'este m'ediatà de un factorproúeinic numit G a càrui acfiune este dependentà de 'energiaeliberatà prin hidroliza GTP, ca gi de o notaibilà modificareconformalionalà a structurii rib,ozomului. Totodatà ri,bozomulse deplaseazà pe ARNrn pe o distan{à echivalentà cu un co-don. Noul codon va ajunge la nivelul sitului A, unde va pà-trunde un nou aminoacil - ARNf cu un anticodon corespun-zitor. Pe màsurà ce ribozomul se miEcà în direclia 5'-+3',de-a lungul catenei ARNrn'are loc alungirea catenei polipepti-dice qi totodatà descifrarea mesajului genetic din ARNm. Cercetàrile lui Fritz Lipmann au aràtat cà în procesul de asam-blare a aminoacizilor intervin trei tipuri diferite de proteinecare s-au numit fo,ctori de elongofie gi au fost desemnafiEF-'Lu, EF-?" qi EF-G. Acegtia sînt compon,ente structuraleale ri,bozomului qi se ataEeazà la particula ribozomalà maturàdoar în faza de funcfionare a aoesteia în asamblanea aminoaci-zilor in catena polipeptidicà.

La E. coli, EF-T, Ei ET-T, reprezintà 50/o din proteinasolubilà Ei participà în transferul aminoacil-ARNt La situlaminoacil al ribozomului. Factorul EF_?, faciliteazà 'forma-rea unui complex dintre f,acúorul EF-T", aminoacil-ARNú qiGTP. Ribozomul care poartà un peptidil-ARN't, în situl sàu Pacceptà acest complex la situl sàu a,minoacil. Cînd are loc for-marea ì.egàturii peptidice EF-T" este eliber,at iar GTP estehidrolizat spre a da GDP qi fosfat cu ,eliberare de energie. Fac-torul EF-G participà in tr,,anslocarea (miqcarea d.e transla{ie) aARN'm pe ribozom spre a fi expus urmàúorul aodon in situl A.Transl,ocarea implicà consum de enrergie derivatà din hidrolizaunei molecule de GTP în GDP Si P. Elongarea însàqi a eate-nei polipeptidice nu necesiúà energia eliberatà prin hidrolizaGTP, de'oar,ece energia liberà înmagazinatà în legàtura amino-acil-ARNf este suficient de mane spre a conduce la formareapuntii peptidice.

GTP acfioneazà agadarnare cu proteina EF-T"

138

ca urì factor alosteric a càrui combi-determinà o modÍficare conforma-

lionalà a factorului EF-T, care permite amino-actl-ARNú sàse lege I'a situl ribozomal cerespunzàtor. Dupà e}ongarea cate-nei polipeptidice nàscînde, GTP este hidrolizat fàcînd caEF-T" sà revinà la conformafia inilia1à qi sà se desprindà depe ribozom.

Iatà reacfiil'e în care factorii de elongalie sînt implica{i înalungirea catenei polipeptidice (Blumenthal gi Carmichael,1e7e):

EF - T,, . GTP I aaAF.N, s EF' - Tn . aaARNr' GTP

EF - Tu . aaARN, . GTP f ribozom 5 ribozom . aaARN, *+EF-T,,.GDP+PP

EF - To . GDP + EF - T, $EF - Tu . T" -f GDP

EF - T. . T. + GTP rsEF - T"' GTP + EF - T".

Viteza de polimerizare a aminoacizilor este de 15 amino-aclzi pe secundà. Dupà ce un ri;bozom a tradus aproximativ25 codoni capàtul 5' al ARNrn devine liber spr€ a forma unal doilea complex de inifiere qi un al doilea ribozom începemiqcarea de-a lungul catenei ARNnz, determinînd siurúeza uneia doua catene polipeptidice, apoi un al treilea, al patrulea ri-bozom q.a.m.d

Prin ataEarea mai multor ribozomi la catena ARNm rgzultào structurà numità poliribuotu Structura poliriibozomalà con-dilioneazà sintez.a simultanà a numeroase ca'terne poUpeptidicecare au dirnensiuni diferite la un moment dat, în funcfie dedistanfa pe care fiecare ribozom a parcurc+ de la capàtul 5'spre capàtul 3' al. catenei ARNm.

La procariote transerierca (sinteza ARNnt) gi traducerea me-sajului (sinteza proteinicà) au loc simultan, Ei înainte ca sà seùermine sinteza AIlNrn, capàtul sàu 5' devine asociat cu ribozo-mul spre a forma un compler dc i,nifiere (fig. 42b).

La euoariote transcrierea are troc în nucleu iar tr'aducereaîn citoplasmà unde se aflà ribozomii. Existà o specificiúate aactivitàlii ribozomilor în sinteza proteinicà care ar reprezentao modalitate de reglare a activitàfii genelor la nivelul tradu-cerii. Astfel, în sistemele de sintezà proúeinicà in uitro (ace-iularà) se consta,tà eà ribozomii izolali din oelulele interfazicesînt mai activi decît cei izolali din celule aflate în diviziune.În c,elulele hepatice, ribozomii ataqafi la reticulul endoplasmic

139

s€rvesc pentru sinúeza proteineloor serice pe cînd cei liberi ser-vesc la sinteza proteinelor hepatice specifice neserice.

Alurgirea catenei polipeptidiee poate fi schematizatà astfelr

AA1 - ARlill * AA, - ARNú'# AA1 - AA2 -- GTP- ARNI2 + ARI{lr.

Atagarea ribozomilor la monocatena ARNrn facilit eazà, piis-trarea structurii liniare, monocaterrar,e a ARNnz, favora,bilaunei citiri corecte a mesajului, unei decodificàri corespunzà-toare. Îrr'- cazul în care pe parcursul catenei ARNnr apar re-giuni dublu-catenare ribozomii le desfac spre a permite ocorectà selecfionare a AA^,i.{RNú.

Lungimea moleculelor ARNnz este heterogenà, depinzînd drmàrimea mesajului genetic purtat. Ia E. coli màrimea medie aARNrn este de 900-1500 nucleotide purtînd un mesaj cìar€corespurì.de la catene polipeptidice de 300-500 aminoacizi.

În sinteza histidinei intervin 10 enzime. Aoestea sînt sin-tetizate sub directia unui mesaj purtat de o singurà molecullde ARNnz.

4.L,3, TERMIN AREA CATENET POLIPEPT IDICE

Cînd ribozomul în deplasarea sa pe ARNnz întîlneEte în sl-tui A un codon terminator la care nu mai ràspunde nici un tipde aminoacil-ARNú are loc înrcerúamea sirutezei caùenei polipep-tidice càci un asemenea oodon nu este neclu'r.oscut de niei unanticodon ARNf, prezenfa sa în situl A aI ribozomului blocîndadàugarea oricàrui alrt aminoacid la caùena poiipepti,dicà. Codo-nii UAA, UGA Ei UAG sînt codoni terminntori. Un,eori existànu un singur codon terminator ci doi cod,oni termin,atori suc-cesivi spre a asigura cà sinteza catenei polipepti'dice se ter-minà în punctul corespunzàtor. Terminarea catenei polipepti-dice este un proces activ qi nu se datoreqte simplulul fapt càun codon nu poate fi citit. Codonii terminator:i (sfop sau non-sens) spre deosebire de codonii sens care sînt citili (necunoscufi)de diferitele tipuri de ARNú sînt recunoscufi de càtre factoriproteinici numili Ei factori de eliberare. Semna1ele de terminarerepnezentate de cei trei codoni terminatori (nonsens) sînt recu-

140

noscute de trei factori proteinici (enzimatici) de termfurar,e(ÎF-&, TF-Rz Fi TF-R1). TF-.R1 r€cunoagùe codonii UAAqi UAG, TF-R2 recunoa$te codonii UAA qi UGA. CodonulUAA (ocru) se pare cà este cel mai eficient codon terminator,pe cînd UAG (arnber\ Ei UGA (opal : qzuy) ar reprezenta sem-nale accesorii care sà asigure cà terminanea nu equeazà. UAAgi UAG asigurà terminarea eficientà a traducerii la bacterii înpropor{ie de 1000/o.UGA este rareori mai eficient de 980/0, iarla codonii terminatori ,,leakys sla,bi, adicA un terminatoraparent gregit citit ca un codon ce specificà um amfuroacid, efi-,cien{a terminàrii esúe scazutà dar semnificativà. Aceasta ducela alungirea eatmei polipeptidice dincolo de aodonul de termi-inare. Codonul terminator interacfiorneazà, cu factori proteinicicare au fost notrali cu R, creînd,u-se un compler R-codon tenni-nator-ribozom care blocheazà alungirea în aontinuare a oateneipolipepticlice. Terminarea implicà formarea ùr situl A a u'nuicomplex ce include fF-& sau TF-R2, codonul ter:rnfuratorUAA qi ribozomul. TF-RB acfioneazà atunci enzimatic ia nive-tul sitului P spre a separa grupul canboxil al a,minoacidului Cterminal de l,egàtura sa cu ARNú printr-o hidrolizà, eliberîndpeptidul. Blocarea sitului A face ca,polipeptida completà só rà-rnînà esterificatà la ARNú finat care ocupà situl P. Factorulproteinic Tî-R3 va rupe aceastà bgaturà, facînd ca sa fie eli-berafl dim ribozorn atît catena potipeptidi,cà cît qi ARNú. Tot-odatà are loc dlsocierea riibozomului în sutbuuritàtile sal,,e mare qimicà, proces mediat de factorul lF3 implicat dupa cum s-a vàzutqi în medierea formàrii compl,exului de inifiere. În prooesul deberminare a catenei polipeptidice au fost implicate qi proteineleribozomale L7 $i Lrz.

Sinteza proteinicà esùe îns'ofità de a.ga-numiúul ciclu riboza-mnt (îig. 43). Mai întîi are loc asam'blarea rirbozomului din sub-.unitàlile s'ale. Pînà în anul 1967 s-a crezut cà subunitàlile 30 Sqi 50 S ale ribozomului sînt p€rfiranr€nt cuplate spre a formaun ri,Lmzom matur 70 S dar, din acest an, s-a stabilit cà sub-unità{ile ribozomale se asociazà doar atunci cînd sînt active însinteza proteinicà. De îndatà oe a fost tradus mesajul geneticdin ARNm Si s-a terminat sinteza caúenei polipeptidice, ribo-zomul se disociazà de pe ARNnz, subunitàlile ri,bozomului seseparà Ei eie îqi iau a$i parteneri (30 Sr * 50 51 30 52 + 50 S2într-un eiclu de sintezà Ei 30 Sr * 50 52 respectiv 30 Sz + 50 Srîn urmàtorul ciciu de sintezà.

Prin experienfe de marcaj cu izotopi grei Ei radioactivi,Wlesels,on a aràtat natuna efemerà tranzientà a cuplàrii de sub-

l4',.

Q() r uet"tn,vat8r(\ir) i

l

J0 ,5,

it:

,.:17!^,-WJJ

,, --)

GLp, I ltet tRN,rl

Alt.! m

-rY*j

{ -:h^Yiiir7os, {-Èn;,H\'m \,.!./lr:';/tl,,nr,-,OnO,\j{f/

tF lu I z'-GTPEF-ts (tr'c I

,,Foqlod- sinrezo, " " i\6tp+Pde eliberore coknei -

lerminoreacotenei

poLpeptiúc: Fal,pcptidÌce

Produs prdein'rc

s ch e m a o ng o i ó r n

n il,ii i ! i "

"r,ìi!,iirt t Q t t o r ri b uo mo r e

Fig. 13. schema *ffirm:t$;;;ff3;1i,n o.r rrbozornare

unitàti rÍbozomale in constituirea de particule ribozomale ma-tune, funcfionale. În timpul inifierii ane loc legarea faetorilorde inifiere IF-l , IF-z $i IF-3 la subunitatea 30 S.

Inifierea mai nec€sità ARNú formil,metionil la ,bacterii sauARNú-metionina Ia euoariote, ARNnz asociat subunitaÉi 30 S,GTP. Aceste cCIrnpooeote alcàtuiese aSa-numitul c.omplex deinifiere. Complexul de inifiere se comrbinà cu o subunitate rirbo-zomalà 50 S spre a forma un rirbozom funcfional 70 S. Proeesuleste însotit de hidroliza unei molecule d'e GTP din care rezultàenergie avînd loc $i eliiberarea facúorilor lF. Se desfàEoaràapoi translocalia ribozomului reprezentînd deplasarea ribozo-mului de-a lungul ARNnz pe o distanfà ce oorespunde cu fie-(:are miqcane la trei nucleotide (oodon). Tnanslocalia rilboz,omu-lui este un proc.es aetiv oare nec,esità energie pusà la dispozilieprin hidroliza GTP precum qi intenvenfia unui foctor G numitfactcr de trarulonfi,e. Siturile de irrteracfiune cu G qi GTP seaflà în subunitatea ri;bozomalà mare. Pentru realizarea transtro-catiei riibozomale, ARNú deacilat (lipsit de aminoacid) trebuie

142

sà fie expulzat din situl P, peptidil,-ARNú trebuie sà se depla-seze din situl A in situtr P, iar ARNm trebuie sà se depla-seze pe subunitatea ri'bozomalà micà ast'fel, încît sà poatà ex-pune urmatorul codon în situl A. Dupà parcurgerea înfuegiimoLecule de ARNm, ribozomul se disociazà în subunitàfile sa1e.La o nouà reconstituire de particule ribozoma,le, subunitàlileribozomale se pot schimba între ele. Reciclarea necesità unfaeùor cle iniliere numit fontor de disociere ríbazomald ce men-line poiirirbozomii, inhilbà disocienea subunitàfilor ri'bozomaleînaimte d,e a fi disponiibil mesagerul, condifioneazà, intràrilecantitati'u'e a1e subunitàfilor mani în polirirbozomi, permite acu-mularea de subunitàli ribozomal,e în loe de acumulare de par-ticule ribozomal,e uniee qi este cerut de legarea ARNrn lari,bozomi.

CONCLUZII

Î,n procesul de biosintezà proùeinicà se realir.eazà, decodi-ficarea informaliei genetice.

Procesul de biosintezl proteinicà este extrem de oomplexqi implicà recunoasúeri pe bazà de complsmentariúate dintreacizii nucleici, fur care ro1, esenfial ane relafia codorr-anúicodon.

Întreg procesul de biosintez,à, proteinicà se desfàqoarà prinintervenlia unui numàr mare de alte proteine cu caracter en-zimatic sau care funclioneazà in calitate de f,actori de recu-noaqtere (inifiere, elon'gare, terminare). Este o refurnoiúà povaràpentru celulà cînd îqi sintetir,eazà o caùenà polipeptidicà, càcipentru aceasta ea pune î,n funcfiun,e un numàr incompararbilmai rnare de alte proteine.

- În celulele procariote cu ARNnz de scurtà duratà devia{à reglarea expresiei genelor apare în principal Ia nivelultranscrierii (vezi reglajul genetic).

La Eucariote cu ARNnz de duratà de via{à mai lungà, ex-presia genicà este controlatà atît la nivelul transcrierii, cît qi atraducerii. Reglarea traducerii în aoest eaz are loc in parte întimpul inifierii catsrelor polipeptidice, ceea ce explicà de cefactorii de inifiere eucariotici sînt mai numerogi qi mai com-plicafi str.uctural decîú omologii tror proeariotici (Oc}roa S. qi deHaro, 1979). Pe cînd aparatul de furifiene proeariotic oonstà di,:r2 sau 3 faetori de inifiere, cel eucariotic imphca cel putin 7

143

sau B asemenea factori. Faetorul proeariotic IF-7, care mijlo-ceqte legarea metionil-ARNú inifiaùor, constà dinrtr-o singuràcatenà polipeptidicà cu greutatea molecularà B0 000-90 000,iar factorul de recunoagtere ,a ARNnz IF-3 constà dintr-o ca-tenà polipeptidicà cu greutatea molecularà de 23 000 dal,toni.

Faetorul de ini{iere eucariotic e IF-2 este eompus din 3subunitàfi cu greutate molecularà com,binatà de 150 000 daltoni,iar /F-3 are nu mai putin de 10 subunità{i care dau o greu-tate molecularà totalà de 500 000 daltoni.

Controlul tr,aducerii la eucariote implicà interven{ia pro-teinkinaz.,elor care, atunci cînd sînt activate înhibà traducer,ea.

Se cunosc douà mecanisme majore ale oon:tr'olului tradu-cerii la eucariote. Primul controLeazà inilierea catenei poli-peptidice prin blocarea funcfionàrii factorului de ini{iere eIF-*Z, blocare care este realizatà prin fosforilarea uneia dintrecele trei subunitàli ale sale. Aceastà fosforilare este catalizatàde proteinkinaza.

Al doilea urecanism de b}ocare a traducerii implicà degra-darea ARNrn pe calea activàrii unei endonucleoze prin inter-mediul unei oligonucleotide c€ are o structurà neobiqnuità pppA 2' p 5' A 2' p 5' A. Aceastà nucleotidà este sinúetizatà dinATP sub acliunea tot a unei protein-kinnze.

Anumite oligonucleotide mici, afl,aùe în celulele eucariote,formate aparenú în urma digestiei endonucleazice a ARN ce-lular pot afecta traduoerea Ia nivelul elongafiei caùenei. EIe pot,fi implicate în tranzilia de la o stare donmantà sau liniqtità lao stare activà ca în emergenfa din criptobiozà, a artropoduluiArternia salina sau în fecundarea ovulului.

Bl'ocarea func{iei e IF-Z qi degradarea ARNnz dupà cu-nogtinlele actuale inhibà traducerea într-o manierà neselec-tivà. CercretàriLe viirtoare vor ad.uoe noi daùe asupna unor cài selective de modular€ a traducerii diferi{il,or mesageri, ca qi asu-pra rolului fosforilàrii proteinelor ribozomale qi factorilor ceintenrin în biosinteza proteinicà, allii decît e IF-z.

Recent s-a descoperit o proteinà stimulatoare a e IF-2 de-s€mnràtà ESP, car,e determinà ca e IF-2 sà formeze un complexternar cu GTP qi ARNú metioni,l inifiaúor. Aoest aomplex ter-nar se leagà la o subunitate 40 S a ribozomului eucariotic dînduraqtere la un complex de iniliere în care intrà Ei ARNrn. Înurma fosforilàrii subunitàlii mici a e /F-2 este blocatà furter-ac{iunea e IF-Z cu ESP $i astfel nu se poate forma comple-xul ternar de inifiere, fiind inhi'batà în consecintà traducerea(Ochoa Ei Haro, 1979).

144

Capitolul V

CARACÎERISTICILE ORGAI{IZARII$I FUNCTIONaRU FACTORILOR EREDTTARI

(GENETOR)

Cel care s-a oeupat pentru prÍma datà de probiema organi-zàríi gi funcfionàrii faetorilor ereditari, stabilind caracteristi-cile lor a fost Gregor Mendel, pàrintele Gerreticii - Etiinfaereditàfii.

La organismele procariote funclionarea gi transmiterea fae-'torilor eneditari prezintà un tablou mai putrn complex compa-rativ cu organismele eucariote. Ciclul de vÍafà al organismelorprooariote este simplu. Reproducenea lor se realizeazÀ prindiviziune celularà, neexistînd diferenfieri celulare majore. Exis-tenta unui singur cnomozom-genofor - substratul fizic unic altuturor genelor pe cìare le prezintà o cel,ula procariotà, faee cade regulà fiecare genà sa fie prezentà într-un singur exemplar,într-o singurà c"opie, în genomul prooariot. Ea se va exprimadeci liber în fenotip, în funclie de necesitàfile de moment al'e,

celulei (vezi reglarea activitàlii genice).La eucariote lucrurile sînt oeva mai complicate. Existenfa

mai multor genofori crpmozomii creeazà premisa pre-zenfei în genotipul unei celule, respectiv individ, a mai multorcopii ale acel.eiaqi gene, adicà a unor stàri alternative ale aces-teia. Comportamentul factorilor ereditari depinde nu numai de'aspecte legate de meoanismul reglàrii activitàfii genelor, darqi de oomplexitaùea organizàrii genomului eucariot qi de pre-zenfa unei gene date, în aceeaqi celutà, în c.'el putin doua stàrial,ternative.

tQ - Descifrîud tainele ereditagi, vol. I 145

1. CICLUL DE VIATA LA ORGANISMELE SUPERIOARE

Organismele eucarioúe se pot reproduce fie pe cale asexuatà(vegetativ lia plante, somatic la animale) fie pe cale sexuatàpropriu-zisà, cu diferenliere de sexe opuse, mascul Ei femei.Reproducerea asexuatà se realizeazà, cel mai adesea pe caleadiviziunii celulare la eucariotele inferioare, unioelulare (al,gaChlorella bunàoarà) sau prin diferenfiere de org€me de repro-ducere vegetativà, Ia plante.

Eucariotele, mai a}es cele superioare, se car,acterizeazi însAprin reproduoerea sexuatà tipicà, în oare s,e difererrliazi anizo-gamefi

- gamefi diferifi morfofizi,ologic - ovulul la arrimalegi oosfera la plarnte, penúru sexul femel, spermatozoidul Ia ani-male gi nucleul spermatic (derivat din diviziunea nucleuluigenerativ rezulrtat în urma diviziunii nucleului haploid al mi-cr,osporului - ,gràu,nciorul de pol'en) pentru sexul mascul.

În ciclul de via{à la organismele cu reprodueere sexuatàalterneaza 'o f"azà, s,exuatà (gametofiticà) qi a fazà vegetativa(sporofiticà).

La animalele superioare precum Drosophila Ei omul, fazasexuatà este reprezentatà doar de celulele din linia germinalàcane produc gamefii. Ele sînt di$oide (2n), se diferenfiazà dincelulele liniei somatice prin diviziuni mitotice succesive încà dinprimele faze ale emrbriogenezei Ei doar ele vor suferi meiozasprc a deveni garne,fi.

Plantele nu posedà o linie germinalà. La plantele care serepnoduc pe cale sexuatà, în floare, reprezentînd o parte asporofitului, u,nele celuie vor fi induse spre a se difermfia înmegasporofit la sexul femel qi microsporofit la cel mascul qiaceste oeiule vor suferi meioz'a. În unna meiozei rezultà rnega-spori (ovulul) Eí microspori (polenul) care se divid mitotic sprea produce ceea ce se cheamà ga,rnetofit. La plantele inferioare(talofite) ,gametofitul ,este foarte dezvoltat pe cînd sporofituleste redus. La plantele cu flori în special angiosperme, ,gameto-fitui este foarte redus pe cînd sporofitul (reprezentînd plantaîntreagà) este foarte dezvoltat. În pr,ocesul de fecundafie dinunirea ovulului cu spermatozoidul respectiv a oosferei cu nu-c121 spermatic, se reface garnitura diploidà de cromozomi, re-zutrtùrd oul sau zigotul diploid car,e, prin diviziuni succesive vag€nera un nou organism. Meioza Ei fecundarea sînt ferromenecompensatorii.

146

2. CARACTERISTICILE GENETICE AI..E MEIOZEI

Meîoza este diviziunea celul'arà cane duce la formarea ce-lulelor reproducàtoare. În cadrul ei, dupa o singurà runda deneplicare a ADN se desfàqoarà douà diviziuni nucleare suc-cesive. În urma replicàrii ADN, o celulà 2n cu o cantitate 2Cde ADN va dobîndi o cantitaúe dublà de ADN de nivel tetra-ploid

- 4C.Dupà prima diviziune meioticà rezultà douà celule care au

o cantitate diploidà de ADN (2C) qi cu mumàr de cromozomiredus Ia jumàùarùe (n). Acresúe oelule suferà ,o a dor.l,a diviziunemei.oticà qi vor da patru celule cu cantitate haploidà de ADN(1C), dar cu acelaqi arumàr de eromozomi redus la jumàtate (n),

În prima diviziune meioticà, anume în gnofom. acesteia eve-arimentul cel mai important esùe sinapsa crpmozomilor omologicane condifioneazà reducerea aparen'tà a numàrului de cromo-zomi. Cromozomii ibicromatidici avînd o crantitaúe 4C de ADN(duplicafi) se asociazà în perechi, pe bazà de omologie, for-mind bivatenfli. În metafaza primei diviziuni meiotice fiecarebivalent se aqazà in placa metafazicà, astfel ca unul dintrecromozomii omologi sà fie deasupra, iar cel,àlalt dedesubtul pla-nului ecuatorial al acesteia. Aceastà agezare a cromozomiloromologi oe alcàttriesc bivalenfii condifioneaza o disjuncfie(segregare) ordonatà spre polti a cromozomilsr omologi, di'nfiecare bivaJent unul diurtre omologi migrtnd spre un pol (deciîntr-un gam,et), celàla,lt în mod obl,igaúoriu, Iegic de,terminat,migrînd spre polul opus (într-un alú garnet). Din prima diviziu-ne meioticà nezulrtà doi nruclei fii, fiecar.e avînd un numàr decnomozomi reprezerrutind jurnàtate din gamitura diploidà acelulei somatice. De asemenea, acesti nuclei au o cantitatede ADN redusà la jumàtate fafà de cantitatea de ADN a nu-cleului interfazie de dinainte de meiozà.

Prima divizir:ne meioticà este redu{ionalà. Nucleii ha-ploizi rezul,tafi din prima diviziune meioticà suferà, fàrà a maiavea loc o sintezà interfazicà de ADN, o a doua diviziune me-ioticà care se desfàqoarà dupà mecanismul mitotie tipic, cu cli-varea longitudinalà a centromerului Ei migrarea spre poli nu decnomozomi bicromatidici ca în prima diviziune meioticà, ci decromozomi monocromatidici. A douà diviziune meioticà desà-vîrgeqte astfei qi reducerea cantitàtii de ADN, care de 1a 2 Cajunge ùa 1 C, canrtiùate specificà gannefilor haploizi. Iau n,a9úere

147

patru nuciei hapl'oizi ca rezultat a douà diviziuni meiotice suc-cesive.

Celuiele organismelor diploide care se reproduc pe calesexuatà, prezintà douà seturi de cromozomi, unul provenindde la mamà, adus la nivel.ul zigotului de càtre ovul, altul pro-venind de la tatà, adus la nivelul zigotului de càtr'e sperma-tozoid. Fiecare set de cromozomi este atrcàtuit di,r: crom'ozomineomologi, neasemànàtori. În cadrul complementuluii diploidînsà, doi cîte doi cromor,omisînt asemànàtori adicà omol,ogi, unulfiind de provenien[a maternà iar altul de provenienta paternà.Asemenea cromozomi ornologi poartà aeeleagi gene în loci oo-respunzaúori qi prezintà aceeagi morfologie. Astfel', star,ea di-ploidà a organismelor eucario,te implicà existenla locil,or omo-togi qi a genelor alele; cel pufin cîte douà gen'e din genotipulorganismului eucariot controleazà acel'aqi caracter. In timpulmeiozei aceEti cromozomi omol'ogi se împereeh eazà,, formîndbivatenfii. În împerecherea omologiior un rol esenfial revinecompl,exul ui sinaptinemal.

3. LOCALIZAREA GBNELOR PE CITOMOZOMI

În anul 1903 Sutton a starbilit relalia dintre comportamen-tul crornozomilor în meiozà (segregare) pe de,o parte qi disjunc-tia (asortarea) independentà a genelor pe de altà parte, faptcare a stat la baza elaboràrii teoriei cromozomale a ereditàfiide càtre Morgan qi Ecoala sa, în 1919.

S-a putut constata cà o genà nu poate sà corespundà la uncromozom întreg de vreme ce oricare .organism, fie el, proca-riot (unde existà un si,ngur cromozom) fie eucariot posedàmai multe gene decît cromozomi. Singura posibilitate ràmînea'ca pe un singur cromozom sà se afle mai mutrte gene caresînt lincate sau înlànluite. S-a stabilit cà fiecare genà ocupào anumità pozilie (toczs) strict determinatà pe cromozom Ei càpe cromozomii omologi alel,ele unei ,gene ocupà pozilii cores-punzàtoare. Mai exact alelele unei gene ocupà acelaEi locus pecromozomii omologi. Ulterior pozilia ocupatà de o genà pecromozom a fost asimilatà cu gena ca atare, încÎt atunci cîndse vorbeqte de un locus genie se înlel,ege gena propriu-zisà,.Piuralul de la locus este loci.

Genele plasate pe un acelaqi cromozom manifestà tendinfade a se transmite înlànt-uit I,a desce'n'denfi, în virtutea faptului

148

cà ele sînt fizic înlànfuite, iar cnomozomul este trecut ca en-titate integrà, discretà, din celula inifialà îan celulele fiice.

Pe de ,aùtà parte, genele care sînt localizatn pe diferifi cro-rn'ozomi (pe cromozomi neomologi) nefiind înlànfuite segnegAindependent unele de altele càci qi perechil,e de cromozomi înanafaza primei diviziuni meiotice (AI) segnegà independemtunele de altele. Dacà dintr-o pereche datà de crnomozomi, cro-rnozomul de origine maternà migreazà spre un pol, în modlegic determinat cromozomutr de origine paúernà migreazà sprepolul opus. Dar, considerînd o arltà peredre de cromozomi, rues'te o'bligatoriu sà migreze spne polul spre cane a mi'grat dinprima per,eche cromozomul matern tot, cromozomul de ori-gine maternà. Astfel, spre poli, în nuclei fii, rezultali dinprima diviziune meioticà, vor mlgra cr,omozomi de ori,gine di-ferità, mate'rnà qi paternà, migranea fiind un evem.iment deter-minat stohastic, probarbilistic. În asemen€a nuctrei vor apar€constelalii genetice de cromozomi, respectiv de gene diîerite caorigin'e (materne qi paterne), ca provenienfà, de cele care aufost la genitori.

Aceste concluzii au fost desprinse însà dupà ce s-a studiatfenomenul ereditar la nivel ceL,ul,ar.

Dar, îna,inúe de a fi cunoscute mecanismele in,time ale me-iozei qi implicarea cromozomitor în ereditate, Gregor Mendel,studiind hibridarea la mazàre, a ajuns la concluzii care îEipàstreazà în total,itate valabiliúaùea qi astazi, astfel cà el, càlu-gàrul augustin Gregon Memdel, nàscu't la Heinuendorf (Cehos-lovacia) în t822, este aonsider,at fondatorul qtiintei er.editàlii.

4. DESCIFRAREA NATURII GENOMULUI (GENOTIPULUI}PRIN STUDIUL FENOTIPULUI (ANALI7,A GENETICA)

(GENETICA FACTORIALA SAU FORMALA)

Cercetàrile lui Mendel se deosebesc radical de ceie ale pre-decesorilor sài (cei mai reprezentativi fiind Knight, Goss, Ch.Naudin) prin trei elemente de n,outate: modul de a privi expe-rienla qi de a alege materialul potrivit, introducer,ea discoarti-nuitàfii qi folosirea maril,,or populalii, oeea oe permite exprima-rea nezultatelor prin numere Ei pr,elucrarea lor ma'tematicà, caqi folosirea un.ror simrboluri simple pentru desemnarea fac.to-rilor er,editari de naturà corpusculanà, prin care devine posi-

149

bil un meîncetat d,ialog diurtre experiment Ei teorie, dintre expe-rimentator qi experienfa sa.

Noua metodologie, prelucrarea statisticà Ei reprezentareasimbolicà impu,n ereditàlii o logicà internà. Cu Mendel, inter-pretarea fenomenelor biologioe dobîndeqte dintr-o datà rigoarematematicà. Gîndirea sa a fost o gîndire revolufionarà. EI a.

ajuns la concl,uzia cà tràsàturil,e (caracterele) ereditare ale unuiindivid sînt distincte, fiecare transmi!îndu-se ca unitàli sepa-rate de l,a pàrinti la descendenli mu direct, aqa cum credeaupredecesorii sài, ci indirect, prin intermediul unor factori ere-ditari. Astfel, deqi un individ poate sà posede mii de tràsàturidistinete care alcàtuiese individualitatea sa, fiecare din acestetràsàturi sînt controlate de càtre unitàli ereditare sau factorteredifuri oare au un caracter discret (în sens de distinct dinpunct de vedere fizic). Mendel a stabilit cà ereditatea urmeazélegi simple qi exacte pe baza càrora poaùe fi prezis comporta-mentul oricàrui factor ereditar care dirijeazà un anumit carac-ter. Moqtenúrea caracùerelor se face dupà reguli foarte exact'e,matematice.

Prin experien!à dar Ei intui{ie genialà, Mendel a statuat càdiferitele caractere a}e unui organism dat sînt determina,úe defactori ereditari de naturà materialà, localizali în nucleul ee-lular, fiind in dozà dublà în celulel,e somatice gi în dozà simplàîn celulele reproducà'ùoare (gamefi). Prezenfa factorului ere-ditar în doza dublà a fost probabitr sugeratà lui Mendel de par-ticiparea a doi incliviei diferifi la uraqterea unui singur individla organismele c€ se reprodue pe ca,le sexuaità. Este acum uEorpentru noi sà apreciem cà aceastà situafie corespunde cu ac€eaa numàruiui de eromozomi sau a cantitàlii de ADN, dar Mendelnu qtia acest l,ucru, deoarece la vremea cînd a elaborat tezelesale mu se d,escoperise nici cnomozomii, nici ADN, nici meioza.

Mendel a mai stabilit cà factorii ereditari în celul,ele soma-tice fiind în doz.à du'blà se aflà su,b formà de pereche sau cuma definit el cu terrnenul grecesc sub formà de alele.

Acum qtim cà factorul ereditar mendelian este o genà qicà gena poate exista sub forma a douà stàri alternative, nu-mite alele din care una este dominnntd (A) gi alta rece'siud (a)"Aceste douà Súàri ,aù,ternative ate aceleiaqi gene sîn,t rezulrta-tul posi,bil al mutafiei bidirecfionale: A, ' a. Existenfa genelorpoarte fi sesizatà numai cînd ele determinà un caracter ce poatesà aparà sub douà stàri al,ternative. Abia atunci vom putea qticà existà o genà care, într-o anumità stare determinà o anumità

150

formà a caracterului considerat (ibob neted în cazul formei bo-bului de mazàre) qi într-o altà stare determinà cealaltà formàa caracterului (bob zbîrcit).

Cele douà alele ocupà acel'agi locus pe o pereche datà decromozomi omologi. Astfel, dacà alela A se aflà pe cromozomulcle origine maternà, într-un anumit sit sau locus, p€ cromozo-rnul omolog de origine paternà, ùl acelaqi locus se va afl,a fiegena ,,Att, fie ale,la sa ,,a6t. Situarea alelelor poate fi qi reci-procà, ,,Att pe cr,omozomul de origine paternà qi ,,a( pe cetrde origine maúemà.

Într-un alt locus pe aceeagi pereche de cromozomi omologise aflà altà genà ,,Btt prezentà sub forma alelelor ,,Bs qi ,,bs.Genele A Ei B, fiind plasate pe acelagi cromozom se transmitde regulà împreunà la descendenfi.

Pe celelalte perechi de cromozomi se aflà alte gene (X, Y,Z etc.) qi transmiterea lor la descendentr nu este legatà directde transmiterea genelor A Ei B.

Gena A prezentà cu alelele sale A gi o în ace,laqi locus pe,cei doi cromozomi ,omologi poate determina variafia expresieifenotipice de regulà a unui singur caracter.

Prezenfa unei gene sub forma a douà stàri alternative (ale-le) poaúe fi comparatà cu un întrerupàtor electric care prezintàdouà stàri posibile, alternative:

- închis Ei în acest caz lumina este stinsà;

- deschis Ei în acest caz lumina este aprinsà.Sà exemplificàm din experienlele lui Mendel. EI a efectuaú

hibridàri de mazàre. Mazàrea prezintà mari avantaje pentntstudiul comportàrii factorilor eneditari (genelor) deoarece esteo planta autogamà (fiecar'e plantà produae atît polen cît qiovuie) qi prin autofecundare se pàstreazé nealteratà puritateageneticà. Din aceastà cauzà mazàr,ea prezintà multe soiuri pure'care se d,eosebesc tranqant între el,e prin caractene contrastante(bob neted -

,bob zbîrcit; bob galben -

,bob verde; flori roqii

- fl'ori al'b,e; port înalt - port pitic etc.) car,e se mai numesc

gi earacùere alelomorfe qi care pot fi o'bservate cu uEurin!à. Pu-ritatea geneticà a unui soi este d'ovedità de faptul cà prin ,out,o-fecundare se pàstreazà nealterate caractercle sale, adicà setransmit fidel, neschim,ba;te, de-a lungul generafiilor, dînd o,d,escenden!à uniformà qi asemànàtoare formei inifiale. Pe dealtà parte, un soi impur genetic va da naqtere prin auúofecun-dare la o desoendentà neuniJormà, ad.icà va segrega.

151

4.1. MONOHIBRIDAREA,

Încnrciqind un soi pur de mazàre cu bob neted, cu un soipur de mazàre cu bob zbîrcirt Meardel a ,oblinut în prima gene-rafÍe (F1) organisme hibride cane prezentau feno,tipic (exterio-rizau) doar caraeterul de boib neùed. Experien{a de încruciqareln car'e se ia în considerafie doar o pereche de canactere aleto-morfe se numegte experien!à de m,onohibridare. în al doilea an,a cultivat rboabel.e hitbride dirl Ft làsînd pl,antele sà se autopole-nizeze Ei a oibfinut cea de-a doua generafie (Fz) de plante. în,acest cazp lîngà plante care fàceau boabe uretede au apàrut qiplante care fàceau boab,e zbîrciúe. Deoarece în prim,a genera-fie, dintre cele douà caractere contrastan,te neted-zbîrclt, s-amanrife,stat doar caracúerul de bob neted, Mendel a numit acestcaracter, caracter dominanú, iar factoruL ereditar care îl deter-minà l-a considerat factor ereditar dominant qi l-a simbolizatcu litera mare ,,Ao. În acelaqi timp caracúerul de bob zbîrcit,neexprimat în Fr, a fost consid'erat oarracter reeesiu, iar facto-ml care ît determinrà a fost considerat factor ereditar recesivqi a fost n,otat cu litera micà ,,at'. În virtutea celor spuse pînàacu.m, experienta de hibridare a luí Mendel poate fi astfel sche-uratizatà (fig. 44).

Analiza femotipicà a celei de-a doua generalii (Fz) a aràtatcà proporlia dintne plantele cu iboabe netede gi pl,antele cu boa-be zbîrcite era de 750/o neted la 250/o zbîrcit, sau simplificatde 3:1. Aoesta a fost numit rraport de segregare Ei s-a, cofrstatata fi aproximativ acelaEi în toaúe experienlele de hibridare deacest tip. Analiza genotipicà judecatà dupà feno'tip gi bazatà peinrtuilie a sugerat eà existà trei categorii diferite genotipiee deorganisme AA, Aa qi aa. Aparilia doar a douà caúegorii fenoti-pice de organisme în cadrul unei popul'a{ii în care probabi-listic apar patru posibilirtàli de combinare a gamefilor i-a su-gerat lui Mendel cà în cazul structurii genotipice Aa se ex-úerioriaeazà qi ca în oazul hllorizilor din F1, doar carastenrl" do-minant. Probabilita,tea aparifiei caracterului dominant esùe de3/4, íar a oelui recesiv este de l/4, de unde raportul fenotipicde segregare 3:1, oel genotipic fiind de 1 AA:2 Aa: 1 oo. De

152

PARINTI fGenitorii'

-*- Hc'r czrgol recesiv

Meroz cr isepororeoer€drl.rír ín gometi

Gomeir

A DOUA

botr zbkit'toctonlrrdrfecrlr I

24o,6 50Vo

hofiozrgot domrnonte heterozigote

75%o bob neted

z Jlo

homozrgot recesivel---_--

25o4bob zbîrcil

GENERATIE (Fzl)

'l Seg.egore drpó,

J SenotiR I l, 2,1l:

'l Segregore dr.rpó,

lfenotrp (3 neted:j t zuîrcrt )

Fíg. 44. Monohibridarea (segregarea sau separarea factorilorereditarí).

fapt, rezultatele experimentale oblinute de Mendel privind ra-portui fenotipic de segregare în cîteva experiente sînt redatsîn tabeiul 3.

sà consideràm cîteva aspecte legate de oomportamentul fac-torilor ereditari. Factorul éreditar A este dominant. El condi-lioneazà un caracter dominant, caracter care se manifestà întoate generaliile, indif,erent dacà intrà sau nu alàturi de fac-torul ereditar recesiu în struc"tura geneticà (î,n genotipul) ce-lulei, respectiv organismui consi'derat. EI se exprimà în- fenotipatît cînd se aflà în d,ozà du'blà (AA) cît gi atunci cînd s,e afló

Gomei'

Él PRìMA GENERAIIE (Fl)

I I I I orEor-,sme t00Tohererozigote

\_y (hitrrcel

rtil x

, "/? ii' ú

'olI o>-:

frtil tD frr;

153

Tabel nr. 3Raportul lcuotiplo de segregare în erperienlele lui lùIendel

Genitori (Pórinfi) Fl F2 lnaport dr

I segfegaîe

Plante de bob neted x

Plante cu bob zbîrcit

Plante cu bob galben xplante cu bob verdePlante cu flori rogii xPlante cu flori albeplante cu póstAi verzi xplante cu póstài galbene

bob neted

bob galben

flori rorsii

pàstài verzi

plante cuboabeuetedeplante cuboabe zbîr-citegalbeneverzi.rogiialbevetzigalbene

2,96: I

3,01 : I

3,15 : I

2,82: I

5471

1850

60222001

705224428t52

în dozà simplà (Aa). Structura geneticà AA este homozigo'tód"omirwnúd pe cînd structura geneticà Ao es,be heterozigotó.

Factorul eredita'r a este recesiv. El condilioneazà un ca-raeter recesiv EÍ nu se poate exprima atunci cînd intrà în struc-tura genotipului alàturi de factorul ereditar dominant (A) laformele heterozigote (Aa). Se spuo,€ cà Ia organismele hetero-zigote dominanla poate sà mascheze genotipul. La organismelehomozigote recesive (aa) fenotipul refl,ectà genotipul.

Factorul ereditar recesiv nu se manifestà decît atunci cîndse aflà în dozà dublà, adieà este plasat pe ambii cromozomiomologi, stare care se numegte hòmozigotd recesiud (aa).

O singurà situalie se cunoaqte în care în mod normal fac-toml ereditar recesiv se exprimà atunci cînd se aflà în dozàsimplà. Este cazul factorilor erreditari plasali pe cromozomii des€x Ia masculul de drosofilà sau mamifere. Formula cromo-zomalà a sexului mascul în aeeste cazuri este XY. Cei d'oi cro-mozomi de sex nu ,alcatuiesc o pereche, nefiind omologi. De-altfel ei nici nu Be împerecheazà, intim pe toatà lungimea lor înmeiozà. Cromozomul Y poartà foarte puline gene priqrtre careqi cele care intervin în masculinizare. Cromozomul X este uncromozom activ genetic. El poartà mulùe gene. Dacà o genà depe crqmozomul X se aflà în stare recesivà (a), ea se exprimà fe-notipic chiar fiind în dozà simplà, càci pe cromozomul Y, ure-fiind omolog cu X, nu se poate afla niciodata alela sa domi-nantà (A). Aceastà stare, în care gena recesivà ,,a35 s,e exprimàfenotipic, chiar cînd se aflà într-un si,ngur exemplar se nu,meste

154

stare de hemizigolie. Hemizigolia poate apare gi la organismeleaneuploide monosomice la car.e lipseqte unul din crornozomiunei perechi de cronnozomi.

Un alt aspect legat de f'actorii ereditari mendelieni se referàla segregore. În procesul hibridàrii, factorul ereditar dominantnu se amestecà cu factorul eredita,r rec€siv. Fii'nd de naturàcorpuscularà, aceEti facùori numai coexistà în genotipul hibrid,se alàturà, fàrà însà a se contopi. Factorul ereditar dominantnu determinà nici o alterare a factorului eredi'tar recesiv, cinumai nu-i permite exprimarea sa fen,otipicà (î1 ,,dominàs).Acest lucru este dovedit de reaparifia factorului ereditar reoe-siv în generalia F2. Raporturile dintre factorÍi ereditari, domi-nant Ei recesiv sînt mai degrabà raporturi funclionale, cel re-oesiv neputÎnd fu'ncfiona î'n prezenfa celui dominant, sau pro-dusul sàu de sintezà este acoperit de produsul specificat de fac-t,oruL domina,nt.

Reaparifia factorului recesiv în F2 a sugerat lui Mendelfenomenul de segregare. Segregarea factorilor ereditari se su-prapune segregàrii cromozomilor omologi din bivalenli î,ntimpul meiozei. Fiecare din cei doi cromozomi omol,ogi conlinefie factorul ereditar ,,A((, fi,e factorul ereditar ,,as a,ja încît prinsepararea lor spre poli opuqi, aceEti factori ereditari vor fi se-parati qi ei în nuclei diferili respectiv în gamefl diferifi atîtla pàr'intele de sex femel cît Ei la pàrintele de sex mascul.

Cîncl într-o ce1ulà se aflà douà alele (Aa) acestea vor fi dis-tribuite egai în gameli. Din cei patru produgi ai meiozei (ga-meti) doi vor primi 'alela ,,Att $i alîi doi alela ,,as. Raportul desegregare alelicà este 24:2a sar simplificat 1:1. Acest fenom'ende segregare, disjunclie sau dezbinare a factorilor ereditari senumegte principiul, segregdrii sau prima lege a lui Mendel. Eastatueazà cà dacà orgarnismele pot fi pure din punct de vederegenetic (homozigote domirnante AA sau homozigote recesive oo)sau impure di'n punct de veder",e genetic (heterozigote Aa), game-lii sînt legic puri din punct de vedere genetic prin faptul cà,derivînd în urma divizunii meiotice, cînd are loc reducerea nu-màrului cle cromozomi respectiv separarea factorilor ereditari,ei confi,n fie f,ac0orul ,eneditar A, fie factorul ereditar o, nici,oda-tà, în condilii normrale, ,arnbii faet'ori er,edirt'ari. Principiul segre-gànii (s,eparàrii f,acùoriior erreditari)

tn.(, oo<2, AA<1) * aplicà în cazul factorilor ered.itari

plasali în acelagi locus pe cromozomi omologi.

155

Considerînd fenomenul segregàrii, se constatà cà dacà înF1 org'anismele rezulta'te din încrucigarea a doi geniùori purigenetic (soiuri pure sau linii pure) sînt TAAo/o h,eterozigote,datorità fenornenului de segregare, procentul organismelor he-terozigote se reduce, cu fiecare generalie la jumàtate (fig. 4b)astfel cà teoretic, dupà circa B generafii, în populalia respecti-và predominà organismele homozigote. Prin autopolenizareaorganismelor homozigote rezultà doar organ,isme homozigoteconform sehemei di,n fig. 45.

Prfur autofecundarea organismeior heterozigote a,re loc se-gregarea oaracterel.or. Aceasta este o cale de a deosebi orga-nismele homozigote de cele heterozigote.

Reducerea heterozigoliei Ei creEterea homozigofiei are mareirnportamta î,n practica amelioràrii. D,e exemplu, fenomenul cleheterozís (vigoare hi'bridà) are la bazà,, ca mecanism genetic,constitufia 1000/o heterozigotà, a organismelor hibride. Inseam-nà cà acest fenomen se manifestà cel mai intens în prima ge-nerafie. În celelalte g'enerafii prin sqgregare se redute graAulde heterozrgofie qi implicit valoarea heterozisului. Totoda(.à se-greganea are importan!à practicà în o',blinerea de forme homo-

,/-1,tY

F1 (orsantsnp t00o/o hpteroz:ú:tFt

I Aufofecu ndarel( segregà )

?5"/" l7j",/o ì5o/o l?,5o/o 2 5 a/"

{-17.90/o '/ 5"h

Fig. 45. Schema red.ucerii heterozigofieí qi cregterii homozigofiei cufiecare generalie de autofecundare (autopolenizare).

156

zigote - linii prrîe (linii consangoínizate) din a caror încruci-gare se oblin, hibrizi simpli care, la rîndul lor, prin încruciqaredau hibrizi dubli. Aceste aspecte genetice stau la baza ob{ine-rii liniilor consangvinizate, a hirbrizil,or simpli Ei dubl,i de po-rumrb, floarea soarelui etc.

La animale consangviurizarea se realizeazà. prin încruciqàride tip incest, mamà-fiu, tatà-fiicà, sorà-frarte etc. încît nu seobline o puritate absolutà a liniilor consangvinizate. De ase-menea segregarea are mare importa.n!à în sfatul genetic. O ma-ladie ereditarà umanà, determinatà de o genà recesivà care s-amanifestat la bunici, sare peste o generafie (pàrinti) qi se ma-nifestà din nou la copii. În funclie de naturà dominantà saurecesivà à g€n€i qi de fenomenul de segregare se poate stabiliriscul de aparilie a'bolii.

Cazutr acesta în care un element (alelà) al perechii de fac-tori ereditari este complet do,minant iar celaLalt element, estecomplet recesiv se numèqte dominn:nfd completd. În cadrul sàu,în genenal uru se poate spune, judecînd dupà fenotip, dacà unÍndivid este homozi,got sa,u heterozigot pen,tru alela dominantà.Genotipul unui individ care prezintà fenotip dominant poate fiúotuqi determiurat dupà fenotipurile qi frecvenfa lor analizatela desaendenlii pe care acesta îi produce în urrtà; încrucigàriisale cu un individ homozrgot recesiv pentru acea pereche defaetori ereditari. Aceastà încruciqare se numeEte test cross. Fe-notipurile Ei frecvenga lor la desoendenlii rezultafi din test crossoorespund tipurilor qi frecvenfelor genotipice ale gamelilorprodugi de organismul al càrui genotip este necunoscut. Cîndindividul test'art a avut unul dintre pàrinfi sau stràmoEi recesivpen'tru perechea de factori er,editari analiza,tà, test crossul semai numeg"te back cross sau retroînuucigare. Dominanfa faceca numàrul claselor fenotipice sà fie mai mic decît numàrulclaselor genotipice. De as€menea dominanfa cauzeazà, regresia,adicà pàrhfii care sînt fen<vtipic extrsmà pentru un caractercantitativ (productivitate) dau descendenfi care sînrt în mediemai pulin extremi. Deoarece dominanla mascheazà prezenlageureJ.or recesive, o încrucigane dintne doi indivizi de acelaEifenotip (de exemplu cu blana neagrà, culoarea fiind un ca-racter cantitativ A) luafi la întîmplare poate produce descen-den{i de culoare deschisà (a). Acoastà tendin{à a pàrinlitor (A}care feno,tipic sînt extreme, de a da descendenli care nu sîntextreme se numeqte regresie.

La orga,nismele polipl,oide fenomenul de s,egregare este rnaicornpltoat, în sensul cà raportul de sqgregare este de 35 A :7 o,

L57

deci frecvenfa cu care apare organismul homozigot recesr'v ,estefoarte micà (tabelul 4)

Rozultatul lneruelgúrll aplolde reprezentin.l ttntlzlgote AAAA x aaaa)

(AAaa x

Tabelul 4

douú organlsmc poli'pure genctlo (homo-in a doua gonorafioAAaa)

IAA

IAAAA4AAAalAAaa

I n^o^"Itoea".

| +eaaa

lAAaa4Aaaalaaaa

Cind se considerà perechi d,e factori ereditari ptasali pe cro-rnozomi diferifi se constatà cà apar aspecte n,oi ale comportà-rii acestora.

4.2. DIHIBRIDAREA

Mendel qi.a propus sà urmàr,eascà modul cum se transmiùsimultan douà perechi d'e factori ereditari: una cane determinàf'orma bobului (A:neted; wùbîrcit) Ei alta care determinà cu-loarea bobului (B-galben; b:verd€). Pentru aoeasta a încru-ciEat un soi pur cu bo,abe neted'e Ei gal'bene (AABB) cu un soipur care prezenta boabe zbîrcite qi verzi (aabb). Asemenea ex-perien!à de încruciqare în car,e se iau în considerafie douà pe-rechi de caractere se nume$te dihibrid&re. ln prima ,gtsneragiea oblinut ,o populafie hibridà pentru am,bele caracter,e (AaBb),care prezenta caracùer,ele de rbob neted Ei galben, ceea oe în-s€@rnnf, cà acestea sînt caracter,ele dominante, cele de bobzbîrcit 9i verde fiind deci canacùere recesive. Pentru a oblinea doua generalie a làsat sà se autopolenízeze plamtetre dublu-hibride din prima generalie dupà schema din fig. 46.

Analizînd tabelul, numit în unele lucràri mai vechi înmod sugestiv ,,gahul cornibinàrilor mendeliene(( sau tabelul luiPunett se consbatà cà prin segregarea facboriùor erreditari î01

meiozà derivà patru cartegorii distincte de game{i rnaseuli qi tot

158

atîtea de gam'efi femeli. În pro-cesul de fecundare are loc uni-rea pe bazà de probabilitate agamelilor mascuùi cu cei femeli,adioà fiecare gamet mascul. (saufemel) are Sanse egale cu aleoelorla'lfi 3 de a se uni cu fie-care din gamefii de sex opus.Rezultà 16 posibilitàli de com-binare, respectiv 16 coantbinaliide factori ereditari. În virtutearelaliei dominan!à-recesivitate,oriunde se întîLnesc factorii ere-ditari dominanti A respectiv Bva fi exprimat în fenotip carac-terul respectiv (neted sau gal-ben). Cîrrd ei sînt prezenS si-multan în acelaqi genotip, vorfi exprimate fenotipic atît ca-racterul rneted cît qi canac"terulgal'bern. Caracterele reaesive vorfi exprimate feurotipie doar încazul în oare factorii ereditarirecesivi (o qu b) nu sînt în pre-zen\a factorilor ereditari domi-nanfi corespunzàbori (A qi B).

Din analiza celor 16 combinàri de factori ereditari se constatà'urmàtoarele :

9/16 prezínti simultan ambii factori dominanli @B) condi-' lionînd expresia caracterului neted gi galben;

3/16 prezintà un factor ereditar dominant { altut recesiv' óondilionînd dezvoltarea unui caracter dominant gi aaltui baracter recesiv (l Ó _ bob neted gi verd'e) ;

3/16 prezintà celàlalt_fa-ctor ereditar dominant 9i pe celàlaltrecesiv (aB : bob zbîrcít ;i galben) ;

1/16 prezintà. ambii factori ereditari recesivi condilionînd.exprrmarea fenotipicà a caracterelor recesive de bobzbîrcit gi neted.

De fapt, în experienla sa, Mend.el a obligut -în F, 556 deplante diirtre care-315 au produs boabe neted'e ;i ga-1b^e19, 1086oabe netede gi verzi, l0l boabe zbîrcite 9i galbene 9i 32 boabezbîrcite gi verzi.

pÀtjttli o+

6AMÍIi

F1

,@j@"AB Ab aB aÌ)

AB AAB B AABb AaBB ìAaBb

Ab AA Bb AAbb AaBb jealraB Aa BB AaBb aa3il laarr

ab AaBb Aa bb aaBb aa bb

F2

Fig a6. Dihibtid.area (Segregarea in-dependeutà a perechilor de factori

ereditari).

159

Deoarece probabilitatea apariliei unui caracter dominanteste de 314 iar a unuia recesiv este de ll4, gi probabilitateaapariliei simultane a douà evenimente înd.epend.ente este egalàcu produsul probabilitàtii apariliei lor separate (individuale) esteu;or sà desprindem de unde rezaltó"raportul de segregare 9:3 :3:1.Probabilitatea apariliei lui A este de 3/4, a lui B tot de 314,a lui a de ll4iar a lui D tot de l/4. Probabilitatea apanlíei simul-tane a lui A gi B este de 314 x 314 :9/16.

AB - 314 x 314 - 9116 bob neted pi galben

Ab : 314 x U4: 3/16 bob neted gi verde

aB :314 x ll4 - 3116 bob zbîrcit gi galben

ab: ll4 x ll4: l/16 bob zbhcit gi verdeDe fapt raporturile rezultà din desfacerea expresiei

Admi!înd cà P reprezinti probabilitatea evenirnentului X(gamefi nerecombinali) iar q probabilítatea evenimentului Y(gamefi recombinali) respectiv contaprobabilitatea evenimen-tului X (l-P) se poate calcula frecvenla apanliei recombinàri-lor în caz;ri, unei încrucigàri dintre organisme dublu heterozigote(AaBb x AaBb). Rezultà patru tipuri de gameli femeli gi patrutipuri de gameli masculi. Dintre acestea, douà sînt nerecombinante(AB gí ab) gi douà sînt recombinate (Ab Si aB). Probabilitateaapariliei unui eveniment este egalà cu raportul dintre numàrulcazurilor favorabile ;i numàrul cazurilor posibile. Probabilitateaapariliei sirnultane a douà evenimente este egaló cu produsul pro-babilitàlii apariliei lor separate. Probabilitatea X- P:+.Probabilitatc'a I- I{ :I:;t p +I:li Q:l -p; p -1 - q

Frecvenla gamelilor nerecombinali - +Frecvenla gamefilor recombinanli -

g a

'zPentru a calcula probabilitatea de aparilie a unui anumit

tenotip se proce deazó" astfel : pentru fenotipul Ab :

pt, p(l-p),p(l-p) pr+p-p'+p-pr 2p-p' p(2-p):_: _4' 4 ' 4 4 4 4

G^+:i,)*(+" *ioJ.

TdZt

(tr(e'r(fÌ

160

Tot astfel se procedeazà' în vederea calculàrii probabilitàfiide aparilie a celorlalte fenotipuri (AB, afl;t aó) folosind dateledin tabelul 5.

Analiza fenotipicà a indivizilor din generalia Fz a aràtat cî-teva aspecte import,ante privind comportamentul factoril,or €r€-ditari. În primul rînd s-a dovedit încà o datà realitatea segre-gàrii factorilor ereditari. Dar mai importantà este aparilia unorcategorii noi de indivizi. Astfel, în clihi,bridare s-a pornit de laclouà tipuri de plante: cu bob neted Ei galben (AB) gi cu bobzbîrcit Ei vei'de (cb,) gi în F2 au apàrut pe lingà aceste douàtipuri iniliale încà d'ouà tipuri care prezenitau un caracter dela un genitor Ei ait caracter de la celàlalt genitor. Avea loc deci1a descendein{i o dezbinare a cuplurilor de caractere parentale.Si,ngura explicalie plauzútbil,à era urmàtoarea:

La nivelul hibridului din prima generalie (AaBb) perecheade factor:i ereditari care determinà forma ,bobului (Aa) segregàindependent de perechea de factori ereditari care determinàculoarea bobului (Bb) Ei astfel se creeazà posibilitatea proba-bilisticà a asortàrii independente a factoriior ereditari astfelîncît în acelagi g'amet va putea trece un factor ereditar de lao pereche Ei un factor ereditar de ia ceaialtà pereche (fig. a7).Acegti gameli se ,numesc game[i recombh,a[i. Dacà ,n'u ar fi osegregare independentà a cetror douà perechi de factori eredi-tari, aiunci ar lua naqtere doar douà categorii de gameli qi anu-me rgamelii nerecom,bi,nanli AB gi ab care ar condiliona for-marea a douà caúegorii de organisme cu bob neted Ei galben

AABBOt X aabbd

Fig- 47. Segregarea indepen-dentà a perechilor de cromo-zorni însolità de segregaîea(disjunctia) independentà a pe-rechilor de factori ereditari,evenimente caîe se presupunreciproc Ai se suprapun, des-fàgurîndu-se în meiozà., Ia fot-

maîea gamefilor.

I I - Descifrînd tainele ereditófii, vol. I 161

(t)t9

Tabehtl 5

Probabllltàflle de aparlflo a dtferltelor fenotlpurl

Ab

r*)

AB

(?)Gamefi

\o\óa\

aB

{;)

ab

(?rAB

t?)I -p

2

ABAB

1-p_(l-p)'

ABAb

p 1-p p(l -p):-224

ABAb

p p(l-p)

Ab

t;)

AbAb

p p_p2224

aB

(*l

ABaB

1-p_p(l -p)

AbaB

ppp2224

ab

(?t p

2

I -pt

ABab

L___r_(l-p):

Abab

I -p p(l - p)

ABaB

p(l - p)

ABab

Abab

l_-p_p(l-p)

I -p P._:oo-2

p

2

ppp2224

AbaB

aBaB

p p_p2224

aBab

P . L:-P:qO-P)224

f-!r2

p p(l-p)24

(AB) $i cu ibob zbîrci,t qi ve,rde'(ab), adicà s-ar pàstra ú,ipurileinifiale, paneurtale, de organúsyne.*

Cunoscînd cà în meiozà ar,e loc disjuncfia independentà aperrechilor de cromozomi omologi gi qtiind cà factorii ereditarisînt plasati pe cromozomi, este ugor de tras concluzia cà pen-tru a segrega ind,ependent unra de al,ta, cele douà percchi defac[ori ereditari Ao Ei Bb tre{buie sà fie plasate pe ,pe'rerohi di-ferite de cromozomi.

Segregarea independeu:tà a douà pereehi de factori ereditari,respeetiv de caracúere în care apare naportuL de segnegare9 :3 :3 : 1 poate fi uqon redusà la segr,eg€ulea a douà cara'cúerealeilomorfe, dacà se considerà segregarea separatà a fiecàreiperechi de caractere. Astfel, oonsiderînd pe,redrea Ao, fàcîndabstractie de perechea, Bb r,aportul de segrqgare va fi

9.3_t_

16'16

3l-t_t6'16

t2- - pentru factorul I gi

16^

pentru factorul 6I sau simplificînd. va fi deci

adici 3A la \a

Situalia este identicà pentru perechea Bb, cînd se faceabsúraclie de perechea Ao.

Peutru a càpàta o anumità" certitudine, mai exact pentrua se asigura statistic cà segregarea este o lege, Mendel a aplicat

testul chi-pdtrat y2 - l, ! în care se introduc valorile agtep-

tate potrivit raportuloi à" sgregare stabilit în alte experienle(9: 3 : 3 : l) gi valorile care se determinà în experienla curentàactualà.

* Disjuncfia independentà a perechilor de factori ereditari impor-bantÈi qi în prac.tica a,melioràrii face oa din or,ganisme dubùuihet€n:ozigotede tip {AaBb, prin ,autofecund'are, sà se oblinà pe lîngà orìgriulisÍtele d,u-blu homozigote inigiale (AABB qi aabb) noi categorii de organisme dubluhomozigote (AAbb pi aaBB) ca qi al,te oategorii homozigatn pentru osingu,rà pereche de caractere (A,abb sau aaBb). Aceste,a, alàturi de onga-nismele recombinante, pot sA reprezinte obiective irnportante în progr'a-mele de ,ameliorare.

4

l6

3.114

163

Astfel, dacà într-o experienfà de ttp AABBXaabb se obtinurmàtoarele daúe (tabelul 6)

Tabelul 6

Caleulul lui It pontru Eogrogatoa ln F, a raportului g: 3: 3: I

Valcri AB Ab Total

observate (0) 2834 920 951

936a;teptate (e) 2808 936

16Diferenfa (d:0-e) 26 t5

dr 676

4,24

256 225

Dr

e4,27 I 0,21

valoarea Lui Xz de 2,75 pentru cele 3 grade de libertate (4clase fenotipice - 1) corespunde l,a o probarbilitate de tr'ans-gresiune care este mai mare de 0,30 dar mai micà de 0,50(p - 0,50 - 0,30). Aceasta inseamnà cà din 100 de repetàri aleunei experienfe date, la 30 pînà la 50 dintre e1e vor apare de-vieri probaibile de la naportul 9 :3 :3 : 1, egale sau mai micidecît cele observate. Cum valoar,ee, lui p esùe clar mai marede 0,05, rezultatel'e observate pentru raportul 9 : 3 :3 : 1 sintîn acord cu oele agteptate pentru asortrarea independentà ad,ouà perechi de alele. Repetabilita,tea 1,or cu o as€menea frec-ven!à nu se poate datora întîmplarii ci mai curînd qqor cauzeintrinsece a desfàEuràrii me'c,anúsmului ereditar la nivelul c,B-lulei dupà anumite legi ,exacte. Astfel, segregarea apare Ìegicdeterminatà gi statistic asigura:tà. Considerarea caracteruiui sta-tistic al fenomenului ereditar se bazea'zà p'e admiterea cà fiecaredintre produqii meiozei (gametr) prezintà qansà egaià de a par-ticipa în procesul de fecundare. Marile evenimen'te geneticese desfàEoarà însà în meiozà.

Cea de-a doua lege el,aboratà de Mendel gste legea esor-tdrii sau. disjwtcfiei indepenlnnte ,a perechilor de factori ere-ditari (gene) qi se referà la gene oare sînt plasate pe cromoz,omineomologi.

Niciodatà gaarrefii nu vor fi Aa, Bb, ABb etc. decît numai încazurile anormale, rare cînd are loc nondisjunclia meioticà acromozomilor oare este însofità în consecin!à de nesegregareafactorilor ereditari. Cînd se fac încruciqàri între douà soiuri

164

pure, luîndu-se în oonsiderare tnei perechi de factori ereditari(AA, BB, CC X dn bb cc) tabloul segregàrii este mult mai corn-p1ex. Asemenea experien?e se numesc experienle de trih,ibri-dare. Se 'oblin cîte B tipuri diferlte ca genotip de gamefi atîtmasculi cît qi ferneli Ei r,ezultà 64 de oombina{ii dînd un r,aportde segregare de 27:9:9:9:3:3:3:1, ceea oe înseamnà càfrecvenfa de aparilie a formelor homozigoùe este proporlionalrnai redusà decît în monohibridar,e sau di'hi'bridare.

Segregarea independentà a per',echilor de fac'tori ,ereditari,respectiv a perechilor de cnomozomi r,eprezintà în sin,e un me-canism de recornbinare genutied, intercromozomnld. Acest tip dere oombinare geneticà carac bertzea'zà, doar organrismele eucariotecàci doar ele conlin mai multe grupe de lineaj, r'espectiv maimulfi cromozomi neomologi. Recombinarea inúercrom,ozomalàreprezintà segregarea de cromozomi întregi în' meiozà caredeterminà segregare,a de gene nelincate adicà de perechi dealele localizate în cromozomi n,eomol,ogi.

Fenomenul disjuncliei independente a per,echilor de cro-mozomi respectiv a perechilor d,e factori ereditari este de faptun fenomen predeterminat de ag€Zarea rand'omizatà a om'olo-gilor din bivalenli fa!à de planul ecuatorial al plàcii metafazice.În virtutea acestui fapt, prorbabilitatea ca toli cromozomii deorigine maternà de la nivelul tuturor bivalenfilor sà se aEezedeasupra planului ecuaúorial sau toli cromozomii de originepaternà de la nivelui tuturor bivalenlilor sà se aEeze sub planulecuatoriai al pl,àcii metafaziae este egalà cu pr'obabilitatea caaceEti cromozomi de origini diferite sà se aqeze unii deasupra,allii dedesubtul planului ecuat'orial. Asemenea agezare rando-mizatà a cromozomilor d'e origin'e maternà qi paternà fa!à deplanul ecuaúorial al p1àcii metafazice în metafaza I condilio-neazà distribu{ia independentà a perechil,or de cromozomi, res-pectiv de factori ereditari spre poli în anafaza I. Din aceastàcauzà este corectà interpretarea în termeni de predeterminarepe care o dàm fenomenului de disjuncfi'e independentà a pe-rechilor de faetori ereditari. În absenfa urir€i asemenea prede-terminàri factorii ereditari de origi,ne maternà (AB) ar migratotdeauna la un pol,, pe cînd cei de origine paúernà (ab) arrnigra ia po1ul opus, rezulúînd doar douà tipuri de game{i (AB,respectiv ab), neexistînd posibilitatea apari{i,ei de gameli re-combinanfi, (Ab Ei oB).

Distribulia polarizatà,a crom,ozomilor particulari ia un polal fusului de diviziune are l,oc foarte r,ar qi duce la o asortanener,andomizatà $i 1a o segr,egare nerandomizatà de markeri ge-

165

netici. Sqrqgarea independentà a perectrilor de f'ac"tori' u€di-tari respectiv a pereohil,or de cromozomi cane asigurà necom-binarea geneticà intercromozomralà face ca probatbilitatea cadoi garnefi sà fie 'asemànàtori sà fie,foante micà. Astfel, cun-siderînd omul, catre aret în gamitura diploidà 46 cromozomi, iarîn gamefi 23 de cromozorni gi adrnifînd cà în fiecare cîorlozóms-ar a,fla doar o genà, proba,bi,litatea oa doi gamqi sà fie iden-'tici grenotipic este o" (;)- iar ca doi indivizi um.mri sà fie

identici genetic este de (+ft. Aceasta reprezintà o probabili,tate

extrecn de micà qi este posibil ca în populalia umanà de la ori-ginile sale sà nu fl exisùart doi iqldivizi asemànàtori. Ercepfie arpu,tea sà facà gemenii monozigoli care pot avea o constelalieidenticà de faretori, ereditari nucleari dar qi în acest caz pot sàaparà diferenle în oonstelatia de facùori ereditari extranucl€ari(rnitoctndriaùi de exemplu), distribuirea mitocondriilor întimpull diviziunii fiind mai pufin echilibratà. Distri'bulia echi-li,bnatà a fagtorilor ereditari nucleari este asigunatà de mecarnis-mul mitotic de diviziune.

Dar probabilitatea ca doi indivizi ai unei specii daúe sà fieidentiei este qi mai micà dacà luàm în considera{ie faptul càpe fiecare cromozom n'u se sflà o singurà genà ci mai multegen€. Consideirînd spe.cia uma,nà rei,ese cà fiecare individ esteo enrtiúste geneticà irepetabilà.

Cercetàrile lui' I\ttendel, au pus pia'tra de temelie a Geneti-cii. Publicate într-o rwistà de sla,bà circulafie sub titlul ,,Ver-suche ùber Pflanzenhybriden( el.e au fost date uitàrii. Savanliitimpului erau încà cu a'tenfia îndreptatà spre teoria lui Darwinasupra originii speciilor prin seleclie naturalà, uitind de altedescoperiri tot atît de geniale. Se spune cà Meurdel nu a avutloc înr seool,trl lui. Elr a fost pur Ei simplu mutat în secolul nos-tru. Destinul luii qtiinfific a fos'ù qi mai dramatic dacà ne gîndimcà Menilel a murit cu Bîndu} cà ceea ce a descoperit el s-arputea sà nu fie o realitate a naturii. Acest fapt s-a datorat efec-tuàrii unor ercperiernle de hi,bridare Ia Hùerupdwrn, plantà apo-micticà, cane nu are deci o meiozà ti,picà qi, cum este qi firesc,nu s-{a supus legilor mendeliene a,le eredi;tà{ii.

Cercetàrile lui Mendel a'u revolufi,onat bíologia. Pentru pri-ma datà, dupà 23 de secole, era dàrîmatà concep{ia lui Hippo-crate despre transmiterea directà a caracterelor de la, pàrinlitra descendenli.

166

Rel'uaúe 1o alte plante qi la animal,e, legile descoperite deMeerdel privind comporrtarea factorilor ereditmi s-au dovedittmiveml aplioabile, iar excep(iile nu au fàcut decît sà currfir-ilre rqula, extinzînd qi' dezvoltînd concep,m lui Mendel desprecrndita,te.

4.3. EXCETTII DE LA BAFORTURILE MENDELIENEDE SEIGBEGARB

CAZUBI PABrICUTIIRE DE ENEDITAÎE

1.3J-. NMTNANTA INCOMPLETA SAU SEMTDOMTNANTA

Corrtns, redescoperitorul legilor lui Mendel a,làturi deTschermak qi Hugo de Vries, încruciqînd un soi de Miruhilis ja-lng cu ftro.ri roqii (AA) cu 1rrì, soi cu flori aìXbe (aa) a oblinutîn prima genera$e tritbridà (Aa) doar plante eare fàoeau florinoz. Prin autopolerrizaîeà, acestora (Aa X fu) a ob.tinut în F2 unraport de segregare diferit de cel mendelian obí$nuit (3 : 1).

2s% 50% 25%Amta a fos't de 1 : AA :2 Aa : I u. Dupà cum se vede, în acest

îotu toz alb

caz rapÉul de segrcgare Senotipicà corespunde cu raportul desegregane fenotipicà, iar homozigo{ii dominangl (AAJ se expri-mà fenotipic diferit (rogu) de heterozigoli (roz). Gena A n,u semarrifestà ca, totatr dominrantà asupna lui ,d' iar ,pf' nu se ilna-nifestà ca total, recisivà fatà de A. Cele douà gene se nra-nifesG cu intensi,tat€ egalà. Fenomenul s-a numit dominsnPdincompleúò sau sqnidsrnirwr4d. Î'n experienfele pe maeàre erao domirran!à completà qi segrqarea in acest Gaz s-a numit se-gregame de tip Piswn. La Mirabiùls este vorba de o dominanfàincompletà iar segrqgarea sra numit de tip Zm càci fenomenula fost prima datà observa,t lia porumb prin încruciEarea un,eivarietà{i' cu 'boabe albastre cu o varietate cu rboabe albe dincaFe au ie.qi,t plante hi'bride cu boabe violacee. Tot astfel dinîncrucigarea unor gàini cu penaj negru cu gàini cu penaj ,alb,rezultà gàini de Andaluzia care au penajul al,bastrui. Cum gài-nile de Andoltnùs, (cu penajul albàstrui) sînt impure genetic(,hihride) ele segregà în fieoare generafie, din care cauzà n-afost posibilà crearea unei, r'a$e de gàini cu penajul albàstrui.

La om, cel' mai cunoscut exemplu de dorninanfà incompletàeste oel al anemiei falciforme. Gena muta,núà s conditioneazà

r67

sinteza unei forme mutante a catenei 0 a hernoglobinei qi faccca sà aparà hemoglobinra HbS în loeu1 hemoglobinei normaleHbA.

Indivizii hom,ozigoli s/s de regulà mor înainte de maturitate,prezentînd anemia falciformà. Heterozigolii Sis sînt viabili qiprezintà eritrocite f,aiciforme, dar anemia 1or nu este atît de se-verà ca la indivizii s/s, prezentînd numai tultburàri de respira-lie ia altitudini mari, unde oantitatea de oxigen e redusà. Cîndhemogiobina unor asemenea indivizi este analizatà electrofore-tic se constatà cà aceasta oonfine carntitàli echimolare de catenenormale gi de ca'tene muùante {3. Acesta ar fi un caz Ce codo-minnnfd, dacà se considerà ,,fe,notipul in vitro((. Aceast,a înseam.nà cà ambeie gene S gi s funclion e'azà cu aproximativ aceeaEieficien{à. Dominanfa lui S este incompietà, dar adesea se con-siderà cà cele douà alele S si s sînt codominante.

4.3.2. SU P RADO M INÉNTrr

Cînd fen,otipul heterozigotului (Aa) depàqeqte prin caracte-risticile sale cantitative ambii genitori homozigoli se înregis-treazó. fenomenui de supradominanfd. Supnadominanfa s-a în-r,egistrat în cele mai multe cazuri în care se ran,aliz eazi màri-mea, pr,oductivitatoa qi via,bilitatea descendenlilor. De. exemplu,la Drosophila, gena care deterrninà culoarea albà a ochiLor estelecesirrà (zp) iar gena care determinà culoarea ro$ie, norm,alàa ochiior este dominantà (tn+).În stare hetenozigotà fu:+/tr.:) seconstatà o creqtere notabilà a cantitàtii de pigmenfi (în speci,ala sepiapterinei) atît fa!à de homozigolii cu .oohii aùbi (u/u:) cîtEi fala de homozigolii normali (u+/ut+1

În cazul codominanfei genotipul heterozigot dà nagtere la unfenotip diferit fafà de ceie det'errninaúe de genotipuriie ,homo-zigote. Aoest fenomen se înregistreazà qi în semidominanfà(dominan{à incompletà). în cazul codominanlei însà, spre de-osebir,e de semidominan{à, genele alele ,nu au raport de domi-nan!à sau recesivitate, ele fiind dominante fafà .de, alte gene

168

dintr*o serie de mai multe alele, dar codominante uura în ra-port cu ceaùaltà.

De exempiu, la om grupele sanguine au un determinisiu ge-nic'polialelic. Grupa sanguinà A are formula genotipicà 14^homozigot dominant sau l l0 heterozigot.

Grupa sauguinà B are determinismul genetic LÍIB respectivFlÙ.

Grupa sangvinà 0 are determinismul genetic 1010.

În toate aceste cazuri alelele I ;i lB se manifestà ca domi-nante fa!à de alela /0 care este recesivà. Cînd. însà cele douàalele dorninante se întîlnesc în genotipul indivizilor cu grupasangvinà AB, care are deci formula l^lB, nici una dintre elenu manifestà dominan!à sau recesivitate f.a!à" de cealaltà. Elecodominà

. fl c9.1d!!io-neazà. apurt.fia.,unui nou fenotip (gtop.*sangvinà AB) diferit de cel al pàrinlilor (mama - grupa sangvi-nà A, tata - grupa sangr;i1[ B sau viceversa).

Un exemplu tipic de cod,ominan!à es'úe locusul esterazei-îde la Drosophila melonogaster. Una din cele d,ouà alele aleecestei gene pr,oduce o formà F ce migreazà rapid (fcrst rnigra-ttng) pe gelul electroforetic iar cealaltà alelà produce o formàS a enzimei esterazice, ce migreazà îneet (slous migroting).

Analiza extractelor din indivizi heterozigofi, desemnali F/Saratà cà cele douà tipuri de enzimà sînt prezente în cantitàfitga,le. Prezcnfa unei proteine nu are vreun efect aparent asu-pra eantitàlii sau activitàtii eeleilalte enzime. Asemenea enzi-me se numesc ismime.

Majorita'tea wozlrnelor sînt d eterminate printr-o interacliun eal,elicà de tip codominan!à, gi ele se pun în eviden!à în extractecelulare nu prin analizà fenotipicà propriu-zisà a întregului or-g'arrism càci indivizii F/F, F/5, S/S nu pot fi deosebili dupàtenotip, ci doar prin analizà electroforeticà, tipuriie homozigoteprezenúînd o singurà bandà electroforeticà pe cînd tipul hete-nozigot prezintà douà ,benzi, una F, alta S.

4.3.4. ALELE MU LTIPLE (POLTALELTA)

Alelele reprezintà alternative ale ace,leiagi gene, controì.îndexpresii diferite a,le aceluiaqi caracter. În urma mutaliei geneide tip sàlbatic care de reguià este dominar,rrtà (A) apare alel,asa reeesivà (o). Mutafia este mult mai rarà în sens invers

169

(a-+A). Genele la organismele diploide se aflà sub formà depereche (alele) Ei sînt dispuse în, acelagi locus F cromozomi'omologi. Fiecare din crei doi cromozomi ,omologi ai unei perechiva oonline î,n, ,locusul corespunzàtor doar cîte o alelà dintr-opereche de a'lele ,ale unei gene, fie A, fie a. Niciodatà cel,edouà alele nu vor fi plasa,te (suprapuse) în aceleqi locus, peacelaqi cromozom.

Proc,esul de mutalie s-a desfàEurat progresiv în timp qi ela dus mai întîi la aparilia din gena inilialà A a alelei sale re-ces,ive ,,at6. Dar într-o altà etapà, din ac€eaEi genà inifialÈ A, &putut deriva alela,q care controleazà o altà expresie a raceluiagicaracter. Mutalia genei A, desfàEuratà înx diferite sensuri adeterminat aparilia unei serii de alele 'c1, @' o3 . . . ant carecontroleazà varia{ia expresiei aoeluiaqi caracùer. Asemenea genepoartà numele de polialele sau otrele mttlbiple. Seria h, o2, as. . .an este o serie polialelà. Toate aceste alele ocupà acelaqi locuspe cromozomii omologi. Aceasúa nu înseamnà cà toate alelelevor fi plasate în acelaqi timp, într-un singur locus pe perecheade cromozomi omologi. Fenomenul polialeliei este un fenomenpopulafional, ceea ce înseamnà cà la unii indivizi ai populafieiconsiderate, pe o perectre de cromozomi omologi se aflà într-unltocus precis delimitat perechea AA; la alti indivizi pe areeagipereche de cromozomi omologi, în acel,aqi locus, se va aflape'rechea are, la alfii ortla q.a.m.d. La indívizii heterozigoti petln crornozom omolog, înúr-un locus dat se va ,afla alela domi-nantà A, íar pe celàla1t cromozom omolog, în acelaEi locus (lo-cus corespunzàtor) se va aflta fie alela r,ecesivà a1, fie ale,Ia re-cesivà a2'etc.

Cazul citat la codominan!à este în acelaEi :timp un caz depolialelie. Cele úrei gene IA, Iu $i 70, ocupà acelaqi locus pecromozomii omologi qi oontroleazà variafia grupei sangvine înpopulafia umanà, fàcînd ca unii ilrdivizi sà ai,bà grupa saqgvinàA, alfii grupa sangvinà B, al,tii grupa sangvinà AB qi af{ii gru-pa sangvinà 0.

Existà un principiu fundamental al imtrnoltogiei potrivitcàruia urÌ orgarrism, în condilii normale, ru va produoe anti-corpi împotriva sa. Astfel, dacà una di,n,trre proteinel'e prodused,e un organism este antigenul-P, atunci anticorpul anti-P nuse va produce în serul aceluiaqi organism. Eri,trocitele umaneprezintà antigene, pe cind serul sarugVin oonfine anticorpi. Cîndserul de la un individ cu grupa sangvinà A se amestecà cueritrocitele de la un individ cu grupa sangvinà B, apare r.eacfiade aglutinare. Tot la fell se înf;implà cînd serul de Ia indivizi cu

170

grupa B se amestecà cu eritrocitele de la indivizi cu grupasangvinà A. Pe de altà parte, amestecul de ser qi de celulede la acelaqi imdivid, sau mai exact de la indivizi care auaceeaqi grupà sangvinà nu determinà ooa,gularea. Aceste ràs-punsuri' diferite sînrt determinaùe de o clasà de antigene loca-liaa'tà pe suprafafa eritrocitelor. Astfel, alteùa dominantà fé'specificà antigenul A qi anticorpi anti,-B, alela domi,nanúà 18specificà antigenul B Ei anticorpi anti-A, iar alela recesivà 10mu specificà nici o structurà anúigenicà.

Analiza biochimicà a eviden{iat, faptul cà antigenul A esteo o-N-acetil-D-galactozaminà, atagatà de un gl,icolipid sau glieo-proteinà, aflnte la slrprafala eritrocitului. Antigenul B es@ oo-D-galactozà. Persoanele cu grupa sangvinà A au enzimaa-N-acatilgoloctolm.núltransfetwn care ata$eazà galactozamin'ala l,ipidul sau proteina de la suprafafa eritrocitulr.ri. Persoanelecu grupa sangvinà B posedà q a-D-galncbsilhwtsfeonzd carea,taqeazà galactoza la compugii de pe suprafafa eritrocitului.

Pensoa^rrele cu grupa sanrgvinà AB au amrbele tipuri de anti-gene qi deci ambele tipuri de enzime, apar€nt în canúitàti echi-rnolare (alelele Io Si IB sînt codominante).

Serul persoanelor cu grupa sangvimà AB nu oonline anti-oorpi an'ti-A, nici, anticorpr anúi-B, din cane cauzà persoanelecu Brupa sangvinà ,48 sînt primitori r,uliversal.i de transfuziide sînge.

Alela -10 nu condilionazà sinteza weunei enzime gi per-soanele cu €rupa sangvinà 0 nu prezinrtà antigene A qi uricianrtigene B. Eritrocitele lor sfurt n€utne, dar în serul lor se aflàatît antiaorpi am.rti-A cît qi anticorpi anti-B.

Pentru deùeeùarea celtor patru fenotipuri se folosegte neac-tia de a,glutimarre (fig. 48) cu douà tipuri de antiser (anticorpi)anti'A gi anti-B, conf,orm ta'beùului 7.

Ier,anhi,a dominanlei celor trei atele este ,(7o : 18) > l0 (ta-bet S). De regulà o alelà necesivà (precum este atela l0) carespecificà o pnoteinà fur,activà es,te rarà comparativ cu alela sadominantà (aqa cum sînú alelele fA sau 1"). În cazulr acestoralele însà rapare o @(c€pfie de la regulà, càci persoanel,er cu gru-pa sangvfurà 0 sflnt muLú mai frecvente în popul,afia umanà decîtpersoanele cu alto grupe sangvine, ceea se înseamnà cà frec-venla genei I0 în populafia um,anà este marne.

Existà o anumità distrirbufie geogrraficà a grupelor sangvineîn populafia umanà. Cea mai constantà disúritbufie o are grupaB. Frewenfa cea mai mare es,te înrqisùratà în Asia cenùralàgi este de 25-300/c. De aici, frecvenfa drescnegtc în toate di-

t7t

Donor(cnhgerc)

G-,ps ,Je

Singe

("€Ù

,í€\1i + F )

*_ */

rolitL_ __lFig. 45. Acfiunea serului de la peîso&ne cu gnlpe sangvine v.À-

riite (receptori)asupra d.iferitelor tipuri de eritrocite (donori).Aglutinatea celuleloi indicó reacfia anticorpilor serului cu anti-

genele celulare.

' Tabelul 7

Roaegia de aglutinare in stabilirsa eelor patru fenotipuri ale grupel sangvlnG

,ArA sautAr0

t&" "^ttBto

Galactozamina(A)

Galactoza(B)

Galactozamina(a)+

Galactoza (B)

anti-B I B, AB A9i0

anti-A I A, AB Bqio

A,B,ABgi0(primitor

Numai de la

nici untip

toto anti-A *f anti-B

A,B9iAB (donator uni

L72

Níci ua tip

sal)

Tabclul g

Btabllirea grupelor sanguine ale eopiiilor rezultafi ùn eAsàtorla unor persoenGsu rllforito grupe sangvlne Ee laeo dupú urmAtoarea sehemA:

Grupa sanguinólfenotip)

a pArinfilor

0xB

Formulagenotipicàposibilà

0x00xA --"--l

rîtn *- iArn I1010 x la10 lAlo gi l.olo

1010 x 1010

lolo X lic,lAj

Formula genotipicàa copiilor

I loio

I rarolal0

f "ron"

sanguinà| (f enotinur)

i t copiilor

Asau01010'à: X lBlB

1o1o' y 1B1o lBio $i lolo

1 1o gi 1n1o

lAIA

lBlo

Bsau0OxAB -U:r Éf'--

lala x lal-{

AseuB

AxB

recîiile, a,jungînd în Franfa qi Anglúa 1a 5-t00/0, iar în popu-latiile naturale ale Australiei $i Americii de sud este foartemicà sa'u nulà.

De asemenea, o distrirbufie asemànàto,are se înregistrcazà înAfrica, unde fnecvenfa gen'ei 18 este oe€, mai mare îrl Congo,de unde descreqte în toate direcfiile.

Gena 7o, prezintà frecvenla cea mai mare în Europa deVest, Australia qi unele zone din America de Nord. Modelul sàude distribulie este mai universal, dan mai putin regulat. Ofrecven!à mai mare a sa se înregistreazà în populafiile diil)Tibet, la boEimanii din Africe de sud, pigmeií din Congo, negîiidin Fitripine Ei unele populalii din sudul l,rÀdi€n.

1"r" r_lglalo x lalo

lalArSi lAlo

lAlA:gf lolo

A

----_Asau0lala x lBlB IAlB AB

lalo x 1BlB, e1e1B qi.1B1o AB, B

14,10 1 1B1o lA,lB, lAlo. 1810. 1o1o A, B, AB, O

1a1A ; 1B1o ?talB, lAlo AB, A1B1Bl y,1B1B lals B

1B1B- ;a'1410 | tola 9i ltlotBto x lBlo I ltlE, lplo: ,i lolo

1B1B I 1a1n I t^tt qi lBtB

lBlrry talB I tAlB, tnt., latl tBla

É1a x lAlB I lap, IAÉJBIB

B

Bsau0AB sau B

AB, B, AA, B, AB

L73

Gerra I0 esúe cnea mai frecventà in toatà trumea, dar cea maiftratt^à frecven!à (750/o) apare în populafiile natunale din Ame-rica (indien,i americani), în r-urele regiuni al,e Afriqr" Au^straliagi Orierrùnl mijlociu. În Europa €8 €lue o frecventa de 5l4go7r.Unele triburi de indieni americani prezintà fiecventa de 100f^a genei 10. Altele au o frecven!à de 490/o I0 Si 1tt/o IA sauB7o/s 10 Ei L3o/o 74.

În cazul càsàtoriilor A X 0, B X 0 sau AB X 0, in ca,r'e fe-meira are grupa San€viftà 0 apare o r,educ€re cu 250/o a niumà-r-ului de oopii cu grupa sangvinà A sau B. Indivizii cu gralpasarlgvinà 0 produc in terul sangvin anticorpi A qi B.- fo timpyl,vieÉi intrau-terine, unele celule sangvine de tip A, formate defo'eiusul A, intrà în circulafia sangvinà a mamei (mai ales fur

timpul naqterii cînd se rupe p}acenta) qi acfioneazà ca rr,tigenecare stimuleazà producerea de antioorpi anti-4. La naq'"terea

urmàtoare anticoipii formafi în tirnpul sarcfurii preoedente trecîn, circulafia sangvinà a fàtului, producîndu-i moartea-

Asemenea Asatorii dintre femei cu gl:upa 0 qi rbàr'bafi cualte grupe sangvfure se numes c AB0-incom'patibile.

niistg de asemenea o corelafie directà dintre grupa sang-vinà 0 Ei incidenta uloerulnri duodenal, persoanele cu grupa,saqgvinà 0 prezentînd o probabilitate de 400/o mai mate d:e aface boale, fa!à de persoanele cu celelalte grupe sangvine.

La om .au

mai fost descrr$i qi atli loci georici ce sÈcificó qialte antigene ale grupelor sangvine. AEa sinú detenminan$tigenici M, N gi Rh.

5. FACTORUL Rh

Stud.iindu-se asemànarea imunologicà dintre sîngele uman;i cel al maimalei Maccacus rh,esus, s-a constatat cà serul iepuri-ior imunízalí cu, eritrocite de maimu!à dà o puternicà reacliede aglutinare a eritrocitelor la un numàr mare de oameni. S-aadmis cà oamenii pot conline un factor responsabil de aceastàreaclie, factor desemnat Rh, de la denumirea speciei de maimufó.Ulterior s-a dovedit cà factorul este ereditar gi reprezintà alelelerh+ (Rh) ;r rh (Rh- ) ale aceleiagi gene implicate în determinismulreacfiei imunologice. Alela d.ominantà rh+ (Rh) condifioneazireacfia de aglutinare, pe cînd. alela recesivà rh (Rh-) nu deter-minà reaclia de aglutinare. Oamenii pot avea d.eci Rh pozitív;i Rlz negativ. Cînd cuplurile parentale sînt homozigote, nuapar probleme de aglutinare gi descendenlii se nasc

- normal.

Complicaliile apar însà atunci cînd tata are Rlt, pozítiv iar mama

174

R h- Rh- Rh+ Rh+ of

Rh- Rh+ (coPii hetcrozigolil

Rh- Rh- o x Rh+ Rh- ol. + /\/\t\

50%Rh+ Rh- 50'/o Rh-Rh-

( nn Pozitivdar (Rh negativl

62Ss7s2i gati )

Fig. a9. Transmiterea factorului Rh.

Rh negativ fig 49. În acest caz se nasc copii heteroziggli (rh*rb+ xih- rh- - rh+ rh-). La prima sarcinà, antigenul speci-ficat de factoral rh- al fàtului heterozigot pàtrunde în circulaliasangvinà a mamei gi d,eterminà aici formarea de anticórpi anti-Rh.- Anticorpii apoi pàtrund în circulafia sangvinà a fàtului.Viala acestui, dacà e vorba de prima sarcinà nu este periclitatà,dat.fiind faptul cà titrul anticorpilor nu este prea ridicat. Primanagtere se desfàgoarà normal. La a doua nattere însó, embrionulheterozigot (rh+rh- ) d,eterminà gi de aceasti dati, prin prezenlafactoruluí rh+, sintezà d.e anticorpi anti -rh în organismul matern.Titrul anticorpilor antí-Rh sintetizali la a doua nagtere seadaugà aceluia realízat la prima nattere, dublîndu-se. Mama esteimunizati îa!à, de antigenul rh+ de la sarcina precedentà prinanticorpii deja prezenlf în corpul sàu. Dar acegti anticorpi pà-trund în circulalia sangvinà a fàtului gi, fiind în cantitate mare,determinà o puternicà reacfie de aglutinaîe a eritrocitelor fàtu-lui. Aceastà reaclie de aglutinare stà la baza malad.iei eritro-blastosis foetalis, în urma càreia fàtul moare.

Accidentele d.e eritroblastozi pot fi prevenite fie prin trans-luzli masive de sînge prin care se înlocuiegte o parte din sîngelematern, reducîndu-se astfel titrul anticorpilor, fie prin scoatereafàtului cu mult timp înainte de termenul na;terii (corespunzîndperioadei în care titrul anticorpilor cregte exponenfial) gi cregte-rea lui în incubator.

Sînt încà d.ispute privind natura locusului Rh. Unii admitcà este vorba de un singur locus genic cu mai multe alele, pe

ei

L75

cînd allii consid.erà cà în determinarea acestei reaclii de tipantigen-anticorp intervin mai multe gene strîns lincate (siste-mul c d t), fiecare cu o a1elà dominantà gi alta recesivà. Alelarecesivà rh este cea mai frecventà (55%) în populafia bascà aSpaniei. În Europa, frecvenla genei rh éste de-4}o/o, în Africade 23o/o iar la negrii americaní 28%. Ale1a este foarte pulinfrecventà sau chiar absentà în populalia chinezà gi japonezàca gi în populaliile indiene ale Americii ;i Australiei.

Alela rh+ are o distribulie mai neregulatà, prezentînd toto-datà mai multe tipuri. De exemplu, tipul .RZ0 sau cDe are ofrecven!à d.e 5o/o în populaliile europene, chineze, indiene ameri-cane gi aborigene australiene ;i 600/" 1a negrii africani gi pigmei"IIn alt típ, Rh 1 sau CDe are o frecven!à de 55% în popuialiaeuropeanó, Sí 600/" în populaliile asiatice, 58% în populalia deaborigeni australieni gi numai 25% în populaliile africane giindiene americane.

Persoanele cu Rh negativ produc anticorpi fa!à de celulelerogii Rh pozítive, dar nu are loc gi o reaclie reversà.

Un interesant fenomen de polialelie a fost descris la Drctso-phi,la melanogaster, la care díferitele nuanle a1e culorii ochilorsînt determinate de o serie polialelà. Astfel, tipul sàlbatic areochi de culoare rogie, nuanià determinantó. de gena dominantà7p1*. Diferitele nuanle ale culorii ochilor, aitele decît culoarearogie, se manifestà recesiv fa!à de culoarea rogie a tipului normal.Aga sînt culoarea coral, determinatà d.e alela ú, culoarea sîn-gerie (blood,), determinatà de alela ubl, culoarea eosinà (trf),ciregie (cherry - wù), honey (ú), buff (u\, tinged (ut), pearî(rú) Si iaory (zai). Alela u este recesivà fa!à de toate aceste alele,descrise mai sus gi determinà în stare homozigotà (ulu) culoareaalbà (uhite) a ochilor la drosofilà, ea condilionînd absenla oricàruipigment pentru culoarea ochilor.

Celelalte alele conditioneazà" producerea unor cantitàli varia-bile de pigment, ele fiind recesive fatà de alela u+ dar dominanteunele fa!à de altele, ordinea descrescîndà a dominanlei fiind I

19* nW@ *U)bl ->Uc ->ZlF -*Wi *Wbî -->,tyt -*W0 *Uti *tD.

Culoarea ochilor la om este tot un caracter determinat prinalelism multiplu. Seria polialelà în acest caz redatà în sensuidescregterii dominanlei este urmàtoarea:

*Eó (ochi negri) -> E3t (ochi càprui-verzui) -> Eb, (ochi albagtr:

Eb- E3t (ochi negri cu reflexe verzui)

176

6. VARIANTELE ELECTROFOREIICE$r sEMNrncaTIA LOR

Blectroforeza s-a dovedit a fi o metodà foarte utilà în stu-diul genetic al populafiilor, în starbilirea relafiilor interaleliocqi în studiul fenotipului, la nivel molecular.

Principial ea se bazeazà pe faptul cà moleculele care pne-zintà o anumità încàrcàturà electricà, suspenda,te într-un me-diu aonductor de electricitate vor migra în cîmpul electric sprepolii acestuia, în func{ie de natura încàrcàturii lor. Mediul con-ductor constà din tampon menlinut într-un mediu de susfinereponos precum hîrtia de filtru, acetat de celul'ozà sau gel agar,amidon sau poliacrilamidà. Moleculele id,em'tice migreazà cuaceeaEi rartà qi dupà o perioadà datà de 'timp se vor ooncentraîntr-un acelaEi punct în mediu formînd o bandà distinctà, binedelimitatà. Datorità structurii sale particulare în aminoaeizi,fiecare protei,nà are pe de o parte o formà gi o dimensiunecaracteristicà, iar pe de alta o încàrcàturà electricà netà pon-tivà sau negativà. Într-un cîmp electroforetic, are loc o sepa-rare clarà a diferitelor tipuri de mol,ecule proteinice. Mobili-tatea electroforeticà reprezintà un criúeriu fenotipic de studiual structurii genetice qi variabilitàtii, iar puterea sa de rezolufieeste atît de mare încît pot fi decel,ate diferen(,e dintre douàpeptide de ordinul a numai un aminoacid. O proteinà constadintr-o singurà catenà polipeptidlcà (rnonomm), din douà ca'úenepolipeptidiee (dimu\, din trei (trimer), patru (tetrarner) saumai multe catene polipeptidice (maltim^er). Fiecare caúenà polÍ-peptidicà este sintetlzatà de cîte o alelà. O proteinà multime-ricà poate fi formatà din catene polipeptidioe identice sau ne-identiee. Dacà are loc omogenizarea drosofilelor omorîte într-osolufie tampon Ei omogenatul este supus electroforezei, sepoate studia modelul ,el,ectr,oforetic aI unor enzime cum ar fienzimel,e esterazice specificate de locusul est-6. S-a cons,tataùcà anumite stocuri de musculife diferà prin mobitri'tatea electro-foreticà a esterazelor, uneùe prezintà esteraze c€ se deplaseazarapid într-o unitate datà de timp, formînd o rbandà numità ,,Fsde la cuvînúul englez ,,fastc. Genotipul unor asemenea mus-culile este considerat a fi FF. Alúe stocuri de muscutrife au untip de estqozd-6 care se deplaseazÀ încet în aoeeagi perioadàde timp, formînd o ba,ndà numitA ,,S( (de I'a slow) avînd geno-tipul, SS. În urma unei încrucigàri FF X SS rezultà în F1 indi-vizi heterozigofi (FS) care prezintà ambele modele electrofore-

1,2 - Descifrînd tainele ereditàfii, vol. I T7T

)

+ tice Pentru enzimà, n€-fiind

- o combinalie dintrediferi,ùe r:nitàfi Proteinieesau subunitàti Produse de

fiecare alelà (fig. 50). Re-zulità cà duPà modelulel,ectroforetic, enzima este'

Fenot ip F

6 enotip F F FS

direclra deii,|íirii"" !' razà-6 este o proteinà mo-iíóteiàùor nom,ericà. Faptul cà ln he-

, terozigoli apar ambele mo-dele electroforetice cores-

Levine, 1973).codominanfà dintre celedouà alele. Studiuù electro-

foretic al fosfatazei, a,lca,liiure la drosofilà a rrelevaù aparifia în F1a unei tbenzi, de morbilitate intermediarà FS care repr"ezintà defa,pt o proteinà hi,bridà. S-a apreciat cà enzima este un dimercare ln súare homozigoúà este reprezentatà de caúene polipepti-dic,e identice, pe cînd în: stare hetenozigotà poate fi, formatà fiedin subunitàfi identioe, fi,e diù subunitàfi neidentice. De ase-merf.e,a formarea unei benzi inùermediare, suplimeinrtare bénziiF gi ,benzii, S, indicà exist'enfa unei rel,a'fii de oodominanfia din-tro alele. Desooperirea unei a,lele O oane oondilion'eazÀ a,bsenlaoricàrei ,benzi' ,pe eoloama electroforeticà indicà existenfa, în de-,terr:ninismul genetie al fosfatazei alcaline, ,a unei serii polÍalele(4 s $i o).

Din com'binrafia S X O r,ezultà ur fenotip SO în cane se ma-nifestà un fenornen de dominan!à inr,complertà.

Electr,oforeza a deveurit astfel r-nr- €xc€lent mij[oc de dece-trar,e indirectà a genotipului prin auraliza fenotipului la nivelmolecular.

Tot un caz de polialelie se întîlnegte gi în determinismulgenetic al culorii blànii la iepuri de casà 9i a fost evidenliat prinîncrucigàri dialele între iepurele albino (rt) complet lipsit depigment melanic, himalaiai (chù) de culoare albà, dar cu extre-mitàtile de culoare neagrà gi chinchilla (t',ù) de culoare grigi tipul sólbatic (CC) de culoare neagrà. Alela C este dominantàfa!à de toate celelalte alele (tabelul 9). ferarhia dominanlei esteCebùc.

L78

!!s F.s

' .ss

Fig, 50. Reprezentarea diagramaticà a fe- pUnZà,toare atît, alel,ei, Fnotipurilor bectroforetice privlnd euzima cît Si alelei S înseamnà càesteraz6 6 la D. T9*ogaster (din esùe vorba de o rela{ie de

Tobclul 0

Scrla dc alele pentru plgmontaÉablànll la lepurl

Fenotipuri Genotiputi posibile

negfuChiuchillagri deschishimalaianalbino

CC, Cúh, 66h, Cccch Càh

Cch dah, CghC

chcL, chccc

7. INTERACTIUNEA GENEI,OR

Sînt numeroase cazurile în carre p€rrtru exteriori,zarea unuisingur carasùer colaboreazà mai multe perechi de g,ene d'ininúeracfiunea càrora pot apare în F1 oaractere cu totul noi, iarîn F2 apar allte rapor-Luri de sqgregare ce se, ab,at aparent de laraporturiile mendeliene. Perechiùb de gene car'e interacfioneazà,nu ocupà 'acrelaqi looq^s .pe cro'Inozomi omol,ogi, ci ele sînt pla-sate fie fur [oci di'ferifi pe aÉ€la$i cromozomi sau în cromozomidiferiti, neomoLogi. Ase,menea gene sint nea,lele.

Interacfiunea genelor nealele poate schimba uneori felurilefenotipului fàrà a schimba numàrul fenotipurilor. De asemeneacînd. douà perechi de gene nealele afecteazà acelagi caracter,numàrul fenotipurilor poate fi mai mic decît numàrul genoti-purilor. Genele nealele pot interacliona contribuind prin catenelepolipeptidice pe care le specificà 7a alcàtuirea unei moleculecomplexe care servegte ca produs genic funcfional. Holoenzimatranscriptazei de la E. coli (arpB'oor) este codificatà de 5 genenealele d, p, p', ar gi o . Tra fel, enzima lactic dehidrogenazlde la om gi alte animale reprezintà un tetramer (ArBr), celepatru catene polipeptidice fiind specificate de d.ouà gene nelin-cate A gi B, care cod.ificà catene d,e aceeagi lungime, d.ar careau secvenle diferite de aminoacizi. Se pot produce cinci tipuride molecule de lactic ilekidrogenozd, care diferà în reaclia 1orfa!à de diferite substraturi An, ArBr, ArB, gi Ba. Tati deci càd.oi loci produc în mod normal 5 produgi funcfionali. Se cunosc,însà gi alele rare ale locilor z{ ti B gi indivizi hibrizi care potforma f2 tipuri diferite de lactic dehidrogenazi. Un al treilea

t79

locus C codificà o altà polipeptidà care intrà în alcótuirea enzi-mei lactic dehidrogenazó, din testicule gi spermatozoízí, crescîndnumàrul potenfial de lactic-dehidrogenaze diferite ce se potforma în lesuturile germinale. în acest caz interacliunile geniceapar imediat dupà traducere, înainte ca produsul genic sà fieplrs în circuitul metabolic.

Diferifi loci nealelici care codificà acelaqi produs sau unpr,odus similar se numese izoloci. Nonalelele de la nivelul izo-locilor se numesc izogene.

În cazul enzimei lactic dehidr,ogerLaza pot interacfiona treiizoloci spre a produce mai multe izoenzime similare lactiede-hidrogenazice care s-au numit isozime.

Izol.oci sub forma a douà perechi de gene duplicate sînùimpiicafi în determinar€o pigmentafiei pielii la om qi a ca-riopsei la grîu ca Ei a pigmentaliei unor flori.

Tipurile de ARNú gi ARNr pot fi codificate de izoloci. LaE. coli se par'e cà existà gene unice pentru fiecane tip de ARNú.La drosofila existà circa 60 izoloci pentru ARNú reprezentîndcirca 750 gffi€, localizate în circa 100 si,turi în tot genomul.Existà deci în medie circa 12 izol,oci pentru fiecare tip deARNú.

Un caz de interacliune a genelor fàrà a se modifica rapor-tul, de segregare, dar care duoe la apari ia de fenotipuri noi afost întîlnit la încruciqarea dintre rasa de gàimi Wgandotte cucreasta tip ,,trandafirs qi rasa de gàini Bruhmns cu creasta tip,,m,azàre66. Cele douà caractere sînt dominante fa!à de tipul,,creastà simplà36 întîlnit la rasa Leghortt.

Bateson gi Punnett au admis cà tipul de creastà ,este de-terminat de intenacfiunea a douà gene nealel,e R 9i P.

RRpp x rrPPWyandotte Brahmas

RrPpcreastà ,,nucà"

Din interacliunea genelor do- RrPp x RrPpminante R gi P apare un nou 9/16 RP creastà ,,nucà"fenotip-creasta ,,nucà." iar 3/16 Rp creastà ,,trand.afir"din interacliunea genelor re- 3/16 rP creastà. ,,mazàre"cesive lri !. apare alt nou fe- 1/16 rp creastà simplànotip, creasta simplà.

180

Se cunosc însà qi oazuri de interae{iune genicà în care areloc atît schimbarea raportului de segregare cît qi aparifia defenotipuri noi. Acestea sînt complem.en'taritatea, epistazia Eipolimeria.

S. COMPLEMENTARITATE GENICA

Este fenomenul prin care, din interacliunea a douà sau maimulte gene nealele rezutrtà o expresie fenotipicà diferità deaceea determinatà de fiecare g,enà în parte. Genele comple-mentare pot fi dominante sau recesive.

Se deosebe$te o complemeultaritate dominantà qi o comple-mentaritate recesivà. În eazul complementaritd.lii dominanteeste vorba de o interacliune dintre gene nealeie în care expri-rnsreà unui anumit caracter necesità prezenla concomitentà adouà sau mai multe alel,e dominante. Astfel, Bates,on gi Pun-nett au încrucigat douà varietàli de Lathyrus odoratru cu florialbe qi au oblinut în F1 plante cu fl,ori r,oqii. Aceste plante dinF1, auúopolenizate au dat o descendentà în F2, oar€ a segregatîn raportul de 9 roqii la 7 alibe. Simbolizatà, experienla aratà,astfel:

AAbb x aaBBalbà albà,

F, AaBbroFr

rogii

albe

Pentru apa,rifia culorii roqii a petalelor, este necesarà in-teraefiunea a douà gene nealel,e dar în stare dominantà, A Si B"Toate oombinafiile în care în stare dominantà apare doar unadin aceste gene nealele oondi{ioneazà culoarea albà a petaLe-lor. De asemcnea, culoar€a al'bà este determinatà qi de alelelerecresive ale aceslor gene nealele.

Abaterea de lb raportul mendelian de segregare este numalaparentà. Altfei, chiar qi acest fenomen de comptrementaritateconfirmà tegite mendeliene ale segregàrii.

AaBb x AaBb *9/16 AB I3lt6 Ab I3116 aB \7t1rc au I

181

Existà qi o cornplemcnfuritate rer,esi,uó, in sare manifestareaunui a,numit caracter ,necesità prezenfa ooncomittsntà a douàsau mai multe gene nealele, recesíve. Acest tip de interacfiunegenicà a fost observat cînd s-a studiat ereditatea formei capsu-lelor de la ,traista ciobanulnri (Ch:pselln bu;rsvl-paseor*). Încnr-cis,îndu-se o varietate cu capsulà ùriunghi,ulara cu o uarietatecu capsul,a ovoidà se ob{in în F1 plante cu crapsule triuqghiu-lare. Ín Fz apare un raport de segTegare de 15/16 pliante cucapsula ,trir:,nghiularà qi l/16 pÌ,ant€ cu capsula ovoida. Sim-bolizínd experienfa se poate scrie:

A1 ArAsAz x àraràz3z. triunghiularà | ovoidàFl Ar er As aa

triunghiularà

e/163ll6

F2 3/161/ t6

Lini,a (-) semnificà prezenfa, fie a alelpi dominante (A1 sauA2) fie a celei recesive (a1 sau a2).

Rezul,tà cà pentru a se exprima caracterul de cupsulà ovoi-dà, tr.ebuie sà interacfioneze douà gene nealele in ltare reoe-sivà (q $i oz).

S-a co,nstatat cà aceastà plantà este un tetraploid prezen-tínd nu doi cîte doi cromozomi omolqgi, ci patru cîte patru cro-mozomi omologi pmrtru fiecare pereche, din care catrzà s-a creatlrosilbilít'atea duplicàrii genirce prin poliplloidie, rezultf,,nd genesimilare ca acfiune 'dar care sînt, nealele situate în, iloci diferi{i,moqtenindu-se ind,ependent.

I autolrclenizareAr-A'-ìAr - &z &z i tSTtS triunghiularàararA2- |àr ?r àz 4z Ì l/16 ovoidà

9. GENE INHIBITOARE SAU INÎERACTIUNEDOMTNANTa $r RECESTVa

Gene inhiibiúoare domin'ante au fost observate la mumeroaseorganisme. La pàsàri, din încrrrciqa,rea rasei, Leghortl (penajalb), cu rasa Wgwdoúúe (penaj alb) se obtine în generafía Frpàsàri cu penaj altb, ia'r în genenalia Fz'rezultà o proportie de

182

13 alh :3 colorat. Acest raport care apare ca o excepfi,e de 'lasqgreganea mendelianà se datoreqúe faptului cà rasa l"qlwrncu pen;aj alb posedà, î,n ac''elaqi timp, gena dominantà C (de lacolour), care determinà culoarea neqgrà qi o genà inhibióoaref care, în stare dominantà, supreseazà rnanifestar@ gerrei C.Rssa Wyandott€ posedà gena c (alela recesivà a geurel domi-manrúe C) care determinà în fenotip absenta pigm€nitatiei qi genai, alela reoesivà inactivà în supresia genei, C.

fn îrncruciqàri cu rase cu penaj colonat, rasa Leghúm secomportà ca domina,ntà pe cînd rasa Wyondotte * comportàca recesivà.

Indivizii de culoare al,bà apar în toate cazuri,le în ca're es'teprezentà gern I ca qi în cazurile în care este prezentà alelarecesivà c. Indivizii cu penaú colorat apar numai în cazul încare gerlrù C scapà de con'trolul genei I qi este alàturi de gena i.

C C I I l-eghorn alb x ccii Wyandotte albF. C cli (alb)

9/16 CcIi alb I

3/16 c c I i. 1t_- - I,t arb : 3 nesruF, 3/16 C cii negru I ^" "

1116ccii alb I

10. GENE EPISTATICN

Cînd douà sau mai mulJte gene acfioneazà asupra acelnriaqicaraoter, o genà poate mascra efectul celeilalte gene, cam înac€ea$i màsurà ln oare efectul unei gene recesive esúe mascatde alela sa dominentà. Aoest fenomen prin care o genà poatemasca sau supres,a efectul altei gene nealel,ice (situatà într-una1i0 losus) a fost m'umit epistazie. Gena epistaticà este o genà ceaparfine u,nei perechi de alele, care împiedicà m,anifestarea ale-lei domilrante dinúr-o altà pereche de altele. Gena supresatàpoartà numele de Eend" hipastaticd.

Fenomenul de epistazie este implicat în aproape ,toaúe ti-purile de interaclitine genicà. Domínanfa implicà supresia ge-nicà intra-alell7ci (mascarea expresiei umeii aleLe recesive decàúre alela dominantà din aoeùagi I'ocus). trpistazi;a cuprinde su-,pnesi,a genicà iruter-alelicó (masoans pe care o exercità u,n locusgenetic {rsupra expresiei ,unui alt locus genic). Raportul feno,ti-

183

pic clasic de 9 : 3 : 3 : 1 observat l,a desoendenfii unor pàrinfi di-hibrizi se modificà datorità epistaziei În raporturi care repre-zintà cornbinalii ale acestuia.

Gena epistaticà poate fi dominantà sau recesivà.

a) Gene epi,stutice dominante (12 : 3 : 1)

Fenomenul epistaziei dominante a f'ost observat la o încru-ciEare între Auenn tatua cu boabe negre qi Auena satiua (ovàzcuitivat) cu h:oabe galbene.

AABB (boabe negre)

F1

F2

x aabb (boabe galbene)I

AaBb boabe negre

,, AABó negrcLa/

Aabb3 aaBb cenugiiI aabb galben

CeIe 12 oombinafii care conlin gena dominantà, A, în starehomozigotà sau heter.ozigotà sînt de culoare neagrà; 3 combi-nafii care au gena dominantà B în stare homozigotà sau hete-rozigotà qi nu confin gena A sînt de culoare cenuqie iar ocombinalie cu genele recesive ob pruduce boabe galfbene.

Din eele de mai sus rezultà cà gena dominantà A împiedicàexpresia genoi dominante B ce determinà cul'oarea cenugie qi

este deci epistaticà pe cînd gena dominante B, a càrei acfiun'eeste înhibatà, este hipostaticà.

b. Gene recesiue epi,statice (9 : 3 :4)

Un exemplu de epistazie recesivà ni-l oferà ,er,editatea cu-lorii blànii la anumite rase de cîini. La încruciqarea o douàrase de cîini, una homozigotà albà cu una -homozÍgotà maron,se obfin în F1 numai descendenfi de cul.oare neagrà. Încruci-gàrile indivizilor din F1 au produs descendenît în raportul desegregare I negru : 4 alb : 3 maron, ceea c€ se poate demonstraln diagrama de mai jos:

184

B Bcc (alb)

F1

x bbCC (maron)t

BbCc (negru)J

RbCc negrú : 9Bbcc alb-------.--bbCc Íl3.roo:3 4bbcc alb-.---

În acest caz, alelele B qi b produc culoarea neagrà Ei res-pectiv maron, dar numai în prezenla alelei dominante (C) de laun alt locus. Pentru a distinge aceastà inter,acfiune de o relafiedominantà qi recesivitate, se spun€ cà. cc este epistatic fa!à deB sau b,' adicà homozi'gofia alelei c previne formarea oricàruipigment, indiferent de alelrele pentru alte culori. Efectul pecare alelele cc î1 au asupra lui B poartà numele de epistozierecesiud.

11. GENE DUPLICATE CU EFBCT CUMULATIV (9 :6 : 1)

Dacà condilia dominantà (fie homozigotà, fie heterozigotà)la unul din loci (dar nu la amîndoi) produce acel,aqi fenotip, ra-portul de segregare în F2 va fi 9 :6 : 1. De exernplu, trnd'e sîntimplicate g'ene epistatice în producerea anumitor substanle cumar fi pigm,enlii, g'enotipurile dominan'te de La fiecare l,ocus potfi considerate ca producînd în mod independent o unitate depigme,nt. Astfel, gen,otipurile A-bb qi aoB - produc fiecare cîteo unitate de pigment, avînd deci acelaqi fenotip. Genotipul aabbnu produce pigment, dar în gen,otipul A-B- efectul es,te cumu-lativ Si in consecin!à vor produce douà unitàli de pi;gment (ocantita0e du,blà).

Se poate constata cà atr:nci cînd epistazia opereazà între doiLoci genici numàrul feurotipurilor ce apar la descendentii rurorpàrinti dihibrizi, va fi mai pufin, de patru deqi segregarea areIoc pentru douà perechi de gene cu efecte fenotipice diferite..A.ceasta se datoreqte mascàrii efectului unei gene de càtrecealaltà, generalia Fz confinîrnd numai trei clase fenotipice înloc de patru iar în cazul oomplrcmentaritàfii arumarul claselorfenotipice se reduce la douà aga ctun reztrltà din úahelul 10.

IF"Î

1

185

Tabchtl 10

Genotipurile

Ccle gase útpurl de rapoÉurl eplstatiee

elslslr

fnteracfíune dominanta gi recesivà

Gene duplicate cu efect cumulativ

Erprimarea în, fantotiP a genelar

12. PENETRANTa $I EXPRESIVITATE GE0ÙICA

Genotipul reprezintà totatitatea factorilior ereditari (gene-lor) pe care o specile, un individ îi preziortà îm struchya sa gel-

neticà (gen,om). Aceste gene se manifestà în afiumite conditiide mediu. Din interac{iun€a genotipul'ui cu mediul rezultà fe-ulotipul, care reprezintà to'talitateia caract€nelor $i însuqirilJor(morf'ologic€, hioehimice, de comportament etc.) pe care unorganism le prezintà I'a un moment dat, in oondílii determinratede-mediu. În interac{iunea oomplexà genotip-mediu, genotipuldeùerminà limiùele între care só poate manifesta fenotipul. Înfeno,tipuli a doi indivizir oe apartin ,aceleiaqi specii pot sà aparàdiferenle, rru rmrnai debermina,te de n,atura genelor, naúurà carepoate fi dominantà sau reoesivà, ci Ei de varialia aourdiliilor demediu. Mediul deci poate influen;fa raportul, fenotitpic de segre-gare. O genà prezentà la toli indivizi'i fu o anumità oatqgqrieóenotipicà în anumite oondifii de me'diu poate sà s,e exprime înfenoúip la ùoli indivizii, caz în care se spune ca mani està openetraor!à completà s,au de 1000/0, dar în al'te oondilii de qe-diu, d'eqi pneze,ntà la tofl indivizii, ea nu se manÍfesta 'decîtla unii di'n'tre ei gi în acesú oau se sprute cà o as€nr€{ogà genà

186

are o penetranfa incompleta sau are o penetran!à sub L000/0.Prin penetrantà se întelege deci frecvenfa cu care o genà sauo combinafie de gene este exprimatà feno'tipic. De exemplu,genele care au fost analizate de Mendel (4, B etc.) prezinrtà openetnanfà completà, ele manifestîndu-se la tofi indiviziÍ pur-tàtori ai lor, pe cînd genele care condifioneazà, rezistrenla sa,usensibilritatea la bolli au penetran!à redusà, irroompletà, deoare-ce ele nu se exprimà la ,to!i indivizii, ci doar Ia ,aoeia cane auf'ost supuEi unei infec{ii oaracteristice (aoeasta reprezenthd oanumità condi[ie de mediu).

Penetranta este un fenome,n de tip ' totul sau nimic: pene-tran{à completà sau penetran{à incompletà. Un ex'emplu foarteconvinrgàtor de penetran{à nù-l oferà cazul a doi gemeni mono-zigrof,, deci care au aoeeaEi structurà genotipicà,'dar lal care launul, gerìa perrtru ,,buzà iepure6s esùe penetrantà (se exprimà înf'enotip) iar la celàlal,t este neperetrantà (nu se exprinnà înfenotip).

Penetranfa incompietà caracterizeazà multe gene dominante.Schizofrenia este determinatà în unele c,azuri de douà gene do-miurante cu penetran!à incompletà.

Influenla me'diul,ui se exercità nu numai asupra numàruluide indivizi care exprimà în fenotip o arÌumità genà ci qi asu-pr,a Írltsnsitàtii exprimàrii în fenotip a acelui caraeter, as-pect cane se numegt'e erpresiuitate gen'icó.

Oda,tà ce gena este penetrantà ea va man,ifesta frecvent va-rialiuni în expresia sa fenotipicà. De exemplu, polidactiùia laom, determinatà de o genà dominrantà, prezinúà expresivitàfidi,ferite: mîini normale - degete suplimentare la picior, pi-cioare normale - deget'e suplimentare la mînà, polidaetil.iaapail:E l,a mîna dr'eaptà dar nu la stîurga, la stînga dar nu ladreapta, sau la am'bele mîini qi picioare etc. În condilie hetero-zirgotà (Pp) gena polidactirliei are o peuretramfà de mai pufin' de7000/o càci uneori ea nu reuqeste sà producà vreun efeet feno-tipic detectabil.

Nepenetranla unor gene înseamnó, 00/o expresivitate.Datorità condifiilor diferite de mediu, aceeagi genà poate

produce sfecte foarte evidente la unii indivizi în timp ce laal,!i indivizi efecte abia vizibile.

Gena recresivà ?rg ca,re determinà caracterul de aripi vesti-giale la drosofiilà prezintà o expresivi'tate diferità în funcfie de

t87

temperafurà: la temperatura oamerei apar arlp1 vestigiale dareare se pot apropia de dimensiunea aripilor normale, pe cînd latemperaturi scàzute apar aripi vestigiale propriu-zise (extremde mici, rudimente de aripi).

Mediut intrauterin la mamif,ere, chiar pentru gemeni mono-zi,gofi poate fi foarte variabil, din punct de vedere al pozilieiocupate de gemeni în uter, aI conexiunilor placentale ,si acesteapot afecta diferit expresivitatea genel,or 1a cei d'oi gemeni.

Varialia expresività{ii unor gene se poate datora însà Eiinfluenfei unor aite gen,e cdr€ se numesc gene modificatoore,dintre care unele sînt reducdtmre, slàbind expresia fenotipicàa altei gene neal,ele, iar altele sînt amplificatoare, întàrind ex-presia fenotipicà a unei alte gene nealelice.

Penetranla qi expresivitatea pot altera raporturile cunos-cute de segregare Ei sà determine ca ades,ea fenotipul sà nuexprime fidel genotipul. Primul care gi-a dat seama de irnpor-tanfa mediului în expresia genicà a fost Wilhelm Jahonnsen,cel care de fapt a introdus qi noliunile de genà, gmotip Eifenotip.

Existà qi cazuri de imitalie fenotipicà numità fenocopie. Inaeest caz un ac,elaEi caracter poate fi produs de alele diferitedar care aclioneazà în medii diferite.

Indivizii care diferà genotipic Ei oane sînt diferili în acelagimediu pot deveni fenotipic similari cînd condiliile lor de rnedir.ldiferà. Asffel, tulpini de E. coli his+ gi his- cr,esc Ei respectivnu eresc pe mediu de cul'turà lipsit de histidinà. Dar tulpinahts- va putea creEte ca Ei tulpina h.is+ dacà mediul de culrturàeonfine histidim'a. Astfel o oelulà his- pe un mediu de culturàcare oon{ine histidina este o fenocopie sau o imita{ie fenotipicàa unei celule his+. Tot astfel un individ uman car,e suferà dediabet - m,aladie ereditarà care determinà producerea unei in-suline anormale

- dacà ia insulina sub formà de medicamentva deveni o fenocopie a persoanelor genetic normal,e pentrugena insulinei qi care nu iau insulinà. Existà qi ca:zuri de feno-copiere a caracterel,or anormale. Astfel, embrionii umani nor-mali ai càror mame au folosit talidomida se vor dezvolta încopii cu diferite rr,ralformafii care imità (fenocopiazà) persoaneanormale ce suferà de maladia er,editarà focomelin cauzatà deo singurà g,enà mendeli,anà în condilie homozigotà.

lBB

13. DETERMTNISMUL GENETIC AL CARACTBRELORCANTITATIVE

Cercetàrile lui Mendel s-au referit la analiza unor caracterediscrete, discontinui, care se încadr'eazà în clase discrete de tipneted - zbîrcit; gal,ben

- verde.Johansen a cerceta't însà modalitatea de transmitere ,a un,or

caractere ce pr'ezintà variabil,itate continuà, cunoscute dreptcaractere cantitative. El a lucrat tot pe o planrtà autogamà ryíanume pe fasole. Dintr-un lot initial el a seleclionat L9 boabede fasole, fiecare avînd o greuta,te specificà qi le-a cuitivatspre a obline 19 linii de fasole, care în virtutea faptului cà fa-solea,este o plantà auúogamà erau pur,e* qi în ceea ce priveqtecaracterul greutàlii. Din fiecare linie de fasole a selectat apoiboabele ceie mai usoare qi boabele ceie mai grel,e pe care le-'acultivat separat. În fiecare an a ales din descendenla boabelorugoare, pe oele mai gr,ele pe car'e de asemenea le-a culrtivat se-parat. Din cele 19 linii pure d,e fasole sînt reprezentate graficdoar liniile 3, 11, 13,qi 17 (fig. 51A). Comparînd aceastà di-qtri-bulie cu distribu{ia greutàfii 'boabelor la genitori, în mod sur-prinzàtor acestea erau simil,are

Astfel, o plantà ieqità din boabe de 150 mg aparlinînd iinieia 3-a dà naqtere prin autofecundare la descendenfi ale càrorboa,be au o greutate rnedie de 200 mg afiatà între limitele 150

Ei 250 mg. O situafie asemànàtoare se înregistreazà în celelaitelinii. Johansen a atribuit greutatea rnedie a boabelor ca dato-rîndu-se constituliei geurotipice, pe cînd variafiii'e pozitive saunegative fafa de aceasta ca da,t,orî,ndu-se fluctuafiilor de mediu.Din suprapunerea u,nei multitudini de cunbe de distributie de-

t tNi/,, :I

I

'i

LiiilAlí Llti,iAl2 LiNi...îlirctifoíectJnilare ù

"rfafecundare,j;-'.a.:,:a.i;i-'a.ii- |.. t.1"

-/ ,/--l--:----')v y'.._.-__::*-i 5C 2-',; ?tC 1,50 500 55A

a;ttofprundare Irlf'l

,.--\,./ -,--\- -1*)>'-

5C0 55C (AC 750 80 0 85{}

î r,: ! I i4i r A B ;-t,.i.n i L 0R i.ì\t,.r,r

Fig. 51. A. Selecfia celor patru linti în experieula luiJohansen (explicatii în text).

+ Linia purà reprezintà totali,t'atea descendentilor unei pi,ante aut&-game hcrnczigote.

189

Toisf ributie

?00 900

Fig.51. B. fneficienfa selecfiei în cadrul liniilorpure (explicafii în text).

termi'natà de sienotip a rez{.rltat o aurùà a distribu{iei nor,malea frecven!,elor (fig. 518). Aceastà experientà ,a demonstrat càdife,ritel€ condi{ii de mediu pot produce diferen{,e fenotipiceîartre irudivizi, dar aceste diferenle nu se rnoqtenesc.

Greutatea boa'belor de fasole apare ca un caracter cantita-tiv care prezinrtà o variabiUtate de tip continuu, oecilînd dela o lraloare minimà la una maximà în cadrul unei populafiidate.

Johansen' a tras din experien!.ele sale o cvncluzie cu im-portan{A rna,jorà pe rtru pnactica amel,ioràrii plantelor qi anima-lelor (caracterele cantitative fiind de o excepfio,naH wrloarepentru aceas'ta, refel'i'ndu-se la caracteristicile de pro-duc$e) gi anume cà selecfia este ineficieortà în cadrul liniilorpurc. Selecfia este eficientà numai in cadrul unei populatiiheterqgene (cele 19 linii de fasole luate în ansarnblu). Darcercetàrile sale nu au oferit o rezolvare fll privire Ia naturagenotipuri-lor care stau la 'baza celor 19 linii pure diferite.

Observa{iile efectuate de suedezul Nilsson-Ehle (1910)au aruncat o lumina Ei asupra acestei probleme.

Încà din 1906, Yule sugerase ca variafiile cantitative con-tinue ar trrvea la bazà o multitudine de gene individuale alcàror efect se cumuleazà, este aditiv. Asemenea idei avuseseqi Mendel cînd a fost pus în situafia de a explica varia{iile înintensitatea culorii roqii la florile de mazàre (de la nosudeschis la rogu închis).

Nilsson-Ehle a sta,bilit prrn experier,r,{e de hidridare lagrîu cà în determinúsmul culorii ,boabelor intervin trei perechide gene neale,tre care condi{ioneazà sim'teza trnei eantità{i anu-mite de pigment.

Îrrcruciqînd un soi de grîu cu boabe roqii (AA, BB, CC) cuun, soi cu boabe albe (w, bb, cc) în F1 se obfin plan,te cane for-mau boabe de culoare rogie (AoBbcc). Prin autofeeundarea in-divizilor din Ft a oblinut în F2 un raport g€neral de sqgr€gare

190

d€ 63 rosii la I atbà. Dar cu-loarea rosie prezeruta dif€r'itenuanfe, sugcrînd existen{aunei sqgrqari pentnr trei ge-n€ echivalente cu efect cu-mtrlativ (aditiv) fie. 52.1

Se deduce eà aparifia ctr-lorii roqii este determina,tà detrei perechi de gene urealelecu efect curnul,ativ ,AA, BBCC, iar culoarea aIbA de ale-lele lor cn, bb, cc. Nilsson-Ehle a tras concluzia ca nu-màrul total al alelelor domi-na,nte a celor trei perechi degtene determinà graduJ depigmentare. Cu alte cuvintefiecare genà dominantà poatefi oonsideratà cu o conúribu-{ie de o dozà }a culoare rogieiar efecttrl fiecarei doze esteqwl qi oúitia.

L,àsînd Ia o ,pafte a tneiapereche de g€ne, se poatecalcula probabilitatea de aobfine 0, l, 2, 3 qi 4 doze alea,lelelor domina,nte din în-crucigarea AaBb X AaBb agacum rezulta din fig. 53.

Observafiile facute deNilsson-Ehle pot fi explica,teprin prezenfa genelor dupli-carte, svînd în vedere faptulcà grîul este o plantà hexa-ploidà, La care, deci, fiecarelocus este reprezenrtat pri,n 3perechi de alele, ceag ce dis-tinge însà aceste rezulta,ùe de cazurile simple de complemeurúa-ritate recesivà este faphrl cà, îrr* arLresnfa dominanfei, seglegrareanu d,uce la aparifia a numai douà clrase fenoti,pice, ci caracterulculoarea boa,belor se comportà asemanàtor unui caracter ca-nti-

I

II 20)

alb #r0s"

Fig, 52. Segregarea caracterelor în cazulîncruciglrii a douó soiuri de gîîu cedifetà prin ttei, petechi de gene caredeterminó culoarea boabelor. Distribuliafrecvenfei culorilor este prezentatA înhistogramA (dupA Strickberger, 1976).

O

tativ.

191

Penlru A Penlru I Pentru A îi B

aabb:t/re

Numàrul tciolct.,doze"o"'dómtnonte

Probóbir\lolcOtotclà

-B B =1/t., '--AA=)c <i- g5=t/z--oo =%

-86 =lluAa-1!z "'l-ad-r/z\o o=h

.-E à=1/':aa -=., */ g6=1,/t-1

o6=y,.

AABB: %e .\ ..-4qg6:70 =\AAbb = '46 \>^.:t

: 11,

/. (roiu locrte inshis) Vs

3(ro?c ?rcr,'s)

0 (olb )

Aagb :1/c t- 21ro9u),, ./Aabb:'rB,-,-r./

raBB-'/',s/ -\a."0: t1s --') l(roguPot)

oAt

L/s

lt/ts

Fig. 53, Segregarea caracterelor-'îtr cazul încruciqórii unei varietàfi de gdu cuboabe ro$ii cu o varietate de grîu

n"lal"nilialbe. Rapoît de segîegare: l5 (l :

Prezenla fiecàrei gene se faee simlità în schimbarea gradatàa fenotipului, genele cumulîndu-qi efectele par{iale. Ideea unuiefect de aditivitate cantitativà a genelor asupra fenotipului(adesea numità ereditate can'titativà) a fost o idee r,evolufionarà,ea furnizînd baza genotipicà pentru curba normalà adesea gà-sità la varia{iile caracter,el,or cantitative cum ar fi înàlfirnea,greutatea, culoarea etc.

Williams (1964) prezintà un interesant exemplu de polime-rie aCitivà la porumb, al càrui endosperm are o constitufi'e tri-ploidà (rezultat din feeundarea nucleului secundar al saculuiembrionar care este 2 n de càtr,e unul din nucleii .spermatici(n). Relalia dintre numàrul dozelor din gena Y, care eondi-lioneazà culoarea galbenà a endospermului Ei conlinutul înrzitamina A al ac,estuia $i gena A care determinà culoare,aalbà a endospermului este redatà în tabelul 11.

Tabalul 11

cH'XlHil""l'T#:#"Hl*l,"Ji"ffi l'fff"'

(dln Giosan gi SAdescu, 1972)

Doze d.e Y Genotipul Vit. A (unitàtila gram)

0

I2

vyvyvY

YYYYIrY

0,05

2,25

5,00

7,50

1,92

Se cunosc foarte multe cazuri de pol,imerie cu situa{ii si-milare celor descrise rnai sus, dar pro,babil cea mai famiiiaràeste ace€a a pignentatiei pielii Ia om în care participà cel pu-fin patru pereehi de gene (gene cuadruplicate). Presupunîndu-sedorainaarfa genelor care produc pigmentafie Ei aditivitatea sim-plà a fiecàrei alele dominante, se cun'osc n,ouà cl,ase diÎeritede pigmenta{ie în care numàrul genel,or donninante este cu-prins între 0 Ei B.

Cazul siurplificat aI pigmeritaliei pielii la orn este redat deformulele genotipice PLPLPyP, pentru negri i Pt/rPrlp, pentramulatri tipici ;i Pt:!t/r?, pentru albi, din care rezultà cà înd.eterminismul acestui caracter cantitativ (d.eterminat în uitimàirstan!à de cantitatea de pigment melanic sintetizaté, în mela-nofori) intervin douà perechi de gene nealele PrP, îi Pr!, 9icà intensitatea pigmentaliei este cu atît mai mare cú cît mairnulte alele d.ominante intrà într-o constitulie genotipicà datà.Din càsàtoria unui negru (PtPlPzPr) cu o femeie a1bà (ft|tfrfr\reaa.Ttà" copii mulatri. Din càsàtoria a doi mulatri (PtptPrp, xx PTPLPT?,) u^ rezulta o descend"entà în care aparg o segregareîntr-un raport diferit de cel mendelian în caatl dihibridàrii 9ianume 1 negru (PLPÌzPz) 4 mulatru închis (PLPtPzPz sauPrPrPzP),6 mulatru tipic (Pt?tPrfr), 1 alb (!rqrfr?r).

Se poate deci conchide cà bazele geneticii mendeliene potexplica- ereditatea caracterelor cantitative (care se prezintà cuo varialie continuà) prin acliunea unui numàr mare de gene(polimerie sau poligenie).

14. GENE I..E[ALE

În 1905 geneticianul francez Cuénot a studiat o varietatede goareci cu blgn1 galbenà. în contrast cu ;oarecii ctl blanàcenugie ce reprezintà tipul sàlbatic. Prin încrucigarea goarecilorgalbeni cu ;oareci cenugii dintr-o linie purà, el a observat uniaport de segregare 1 : 1. Aceasta sugereazà cà alela pentrublàna galbenà este dominantà asupra alelei pentru blana cenugie,În urma încruci;àrii între ei a goarecilor galbeni, Cuénot a regà-sit descendenfii galbeni gi cenugii în raportul 2:1, o deviereclarà de la propò4ia mendelianà de 3: 1. Aceasta 1-a dus laconcluzia cà goarecii galbeni sînt het"erozigo!í. Raportul de

t$ - Descifrind tainele ereditófii, vol. I 193

segregare de 2: l, în loc de 3: I arati ci l/4 din indivizi audispàrut gi anume homozigotii dominanfi.

v/+Y/Y Y/+

neviabili galben

x vl+vl+ +l+

galben agouti

25%/l

50%

Segregarea genei pentru culoare galbenà Cy)încrucisare Yl+ X Y/+

25%

la qoarece, într-o

De fapt, raportul t:2:l este transformat în raportulr 2:1 prinmoartea clasei homozigote gal'bene în uter.. Tr,elbuie de rnemar-cart cà gena Y esùe dnrnùwttú pri'n efectel,e fenotipice asupraculorii; blànii, în plus ea esùe gi nacesiaó în efectul lierùal, deoare-ce alela trebuie sà fie homozigotà penrtru a determina moarteafàtuliui. Se spune cà g€na Y este dominrantà vizibil gi recesivàletal. Efecte'le aoesúei gene sînt, plei.otropdce adicà gena are unefect fenotipic multiplu asupra culorii Ei asupra viabilitàfii.

În afa,rà de I'etalitatea de dominantà, în narturà se întîlneq,teq,i o letuli.ffie de recesiaitute descoperità de Baur (1930) IaAnúirrhinrtm mnjus var : cruireq. 'În urma autofecundàrii are locîn F1 urmàtoarea segregar€: L/3 plantre cu frunze verzi,, l/3ptanrtre cu frunze verde-pal' qi 1/3 plante cu frunae galbene, agacum rezultà di,n, ta,berlul 12.

Tùclul '12

Letalltatoa ds reoeslvitato la Antlrrhinum

cenotirurl Fenotipul

verde (normal)

verde pal (aurea)

gAbui (letal)

ccCc

cc

Cantita'tea de clor,ofilà le Antirrhiurum esúe controlata decàtre o genà recesivà irreornpletà care manifestà un efect le'talîn stare homozigotà qi un efect fenotipic distinet în stare he-ter.ozigotà.

194

Penetranla genelor letale fie recesive fie dominante poatesà vari,eze, astfei cà nu toli indivizii afectali genotipic vor filetali fenotipic. Anumite gene letale au un îna1t grad de pe-netran!à ;i expresivitate, permi!înd un mic procent de supra-vieluire sau chiar deloc (penetranîà 1000/o) printre genotipurileafectate în stadiul embrionar sau postemrbrionar. Alùe gene nu-mite senúletole sau su'bvitale permit supravieluirea unei pro-por{ii mai mari de genotipuri afectate (500/0-300/c). Se vededeci cà vitalitatea este un caracter influenlat de un spectru largde gene, care variazà de la letalitatea completà la subl,eial, lasubvital, apoi normal Ei în mod ocazional la supervital sau Iagenotipuri superioare celor medii. Dar, ca regulà, genele l,etal,esînt considerate acelea al,e càror efecte cauzeazà moartea or-ganismului, în mod obiEnuit, în primele stadii de dezvoltare,oricum înainte de reproclucere.

15. PLEIOTROPIA

Reprezintà un fenomen genetic opus polialeliei. EÌ se înre-gistreazà atunci cînd o singurà genà nu con'troleazà expresiaunui sin,gur caracter, ci a mai mulúor caractere. Pleiotropia arputea fi definità ca efectul fen'otipic multiplu al unei sin,guregene.

La mazàre, chiar l\{endel a constatat cà pelechea de genecal'e determinà culoarea fl,orii acfioneazà gi asupra culorii se-minfelor gi asupra prezenfei sau absen{ei petelor roqietice depe stipele.

La drosofilà, gena ug care determinà forma vestigialà a ari-pilor, controleazà, în acelaqi timp qi alte caractere precum dis-tribulia periqorilor pe partea dorsalà, modificarea spermatecii,ducind Ei la reclucerea vitalitàlii Ei fecunditàlii.

La mamif,ere, incluzînd omul, gena care este impiicatà înalbinism, afecteazà de asemenea vàzul Si auzul. În aoest caztoate sectoarele corpului care sînt afectate au o origine comunàîn dezvoltarea embrionarà timpurie qi anume ectodermicà.Astlei la om, în cazul sindro,rnului Lobstein, este implicatà o

195

genà care determinà deopotrivà surditatea, fragilitatea vaselorgi modificàri ale scl,eroticii.

Nu este exclus ca marea majoritate a gerreior sà se mani-feste pleiotropic, aspect care este izvorît din caracterul de in-tegraiitate ai celulei, respectiv al indi-;idului biologic care,func{ionînd ca sistem unitar Ei avîncl o stare aiteratà într-unuldin componentele sale subordonate, prezintà alteràri qi în alteelemen,te în urma interactiunilor structurai-functional,e.

Redactor: ADRIAN CJR.\NESCUl-elinoredactor: CONS'IANTIN RUSU

Apàrut:Crili de

1981. Bun de ti.par: 25.09.1S81. Comancla nr.2l0lltipar: 12,2i>. Hìr1"ia: veliné 90 g/mp. Format: 6f i.Brji 1{)

Tipaiul executat sub comanda nr.312/1981la Înfrcprinderea Poligraficó Cluj,

Municipiul Cluj-NapocaB-dul Lenrn nr. 146

Republica Socialistà Romània