departman za biologiju i ekologiju prirodno – … · dinamika rasta ćelija respiratornih izolata...
TRANSCRIPT
UNIVERZITET U NIŠUPRIRODNO – MATEMATIČKI FAKULTET
DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU
MASTER RAD
Uticaj etarskog ulja Inula helenium L. na rast odabranih sojeva respiratornih izolata
Mentor:dr Zorica Stojanović Radić
Kandidat:Kristina Lj. Stanković
Niš, 2018
2
Kristina Lj. Stanković Master rad
UNIVERSITY OF NIŠFACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICSDEPARTMENT OF BIOLOGY AND EKOLOGY
MASTER THESIS
The influence of Inula helenium L. essential oil on the growth of selected strains of respiratory isolates
Mentor:PhD Zorica Stojanović Radić
Candidate:Kristina Lj. Stanković
Niš, 2018
SADRŽAJ
1. Uvod 8 1.1. Lekovito bilje 8 1.2. Opšte karakteristike - familija Asteraceae 9 1.3. Opšte karakteristike - rod Inula 11 1.4. Opšte karakteristike - vrsta Inula helenium L. 11 1.4.1. Hemijski sastav Inula helenium L. 13 1.4.2. Biološke aktivnosti vrste Inula helenium L. 19 1.4.2.1. Antioksidativna aktivnost 20 1.4.2.2. Antimikrobna aktivnost 21 1.4.2.3. Antineoplastična/ Citotoksična/ Antitumorska aktivnost 25 1.4.2.4. Imunomodulatorna aktivnost/ potencijal 27 1.4.2.5. Efekat na nervni sistem 27 1.5. Osobine ispitivanih mikroorganizama 28 1.5.1. Gram negativne bakterije 28 1.5.1.1. Rod Escherichia, vrsta Escherichia coli 28 1.5.1.2. Rod Moraxella, vrsta Moraxella catarrhalis 29 1.5.2. Gram pozitivne bakterije 31 1.5.2.1. Rod Staphylococcus, vrsta Staphylococcus aureus 312. Ciljevi rada 333. Materijal i metode 34 3.1. Izolovanje etarskog ulja 34 3.2. Gasna hromatografija-masena spektrometrija (GC-MS) 34 3.3. Identifikacija sastojaka 35 3.4. Antimikrobne analize 35 3.4.1. Testiranje antimikrobne aktivnosti etarskog ulja na respiratorne
izolate 35
3.4.1.1. Bakterijski izolati 35 3.4.1.2. Mikrodiluciona metoda 36 3.4.2. Metode za određivanje mehanizma delovanja etarskih ulja 37 3.4.2.1. Kinetika (dinamika) rasta tretiranih bakterija 37 3.4.2.2. Metoda detekcije oslobađanja nukleinskih kiselina 374. Rezultati i diskusija 385. Zaključak 53
6. Literatura 54
4
Kristina Lj. Stanković Master rad
Hvala.
ZAHVALNICA
Najsrdačnije se zahvaljujem svom mentoru, dr Zorici Stojanović-Radić koja mi
je dala ideju za ovaj rad i pružila veliku pomoć tokom laboratorijskih
istraživanja. Zahvaljujem joj se na razumevanju, strpljenju, nesebičnoj pomoći i
savetima koje mi je pružila tokom izrade master rada.
Zahvaljujem se i doktorantkinji Marini Dimitrijević, koja je uložila veliki deo
svog vremena i pružila mi pomoć u toku izvođenja eksperimentalnog dela rada.
Na kraju, svoju neizmernu zahvanost dugujem dragim ljudima oko sebe, bez
kojih ne bih mogla da ostvarim svoje zamisli, a posebno mojim roditeljima koji
su mi omogućili školovanje i motivisali me tokom istog, i bratu bez čije ljubavi i
razumevanja ne bih istrajala do kraja.
Iskreno Vam hvala.
.
BIOGRAFIJA
Kristina Lj. Stanković, rođena je 26.02.1994. godine u Nišu. Osnovnu školu
“Ivan Goran Kovačić” završava 2009. godine, nakon čega upisuje Medicinsku
školu “Dr Milenko Hadžić” u Nišu, smer fizioterapeutski tehničar, koju
završava 2013. godine. Iste godine upisuje Prirodno-matematički fakultet u
Nišu, Odsek za biologiju i ekologiju. Osnovne akademske studije završava
2016. godine sa zvanjem “biolog”. Iste godine upisuje master akademske
studije, smer Biologija na istom fakultetu.
6
Kristina Lj. Stanković Master rad
SAŽETAK
Ciljevi ovog master rada su bili ispitivanje hemijskog sastava etarskog ulja korena Inula
helenium L., kao i određivanje antimikrobne aktivnosti ovog etarskog ulja u odnosu na odabrane
sojeve respiratornih izolata humanog porekla. Ujedno je izvršeno i ispitivanje mehanizma dejstva
etarskog ulja omana metodom detekcije oštećenja membrane i praćenja dinamike rasta ćelijskih
kultura tretiranih uljem. Destilacijom biljnog materijala omana, dobijeno je etarsko ulje čije su
glavne komponente bile alantolakton (65,75%) i izoalantolakton (25,53), a ove dve komponente
su sačinjavale 91,3% ukupnog sastava ispitivanog etarskog ulja. Aktivnost etarskog ulja omana
se kretala u opsegu koncentracija 0,07-10,0 mg/ml. Ulje je bilo efikasno na sve testirane izolate
pri čemu su MIK varirale od 0,07-2,50 mg/ml, dok su se MBK kretale 0,15-10 mg/ml. Najveću
osetljivost na ulje je pokazao izolat S. aureus 3, dok su najveću rezistenciju pokazali dva soja, i to
S. aureus 1 i E. coli. Na osnovu dobijenih rezultata, spektrofotometrijskim merenjem izlaska
nukleinskih kiselina iz ćelija respiratornih izolata tretiranih etarskim uljem omana, može se
zaključiti da ni kod jednog soja nije detektovano masivno oštećenje membrane koje bi izazvalo
smrt ćelije u periodu od 4 h nakon aplikacije ulja. Dinamika rasta ćelija respiratornih izolata
tretiranih etarskim uljem omana je pokazala različite aktivnosti ovog ulja, pri čemu je kod vrsta
M. catarrhalis i S. aureus 2 uočen mikrobicidni efekat, s obzirom da je ulje ispoljilo inhibitornu i
mikrobicidnu aktivnost pri istoj koncentraciji u oba slučaja. Kod ostalih izolata S. aureus su se
ispoljili različiti intenziteti inhibicije, koja je počinjala nakon 12 h inkubacije i dovela je do
razlike od 0,27 (izolat 1), 0,16 (izolat 3) i 0,21 (izolat 4) jedinica apsorbance. Escherichia coli je
imala manju redukciju u odnosu na S. aureus, ali je zato efekat bio nešto brži, jer se redukcija
apsorbance uočila pre perioda inkubacije od 12 h.
Ključne reči: antimikrobna aktivnost, etarsko ulje, Inula helenium L., respiratorni izolati.
7
Kristina Lj. Stanković Master rad
ABSTRACT
The objectives of this master study were to examine the chemical composition of the
etheric oil of the root of Inula helenium L., and to determine the antimicrobial activity of this
etheric oil in relation to selected strains of respiratory isolates of human origin. At the same time,
the mechanism of the effect of etheric oil of the canopies was investigated by the method of
detecting the damage of the membrane and monitoring the growth dynamics of oil-cell cultures.
By distillation of the plant material of oman, etheric oil was obtained, the main components of
which were alantolactone (65,75%) and isoalantolactone (25,53), and these two components
comprised 91,3% of the total composition of the test etheric oil. The activity of the etheric oman
oil was within the concentration range of 0,07-10,0 mg / ml. The oil was effective on all tested
isolates, with MIC varied from 0,07 to 2,50 mg / ml, while MBC ranged 0,15-10 mg / ml. The
highest sensitivity to oil was demonstrated by S. aureus 3 isolates, while the highest resistance
was shown by two strains, S. aureus 1 and E. coli. Based on the obtained results, the
spectrophotometric measurement of the release of nucleic acids from the cells of the respiratory
isolates treated with etheric oman oil, it can be concluded that no massive damage to the
membrane was detected in a single strain that would cause cell death in the 4 hours after
application of the oil. The growth dynamics of the cells of respiratory isolates treated with ethane
oman oil revealed various activities of this oil, with the microbicidal effect observed in the
species M. catarrhalis and S. aureus 2, as the oil exhibited inhibitory and microbicidal activity at
the same concentration in both cases. In the other S. aureus isolates, different intensities of
inhibition began, which began after 12 hours of incubation and resulted in a difference of 0,27
(isolate 1), 0,16 (isolate 3) and 0,21 (isolate 4) units apsorbance. Escherichia coli had a lower
reduction compared to S. aureus, but the effect was therefore somewhat faster, since the
reduction in absorbance was observed before the incubation period of 12 h.
Keywords: antimicrobial activity, essential oil, Inula helenium L., respiratory isolates.
8
Kristina Lj. Stanković Master rad
1. Uvod
1.1 Lekovite biljke
Tokom čitave istorije čovečanstva, ljudi su zavisili od biljaka koje su oduvek bile sastavni deo
njihovog životnog staništa. Čovek je taj biljni svet svojim iskustvom sve bolje upoznavao i
koristio ga na razne načine za svoj opstanak. Bilje je čoveku predstavljalo izvor hrane, a sa većim
iskustvom je shvatio da mu može poslužiti za lečenje raznih bolesti, te je tako sve više sticao
znanje o lekovitosti pojedinih vrsta iz biljnog carstva (Videk, 1960). Ljudi su koristili lekovito
bilje za mnoštvo potreba: imale su ulogu u ceremonijama i ritualima, dok su se druge koristile za
bojenje i čišćenje tkanina, a mnoge su se upotrebljavale u svakodnevnom životu kao začini za
hranu i piće, za poboljšanje opšteg zdravlja i lečenje bolesti. Lekovitim biljem se smatra ono bilje
koje se koristi za konkretne svrhe zbog svojih medicinskih, aromatičnih i drugih svojstava.
Kako navode Stanković i Stanojević (2014), prema definiciji Svetske zdravstvene
organizacije, u lekovito bilje se ubrajaju one biljne vrste čiji jedan deo ili više delova sadrže
biološki aktivne supstance koje se mogu iskoristiti u terapijske svrhe ili za farmaceutsko-
hemijske sinteze. U narodnoj medicini lekovite biljke se koriste za lečenje bolesti ili očuvanje
zdravlja ljudi. Posvećuje im se velika pažnja u cilju pronalaženja boljih lekova koji bi po
organizam čoveka bili što je moguće manje štetni.
Lekovite biljke je, prema farmakološkom dejstvu, moguće podeliti u dve grupe:
1) lekovite biljke blagog dejstva, koje su u širokoj i skoro svakodnevnoj upotrebi u domaćim
uslovima (nana, kamilica, lipa)
2) lekovite biljke jakog dejstva, toksične vrste od kojih se proizvode vrlo jaki otrovi poput
heroina, morfina i čija je upotreba i rukovanje propisana zakonom o otrovnom bilju.
Istraživanja lekovitog bilja u savremenoj medicini su intezivna tokom poslednjih nekoliko
decenija. Pokazalo se da većina lekova biljnog porekla ima manje neželjenih dejstava od
sintetskih lekova. Iskustva tradicionalne medicine, kao i rezultati bioloških, hemijskih i
farmakoloških ispitivanja ukazali su na značajnu biološku aktivnost biljnih ekstrakata i omogućili
izolovanje i karakterizaciju aktivnih komponenti, od kojih se mnoge primenjuju u savremenoj
farmakoterapiji. Određivanje biološke aktivnosti i hemijska identifikacija do sada neispitanih
biljnih vrsta vode ka otkrivanju novih prirodnih proizvoda sa potencijalom za primenu u
9
Kristina Lj. Stanković Master rad
prevenciji i terapiji različitih oboljenja (Simin, 2014). Dokazano je da fenolna jedinjenja biljaka
ispoljavaju antiinflamatornu, antiproliferativnu, antimutagenu, antigenotoksičnu, antialergenu,
antimikrobnu, antioksidativnu i druge aktivnosti. Posebna pažnja se posvećuje njihovom
potencijalu u zaštiti i prevenciji od kardiovaskularnih i kancerogenih bolesti, s obzirom da
epidemiološke studije ukazuju da poseduju protektivni efekat u odnosu na razvoj ovih bolesti
(Basile et al., 2000; Croft, 1999; Keli et al., 1996; Lea i Leegod, 1999). Antimikrobna i
antioksidativna aktivnost učestvuju u inhibiciji oksidacije i vrše zaštitu organizma (Kähkönen et
al., 1999). Biljke su neicrpan izvor biološki aktivnih jedinjenja, pa su njihova fitohemijska i
biohemijska istraživanja veoma značajna (Simin, 2014).
Jedna biljna vrsta, koja se zbog svog blagotvornog efekta na zdravlje ljudi koristi u narodnoj
medicini je oman – Inula helenium L. (rod Inula, fam. Asteraceae). Ona se primenjuje za
suzbijanje repiratornih infekcija i zbog toga su mnoga istraživanja bila usmerena na istraživanje
bioloških aktivnosti njenih sekundarnih metabolita. Pošto se za tradicionalne tretmane koristi
osušen koren ove biljke, za koji se pokazalo da etarsko ulje izolovano iz njega poseduje značajnu
antimikrobnu aktivnost, cilj ovog rada bio je da se po prvi put ovo ulje testira na humane kliničke
izolate iz respiratornog sistema. U nastavku istraživanja, ispitan je potencijalni uticaj ovog ulja na
ćelijsku membranu ovih izolata.
1.2. Opšte karakteristike porodice (familia) Asteraceae
Asteraceae su pretežno zeljaste jednogodišnje i višegodišnje biljke (Blečić, 1970).
Porodica obuhvata više od 1600 rodova i oko 23 000 vrsta (Sabljak, 2015). Listovi su pretežno
naizmenični, ređe naspramni (Blečić, 1970). Pojedinačni cvetovi su uglavnom složeni u
glavičaste cvasti. U glavičastim cvastima postoje dva tipa pojedinačnih cvetova, to su jezičasti i
cevasti cvetovi. Jezičasti cvetovi koji nose latice i raspoređeni su po obodu glavice ili diska,
najčešće su sterilni, dok su cevasti cvetovi raspoređeni od periferije prema središnjem delu diska i
najčešće su fertilni (Sabljak, 2015). Mnogi predstavnici familije Asteraceae sadrže polisaharid
inulin kao rezervnu materiju (Josifović, 1975). Imaju i šizogene smone hodnike i člankovite
mlečne cevi. Pripadnici ove familije su brojni i pripadaju kosmopolitskim vrstama. Najstariji
fosilni ostaci poznati su od oligocena. Pored ogromne opširnosti i raznolikog izgleda,
predstavljaju jednu prirodnu celinu, pa je zbog toga veoma teško deliti ih ne samo u više familija
10
Kristina Lj. Stanković Master rad
već ni u pojedine podfamilije. Na osnovu građe glavičaste cvasti kao i nekih drugih osobina sve
Asteraceae se mogu podeliti u dve podfamilije: Asteroideae i Cichorioideae (Blečić, 1970).
Koren je izuzetno krtolasto zadebljao. Stabljika je jednostavna ili granata, katkad u obliku
skapusa ili okriljena. Čašica nije nikada u obliku listova, nedostaje ili postoji u obliku
jednostavnih ili perastih dlaka, čekinjica, ljuspica ili u obliku kožastog ruba, dok u vreme
plodonošenja najčešće ostaje i služi kao organ za letenje zrelih plodova. Krunica je ili pravilna,
cevasta, po obodu sa 4-5 zubaca ili je zigomorfna sa kratkom cevi, a obod produžen u linearni
jezičak, koji na vrhu ima 5 zubaca (od 5 ili samo 3 spojena krunična listića), retko sa 5 ili 2
režnja. Prašnika ima 5, prirasli su na krunicu, prašnice su pri osnovi često strelaste ili sa
nastavkom, sa dva okca, prema unutra se otvaraju, međusobno su srasle u cev, koja opkoljava
stubić. Tučak je potcvetan od dve karpele, dok je plodnik sa jednim anatropnim semenim
zametkom i jednim integumentom. Stubić je sa dva žiga, ovi na unutrašnjoj strani sa papilama, a
na spoljašnjoj strani i na vrhu sa uspravno štrčećim kratkim čekinjama. Plod je suv, ahenija, sa
jednim semenom, najčešće sa papusom, ponekad i sa kljunom. Hranljivo tkivo nedostaje.
Najveći broj vrsta iz familije Asteraceae, poput Eupatorium cannabinum L., Solidago
virgaurea L., Inula helenium L., Matricaria chamomilla L., Achillea millefolium L. koriste se kao
lekovite biljke. Neke se koriste za dobijanje jestivog ulja – npr. Helianthus annuus L., neke služe
za ishranu u svežem stanju – npr. Taraxacum officinale Web., dok određene vrste služe kao
insekticidna sredstva – npr. Chrysanthemum cinerariifolium (Triv.) Vis. Veliki broj vrsta koje
pripadaju ovoj familiji koristi se u dekorativne svrhe (vrste iz rodova Calendula L., Bellis L.,
Zinnia L. i druge).
Familija Asteraceae deli se na dve podfamilije:
1) Podfamilija Tubuliflorae DC. – Cvetovi cevasti, obodni cvetovi katkad jezičasti ili
dvousnati. Mlečni sok nedostaje. Šizogeni uljani kanali postoje.
2) Podfamilija Liguliflorae DC. – Svi cvetovi nepravilni, jezičasti. Mlečni sok postoji. Uljani
kanali najčešće nedostaju (Josifović, 1975).
11
Kristina Lj. Stanković Master rad
1.3. Opšte karakteristike roda (Genus) Inula
Vrste roda Inula pripadaju zeljastim, najčešće višegodišnjim biljkama. Listovi su
naizmenični i celi. Glavice su pojedinačne ili u gronjastim ili metličastim cvastima, najčešće
velike, heterogamne, sa mnogo cvetova i sa poluloptastim involukrumom. Listići involukruma
poređani su gusto kao crepovi na krovu, u mnogo redova, a spoljni su često slični listovima.
Cvetna loža je ravna i gola. Središni cvetovi (cvetovi diska) su hermafroditni, sa cevasto
levkastim krunicama i 5 zubaca. Obodni cvetovi su ženski, jezičasti, na vrhu sa 3-5 zubaca, žuti i
u jednom redu. Papus je sastavljen od čekinjastih, skoro jednakih dlačica, u jednom ili više reda.
Ahenija je gola ili sa dlakama, okruglasta ili sa 4-5 ivica.
Rod obuhvata oko 120 vrsta koje su rasprostranjene u umerenim i toplijim oblastima Evrope
i Azije. Razlikujemo tri centra formiranja. Jedan se nalazi u području severne Španije i južne
Francuske, drugi centar se nalazi u predelu Kavkaza i Armenije, a treći leži u zapadnom delu
Himalaja. U Evropi se nalaze 35 vrsta, a u Srbiji 11 vrsta (Josifović, 1975).
1.4. Opšte karakteristike omana (Inula helenium L.)
Inula helenium L. (Asteraceae) (slika 1) je višegodišnja
biljka široko rasprostranjena u Evropi i Istočnoj Aziji. Oman
je visine 60 – 150 (200) cm visine, sa granatim i krtolasto
zadebljalim rizomom. Stabljika je sa štrčećim grubim
dlakama, u gornjem delu vunasto prstenasto dlakava, kruta,
uspravna, jednostavna ili u gornjem delu granata. Listovi su
sa gornje strane zeleni, razređeno kratko dlakavi, sa donje
strane prileglo sivo prstenasto dlakavi, po obodu nejednako
urezani ili tupo nazubljeni. Prizemni listovi postepeno su
suženi u dugačku vrstu, jajasti do eliptični, šiljati.
Slika 1. Inula helenium (L.)http://lekarstven-travi.ru
12
Kristina Lj. Stanković Master rad
Listovi stabljike su sa srcastom osnovom, koji
opkoljavaju stabljiku, sedeći ili se kratko spuštaju niz
stabljiku, šiljati. Glavice su prečnika 6-7 cm u razređenim
gronjastim cvastima ili pojedinačne. Cvetna loža je skoro
gola, a listići involukruma u više redova. Spoljni listići su
dlakavi, sa srcasto proširenim i unazad savijenim vrhom,
a unutrašnji suvokožičasti, linearni. Jezičasti cvetovi su
dvostruko duži od listića omotača, uski, mnogobrojni,
široki 1,5 mm. Ahenija je gola, sa uzdužnim rebrima,
dužine 5 mm. Stanište omana su vlažne livade i osenčana
područja, kao i pored potoka u šumama.
Koren omana se tradicionalno koristi za lečenje
različitih bolesti kao što su emezija, bol u gornjem delu tela, bronhitis, dijareja i paraziti (Kina),
razne plućne bolesti i tuberkuloza (Amerika) (Konishi et al., 2002; Huo et al., 2008). U Evropi,
zvanično je naveden u farmakopeji kao diuretik, dijaforetik i ekspektorant, kao i antihelmintik
(Stojakowska et al., 2005). U istočnoj Evropi ova biljka se uglavnom koristi za lečenje
respiratornih stanja kao što su astma ili veliki kašalj, urinarne infekcije, poremećaji digestivnog
sistema kao i bolesti kože (Stojanović-Radić et al., 2012). Prema Ghedira et al. (2011), koren se
koristi za različite preparate - infuzija, prah, vino, sirup sa sledećim terapeutskim indikacijama:
antiseptik kod egzantema, bakterijskog i gljivičnog dermatitisa; antipruritik kod suvih pečata na
koži; za poboljšanje urinarne i digestivne funkcije; za lečenje simptomatskog kašlja i bronhitisa;
za lečenje poremećaja dispeptične hepatobilijarne ili bilijarne diskinezije; kao dodatak u lečenju
hiperglikemije i gojaznosti.
Iako se samo ograničeni broj studija bavio antimikrobnom aktivnošću etarskog ulja korena I.
helenium, utvrđeno je da je ono aktivno protiv nekih Gram-pozitivnih i Gram-negativnih
bakterija i vrste Candida albicans (Stojanović-Radić et al., 2012). Aktivne komponente iz omana
uglavnom pripadaju klasi seskviterpenskih laktona-eudesmanolidi (alantolakton, izoalantolakton,
4α,5α-epoksialantolakton, diplofilin) i germakranolidi (izokostunolid) (Seca et al., 2014) koji se
koriste kao antiinflamatorni, antimikrobni i antikancerogeni agensi.
Tabela 1. Sistematika vrste Inula
helenium L.
Carstvo: Plantae
Razdeo: Magnoliophyta
Класа: Magnoliopsida
Red: Asterales
Porodica: Asteraceae
Rod: Inula
13
Kristina Lj. Stanković Master rad
1.4.1. Hemijski sastav Inula helenium L.
Prethodne studije I. helenium su pokazale da su dominantne isparljive materije korena
eudezmanski seskviterpenski laktoni i to alantolakton i izoalantolakton. Koren sadrži do 5%
etarskog ulja, derivata timola, triterpena, sterola i do 44% polisaharida inulina (Stojanović-Radić
et al., 2012).
Istraživanje Bohlmann et al. (1978) je prvo istraživalo hemijski sastav pripadnika roda Inula
i to Inula helenium, I. royleana, I. salicina i I. bifrons, gde je u korenu, kao i u nadzemnim
delovima vrste I. helenium utvrđeno dominantno prisustvo alantolaktona i izoalantolaktona uz
ostala jedinjenja, koja su uglavnom pripadala seskviterpenima (Tabela 2).
U nešto kasnijem istraživanju Vajs et al. (1989), istraživanja seskviterpenskih laktona iz I.
helenium po prvi put su utvrdila prisustvo 11(13)-dehidrokriolina, 2α-hidroksialantolaktona,
4α,5α-epoksi-10α-14-H-inuviskolida i karabrona.
U heksanskoj frakciji metanolnog ekstrakta korena I. helenium, koji je pokazao izuzetnu
antiproliferativnu aktivnost, utvrđeno je prisustvo sedam seskviterpena i to jednog germakrana
(4β,5α-epoksi-1(10),11(13)-germakradien-8,12-olid), jednog elemana (igalan) i pet eudezmana
(alantolakton, izoalantolakton, 11α,13-dihidroalantolakton, 11α,13-dihidro-izoalantolakton i 5-
epoksialantolakton) (Konishi et al., 2002).
U radu Cantrell et al. (1999), gde je testiran antimikobakterijski efekat ekstrakta iz korena I.
helenium, utvrđeno je da izuzetno aktivna hromatografska frakcija sadrži alantolakton,
izoalantolakton i 11αH,13-dihidroizoalantolakton.
Lim et al. (2007) su dodatno frakcionisali metanolni ekstrakt na heksansku,
dihlorometansku, butanolnu i vodenu frakciju. Ustanovljeno je da su seskviterpeni iz heksanske
frakcije i to alantolakton, izoalantolakton i 5α-epoksialantolakton odgovorni za indukciju enzima
kinon reduktaze, ali su pored njih u njoj pronađeni i jedinjenja igalan, 4β,5α-epoksi-1(10),11(13)-
germakradien-8,12-olid, 11α,13-dihidroalantolakton i 11α,13-dihidro-izoalantolakton.
Petkova et al. (2015) vršili su ispitivanje antioksidativne aktivnosti i sadržaja fruktana u
etanolnim i vodenim ekstraktima korena omana (Inula helenium L.). Sadržaji ukupnih fruktana i
šećera određeni su spektrofotometrijskom, TLC i HPLC-RID metodom. Nivo fruktana u
ekstraktima etanola iznosio je 14,1 g/100 g suve mase, gde su nistoza i 1-kestoza činile samo 0,3
g/100 g odnosno 0,5 g/100 g suve mase. Utvrđeno je odsustvo fruktooligosaharida i šećera u
14
Kristina Lj. Stanković Master rad
vodenim ekstraktima nakon predtretmana etanolom. Procenjen je sadržaj inulina koji iznosi 32
g/100 g suve mase.
Nan et al. (2012) vršili su ispitivanje čiji je cilj bio da odrede profil i sastav karotenoida u
nadzemnom delu (cvetovi i listovi) ove biljne vrste. Separaciju i kvantifikaciju karotenoida vršili
su pomoću tečne hromatografije visokih performansi (HPLC). Nakon ekstrakcije organskim
rastvaračima i saponifikacije, sadržaj karotenoida Inula helenium L. je određen u ekstraktima
listova, cvasti, cevastih cvetova i ligula. Sadržaj karotenoida varirao je od 4,87% u listovima do
47,7% u ligulama. U ligulama je glavno jedinjenje bio lutein-5,6-epoksid, koji čini 73,8%
ukupnih karotenoida. Cevasti cvetovi sadrže veće količine anteraksantina (36,9%) i luteina
(28,4%), dok u listovima β-karoten i lutein zajedno čine više od 72% ukupnih karotenoida. Svi
nadzemni delovi biljke sadrže male količine neoksantina i violaksantina.
Tri nova seskviterpenoida, nov dimerni eudezmanolid, bialantolakton, nov noreudezmanolid,
trinoralantolakton i novi seko-gvajen 7S,1(10)Z-4,5-seko-gvaja-1(10),11-dien4,5-diokso,
izolovani su iz korena Inula helenium zajedno sa 13 poznatih seskviterpenoida (Jiang et al.,
2011).
U istraživanju alkoholno vodenog ekstrakta iz korena omana, HPLC analiza potvrdila je
prisustvo fenolnih jedinjenja (polifenolne karboksilne kiseline kao što su kofeinska, hlorogenska,
rozmarinska, galna, protokatehuična i gentizinska kiselina i flavonoidi kao što su rutin, kvercetin,
kempferol), ali i alantolaktona kao glavnog seskviterpenskog laktona u proučavanom
hidroalkoholnom ekstraktu (Grigore et al., 2016).
Studije o hemijskom sastavu etarskog ulja korena I. helenium (Tabela 3), gde je hemijski
sastav ispitivan korišćenjem GC i GC/MS-a (gasne hromatografije i gasne hromatografije sa
masenom spektrometrijom), pokazale su da su osnovni sastojci koji se javljaju u ovom ulju
alantolakton, izoalantolakton, dihidroalantolakton i diplofilin (Bourrel et al., 1993; Deriu et al.,
2008; Stojanović-Radić et al., 2012). Pored već poznatih alantolaktona (alantolakton (52,4%) i
izoalantolakton (33,0%), u ulju je identifikovano do 45 komponenti (Stojanović-Radić et al.,
2012), koje su manje zastupljene u njegovom sastavu (Tabela 3). Helenin je fitohemijska
mešavina koja se nalazi u mnogim biljnim vrstama, uključujući oman. To je mešavina dva
izomerna seskviterpenska laktona, alantolaktona i izolantantolaktona (slika 2). Nemački naučnici
Julius Bredt i Wilhelm Posh su 1895. godine ekstrahovali helenin iz I. helenium i utvrdili njegove
15
Kristina Lj. Stanković Master rad
fizičke i hemijske osobine. Alantolakton se javlja kao sastavni deo korena biljne vrste I. helenium
i drugih vrsta roda Inula (Hoffmann, 2003).
Jedinjenja Izvor Referenca
Eudezmanolidi (Seskviterpeni)
1 Alantolakton I. helenium Bohlmann et al. 1978
2 Izoalantolakton I. helenium Bohlmann et al. 1978
3 Aloantolakton I. helenium Bohlmann et al. 1978
4 2α-Hidroksi alantolakton I. helenium Vajs et al. 1989
5 11αH,13-Dihidroizoalantolakton I. helenium Cantrell et al. 1999
6 11αH,13-Dihidroalantolakton I. helenium Konishi et al. 2002
7 Izokostunolidi I. helenium Chen et al. 2007
Elemanolidi (Seskviterpeni)
8 1,3,11(13)-Elematrien-8β,12-olide I. helenium Konishi et al. 2002
Germakranolidi (Seskviterpeni)
9 1(10),4(15),5(6),11(13)-Germakratetraen-8, 12-olid I. helenium Bohlmann et al. 1978
10 4β, 5α-epoksi-1(10),11(13)-Germakradien-8, 12-olid I. helenium Konishi et al. 2002
11 11(13)-Dehidroeriolin I. helenium Bohlmann et al. 1978
Seskvikaranolidi (Seskviterpeni)
12 Karabron I. helenium Vajs et al. 1989
Gvajanolidi (Seskviterpeni)
13 4α,5α-Epoksi-10α-14H-inuvizkolidi I. helenium Vajs et al. 1989
Humuleni (Seskviterpeni)
14 Izohumulen I. helenium Bohlmann et al. 1978
Druge komponente
15 Damadienol acetat I. helenium Bohlmann et al. 1978
Tabela 2: Hemijska jedinjenja izolovana iz korena I. helenium
16
Kristina Lj. Stanković Master rad
Koren omana (Inula helenium) može se ekstrahovati korišćenjem alkohola ili drugih
nepolarnih rastvarača za proizvodnju helenina sa sastavom od oko 40% alantolaktona i 60%
izoalantolaktona (Xu, 2014).
Slika 2. Alantolakton, dihidroalantolakton i izoalantolakton
17
Kristina Lj. Stanković Master rad
Rt/min Klasa jedinjenja Jedinjenje
Bourell et al., 1993
Deriu et al., 2008
Stojanović – Radić et al., 2012
2,63 o Heksanal - - tr
2,7 o 2-metiltetrahidrofuran-3-on - - tr
2,9 o 3-metilbutanska kiselina - - tr
3,52 o 1-Nonen - - tr
4,22 m α-Pinen - - tr
4,52 m Camfen - - tr
4,87 m Sabinen - - tr
5 m β-Pinen - - tr
5,11 o 1-Decen - - tr
5,15 o 2-Pentil furan - - tr
5,18 m Dehidro-1,8-cineol - - tr
5,88 m p-Cimen - - tr
5,98 m Limonen - - tr
6,04 m 1,8-Cineol - - tr
6,84 m cis-Linalol oksid (furanoid) - - tr
7,24 o 1-Undecen - - tr
7,47 m Linalol - - tr
7,71 m α-Tujon - - tr
7,98 m β-Tujon - - tr
8,74 m Kamfor - - tr
8,92 m Menton - - tr
9,06 s Alben - - tr
9,15 m izo-Menton - - tr
Longifolen 0,2 -
9,55 m Terpinen-4-ol - - tr
m Aromadendren 0,2 -
9,92 m α-Terpineol - - tr
12,13 m Izobornil acetat - - tr
12,25 o 1-Tridecen - - tr
13,74 m Citronelil acetat - - tr
13,87 s α-Longipinen - - tr
14,32 m Neril acetat - - tr
14,83 s β-Elemen 1,2 1,5 0,1
15,08 s Petaziten - - tr15,63 s β-Karioflen - - 0,1
Tabela 3. Uporedni prikaz rezultata istraživanja sastava etarskog ulja korena biljne vrste
Inula helenium L.
18
Kristina Lj. Stanković Master rad
15,9 s cis-α-Ambrinol - - tr
16,26 s epi-β-Santalen - 0,1 tr
16,86 s 4,5-Di-epi-aristolohen - - 0,2
16,92 s Selina-4,11-dien - - 0,3
16,99 m Citronelol izobutanoat - - Tr
17,1 m Neril izobutanoat - - Tr
17,18 s γ-Humulen - - Tr
17,29 s Eremofilen - - 0,3
17,34 s β-Selinen 0,5 0,1
17,51 s α-Selinen - 0,4 0,1
17,67 m Geranil izobutanoat - - 0,1
17,71 s Eremofila-1(10),8,11-trien - - Tr
17,77 s Germakren A - - 0,3
s Germakren B - 0,2 -
19,17 m Neril izovalerat - - Tr
19,57 s Kariofilen oksid 0,7 - 0,1
19,79 m Geranil 2-metilbutirat - - Tr
20 s Rozifoliol - - Tr
20,86 s Eudezm-3,11-dien-5-ol - - Tr
20,93 s Epi- α-Kadinol - - 0,2
21,17 s β-Eudezmol - 0,5 0,1
Eudezma-5,7(11)-dien-8β-12 olid 1,3 - -
Eudezma-4(15), 7(11)-dien-8β-12 olid 0,9 - -
21,33 s Selin-11-en-4-ol - 0,4 0,4
22,11 o 2-Pentadekanon - - Tr
Akorenon - 0,4 -
22,18 s (E)-Kariofilen - 0,2 -
23,22 s α-Ciperon - - Tr
24,33 s Drima-7,9(11)-diene - 0,2 -
24,54 s γ-Gurjunen - 0,4 -
24,67 s Kalitrin - - 0,1
s Ledol - 0,2 -
24,85 s γ-Himahalen - 0,2 -
24,94 s Dihidroinunolid - Tr
25,09 s Valencen - 1,0 -
25,82 s Dihidroizoalantolakton - Tr
26,49 s Alantolakton 52,4 51,3 55,8
26,99 s Dihidroalantolakton 0,4 0,5
27,31 s Diplofilin - 5,1
27,55 s Izoalantolakton 33 36,9 26,3
28,59 m 10-Acetoksi-8,9-epoksithimolizobutirat - - 0,1
19
Kristina Lj. Stanković Master rad
miristinska kiselina 0,6 - -
palmitinska kiselina 0,3 - -
30,77 o Linolenska kiselina - - 0,3
30,89 o Oleinska kiselina - - 0,9
31,36 o Stearinska kiselina - - tr
Ukupno 91,7 93,9 91,5 tr – trag (< 0,05%); s – seskviterpen; m – monoterpen; o – ostalo
1.4.2. Biološke ativnosti vrste Inula helenium L.
Prethodno je utvrđeno da alantolakton i izoalantolakton imaju niz bioloških aktivnosti,
uključujući antiproliferativno, antikancerogeno, antiinflamatorno, antioksidativno, kao i aktivnost
indukcije enzima za detoksikaciju (Lawrence et al., 2001; Konishi et al., 2002; Spiridonov et al.,
2005; Lim et al., 2007; Petkova et al., 2015).
Alantolakton (ATL) je prirodni seskviterpenski lakton koji poseduje širok spektar bioloških
aktivnosti, kao što su antibakterijska, antifungalna, antiinflamatorna i hepatoprotektivna aktivnost
(Cantrell et al., 1999). Ovo jedinjenje je jak kontaktni alergen (Wichtl, 2004; Huo et al., 2008), a
utvrđeno je sa poseduje i antihelmintnu aktivnost (Konishi et al., 2002). Alantolakton izolovan iz
korena I. helenium je pokazao antiinflamatornu (Rao i Mishra, 1997), antifungalnu (Wahab et al.,
1979; Bourell et al., 1993, Barrero, 2000), antibakterijsku (Cantrell et al., 1999; Tosun et al.,
2005) i antitumorsku aktivnost (Wang et al., 2017). Utvrđeno je da alantolakton ima razne in
vitro biološke aktivnosti, uključujući indukciju apoptoze i zaustavljanje ćelijskog ciklusa u
plućnim skvamoznim ćelijama karcinoma (Zhao, 2015), suzbija aktivaciju STAT3 (Chun, 2015),
kao i da ima antiinflamatorne efekte inhibicijom proizvodnje hemokina i STAT1 fosforilacije
(Lim et al., 2015).
Antitumorska svojstva ATL-a pokazana su u perifernim tumorima, uključujući rak pluća, rak
jetre, rak debelog creva i leukemiju (Pal et al., 2010; Lei et al., 2012; Yang et al., 2013; Shen et
al., 2013; Ding et al., 2016). Međutim, do danas nisu detaljno opisani detaljni antikancerski
mehanizmi pomoću kojih ATL vrši svoje efekte.
Izoalantolakton je takođe potvrđen kao efikasno antimikrobno jedinjenje, aktivno protiv
gljivica (Tan et al., 1998) i bakterija (Cantrell et al., 1999; Liu et al., 2001).
20
Kristina Lj. Stanković Master rad
1.4.2.1. Antioksidativna aktivnost
Pošto je prethodno utvrđeno da metanolni ekstrakt biljke I. helenium ima potencijal da
indukuje detoksikujuće enzime poput kinon reduktaze (Quinone reductase - QR) i glutation-S-
transferaze (Kwon et al., 2002), u narednoj studiji iste grupe autora ovaj ekstrakt je frakcionisan i
ispitivana ista aktivnost za svaku frakciju (Lim et al., 2007). Heksanska frakcija pokazala je
najveću aktivnost indukcije QR-a i takođe je indukovala glutation-S-transferazu na dozno-zavisni
način. Seskviterpeni, izolovani iz frakcije heksana, bili su glavne komponente odgovorne za QR
indukciju. Među sedam jedinjenja testiranih u ovoj studiji, alantolakton, izoalantolakton i 5-
epoksialantolakton značajno su indukovali QR aktivnost kako u Hepa1c1c7 tako i u BPRc1
ćelijama. Iz tog razloga, seskviterpeni prisutni u I. helenium, uključujući alantolakton,
izoalantolakton i 5-epoksialantolakton, predstavljaju potencijalne hemopreventivne agense (Lim
et al., 2007).
Gökbulut et al. (2013) istraživali su antioksidativnu aktivnost i fenolni sadržaj vodenih,
metanolnih i etil acetatnih ekstrakata tri vrste roda Inula (I. viscosa, I. helenium ssp.
turcoracemosa i I. montbretiana), sakupljanih na raznim lokacijama u Anatoliji. Antioksidantni
kapacitet ispitivan je korišćenjem DPPH i ABTS metode. Fenolni sadržaj utvrđen Folin-
Ciocalteu metodom varirao je u različitim delovima ispitivanih vrsta, krećući se od 21.1 ± 0.8 do
190.9 ± 6.1 mg GAE/g ekstrakta. U vrsti I. helenium utvrđeno je veće prisustvo u nadzemnim
delovima u poređenju sa sadržajem fenola u korenu iste vrste. U metanolnim ekstraktima Inula
vrsta HPLC-DAD metodom utvrđeno je prisustvo hlorogene kiseline, kafeinske kiseline, rutina,
miricetina, kvercetina, luteolina i kempferola. Antioksidativna aktivnost je utvrđena za sve tri
vrste, pri čemu je metanolni ekstrakt cvetova I. helenium pokazao najznačajniji antioksidativni
efekat (IC50: 0.14 ± 0.06 mg/mL, DPPH metodom i (IC50: 0.05 ± 0.02 mg/mL, ABTS
metodom).
Vršena su ispitivanja antioksidativnog potencijala metanolnih (ME), etanolnih (EE),
vodenih (WE) i etil acetantnih (EAE) ekstrakata 4 taksona Inula helenium L. (I. helenium ssp.
orygalis (Boiss.) Grierson, I. helenium ssp. pseudohelenium Grierson, I. helenium ssp.
turcarasemosa Grierson and I. helenium ssp. vanensis Grierson). Korišćeni su fosfomolibdenski
test, β-karotenska metoda i DPPH test kako bi se ocenio antioksidativni kapacitet. Ukupni
fenolni sadržaji određeni Folin-Ciocalteu metodom kretali su se od 4.18 do 102.91 mg
21
Kristina Lj. Stanković Master rad
ekvivalenta galične kiseline (GAE)/g suvog ekstrakta. Ekstrakti su pokazali značajan efekat na
smanjenje oksidacije β-karotena. Najviša antioksidativna aktivnost dobijena je kod ME I.
helenium ssp. orygalis pri DPPH testiranju (Albayrak et al., 2015).
Petkova et al. (2015) vršili su ispitivanje antioksidativne aktivnosti i sadržaja fruktana u
etanolnim i vodenim ekstraktima korena omana (Inula helenium L.). Postupak ekstrakcije je
uključivao ekstrakciju 95% (v/v) etanolom i naknadni tretman vodom. Antioksidativna aktivnost,
kao i sadržaj ukupnih fenola, procenjeni su pomoću nekoliko metoda i to DPPH, ABTS, FRAP i
CUPRAC testovi. Profil metabolita korena je otkrio njihovu potencijalnu primenu kao hvatača
slobodnih radikala zbog prisustva polifenola. Prema tome, za ekstrakte korena omana može se
pretpostaviti da su bogat izvor biološki aktivne supstance, naročito dijetetskih vlakana sa
potencijalnim prebiotskim efektom, zbog prisustva polisaharida inulina, kao i fruktooligosaharida
(Petkova et al., 2015).
Rezultati istraživanja Grigore et al. (2016) ukazala su na značajan antioksidativni potencijal
alkoholno vodenog ekstrakta korena biljke I. helenium. Ekstrakt je na DPPH testu pokazao
antioksidativnu aktivnost od preko 80% na 50-100 μg/mL, verovatno zbog visokog sadržaja
fenolnih kiselina koje su u njemu utvrđene HPLC analizom.
1.4.2.2. Antimikrobna aktivnost
Jedno od prvih istraživanja bioloških efekata alantolaktona pokazalo je izuzetnu fungistatsku
aktivnost ovog jedinjenja pri koncentraciji od 100 i 200 µg/ml na rast gljive Fusarium solani
izolovanog iz pacijanta sa mikotičnim keratitisom (Wahab et al., 1979).
Uzorak etarskog ulja i heksanski ekstrakt su podvrgnuti antimikrobnom testiranju u odnosu
na pet bakterija i sedam gljivica (Bourrel et al., 1993). Ulje je pokazalo antibakterijsku aktivnost
u opsegu koncentracija od 62,5-4000 µg/ml, gde je najosetljivija bakterija bila S. aureus, a
najveću otpornost pokazala je Gram-negativna bakterija Pseudomonas aeruginosa. Među
testiranim gljivama, humani patogeni su bili osetljiviji u poređenju sa fitopatogenim gljivama, a
najosetljivija je bila C. albicans, gde je MIK iznosila 62,50 µg/ml.
U istraživanju Tan et al. (1998), izoalantolakton izolovan iz korena I. racemosa pokazao je
antimikrobnu aktivnost inhibirajući rast Aspergillus flavus, A. niger, Geotrichum candidum,
22
Kristina Lj. Stanković Master rad
Candida tropicalis i Candida albicans pri inhibitornim koncentracijama od 49, 49, 14, 14 i 14
mg/ml.
Cantrell et al. (1999) su ispitivali antimikobakterijski efekat heksanskih, dihlorometanskih i
metanolnih ekstrakata korena omana, kao i njihovih hromatografskih frakcija. Utvrđeno je da su
alantolakton, izoalantolakton, 1,2-dehidro-3-epi-izotelekin i aloalantolakton pokazali inhibiciju
mikrobakterije pri koncentraciji od svega 32 µg/ml.
Testiranje antimikrobne aktivnosti izoalatolaktona u odnosu na pet bakterija, šest humanih i
šest biljnih patogenih gljiva pokazalo je apsolutnu toksičnost pri koncentraciji od 500 µg/ml na
tri zemljišne fitopatogene gljive (Gaeumannomyces graminis var. tritici, Rhizoctonia cerealis and
Phytophthora capsici). Utvrđeno je da pri MIK koncentracijama ovo jedinjenje ima fungistatski
efekat, dok su MFK (minimalne fungicidne koncentracije) bile 150, 150 i 350 µg/ml. Pored
ovoga, izoalantolakton je pokazao slabu antibakterijsku aktivnost na Bacillus subtilis,
Escherichia coli, Pseudomonas fluorecense, Sarcina lentus i Staphylococcus aureus pri MIK
koncentracijama od 125, 425, 150, 150 i 100 µg/mL (Liu et al., 2001).
U istraživanju Tosun et al. (2005), ekstrakti pripremljeni od biljnog materijala ukupno 107
vrsta testirani su u odnosu na Mycobacterium tuberculosis H37Rv (ATCC 27294). Od testiranih
biljnih vrsta, svega pet, među kojima je bila i I. helenium subsp. turcoracemosa, je pokazalo više
od 90% inhibicije mikobakterije pri koncentracijama nižim od 100 mg/ml. U daljem radu,
testiranje čistog alantolaktona u odnosu na istu bakteriju pokazalo je minimalnu inhibitornu
aktivnost pri 3,125 mg/ml.
Stojakowska et al. (2005) utvrdili su da je 10-izobutiriloksi-8,9-epoksitimol glavni sastojak
kultura korena Inula helenium i Inula royleana. Jedinjenje je pokazalo antimikrobnu aktivnost u
delovanju na Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherischia coli, Pseudomonas
aeruginosa i Candida albicans. Ispitivano jedinjenje je pokazalo umerenu antimikrobnu
aktivnost, sličnu onoj koja je utvrđena kod izoalantolaktona. Etil acetatna frakcija ekstrakta
korena I. helenium koji je ispitivao Gorecki (2001) pokazao je jaču antibakterijsku aktivnost od
10-izobutiriloksi-8,9-epoksitimola u odnosu na S. aureus FDA 209 P (MIK < 10 µg/ml). Studija
koju je sproveo Kowalewski et al. (1976), opisuje antimikrobnu aktivnost helenina, kristalnu
mešavinu eudezmanolida iz korena I. helenium. MIK za helenin kretao se od 10 do 100 µg/ml za
različite organizme, uključujući nekoliko sojeva S. aureus (10–400 µg/ml), E. coli, P. aeruginosa
(200–750 µg/ml) i C. albicans (200–750 µg/ml). Jedinjenje 10-izobutiriloksi-8,9-epoksitimol
23
Kristina Lj. Stanković Master rad
pokazalo je sličan obim aktivnosti prema testiranim mikroorganizmima. Uzimajući u obzir da
kultivisano korenje sadrži veoma male količine eudezmanolida, ukoliko ih uopšte i sadrže,
derivati timola su izgleda glavni antimikrobni agensi u mladom korenju. Pošto su jedinjenja
zajednički konstituenti korenja mnogobrojnih vrsta Asteraceae, autori su predložili dalja
ispitivanja antimikrobne aktivnosti i drugih derivata timola.
O’Shea et al. (2009) su ispitivali ekstrakte omana i utvrdili 100% inhibiciju ukupno 200
kliničkih izolata stafilokoke (uključujući meticilin rezistentnu S. aureus, meticilin senzitivnu S.
aureus i koagulaza negativne stafilokoke). Minimalna baktericidna koncentracija varirala je od
0.9-9 mg/ml, pri čemu je ekstrakt pokazao istu efikasnost i na meticilin senzitivne i meticilin
rezistentne sojeve stafilokoka.
Žugić et al. (2013) su vršili testiranje etarskog ulja dobijenog hidrodestilacijom (IH-HD),
kao i Sohxlet ekstrakata i to etarske (IH-SOX-E) i etanolne (IH-SOX-Et) frakcije. Ekstrakti su
rastvarani u DMSO u koncentracijama od 2560 do 0,625 µg/mL. Antimikrobna aktivnost
ispitivana je mikrodilucionom metodom u bujonu na referentnim bakterijskim sojevima i
kliničkim izolatima iz briseva kože. IH-SOX-E ispoljila je najbolju antimikrobnu aktivnost prema
svim testiranim mikroorganizmima (MIK=<1,25-160 mg/ml), IH-HD je bilo aktivno ali pri višim
koncentracijama (40-1280), dok je IH-SOX-Et jaku aktivnost pokazala je jedino prema kliničkom
izolatu Candida albicans. Rezultati su pokazali da se izolati korena omana mogu koristiti za
inkorporiranje u fitopreparate namenjene za spoljašnju primenu kod kožnih infekcija, naročito
gljivičnih infekcija izazvanih C. albicans.
Tokom istraživanja u kome su izolovana nova jedinjenja iz korena omana, Jiang et al. (2011)
su testirali aktivnost ukupno 16 jedinjenja na Bacillus cereus, Escherichia coli, Erwinia
carotovora, S. aureus i P. aeruginosa. Utvrđeno je da je 4α,15α-epoksialantolakton pokazao jaču
efikasnost na B. cereus (MIK=15,5 µg/ml) nego pozitivna kontrola ampicillin, dok je
izoalantolakton pokazao aktivnost pri 31,3 µg/ml na istu bakteriju. Izoalantolakton, 4α,15α-
epoksialantolakton, makrofililakton, telekin i 3α-hidroksieudezm-4,11-dien-12,8β-olid pokazali
su slabu aktivnost na E. coli (MIK=62,5-125 µg/ml). Jedinjenje 3α-hidroksieudezm-4,11-dien-
12,8β-olid pokazalu je slabu inhibiciju B. cereus, kao i izoalantolakton na S. aureus, dok su
izoalantolakton, makrofililakton, telekin i 3α-hidroksieudezm-4,11-dien-12,8β-olid inhibirali E.
carotovora. Sva ostala testirana jedinjenja nisu pokazala antimikrobni efekat.
24
Kristina Lj. Stanković Master rad
Ekstrakti izolovani iz tri vrste roda Inula i to I. viscosa, I. helenium ssp. turcoracemosa i I.
montbretiana sakupljanih na raznim lokacijama u Anatoliji, istraživane su u smislu antimikrobne
aktivnosti. Antimikrobni potencijal metanolnih ekstrakata navedenih vrsta ispitivan je u odnosu
na vrste Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Pseudomonas
aeruginosa, Candida albicans i Candida tropicalis. Svi ekstrakti pokazali su bolju aktivnost na
Gram-pozitivne bakterije i na kvasce u poređenju sa Gram-negativnim bakterijama, a aktivnost je
utvrđena pri koncentracijama od 50-800 µg/ml (Gökbulut et al., 2013).
Diguta et al. (2014) sproveli su studiju kako bi se procenile in vitro antimikrobne aktivnosti
korenja populacije Inula helenium L. sa prostora Rumunije. Ekstrahovan je prah suvog korena
biljke u etanolu (30%, 50% and 70% v/v). Antimikrobna aktivnost je testirana na 5 potencijalno
patogenih vrsta bakterija (Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Enterococcus faecalis, Escherichia
coli, Staphylococcus aureus) i 4 vrste gljivica (Candida albicans, C. parapsilosis, C. lipolytica
and Aspergillus niger). Antimikrobno dejstvo je ispitivano metodom disk difuzije, a rezultati
studije pokazali su da su etanolni ekstrakti (50% i 70%) iz korena rumunske kultivirane I.
helenium L., pokazali značajno antimikrobno dejstvo na sve testirane mikroorganizme, osim na
patogenu filamentoznu gljivu A. niger. Na vrste roda Candida inhibitorski efekti 50% i 70% -
nih ekstrakata bili su veoma slični. Zbog izuzetno dobrog antimikrobnog efekta, autori su kao
zaključak predložili upotrebu ove biljke u kreiranju novog veterinarskog proizvoda sa
antimikrobnim efektom.
Vodeni ekstrakti izolovani iz nekoliko vrsta roda Inula nisu imali nijedan inhibitorni efekat
na testirane bakterije osim kod I. helenium ssp. orygalis. EE I. helenium ssp. orygalis jedino je
bio efikasan kod C. albicans. U ovoj studiji korišćeni su mikroorganizmi Aeromonas hydrophila
ATCC 7965, Bacillus brevis FMC 3, Bacillus cereus RSKK 863, Bacillus subtilis ATCC 6633,
Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 27736, Listeria monocytogenes
1/2B, Morganella morganii, Proteus mirabilis BC 3624, Pseudomonas aeruginosa ATCC
27853, Salmonella typhimurium NRRLE 4463, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Yersinia
enterocolitica ATCC 1501 (Albayrak et al., 2015).
U istraživanju Ginovyan et al. (2017) koji su pored heksanskih, metanolnih, hloroformnih i
acetonskih ekstrakata više biljnih vrsta, lekovitih u Jermeniji, ispitivali navedene ekstrakte i vrste
I. helenium. Sva četiri ekstrakta pokazala su aktivnost samo na P. aeruginosa, dok su S. aureus i
25
Kristina Lj. Stanković Master rad
Bacillus subtilis pokazale osetljivost samo na heksanski ekstrakt, koji se samim tim pokazao kao
najaktivniji.
Iako postoji samo nekoliko studija na temu antimikrobne aktivnosti etarskog ulja korena I.
helenium, dobijene aktivnosti variraju među studijama i kreću se od 62.50-4000.0 µg/ml (Bourrel
et al., 1993), 9.0-14000.0 µg/ml (Deriu et al., 2008), 13.00 µg/ml (Stojanović-Radić et al., 2012) i
40.0-1280.0 µg/ml (Žugić et al., 2013).
U istraživanju Deriu et al. (2008), utvrđeno je etarsko ulje izolovano iz korena omana deluje
na bakterije Enterococcus faecium, E. faecalis, S. aureus, S. epidermidis, B. cereus, E. coli,
Acinetobacter baumannii, Serratia marcescens, Salmonella typhimurium, Aeromonas sobria i
Pseudomonas aeruginosa, kao i na više vrsta gljiva iz roda Candida (C. albicans, C. glabrata, C.
parapsilosis i C. tropicalis). Bolji antimikrobni efekat utvrđen je na kvasce iz roda Candida, gde
se raspon MIK vrednosti kretao od 0,009-0,6 mg/ml, za razliku od bakterija, kod kojih su se ove
vrednosti kretale od 0,017-14,80 mg/ml. Znatno niža aktivnost utvrđena je za ekstrakt dobije
superkritičnom fluidnom ekstrakcijom, koji je ispoljio aktivnost na samo neke vrste bakterija i
gljiva pri višim koncentracijama u odnosu na etarsko ulje dobijeno vodenom destilacijom.
Pored visokog antimikrobnog potencijala, navedene studije ukazuju na veću aktivnost
etarskog ulja korena I. helenium prema Gram-pozitivnim bakterijama, kao i na mehanizam
delovanja usmeren na ćelijsku membranu S. aureus (Stojanović-Radić et al., 2012).
1.4.2.3. Antineoplastična/ Citotoksična/Antitumorska aktivnost
U radu Konishi et al. (2002) utvrđeno je da metanolni ekstrakt korena omana pokazuje visoku
inhibiciju rasta tumorskih ćelija i to MK-1, HeLa i B16F10. U heksanskoj frakciji ovog ekstrakta,
identifikovano je sedam seskviterpena, među kojima su posebno aktivni bili 1,3,11(13)-
elematrien-8β,12-olid, alantolakton i 5α-epoksialantolakton.
Cilj istraživanja Dorn et al. (2006) bila je identifikacija botaničkog ekstrakta sa
antineoplastičnom aktivnošću. U tom smislu ekstrakti pripremljeni iz korena I. helenium pokazali
su značajno delovanje. Kao što je utvrđeno MTT testom, ekstrakti I. helenium otkrili su visoko
selektivnu toksičnost prema različitim vrstama tumorskih ćelija (HT-29, MCF-7, Capan-2 and
G1), ali mnogo nižu toksičnost prema zdravim ljudskim perifernim krvnim limfocitima (PBL)
kod dva donora. Dodatno je proučavano (elektronskim mikroskopom) umiranje tumorskih ćelija
26
Kristina Lj. Stanković Master rad
indukovano ekstraktom. Postojala je značajna sličnost morfoloških izmena posmatranih kod četiri
ćelijska tipa: nejednaka kondenzacija hromatina, citoplazmatska vezikulacija, oticanje i ruptura
mitohondrija. Morfologija ćelijskog izumiranja više je podsećala na nekrotično nego na
apoptotično ćelijsko umiranje, što je potkrepljeno neuspešnim označavanjem ranog apoptoničkog
odvijanja Annexin V. Ukazano je, nedavno, da jedinjenja koja indukuju ćelijsku smrt sa
morfologijom poput nekrotične mogu veoma biti od koristi u slučajevima gde su kancerogene
ćelije stekle rezistenciju prema apoptozi. U ovom kontekstu, značajna razlika u citotoksičnosti
uzrokovana ekstraktom I. helenium, a koja je bila više od 100 puta veća u redovima tumorskih
ćelija nego u PBL, čini da je ekstrakt odličan kandidat za dalja antikancerogena istraživanja,
naročito zato što ekstrakt I. helenium nije bio mutageničan prilikom Ames-ovog testa.
Citotoksično dejstvo sirovih ekstrakata etanola iz 61 biljne vrste koje se koriste u ruskoj
narodnoj medicini za ublažavanje simptoma bolesti kod obolelih od raka, proučavano je na
kulturama humanih limfoblastičnih Raji ćelija. Ekstrakti Chelidonium majus, Potentilla erecta,
Chamaenerium angustifolium, Filipendula ulmaria i Inula helenium, imali su značajnu
citotoksičnost, sprečavali su rast ćelija pri koncentracijama od 10 i 50 µg/ml. Citotoksičnost
prečišćenih aktivnih jedinjenja odabranih biljnih vrsta ocenjivana je zajedno sa farmaceutskim
antineoplastičnim lekovima metotreksat, fluorouracil, citofosfamid i vinblastin. Seskviterpenski
laktoni helenin, telekin i artemisinin, aromatični poliacetilen kapilin i alkaloidni preparat
sangviritin suzbili su rast ćelija pri koncentracijama od 1–2 µg/mL, što premašuje citotoksičnost
ciklofosfamida i fluorouracila (Spiridonov et al., 2005).
Antitumorski potencijal ekstrakta omana, ispitivan na ćelijskoj liniji raka dojke BT-20 nije
potvrđen u istraživanju Grigore et al. (2016), gde je samo pri veoma visokoj dozi (500 μg/mL)
ekstrakt indukovao citotoksični efekat na 50% tretiranih ćelija.
27
Kristina Lj. Stanković Master rad
1.4.2.4. Imunomodulatorna aktivnost/potencijal
Grigore et al. (2016) vršili su istraživanja koja se bave imunomodulatornim potencijalom
alkoholno vodenog ekstrakta korena biljke Inula helenium. In vitro testovi izvedeni na
makrofagima, jednog od najvažnijih tipova ćelija koji su uključeni u imunološki odgovor,
potvrdili su imunostimulatorni potencijal ekstrakta. Manje doze ekstrakta (25-50 μg/mL) pojačale
su stopu proliferacije alveolarnih makrofaga bolje od levamizola. Istovremena primena ekstrakta
omana i LPS-a i izloženost ćelija ovoj kombinaciji tokom 21 sata održale su ćelijsku vitalnost na
preko 50%. Trebalo bi nastaviti studije kako bi se istražilo jedinjenje(a) odgovorno za ovu
aktivnost i objasnio mehanizam aktivnosti.
1.4.2.5. Efekat na nervni sistem
Pored mnogih aktivnosti ulja, nedavno istraživanje o efektu inhalacije etarskog ulja I.
helenium je pokazalo da ovaj proces može pozitivno uticati na psihofiziološke poremećaje
poboljšanjem stanja budnosti mozga (Sowndhararajan et al., 2016). Sowndhararajan et al. (2016)
su istraživali efekat inhalacije esencijalnog ulja iz korena biljke I. helenium na
elektroencefalografsku (EEG) aktivnost ljudskog mozga. Rezultati pokazuju da je inhalacija
esencijalnog ulja biljke I. helenium uzrokovala značajne promene u vrednostima spektra jačine
EEG-a. Tokom inhalacije su zabeležena smanjenja apsolutnih teta (svi regioni osim T3), beta
(Fp1) i srednjih beta (P4) i relativnih teta (Fp1, Fp2, F3 i F4) talasa. Sa druge strane, odnos SMR
i teta (Fp1 i P4), SMR ~ srednjeg beta i teta (Fp1) i SEF 50% alfe (P4) značajno su se povećali
tokom inhalacije esencijalnog ulja biljke I. helenium. Promene u vrednostima EEG-a usled
inhalacije esencijalnog ulja korena biljke I. helenium poboljšava stanje budnosti mozga i može se
koristiti za lečenje psihofizioloških poremećaja.
28
Kristina Lj. Stanković Master rad
1.5. Osobine ispitivanih mikroorganizama
1.5.1. Gram negativne bakterije
1.5.1.1. Rod Escherichia, vrsta Escherichia coli
Rod Escherichia obuhvata 5 vrsta, od kojih je u medicini najvažnija E. coli. Ova vrsta je
uslovno patogena bakterija koja ulazi u sastav normalne mikrobne flore digestivnog trakta
čoveka, a predstavlja jednu od najčešće izolovanih bakterija iz uzoraka u kliničkim
mikrobiološkim laboratorijama.
Escherichia coli (slika 3) je Gram-negativna pokretna, asporogena i fakultativno anaerobna
bakterija štapićastog oblika koja pripada oportunističkim patogenima. Optimalna temperatura za
njen rast je 37 °C, a nepatogeni sojevi uspevaju i na nižoj temperaturi. Poseduju kapsulu oko
ćelije, kao i flagele.
Morfološke i biohemijske karakteristike. Vrsta je pozitivna na indol, lizin dekarboksilazu,
manitol i formira gas iz glukoze. Oksidaza su negativne. Karakteristični su po fermentaciji
laktoze i specifičnom metalik sjaju na selektivnim podlogama poput Endo ili EMB agara. Na
Endo agaru posle inkubacije od 24 sata kolonije ovih bakterija su prilično velike, konveksne,
glatke i sjajne površine, ravnih ivica i crvene boje, s metalnim sjajem od istaloženog fuksina.
Posle duže inkubacije, kolonije postaju pljosnatije, ivice su im neravnije, a površina im je nešto
izbrazdana. Na dezoksiholat-citratnom agaru rastu oskudnije u vidu manjih, neprozračnih
narandžastih do narandžastocrvenih kolonija. Na krvnom agaru rastu u vidu velikih, konveksnih,
glatkih, sjajnih i prilično velikih mutno sivkastih kolonija. Neki sojevi luče termostabilni
hemolizin i izazivaju beta-hemolizu. Hemolizin ovih sojeva najintenzivnije hemolizira eritocite
pasa, slabije kunića, goveda i konja, a najslabije ovna, zamorca i čoveka (Karakašević et al.,
1967).
Escherichia coli je čest izazivač i intestinalnih i ekstraintestinalnih infekcija kao što su urinarne
infekcije, infekcije rana, meningitis novorođenčadi, pneumonija i sepsa. U smislu respiratornih
oboljenja, ova bakterija se ređe izoluje ali se može naći u uzorcima briseva grla i sputuma, a
najčešće se javlja kao intrahospitalna infekcija (pneumonija asocirana sa mehaničkom
ventilacijom u jedinicama intenzivne nege) (Sutherland et al., 2016). Do pluća može dospeti
29
Kristina Lj. Stanković Master rad
putem krvi iz gastrointestinalnog ili urinarnog trakta, ali je znatno češći slučaj aspiracije ove
bakterije iz orofaringealnog trakta.
Slika 3. Escherichia coli(a. http://www.starweekly.com.au, b. https://news.wisc.edu,c. https://www.foodsafetynews.com, d. https://news.unl.edu)
1.5.1.2. Rod Moraxella, vrsta Moraxella catarrhalis
Moraxella catarrhalis (slika 4) je Gram-negativna, aerobna, nepokretna, nekapsulirana
diplokoka veličine 1,0-2,5 µm, koja je deo normalne orofaringealne flore, ali i važan
oportunistički patogen (Chen et al., 1996). Na preparatu, ova Gram-negativna koka podseća na
Neisseria sp., ali se može lako razlikovati pomoću rutinskih biohemijskih testova nakon što se
izoluje iz uzoraka inficiranih telesnih tečnosti ili tkiva.
Morfološke i biohemijske karakteristike. Kolonije na hranljivom agaru su veličine oko 2 mm
nakon 48 h kultivacije, mat i konveksne, a glavna karakteristika je da se ne adheriraju na agar.
Optimalna temperature za njihov rast je 37 °C, a mogu rasti u rasponu od 22-42 °C. Vrsta je
oksidaza, esteraza, ekstracelularna dezoksiribonukleaza, lipaza i katalaza pozitivna i vrši
30
Kristina Lj. Stanković Master rad
hidrolizu tributirina. Ne produkuje kiselinu iz glukoze, maltoze, fruktoze i saharoze; negativna je
na indol, citrat, vodonik sulfid i ne razlaže želatin.
Prisustvo ove bakterije u gornjem delu respiratornog sistema zabeleženo je kod 1 do 5%
zdravih odraslih osoba. Kolonizacija nazofarinksa česta je u detinjstvu, u zimskim mesecima je
učestalija i predstavlja faktor rizika za akutnu upalu srednjeg uva (otitis). Pored pomenutog
otitisa, kao posledica efekta ove bakterije mogu se javiti i sinuzitis, konjuktivitis, bronhitis i
bronhopneumonija, najčešće kod male dece. Veliki broj sojeva je izuzetno otporan na antibiotike
(Murray et al., 1994). Svi sojevi M. catarrhalis proizvode β-laktamaze, a osetljivi su na β–
laktamske antibiotike u kombinaciji s inhibitorima β–laktamaza.
Slika 4. Moraxella catarrhalis(a. https://fineartamerica.com, b. https://www.pinterest.com, c. http://microbe-canvas.com)
31
Kristina Lj. Stanković Master rad
1.5.2. Gram pozitivne bakterije
1.5.2.1. Rod Staphylococcus, vrsta Staphylococcus aureus
Rod Staphylococcus predstavlja Gram-pozitivne, nepokretne, asporogene koke, koje su
specifično grupisane u grozdove zbog deobe koja se odvija u više ravni. Ćelije su veličine 0,5-1,0
µm i ponekad su inkapsulirane. U okviru roda Staphylococcus najznačajniji humani agens je
Staphylococcus aureus (slika 8), koji ima veći patogeni potencijal od drugih pripadnika ovog
roda. Široko je rasprostranjen u prirodi, a vrlo često se može naći u nazofarinksu, kao i
perineumu, aksili i vagini zdravih ljudi (Jovanović, 2000). Stafilokoke su izuzetno otporne na
fizičke i hemijske agense, pa mogu dugo da opstanu van tela domaćina i široko su rasprostranjene
u prirodi.
Staphylococcus aureus (zlatni stafilokok) (slika 5) je dobio ime po karakterističnom
pigmentu koji kolonijama ove bakterije daje zlatno-žutu boju. Zlatni stafilokok je oportunistički
patogen i izaziva mnošto različitih infekcija i intoksikacija počev od manjih infekcija kože do
teških bolesti poput sepse, zapaljenja pluća i sindroma toksičnog šoka. Poseduje veliku otpornost
na antibiotike. Najznačajnije morfološke karakteristike S. aureus su: ćelijski zid, peptidoglikan,
protein A, tejhojna kiselina i klamping (clumping) faktor. Određeni sojevi S. aureus sintetišu
egzotoksine a određeni procenat sojeva produkuje eksfolijatin. Ova bakterija ima sposobnost
produkcije i pet različitih citotoksina: α, β, γ, δ i leukocidin (Karakašević, 1987).
Morfološke i biohemijske karakteristike. Ova vrsta raste na velikom broju podloga opšte
namene u vidu mat, okruglih kolonija ravnih ivica i promera oko 2 mm. Na preparatu se mogu
uočiti ljubičasto obojene grozdaste formacije sačinjene od okruglih ćelija. Ne poseduju kapsulu
niti strukture za kretanje. Biohemijski testovi pokazuju katalaza, citrat, koagulaza, MR i VP
pozitivnu reakciju, kao i beta hemolizu na krvnom agaru. Vrše hidrolizu želatina i redukciju
nitrata. Prema sposobnosti produkcije enzima koagulaze, sve stafilokoke se dele u dve grupe:
koagulaza pozitivne i koagulaza negativne. U laboratoriji se, na osnovu ispitivanja sposobnosti
produkcije koagulaze može diferentovati koagulaza pozitivan stafilokok (patogeni) od koagulaza
negativnih – uslovno patogenih (oportunističkih) stafilokoka.
32
Kristina Lj. Stanković Master rad
Vrsta S. aureus izaziva veoma širok spektar oboljenja, uključujući razne kožne infekcije,
oboljenja unutrašnjih organa (endokarditis), ali i respiratorna oboljenja, koja su najčešća kao
sekundarna infekcija nakon viroze, najčešće gripa.
Slika 5. Staphylococcus aureus(a. https://sk.wikipedia.org, b. http://www.pinsdaddy.com)
33
Kristina Lj. Stanković Master rad
2. Ciljevi rada
izolovati etarsko ulje iz biljnog materijala korena vrste I. helenium metodom
hidrodestilacije
ispitati hemijski sastav etarskog ulja
odrediti antimikrobni potencijal etarskog ulja u odnosu na respiratorne izolate vrsta
Staphylococcus aureus, Escherichia coli i Moraxella catarrhalis
ispitati mehanizam dejstva etarskog ulja omana metodom detekcije oštećenja
membrane i praćenja dinamike rasta ćelijskih kultura tretiranih uljem
34
Kristina Lj. Stanković Master rad
3. Materijal i metode
3.1. Izolovanje etarskog ulja
Etarsko ulje biljne vrste Inula helenium je izolovano hidrodestilacijom u aparaturi po
Klevendžeru (Clevenger). Suvi biljni materijal je nakon usitnjavanja i odmeravanja
hidrodestilovan tokom 2,5 h. Dobijeno etarsko ulje tamno plave boje je ekstrahovano dietil-
etrom, a zatim je ekstrakt sušen preko anhidrovanog magnezijum-sulfata. Prinos ulja je određen
odmah nakon odvajanja sredstva za sušenje filtriranjem, odnosno uparavanja dietil-etra na
rotacionom vakuum uparivaču. Dobiveno etarsko ulje je, odmah nakon obrade, analizirano
korišćenjem metoda GC i GC-MS.
3.2. Gasna hromatografija-masena spektrometrija (GC-MS)
Gasno-hromatografska analiza (GC-MS) etarskog ulja i „dry flash” frakcija etarskog ulja
je izvršena na gasnom hromatografu tipa HP 6890N, sa DB-5MS kapilarnom kolonom (5%
fenilmetilsiloksan, dimenzije 30 m × 0,25 mm, debljina filma 0,25 μm, Agilent Technologies,
SAD). Gasni hromatograf je bio direktno povezan sa masenim detektorom MSD 5975B iste
kompanije. Uslovi analize: radna temperatura injektora 250 °C, odnosno detektora 320 °C;
linearni temperaturni program zagrevanja kolone u opsegu od 70 °C do 290 °C sa brzinom
povećanja temperature od 5 °C/min, nakon čega je postojao izotermalni period na 290 °C u
trajanju od 10 minuta. Injektiran je rastvor uzorka u etru (1 μl rastvora koncentracije 1 mg u 1 ml
dietil-etra), u pulsnom „split” modu (40:1), pri protoku od 1,5 ml/min helijuma za prvih 30
sekundi, a zatim je protok održavan na 1,0 ml/min do kraja analize. Jonizacija je vršena
elektronima energije 70 eV, sa akvizicijom m/z vrednosti opsegu od 35 do 650 i brzinom
skeniranja na 0,32 s po skenu. Procentualni sastav pojedinih sastojaka je određen na osnovu
odnosa površina pikova, bez korišćenja korekcionih faktora.
35
Kristina Lj. Stanković Master rad
3.3. Identifikacija sastojaka
Obrada rezultata je vršena pomoću MSD ChemStation softvera (ver. D.03.00.611,
Agilent Technologies, SAD) u kombinaciji sa AMDIS (ver. 2.68) i NIST MS Search
programskim paketima (ver. 2.0d, Nacionalni institut za standarde i tehnologiju (NIST), SAD).
AMDIS je korišćen za dekonvoluciju masenog skena, tj. ekstrakciju masenih spektara iz skenova
preklopljenih pikova, dok je NIST MS Search obezbedio algoritam za pretragu biblioteka
masenih spektara. Linearni retencioni indeksi svih sastojaka analiziranih uzoraka su određeni
koinjekcijom uzorka sa homologom serijom n-alkana od C9-C29 (Den Dool i Kratz, 1963).
Hemijski sastav uzoraka ulja i frakcija ulja je određen upoređivanjem linearnih retencionih
indeksa sastojaka sa literaturnim vrednostima (Adams, 2007), kao i na osnovu poređenja
masenih spektara jedinjenja sa spektrima jedinjenja iz biblioteka Wiley Registry of Mass
Spectral Data 11th Edition, NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library 07, MassFinder 2.3, Adams
(Adams, 2007) i biblioteke masenih spektara laboratorije za organsku analizu i sintezu, PMF-a u
Nišu. Gde god je bilo moguće, vršena je i analiza uzorka sa koinjektiranim odgovarajućim
standardom.
3.4. Antimikrobne analize
3.4.1. Testiranje antimikrobne aktivnosti etarskih ulja na respiratorne izolate
3.4.1.1. Bakterijski izolati
Za određivanje antimikrobne aktivnosti etarskog ulja korišćeni su sledeći izolati: 4 izolata
Staphylococcus aureus (bris nosa), jedan izolat Escherichia coli (bris grla) i jedan izolat vrste
Moraxella catarrhalis (bris nosa). Respiratorni izolati su poreklom od pacijenata poliklinike
''Human'' u Nišu. Izolati su kultivisani na hranljivom agaru i inkubirani na 37 °C, nakon čega su
održavani i skladišteni u laboratoriji Prirodno-matematičkog fakulteta Univerziteta u Nišu.
36
Kristina Lj. Stanković Master rad
Slika 6. Mikrotitar pločahttp://www.ibz.ethz.ch
3.4.1.2. Mikrodiluciona metoda
Antimikrobna aktivnost etarskog ulja I. helenium testirana je mikrodilucionom metodom
na mikrotitar pločama. Od prekonoćnih kultura testiranih sojeva mikroorganizama uzgajanih na
hranljivom ili krvnom agaru, napravljene su suspenzije bakterija u sterilnom fiziološkom
rastvoru i podešene na turbiditet od 0.5 McFarland-a, što odgovara koncentraciji bakterija od 1-5
x 108 CFU/ml (CLSI –Clinical and Laboratory Standards Institute, 2008). Rastvor etarskog ulja
(100% DMSO) ubačen je u bunariće mikrotitar ploče i napravljena serija od 12 duplih
razblaženja (finalni raspon koncentracija iznosio je 0,004-10 mg/ml), nakon čega je svaki
bunarčić inokulisan prethodno podešenom suspenzijom odgovarajuće vrste bakterije. Ovako
pripremljene mikrotitar ploče inkubirane su na 37 °C u trajanju od 24 h. Nakon tog perioda,
minimalne inhibitorne koncentracije (MIK) očitavane su nakon 1 h inkubacije na 37 °C sa
dodatkom 0,05% TTC-a (trifenil-tetrazolijum hlorid). Koncentracija prvog bunarića u kojoj nije
bilo crvenog obojenja predstavlja MIK, a bujon iz svih neobojenih bunarića je prenet
automatskom pipetom na petri ploče sa sterilnom Miler-Hinton podlogom. Nakon inkubacije
tokom 24 h na 37 °C, brojane su izrasle kolonije i određene minimalne baktericidne
koncentracije (MBK) testiranog etarskog ulja. MBK se definiše kao ona koncentracija
antimikrobne supstance pri kojoj se uništi 99.99% bakterijskih ćelija. Metoda dilucije je izvedena
u tri ponavljanja, a kao pozitivna kontrola korišćen je antibiotik hloramfenikol početne
koncentracije 0,1 mg/ml.
37
Kristina Lj. Stanković Master rad
3.4.2. Metode za određivanje mehanizama delovanja etarskih ulja
3.4.2.1. Kinetika (dinamika) rasta tretiranih bakterija
Za merenje kinetike rasta tretiranih bakterija, sterilni bujon sa dodatkom etarskog ulja I.
helenium (u minimalnoj inhibitornoj koncentraciji) zasejan je suspenzijom napravljenom iz
prekonoćne kulture odgovarajućeg bakterijskog soja, prethodno standardizovanog na 0.5
MacFarland turbiditet. Nakon inokulacije, odmah je uzet uzorak čija je apsorbanca izmerena na
600 nm (vreme 0), a zatim su uzorci uzimani nakon 1, 2, 6, 12 i 24 h. Pored ovoga, eksperiment
je obuhvatao i sledeće kontrolne uzorke: bujon sa rastvaračem (DMSO), bujon koji je sadržao
samo dodato etarsko ulje, kao i bujon koji je sadržao samo bakterije (inokulum).
3.4.2.2. Metoda detekcije oslobađanja nukleinskih kiselina
Prekonoćne kulture bakterija u Miler Hinton bujonu (30 ml) su centrifugirane 5 min na
4000 rpm (4 °C), dva puta isprane fosfatnim puferom (PBS-Phosphate Buffer Saline) i
resuspendovane u PBS-u, tako da je finalna gustina suspenzija iznosila 1010 ćelija/ml. Suspenzija
je zatim podeljena na jednake volumene, koji su zatim centrifugirani 10 minuta na 10 000 x g,
(20 °C). Nakon odlivanja supernatanta i dodavanja rastvorenih etarskih ulja u istom volumenu,
suspenzije su ponovo centrifugirane, nakon čega je dobijeni supernatant sniman na 260 nm
talasne dužine. Merenja su vršena u vremenskim intervalima od 0 minuta, 30 minuta, 1 h, 2 h i 4
h od momenta dodavanja ulja. Uz pomenute uzorke, snimana je i apsorbanca rastvora etarskog
ulja bez ćelija, koji je služio kao kontrola koja je pri analizi podataka oduzimana od apsorbance
uzoraka.
38
Kristina Lj. Stanković Master rad
4. Rezultati i diskusija
Destilacijom biljnog materijala korena omana dobijeno je etarsko ulje, čijom je analizom
tehnikama GC i GC-MS utvrđeno prisustvo 25 komponenti, što predstavlja 96,2%
ukupnog masenog udela. Od prisutnih 25 komponenti identifikovano je 21, što
predstavlja 93,3% masenog udela. Pregled učestalosti pojedinačnih komponenti prikazan
je u Tabeli 4 i na Grafikonu 1.
RI1 Sastojci [%] ID800 Heksanal 0,1 RI, MS, CoI806 Butil acetat 0,1 RI, MS, CoI907 Ciklofenhen tr MS, CoI966 β-Pinen 0,1 RI, MS, CoI1030 Eukaliptol tr RI, MS, CoI1148 Camfor tr RI, MS, CoI1159 Alben 0,1 MS, CoI1394 β-Elemen 0,3 MS, CoI1422 (E)-Kariofilen 0,1 RI, MS, CoI1440 Dihidro-β-jonon tr MS, CoI1449 epi-β-Santalen tr MS, CoI1462 β-Santalen tr MS, CoI1472 4,5-di-epi-Aristolohen 0,2 MS, CoI1489 β-Selinen 0,5 MS, CoI1498 α-Selinen tr MS, CoI1508 Germakren A 0,1 MS, CoI1580 Elemenal 0,2 RI, MS, CoI1586 Kariofilen oksid 0,2 RI, MS, CoI1649 3-Metiltetradekan-2-on tr RI, MS, CoI
1901 Seskviterpenski lakton 1 (C15H22O2)a tr /
1915 Alantolakton 65,8 RI, MS, CoI
1931 Seskviterpenski lakton 2 (C15H22O2)b 0,4 /
1954 Izoalantolakton 25,5 RI, MS, CoI
1957 Seskviterpenski lakton 3 (C15H22O2)c 1,9 /
Tabela 4. Hemijski sastav etarskog ulja izolovanog iz korena biljne vrste Inula helenium
39
Kristina Lj. Stanković Master rad
1967 Seskviterpenski lakton 4 (C15H20O2)d 0,6 /
Ukupno 96.2 (25)j
Monoterpenoidi (M) 0.2 (4)Seskviterpenoidi (S) 92.8 (12)Seskviterpenski laktoni 91.3 (2)Ostalo (O) 0.2 (5)Neidentifikovana jedinjenja 2.9 (4)
Ukupno (%) 96.2 (25)j
RI1 = eksperimentalno određeni retencioni indeksi na DB-5MS koloni koinjekcijom homologe serije n-alkana C7-C30. tr = trag (< 0.05%); ID = Identifikacija; Identitet jedinjenja je potvrđen poređenjem njihovih masenih spektara sa spektrima iz Wiley 6, Nist 02, MassFinder 2.3 (MS), izračunatih retencionih indeksa (RI) sa literaturnim vrednostima (Adams, 2007) i koinjekcijom (CoI) sa odgovarajućim standardom.a MS(EI, 70 eV), m/z (rel. int, %): 234 (12.8), 219 (21.5), 178 (23.2), 161 (16.6), 145 (100), 131 (20.5), 119 (26.7), 105 (56.3), 91 (69.1), 77 (36.9), 67 (18.8), 55 (26), 41 (40.6).b MS(EI, 70 eV), m/z (rel. int, %): 234 (12.5), 219 (42.9), 173 (14.6), 161 (10.3), 145 (100), 131 (26.4), 119 (15.4), 105 (33.1), 91 (51.3), 77 (31.3), 67 (14.5), 55 (19.7), 41 (30).c MS(EI, 70 eV), m/z (rel. int, %): 234 (6.8), 219 (16.4), 192 (29.8), 178 (16.9), 161 (43.4), 145 (53.5), 133 (26.4), 119 (57.8), 105 (65.8), 91 (100), 79 (81.8), 77 (65.1), 67 (49.2), 55 (56.9), 41 (73.3).d MS(EI, 70 eV), m/z (rel. int, %): 232 (9.6), 217 (9.6), 203 (3.1), 189 (4.4), 175 (9), 161 (8.3), 145 (14.1), 135 (15), 121 (22.1), 108 (39.7), 105 (31.5), 91 (70.3), 79 (44.2), 77 (43.4), 68 (100), 53 (66.4), 41 (52.8).j broj u zagradi predstavlja broj jedinjenja koja pripadaju datoj klasi klasi.
Rezultati su izraženi kao relativni udeo (%) komponente u etarskom ulju. Etarsko ulje
koje je dobijeno hidrodestilacijom korena omana pokazuje visok sadržaj seskviterpenoida
92,8% (12 komponenti), gde seskviterpenski laktoni čine 91,3% (2 komponente) i nizak
sadržaj monoterpenoida 0,2% (4 komponente). Od znatno manje zastupljenih komponenti
ispitivanog ulja, kao najdominantnije izdvojile su se:
1. neidentifikovani seskviterpenski lakton 1 (tr), 2 (0,4%), 3 (1,9%), 4 (0,6%)
(C15H22O2) što čini ukupno 2,9%,
2. β-selinen (0,5),
40
Kristina Lj. Stanković Master rad
3. β-elemen (0,3%).
Prisustvo alantolaktona i izoalantolaktona, kao glavnih komponenti ovog ulja,
dokumentovano je u svim radovima na ovu temu, gde su ova dva seskviterpenska laktona
uglavnom zauzimala više od 80% njegovog sastava (Bourrel et al., 1993; Deriu et al.,
2008; Stojanović-Radić et al., 2012). U ovom radu ispitivano ulje (Tabela 4), u odnosu na
prethodne rezultate (Tabela 3), pokazuje da seskviterpenski laktoni čine 91,3% udela
komponenti etarskog ulja - alantolakton (65,8%) i izoalantolakton (25,5%).
Grafik 1. Prikaz sastava etarskog ulja izolovanog iz korena biljne vrste I. helenium (L.)
41
Kristina Lj. Stanković Master rad
U radu Bourrel et al. (1993), seskviterpenski laktoni čine 85,4%, što je za 5,9%
manje, od toga alantolakton iznosi 52,4%, što je za 13,4% više i izoalantolakton 33% što
je za 7,5% više nego u ovde ispitivanom ulju. Takođe, kod Deriu et al. (2008),
procentualna zastupljenost helenina (alantolakton + izoalantolakton) iznosila je 88,2%,
što je za 3,1% manje negó u našem ulju. Od toga, alantolakton je bio zastupljen sa 51,3%,
(14,5% manje), a izoalantolakton sa 36,9% (11,4% više nego u našem istraživanju).
U studiji Stojanović-Radić et al. (2012), helenin je bio zastupljen sa 82,1% (9,2%
manje), a od toga je bilo 55,8% alantolaktona (za 10% manje) i 26,3% više
izoalantolakton, što je za 0,8 više nego u ovom radu. Srednja vrednost za alantolakton, u
pomenuta 3 rada, iznosi 53,17%, a za izoalantolakton iznosi 32,07% (za helenin 85,24%).
Upoređujući sa našim radom, srednja vrednost za alantolakton je manja za 12,63%, a za
izoalantolakton veća za 6,57% nego u prethodnim istraživanjima. Interesantna je
činjenica da u našoj analizi nije pronađena komponenta diplofilin, koja je bila prisutna u
etarskom ulju omana sakupljenog u Srbiji, a koja se pokazala kao jedan od glavnih
nosioca antimikrobne aktivnosti ovog ulja (Stojanović-Radić et al., 2012).
Na osnovu daljeg upoređivanja ovog rada (Tabela 4) sa tri pomenuta (Tabela 3),
može se videti da je u ovom radu identifikovano prisustvo 25 komponenti (96,2%
masenog udela), dok su Bourrel et al. (1993) utvrdili prisustvo 12 (što čini 91,7%
masenog udela), Deriu et al. (2008) 15 (93,9%) i Stojanović-Radić et al. (2012) 67
komponenti (91,5% masenog udela) u hemijskom sastavu ulja izolovanog iz korena
omana.
U odnosu na ova tri rada, u našem ulju se pojavljuju tri komponente koje nisu
zabeležene ili su u tragovima kod njih, a to su heksanal (sa 0,1%), β-pinen (sa 0,1%) i
alben (sa 0,1%) - (kod Bourrel et al. (1993) i Deriu et al. (2008) nisu zabeleženi, dok je
kod Stojanovi-Radić et al. (2012) u tragovima).
Pet jedinjenja koja se pojavljuju u ovom radu (iznose 0,1% i više), u ostala tri
rada se ne pojavljuju čak ni u tragovima, ili se pojavljuju u minimalnim procentima, su:
1. β-elemen 0,3% (Bourrel et al. (1993) 1,2%, Deriu et al. (2008) 1,2%, Stojanović-
Radić et al. (2012) 0,1%),
42
Kristina Lj. Stanković Master rad
2. 4,5-di-epi-aristolohen 0,2% (Bourrel et al. (1993) 0%, Deriu et al. (2008) 0%,
Stojanovi-Radić et al. (2012) 0,2%),
3. β-selinen 0,5% (Bourrel et al. (1993) 0,5%, Deriu et al. (2008) 0%, Stojanović-
Radić et al. (2012) 0,1%),
4. Germakren A 0,1% (Bourrel et al. (1993) 0%, Deriu et al. (2008) 0%, Stojanović-
Radić et al. (2012) 0,3%),
5. (E)-Kariofilen 0,1% (Bourrel et al. (1993) 0%, Deriu et al. (2008) 0,2%,
Stojanović-Radić et al. (2012) 0%).
Četiri komponente koje su se u našem ulju javila u jako niskom procentu (eukaliptol,
kamfor, epi-β-santalen i α-selinen) u ostala tri rada nisu zabeležene kao prisutne, ili su
takođe detektovane u minimalnim procentima. Eukaliptol i kamfor se kod nas i ulja
takođe izolovanog iz materijala poreklom iz Srbije (Stojanović-Radić et al., 2012)
pojavljuju u tragovima, dok u ostalim radovima nisu detektovane kao komponente ulja
omana. Epi-β-santalen se u ovom radu i studiji Stojanović-Radić et al. (2012) pojavljuje u
tragovima, kod Deriu et al. (2008) njegovo učešće bilo je 0,1% ukupnog sadržaja ulja,
dok kod Bourrel et al. (1993) ova komponenta nije detektovana. Slična situacija uočena
je za jedinjenje α-selinen, koja je u ovde ispitivanom ulju bila prisutna u tragovima, u
istraživanju Stojanović-Radić et al. (2012) imala je učešće od 0,1%, kod Deriu et al.
(2008) 0,4%, dok kod Bourrel et al. (1993) ni ona nije detektovana. Takođe, četiri
minornih komponenti našeg ulja i to ciklofenhen, dihidro-β-jonon, β-santalen i 3-
metiltetra-dekan-2-on nisu do sada zabeležene kao komponente ulja omana. Pored ovih,
nešto više zastupljene komponente (0,1% i više), koje do sada nisu zabeležene u ulju
omana bile su butil acetat (0,1%), elemen (0,2%) i kariofilen oksid (0,2%). Na osnovu
navedenog, ukupno je 7 komponenti (koje su u tragovima ili iznose 0,1% i više u ovom
radu) po prvi put zabeleženo u etarskom ulju omana. Kod ispitivanja hemijskog sastava
korena i nadzemnih delova vrste Inula helenium od strane Bolhman et al. (1978),
utvrđeno je da su, pored dominantnog prisustva alantolaktona i izoalantolaktona, prisutna
i jedinjenja koja pripadaju uglavnom seskviterpenima i to aloalantolakton
(eudezmanolid/seskviterpen), 1(10),4(15),5(6),11(13)-germakrateaen-8,12-olid, 11(13)-
dehidroeriolin (germakranolidi/seskviterpeni), izohumulen (humulen/seskviterpen) i
43
Kristina Lj. Stanković Master rad
damadienol acetat (druge komponente). Navedene komponente u ovom radu nisu
pronađene prilikom hemijske analize etarskog ulja I. helenium. Takođe, nešto kasnije,
Vajs et al. (1989) istraživanja seskviterpenskih laktona iz I. helenium po prvi put su
utvrdila prisustvo 11(13)-dehidrokriolina, 2α-hidroksialantolaktona, 4α,5α-epoksi-
10α,14-H-inuviskolida i karabrona, koji takođe nisu zabeleženi u ovom radu prilikom
hemijske analize etarskog ulja I. helenium. Rezultati drugih istraživanja, koji su
pomenuti, kao i rezultati dobijeni u okviru istraživanja u ovom radu, ukazuju nam na
velike razlike u kvalitativnom i kvantitativnom sastavu terpenoidnih jedinjenja. Mnoge
komponente se pojavljuju u jednim istraživanjima, dok se u drugim ne pojavljuju čak ni u
tragovima. Ovo je najverovatnije rezultat uticaja staništa, različitih genetičkih, ekoloških
i drugih faktora na biosintezu sekundarnih metabolita. Poznato je da vrste i količine
pojedinih jedinjenja u organima i tkivima biljaka su upravo uslovljene pomenutim
faktorima. Komponente koja se pojavljuju u svim istraživačkim radovima i koja su
dominantna, jesu seskviterpenski laktoni i njihov udeo je veći od 80% u etarskom ulju I.
helenium.
U ovom radu vršeno je ispitivanje antimikrobne aktivnosti etarskog ulja I.
helenium (omana) u odnosu na odabrane sojeve mikroorganizama (Tabela 5).
Mikrodilucionom metodom određene su minimalna inhibitorna koncentracija (MIK) i
minimalna baktericidna koncentracija (MBK). Ova metoda, korišćena u ovom
istraživanju, pokazala je aktivnost etarskog ulja omana u opsegu koncentracija od 0,07 do
10,0 mg/ml (Tabela 5, Grafik 2). Ispitivano etarsko ulje bilo je efikasno na sve testirane
izolate, pri čemu su minimalne inhibitorne koncentracije varirale od 0,07-2,50 mg/ml,
dok su se minimalne baktericidne koncentracije kretale od 0,15-10,0 mg/ml.
44
Kristina Lj. Stanković Master rad
Redni broj Izolati Poreklo MIK MBK
1 Staphylococcus aureus bris nosa 2,50 10,0
2 Staphylococcus aureus bris nosa 0,31 0,31
3 Staphylococcus aureus bris nosa 0,07 0,15
4 Staphylococcus aureus bris nosa 0,15 0,62
5 Escherichia coli bris grla 2,50 10,0
6 Moraxella catarrhalis bris nosa 1,25 1,25
Tabela 5. Antimikrobna aktivnost (MIK/MBK) etarskog ulja I. helenium protiv respiratornih izolata
Grafik 2. Antimikrobna aktivnost (MIK/MBK) etarskog ulja I. helenium protiv respiratornih izolata
45
Kristina Lj. Stanković Master rad
Dosadašnje studije na temu antimikrobne aktivnosti etarskog ulja korena I.
helenium, pokazuju da dobijene aktivnosti variraju među njima i kreću se od 0,01 mg/ml
do 14,8 mg/ml (0,06-4,00 mg/ml (Bourrel et al., 1993), 0,02-14.80 mg/ml (Deriu et al.,
2008), 0,01 mg/ml (Stojanović-Radić et al., 2012) i 0,04-1,28 mg/ml (Žugić et al., 2013)),
što se poklapa sa rezultatima dobijenim u ovom istraživačkom radu gde je opseg
koncentracija od 0,07 mg/ml do 10 mg/ml.
Bourrel et al. (1993) izvršili su antimikrobno testiranje uzoraka etarskog ulja i
heksanskih ekstrakata u odnosu na pet bakterija i sedam gljivica. Ulje je pokazalo
antibakterijsku aktivnost u opsegu koncentracija od 0,06-4 mg/ml, gde je najosetljivija
bakterija bila S. aureus, a najveću rezistentnost pokazala je Gram-negativna bakterija
Pseudomonas aeruginosa. Pored toga, Stojanović-Radić et al. (2012) su pored visokog
antimikrobnog potencijala, ukazali takođe na veću aktivnost etarskog ulja korena I.
helenium prema Gram-pozitivnim bakterijama, kao i na mehanizam delovanja usmeren
na ćelijsku membranu S. aureus. Godinu dana kasnije, Gökbulut et al., (2013) ispitivali
su antimikrobni potencijal metanolnih ekstrakata, izolovanih iz tri vrste roda Inula i to I.
viscosa, I. helenium ssp. turcoracemosa i I. montbretiana, u odnosu na vrste
Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Pseudomonas
aeruginosa, Candida albicans. Svi ekstrakti pokazali su, kao i u prethodnim
istraživanjima, bolju aktivnost na Gram-pozitivne bakterije u poređenju sa Gram-
negativnim bakterijama, a aktivnost je utvrđena pri koncentracijama od 0,05-0,8 mg/ml.
U ovom, kao i u dosadašnjim istraživanjima, najveću osetljivost na dejstvo ulja
pokazao je (Tabela 5) izolat S. aureus 3 (MIK 0,07 mg/ml i MBK 0,15 mg/ml), dok su
najveću rezistenciju pokazala dva soja i to S. aureus 1 i E. coli, koji su imali iste
vrednosti inhibitornih i baktericidnih koncentracija (MIK 2,50 mg/ml i MBK 10 mg/ml).
U ostalim radovima vršeno je i ispitivanje drugih ekstrakata, kao i pojedinačnih
komponenti ekstrakata I. helenium, kao što je i studija koju je sproveo Kowalewski et al.
(1976), gde opisuje antimikrobnu aktivnost helenina, kristalnu mešavinu eudezmanolida
iz korena I. helenium. MIK za helenin kretao se od 10 do 100 µg/ml za različite
organizme, uključujući nekoliko sojeva S. aureus (10–400 µg/ml), E. coli, P. aeruginosa
(200–750 µg/ml) i C. albicans (200–750 µg/ml). Jedinjenje 10-izobutiriloksi-8,9-
46
Kristina Lj. Stanković Master rad
epoksitimol pokazalo je sličan obim aktivnosti prema testiranim mikroorganizmima.
Uzimajući u obzir da kultivisano korenje sadrži veoma male količine eudezmanolida,
ukoliko ih uopšte i sadrže, derivati timola su izgleda glavni antimikrobni agensi u
mladom korenju. Pošto su jedinjenja zajednički konstituenti korenja mnogobrojnih vrsta
Asteraceae, autori su predložili dalja ispitivanja antimikrobne aktivnosti i drugih derivara
timola (Stojanowska et al., 2005).
Istraživanja Cantrell et al. (1999), koja su vršena za ispitivanje antimikobakterijskih
efekata heksanskih, dihlorometanskih i metanolnih ekstrakata korena omana, kao i
njihovih hromatografskih frakcija pokazala su da pojedinačne komponente kao što su
alantolakton, izoalantolakton, 1,2-dehidro-3-epi-izotelekin i aloalantolakton pokazuju
inhibiciju mikrobakterije pri koncentraciji od svega 0,03 mg/ml. Testiranje koje su
sproveli Liu et al. (2001) o antimikrobnoj aktivnosti izoalatolaktona u odnosu na Bacillus
subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas fluorecense, Sarcina lentus i Staphylococcus
aureus utvrdilo je MIK koncentracije od 0,13 mg/ml, 0,43 mg/ml, 0,15 mg/ml, 0,15
mg/ml i 0,1 mg/ml, respektivno, što ukazuje na umerenu antibakterijsku aktivnost. U
istraživanju Tosun et al. (2005), ekstrakti pripremljeni od biljnog materijala ukupno 107
vrsta testirani su u odnosu na Mycobacterium tuberculosis H37Rv (ATCC 27294). Od
testiranih biljnih vrsta, svega pet, među kojima je bila i I. helenium subsp.
turcoracemosa, je pokazalo više od 90% inhibicije mikobakterije pri koncentracijama
nižim od 100 mg/ml. U daljem radu, testiranje čistog alantolaktona u odnosu na istu
bakteriju pokazalo je minimalnu inhibitornu aktivnost pri 3,125 mg/ml.
Zbog svega navedenog, dalja istraživanja treba fokusirati ka detaljnijim
ispitivanjima hemijskog sastava i antimikrobnog potencijala pojedinačnih komponenti
etarskog ulja I. helenium. Treba detaljno ispitati i efekat ovog ulja na normalnu floru,
kako bi se procenila eventualna selektivnost na patogene vrste, čime bi ovo ulje dobilo
na značaju kao terapeutski agens.
Rezultati dobijeni spektrofotometrijskim merenjem izlaska nukleinskih kiselina iz
ćelija respiratornih izolata tretiranih etarskim uljem omana pokazali su različite efekte
nakon finalnog perioda od 4 h (Grafik 3). U odnosu na jedini tretirani soj vrste E. coli,
vidi se postupni rast koncentracije nukleinskih kiselina van ćelije, koji je bio najveći
47
Kristina Lj. Stanković Master rad
nakon 4 h. Međutim, pošto je kontrolni uzorak pokazao slične rezultate, efekat ulja je
verovatno nije usmeren na ćelijsku membranu.
U odnosu na izolat M. catarrhalis, uočen je povećan izlazak nukleinskih kiselina
kada su ćelije tretirane etarskim uljem u poređenju sa kontrolnim uzorcima. Izolati S.
aureus su pokazali različite efekte ispitivanog etarskog ulja, pri čemu je na nekim
sojevima uočljiva povećana propustljivost ćelijske membrane (sojevi 3 i 4), dok je kod
drugih taj efekat izostao u prvih 4 h inkubacije u prisustvu etarskog ulja u minimalnoj
inhibitornoj koncentraciji. Generalno se na osnovu dobijenih rezultata može reći da ni
kod jednog soja nije detektovano masivno oštećenje membrane koje bi rezultovalo smrću
ćelije u periodu do 4 h nakon aplikacije ulja. Samim tim, može se zaključiti da
mehanizam delovanja etarskog ulja omana nije usmeren samo na ćelijsku membranu, već
verovatno na neke od regulatornih ćelijskih procesa.
Curenje citoplazminog materijala smatra se indikativnim za grubo i nepovratno
oštećenje citoplazmine membrane. Zato, mnoga antimikrobna jedinjenja izazivaju
gubitak materijala delujući na bakterijsku membranu. Materijal koji se apsorbuje na 260
nm su nukleinske kiseline, dok su na 280 nm proteini (Carson et al., 2002). Suspenzija E.
coli K1.1, koja je tretirana etarskim uljem biljne vrste Kaempferia pandurata, izgubila je
značajne količine 260 i 280 nm apsorbujućeg materijala upoređujući vrednosti sa
kontrolnim uzorkom koga su sačinjavale samo bakterijske kulture, što ukazuje na to da su
nukleinske kiseline i određeni protein izgubljeni kroz oštećenu citoplazminu membranu.
Značajno povećanje apsorpcije na 260 nm dogodilo se posle tretmana MIK (0,11%) i
2xMIK (0,22%) koncentracijom etarskog ulja u etanolu (P˂0,005; F vrednosti = 249,58)
(Miksusanti et al., 2008). U poređenju sa našim istraživanjem, gde su kontrolni uzorak i
tretirani uzorak imali slične rezultate, može se zaključiti da je etarsko ulje K. pandurata
efikasnije delovalo na soj E. coli u odnosu na etarsko ulje I. helenium.
U radu Yang et al. (2018) ispitivan je uticaj etarskog ulja Kaempferia galanga na
odabrane sojeve bakterija (E. coli, S. typhimurium, S. aureus) merenjem količine
oslobođenog nukleinskog mareijala u supernatantu. Nukleinske kiseline i proteini su
oslobođeni u supernatantu, na nivoima koji se značajno povećavaju vremenom posle
izlaganja etarskom ulju K. galanga. Uzorci su mereni 1, 2, 6 h nakon početka
48
Kristina Lj. Stanković Master rad
eksperimenta. Utvrđena je pozitivna korelacija oštećenja sa vremenom trajanja tretmana
etarskim uljem. Koncentracije nukleinskih kiselina i proteina u ekstracelularnom prostoru
značajno su se povećale u prvom satu tretmana. I u narednih 5 sati, ovaj trend se nastavio
u različitim stepenima. U međuvremenu, kontrolni uzorci nisu pokazali skoro nikakav
porast. U našem radu prisutan je postupni rast koncentracije nukleinskih kiselina van
ćelije (E. coli), ali je i kontrolni uzorak pokazao slične rezultate, pa verovatno efekat ulja
nije usmeren na ćelijsku membranu, za razliku od rezultata koji su dobijeni u radu Yang
et al. (2018). U navedenom radu, takođe je bio prisutan postupni rast koncentracije
nukleinskih kiselina van ćelije (E. coli), ali za razliku od naših rezultata, kontrolni uzorci
nisu pokazali skoro nikakav porast, pa se može zaključiti da je efekat etarskog ulja K.
galanga usmeren na ćelijsku membranu. Izolati S. aureus su u našem radu pokazali
različite efekte ispitivanog etarskog ulja, pri čemu je na nekim sojevima uočljiva
propustljivost ćelijske membrane (sojevi 3 i 4), dok je kod drugih taj efekat izostao u
prvih 4 h eksperimenta, za razliku od rezultata koji su dobijeni u radu Yang et al. (2018)
gde takvih varijacija nije bilo, već se koncentracija nukleinskih kiselina postupno
povećavala van ćelije u toku vremena dok je porast nukleinskih kiselina u kontrolnim
uzorcima izostao.
Ispitivanje uticaja ulja semena biljne vrste Caesalpina bonducella na odabrane
sojeve bakterija (L. monocytogenes i E. coli) vršeno je merenjem količine izolovanih
nukleinskih kiselina od strane Shukla et al. (2016). Ulje semena C. bonducella pokazalo
je značajan potencijal za oslobađanje 260 nm materijala (DNK i RNK) iz ćelija testiranih
bakterija kada su izložene minimalnoj inhibitornoj koncentraciji. Tokom studije nije
primećen rast koncentracije nukleinskih kiselina van ćelije tokom vremena u kontrolnim
uzorcima. Merenja su vršena na 0, 30 i 60 minuta od početka tretmana. Poređenjem našeg
eksperimenta i eksperimenta vršenog od strane Shukla et al. (2016) konstatujemo da je u
našem radu došlo do povećanja koncentracije nukleinskih kiselina van ćelije i u
tretiranim i u kontrolnim uzorcima (E. coli), dok se u radu Shukla et al. (2016) javilo
povećanje koncentracije nukleinskih kiselina van ćelije u tretiranim uzorcima, dok tog
povećanja nije bilo u kontrolnim uzorcima.
49
Kristina Lj. Stanković Master rad
Zbog toga, zaključuje se da je uticaj semenog ulja C. bonducella usmeren na ćelijsku
membranu, dok etarsko ulje I. helenium verovatno nije.
Grafik 3. Prikaz spektrofotometrijskog merenja izlaska nukleinskih kiselina iz ćelija
respiratornih izolata tretiranih etarskim uljem omana(Staphylococcus aureus 1, Staphylococcus aureus 2, Staphylococcus aureus 3, Staphylococcus aureus
4, Moraxella catarrhalis i Escherichia coli)
50
Kristina Lj. Stanković Master rad
Dinamika rasta ćelija respiratornih izolata tretiranih etarskim uljem omana (Grafik
4) pokazala je različite vrste inhibitorne aktivnosti ovog ulja, pri čemu je uočen
mikrobicidni efekat kod vrsta M. catarrhalis i S. aureus 2. Ovo je i bilo očekivano, s
obzirom na činjenicu da je ulje ispoljilo inhibitorni i mikrobicidni efekat pri istoj
koncentraciji u oba slučaja. Ostali izolati S. aureus pokazivali su različit intenzitet
inhibicije, koja je počinjala nakon 12 h inkubacije i dovodila do razlike od 0,27 (izolat 1),
0,16 (izolat 3) i 0,21 (izolat 4) jedinica apsorbance. U odnosu na E. coli, redukcija je bila
znatno veća pri poređenju sa kontrolnim uzorkom. Pored navedenog, za razliku od vrsta
S. aureus, ovaj efekat je bio nešto brži jer se redukcija apsorbance mogla uočiti i pre
perioda inkubacije od 12 h. Poređenjem rezultata dinamike rasta sa rezultatima dobijenim
za oštećenje (povećanu propustljivost) ćelijske membrane, uočava se uklapanje i to u
smislu da su na krivama rasta vidljive sličnosti između kontrolnih i tretiranih uzoraka u
periodu do 12 h, nakon čega dolazi do dejstva ulja u smislu manje ili veće inhibicije rasta.
Jedini izuzeci su bili izolati kod kojih su inhibitorne i baktericidne koncentracije bile iste,
a kod kojih je dejstvo bilo trenutno. Na osnovu koncentracija DNK detektovanih u
ekstracelularnom prostoru ovih izolata, ne može se zaključiti da je ovo ulje značajno
oštetilo njihovu ćelijsku membranu.
Ginoiseau et al. (2010) su ispitivali uticaj etarskih ulja biljnih vrsta Inula
graveolens i Santolina corsica na odabrani soj Gram-pozitivne bakterije S. aureus tokom
24 h. Tretirani uzorci su sadržali etarska ulja (I. graveolensis ili S. corsica) u
koncentraciji koja je odgovarala njihovoj MIK, dok kontrolni uzorci nisu imali dodato
etarsko ulje. Merenja su vršena tokom 2 h, i to na 0, 10, 30, 60, 120 min od početka
tretmana. Rezultati su pokazali da su etarska ulja I. graveolens i S. corsica pri MIK imala
baktericidni efekat nakon 2 i 4 h. Etarsko ulje I. graveolens u MIK delovalo je veoma
brzo, gde je utvrđeno da je tokom prvih 10 min, broj jedinki je pao za 1 log10, a za 1 h je
postignut prag detekcije. Poređenjem našeg rada i istraživanja sprovedenog od strane
Ginoiseau et al. (2010), možemo zaključiti da se rezultati eksperimenata delimično slični,
ali samo u odnosu na određene sojeve iz ispitivanog spektra izolata. U našem radu,
etarsko ulje I. helenium je na soj S. aureus 2 delovalo skoro trenutno, pa su ovi rezultati
slični sa onim koji su dobijeni u radu Ginoiseau et al. (2010), gde se već prva inhibicija
51
Kristina Lj. Stanković Master rad
javila za 10 min. Interesantno je da ovo ne važi za ostale sojeve S. aureus 1, 3, 4, gde se
inhibicija javila mnogo kasnije (nešto malo pre 12 h od početka tretmana), što je
verovatno povezano sa većim stepenom rezistencije na antimikrobne agense koje su
pomenuti sojevi eksprimirali.
Ispitivanje uticaja ulja biljne vrste Salvia sclarea, prebrojavanjem broja kolonija
tokom vremena (0, 0,5, 1, 2, 4 i 8 h nakon početka tretmana), koje su sproveli Cui et al.
(2015) na odabrane sojeve bakterija (E. coli i S. aureus) pokazalo je visok efekat ovog
ulja. Posle 2 h tretmana, postignuta je redukcija broja jedinki E. coli i S. aureus od
99,99% ukupnog broja tretiranih ćelija. Zbog ovih rezultata, može se reći da ulje S.
sclarea može delovati kao dobar antimikrobni proizvod zbog svog kratkog
antimikrobnog vremena. U poređenju sa našim radom, ulje S. sclarea ima brži inhibitorni
efekat na soj E. coli (nakon 1 h je primećena inhibicija), dok je ulju I. helenium trebalo
više vremena za inhibiciju (nešto malo pre 12 h od početka tretmana). Deo eksperimenta
koji se odnosi na uticaj ulja S. sclarea na soj S. aureus se delimično potvrđuje sa našim
rezultatima (soj S. aureus 2), gde je uticaj oba ulja na bakteriju bio jako brz. Jedino sojevi
1, 3 i 4 u našem radu se ne uklapaju sa ovim rezultatima, jer je za prve efekte bilo
potrebno 12 h od početka tretmana.
52
Kristina Lj. Stanković Master rad
Grafik 4. Prikaz dinamike rasta ćelija respiratornih izolata tretiranih etarskim uljem omana
(Staphylococcus aureus 1, Staphylococcus aureus 2, Staphylococcus aureus 3, Staphylococcus aureus 4, Moraxella catarrhalis i Escherichia coli)
53
Kristina Lj. Stanković Master rad
5. Zaključak
1. Etarsko ulje dobijeno destilacijom biljnog materijala omana imalo je kao glavne
komponente alantolakton (65,75%) i izoalantolakton (25,53), koje su sačinjavale
91,4% ukupnog sastava ispitivanog etarskog ulja.
2. Ispitivano etarsko ulje omana imalo je aktivnost u opsegu koncentracija 0,07-10,0
mg/ml, pri čemu je efikasnost ispoljena u odnosu na sve testirane izolate.
Minimalne inhibitorne koncentracije su bile u opsegu koncentracija 0,07-2,50
mg/ml, dok je baktericidni efekat ispoljen pri koncentracijama od 0,31-10 mg/ml.
3. Metodom merenja izlaska nukleinskih kiselina iz ćelija, ni kod jednog soja nije
detektovano masivno oštećenje membrane koje bi izazvalo smrt ćelije u periodu
do 4 h nakon aplikacije ulja.
4. Praćenjem dinamike rasta ćelija respiratornih izolata tretiranih etarskim uljem
omana uočene su različite aktivnosti ovog ulja, od inhibicije koja je počinjala tek
nakon 12 h inkubacije do mikrobicidnog efekta (M. catarrhalis i S. aureus 2).
Različiti efekti ulja na sojeve iste vrste (S. aureus) mogu se povezati sa većim
stepenom rezistencije na antimikrobne agense koje su ovi sojevi eksprimirali.
5. U poređenju sa prethodnim istraživanjem etarskog ulja omana sakupljanog u
Srbiji, manja antimikrobna efikasnost uočena kod ovde ispitivanog ulja može se
povezati sa nedostatkom diplofilina u njegovom sastavu, koji je ranije
identifikovan kao glavni nosilac njegove antibakterijske aktivnosti.
54
Kristina Lj. Stanković Master rad
6. Literatura
Adams, R. P., 2007. Identification of essential oil components by gas
chromatography/mass spectrometry. Allured Publishing Corporation, Carol
Stream.
Albayrak S., Korkmaz Cinar A. E., Paksoy M. Y., Aksoy A., 2015. An investigation
on antioxidant and antimicrobial activities of four Inula helenium L. taxa. Iranian
Journal of Science & Technology, 39A4: 473-483, Turkey.
Barrero A. F., Oltra J. E., Alvarez M., Raslan D. S., Saude D. A., Akssira M., 2000.
New sources and antifungal activity of sesquiterpene lactones; Fitoterapia, 71:60-
64, Spain.
Basile A., Sorbo S., Giordano S., Ricciardi L., Ferrara S., Montesano D., Castaldo
Cobianci R., Vuotto M. L., Ferrara L., 2000. Antibacterial and allelopathic
activity of extract from Castanea sativa leaves, Fitoterapia 71, Suppl. 1:110-116.
Blečić V., 1970. Sistematika viših biljaka. Zavod za izdavanje udžbenika
socijalističke Republike Srbije, Beograd.
Bohlmann F., Mahanta P. K., Jakupovic J., Rastogi R. C., Natu A. A., 1978. New
sesquiterpene lactones from Inula species. Phytochemistry, Volume 17, Issue 7,
Pages 1165-1172.
Bourrel C., Vilarem G., Perineau F., 1993. Chemical analysis, bacteriostatic and
fungistatic properties of the essential oil of Elecampane (Inula helenium L.).
Journal of Essential Oil Research 5, 411‒417.
Cantrell C. L., Abate L, Fronczek F. R., Franzblau S. G., Quijano L, Fischer N. H.,
1999. Antimycobacterial eudesmanolides from Inula helenium and Rudbeckia
subtomentosa. Planta Medica 65:351–5.
Carson C. F., Mee B. J., Riley T. V., 2002. Mechanism of action of Melaleuca
alternifolia (tea tree) oil on Staphylococcus aureus determined by timen-kill,
lysis, leakage, and salt tolerance assays and electron microscopy. Antimicrobial
Agents and Chemotherapy, Vol. 46, 6:1914-1920.
55
Kristina Lj. Stanković Master rad
Chen C. N., Huang H. H., Wu C. L., Lin C. P. C., Hsu John T.A., Hsieh H. P.,
Chuang S. E., Lai G. M., 2007. Isocostunolide, a sesquiterpene lactone, induces
mitochondrial membrane depolarization and caspase-dependent apoptosis in
human melanoma cells. Cancer Letters 246: 237–252.
Chen D., McMichael J. C., Vandermeid K. R., Hahn D., Mininni T., Cowell J.,
Eldridge J., 1996. Evaluation of purified UspA from Moraxella catarrhalis as a
vaccine in a murine model after active immunization. Infection and Immunity,
Vol. 64, No. 6, p. 1900–1905.
Chun J., 2015. Alantolactone selectively suppresses STAT3 activaction and exhibits
potent anticancer activity in MDA-MB-231 cells.; Cancer Letters. 357: 393-403.
Croft K. D., 1999. Antioxidant effects of plant phenolic compounds. Department of
Medicine, University of Western Australia, Perth, Australia, 109-123.
Cui H., Zhang X., Zhou H., Zhao C., Lin L., 2015. Antimicrobial activity and
mechanisms of Salvia sclarea essential oil; Botanical Studies An International
Journal, 56:16.
Deriu, A., Zanetti, S., Sechi, L.A., Marongiu, B., Piras, A., Porcedda, S., Tuveri, E.,
2008. Antimicrobial activity of Inula helenium L. essential oil against Gram-
positive and Gram-negative bacteria and Candida spp. International Journal of
Antimicrobial Agents 31, 588‒590.
Diguță C., Cornea C. P., Ioniță L., Brînduşe, E., Farcaş, N., Bobit D., Matei F., 2014.
Studies on antimicrobial activity of Inula helenium L Romanian cultivar.
Romanian Biotechnological Letters. Vol. 19, No. 5
Ding Y., Wang H., Niu J., Luo M., Gou Y., Miao L., Zou Z., Cheng Y., 2016.
Induction of ROS overload by Alantolactone prompts oxidative DNA damage and
apoptosis in colorectal cancer cells. International Journal of Molecular Sciences,
17:558.
Van Den Dool H., Kratz P.D., 1963. A generalization of the retention index system
including linear temperature programmed gas–liquid partition chromatography.
Journal of Chromatography A, 11, 463–471.
56
Kristina Lj. Stanković Master rad
Dorn D. C., Alexenizer M., Hengstler J. G., Dorn A., 2006. Tumor Cell Specific
Toxicity of Inula helenium Extracts. Phytotherapy Research, 20, 970–980.
Ghedira K., Goetz P., Jeune R., 2011. Inula helenium L. (Asteraceae): aunée.
Phytothérapie. 9: 176-179.
Ginovyan M., Petrosyan M., Trchounian A., 2017. Antimicrobial activity of some
plant materials used in Armenian traditional medicine. BMC Complementary and
Alternative Medicine, 17:50.
Gökbulut A., Günal S., Arer E., 2013. Antioxidant and antimicrobial activities, and
phenolic compounds of Inula thapsoides ssp. thapsoides. Planta Medica 79: PJ19.
Grigore A., Neagu G., Dobre N., Ionita C., Ionita L., Bobit D., 2016.
Immunomodulatory potential of Inula helenium L. Analele Ştiinţifice ale
Universităţii „Al. I. Cuza” Iaşi s. II a. Biologie vegetală 62, 2: 29-33.
Guinoiseau E., Luciani A., Rossi P. G., Quilichini Y., Ternengo S., Bradesi P., Berti
L., 2010. Cellular effects induced by Inula graveolens and Santolina corsica
essential oils on Staphylococcus aureus; European Journal of Clinical
Microbiology & Infectious Diseases, 29:873–879.
Hoffmann D., 2003. Medical Herbalism: The Science and Practice of Herbal
Medicine. Healing Arts Press. Rochester, Vermont, 69-70.
Huo Y., Shi H. M., Wang M. Y., Li X. B., 2008. Chemical constituents and
pharmacological properties of Radix Inulae. Pharmazie 63: 699–703.
Jiang H. L., Chen J., Jin X. J., Yang J. L., Li Y., Yao X. J., Wu Q. X., 2011.
Sesquiterpenoids, alantolactone analogues, and seco-guaiene from the roots of
Inula helenium. Tetrahedron 67(47): 9193–8.
Josifović M., 1975. Flora SR Srbije, VII tom, Beograd.
Jovanović T., 2000. Praktikum iz mikrobiologije i imunologije. Savremena
administracija, Beograd.
Kähkönen M. P., Hopia A. I., Vuorela H. J., Rauha J. P., Pihlaja K., Kujala T. S.,
Heinonen M., 1999. Antioxidant activity of plant extract containing phenolic
compounds. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 47: 3954-3962.
57
Kristina Lj. Stanković Master rad
Karakašević B., 1967. Priručnik standardnih metoda za mikrobiološki rutinski rad (lll
prerađeno izdanje). Savezni zavod za zdravstvenu zaštitu, Beograd-Zagreb.
Karakašević B. 1987. Mikrobiologija i parazitologija - Medicinska knjiga, 677-683,
Beograd - Zagreb.
Keli S. O., Hertog M. G., Feskens E. J., Kromhout D., 1996. Dietary flavonoids,
antioxidant vitamins, and incidence of stroke: the Zutphen study. Archives of
Internal Medicine, 156:637-642.
Konishi T., Shimada Y., Nagao T., Okabe H., Konoshima T., 2002. Antiproliferative
sesquiterpene lactones from the roots of Inula helenium. Biological and
Pharmaceutical Bulletin 25(10): 1370–1372.
Kowalewski Z., Kedzia W., Koniar H., 1976. Action of helenin on microorganisms.
Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis, 24(1):121-5.
Kwon C. S., Kim J. H., Son K. H., Kim Y. K., Lee J. S., Lim J. K., Kim J. S., 2002.
Induction of quinone reductase, an anticarcinogenic marker enzyme, by medicinal
herb extracts. Nutraceuticals and Food 74: 358-366.
Lawrence N. J., McGown A. T., Nduka J., Hadfield J. A., Pritchard R. G., 2001.
Cytotoxic Michael – type amine adducts of α – methylene lactones alantolactones
and isoalantolactone. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 11: 429 – 431.
Lea P. J., Leegood R. C., 1999. Plant Biochemistry and Molecular Biology, 2end ed.,
John Wiley & Sons, Chichester.
Lei J. C., Yu J. Q., Yin Y., Liu Y. W., Zou G.L,. 2012. Alantolactone induces
activation of apoptosis in human hepatoma cells. Food and Chemical Toxicology,
50:3313–9.
Lim S. S., Kim J. R., Lim H. A., Jang C. H., Kim Y. K., Konishi T., Kim E. J., Park J.
H. Y., Kim j. S., 2007. Induction of Detoxifying Enzyme by Sesquiterpenes
Present in Inula helenium. Journal of medicinal food 10 (3): 503–510, Republic of
Korea.
Lim H. S., Jin S. E., Kim O. S., Shin H. K., Jeong S. J., 2015. Alantolactones from
Saussurea lappa exerts antiinflammatory effects by inhibitinh chemokine
58
Kristina Lj. Stanković Master rad
production and STAT1 phosphorylation in TNF-α and IFN-γ-innduced in HaCat
cells. Phytotherapy Research. 29 (7): 1088-1096.
Liu C., Mishra A. K., He B., Tan R., 2001. Antimicrobial activities of
isoalantolactone, a major sesquiterpene lactone of Inula racemosa; Chinese
Science Bulletin, Vol. 46 No. 6.
Miksusanti, Jenie B. S. L., Priosoeryanto B. P., Syarief R., Rekso G. T., 2008. Mode
of action Temu kunci (Kaempferia pandurata) essential oil on E. coli K1.1 cell
determined by leakage of material cell and salt tolerance assays; Hayati Journal of
Biosciences, p 56-60; Vol. 15, No. 2
Murray P. R., 1994. Medical Microbiology (second edition). United States of
America.
Nan M., Pintea A., Bunea A., Eşianu S., Tămaş M., 2012. HPLC Analysis od
carotenoids from Inula helenium L. flowers and leaves. Farmacia, Vol. 60, 4.
Romania.
O'Shea, S., 2009. In vitro activity of Inula helenium against clinical Staphylococcus
aureus strains including MRSA. British Journal od Medical Science. 66 (4): 186-
9.
Pal H. C., Sehar I., Bhushan S., Gupta B. D., Saxena A. K., 2010. Activation of
caspases and poly (ADP-ribose) polymerase cleavage to induce apoptosis in
leukemia HL-60 cells by Inula Racemosa. Toxicology in Vitro. 24:1599–609.
Petkova N., Vrancheva R., Mihaylova D., Ivanov I., Pavlov A., Denev P., 2015.
Antioxidant activity and fructan content in root extracts from elecampane (Inula
helenium L.). Journal of BioScience and Biotechnology 4(1): 101-107.
Rao K. S., Mishra S. H., 1997. Screening of anti – inflammatory and hepatoprotective
activities of alantolactone, istolated from the roots of Inula racemosa. Indian
Drugs 34(10):571-575.
Sabljak A., 2015. Najznačajnije biljke za proizvodnju eteričnih ulja u Republici
Hrvatskoj (Završni rad). Osijek.
59
Kristina Lj. Stanković Master rad
Seca, A., Grigore, A., Pinto, D., Silva, A. 2014. The genus Inula and their
metabolites: From ethnopharmacological to medicinal uses. Journal of
Ethnopharmacology 154: 286-310.
Shen T., Yang W. S., Yi Y. S., Sung G. H., Rhee M. H , Poo H., Kim M. Y., Kim K.
W., Kim J. H., Cho J.Y., 2013. AP-1/IRF-3 targeted anti-inflammatory activity of
Andrographolide isolated from Andrographis paniculata. Evidence-Based
Complementary and Alternative Medicine 2013:210736.
Shukla S., Majumder R., Ahirwal L., Mehta A., 2016. Proposed mechanism of
antibacterial mode of action of Caesalpinia bonducella seed oil against food-
borne pathogens; Bangladesh Journal of Pharmacology, 11: 257-263.
Simin N. 2014: Doktorska disertacija - Sekundarni biomolekuli u vrstama Allium
sect. codonoprasium rchb. – biološke aktivnosti, fitohemijski i hemotaksonomski
aspekti.
Sowndhararajan K., Cho H., Yu B., Song J., Kim S., 2016. Effect of inhalation of
essential oil from Inula helenium L. root on electroencephalographic (EEG)
activity of human. European Journal of Integrative Medicine, Volume 8, Issue 4,
Pages 453-457.
Spiridonov N. A., Konovalov D. A., Arkhipov V. V., 2005. Cytotoxicity of some
Russian ethnomedicinal plants and plant compounds; Phytotherapy Research 19,
428–432.
Stanković, M., Stanojević, Lj., 2014. Tehnologija lekovitog začinskog i aromatičnog
bilja. Tehnološki fakultet, Leskovac.
Stojakowska A., Kędzia B., Kisiel W., 2005. Antimicrobial activity of 10-
Isobutyryloxy-8,9-epoxythymol isobutyrate; Fitoterapia 76: 687–690, Poland.
Stojanović-Radić, Z., Čomić, Lj., Radulović, N., Blagojević, P., Denić, M.,
Miltojević, A., Rajković, J., Mihajilov-Krstev, T., 2012. Antistaphylococcal
activity of Inula helenium L. root essential oil: eudesmane sesquiterpene lactones
induce cell membrane damage. European Journal of Clinical Microbiology 31:
1015‒1025.
60
Kristina Lj. Stanković Master rad
Sutherland C. A. , Verastegui J. E., Nicolau D. P., 2016. In vitro potency of
amikacin and comparators against E. coli, K. pneumoniae and P. aeruginosa
respiratory and blood isolates. Annals of Clinical Microbiology and
Antimicrobials 15:39.
Tan R. X., Tang H. Q., Hut J., Shuai B., 1998. Lignans and sesquiterpene lactones
from Artemisia sieversiana and Inula racemosa. Phytochemistry Vol. 49, No. 1,
pp. 157-161, China.
Tosun F., Kizilay C. A., Sener B., Vural M., 2005. The Evaluation of plants from
Turkey for in vitro antimycobacterial activity. Pharmaceutical Biology Vol. 43,
No. 1, pp. 58–63, Turkey.
Vajs V., Jeremic D., Milosavljevic S., 1989. Sesquiterpene lactones from Inula
helenium. Phytochemistry 28: 1763–1764.
Videk V., 1960. Ljekovito bilje Jugoslavije. Poljoprivredni nakladni zavod, Zagreb.
Wahab S., Lal B., Jacob Z., Pandey V. C., Srivastava O. P., 1979. Studies on a strain
of Fusarium solani (Mart.) sacc. isolated from a case of mycotic keratitis.
Mycopathologia, Volume 68, Issue 1, Pages 31-38, India.
Wang X., Yu Z., Wang C., Cheng W., Tian X., Huo X., Wang Y., Sun C., Feng L.,
Xing J., Lan Y., Sun D., Hou Q., Zhang B., Ma X., Zhang B., 2017.
Alantolactone, a natural sesquiterpene lactone, has potent antitumor activity
against glioblastoma by targeting IKKβ kinase activity and interrupting NF–
kB/COX-2-mediated signaling cascades. Journal of Experimental & Clinical
Cancer Research 36:93.
Wichtl M., 2004. Herbal drugs and phytopharmaceuticals: a handbook for practice on
a scientific basis. Medpharm GmbH Scientific Publishers, Stuttgart.
Xu R., 2014. Pharmacokinetic comparison of isoalantolactone and alantolactone in
rars after administration separately by optimization of an UPLC-MS2 method.;
Journal of Chemistry. 2014: 8.
Yang C., Yang J., Sun M., Yan J., Meng X., Ma T., 2013. Alantolactone inhibits
growth of K562/adriamycin cells by downregulating Bcr/Abl and P-glycoprotein
61
Kristina Lj. Stanković Master rad
expression. International Union of Biochemistry and Molecular Biology Journals,
65:435–44.
Yang Y., Tian S., Wang F., Li Z., Liu L., Yang X., Bao Y., Wu Y., Huang Y., Sun L.,
Yu C., Li Y., 2018. Chemical composition and antibacterial activity of
Kaempferia galanga essential oil; International Journal of Agriculture & Biology,
Vol. 20, No. 2.
Zhao P., 2015. Alantolactone induces apoptosis and cell cycle arrest on lung
squamous cancer SK-MES-1 cells. Journal of Biochemical and Molecular
Toxicology. 29: 199-226.
Žugić A. R., Đorđević S. M., Tadić V. M., Arsić I. A., Mišić D. R., 2013
Antimikrobna aktivnost izolata korena omana, 54-58. Srbija.
62
Kristina Lj. Stanković Master radПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ
НИШ
КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА
Редни број, РБР:
Идентификациони број, ИБР:
Тип документације, ТД: Монографска документација
Тип записа, ТЗ: Текстуални / графички штампани материјал
Врста рада, ВР: Мастер рад Аутор, АУ: Кристина Љ. Станковић
Ментор, МН: Зорица Стојановић-Радић
Наслов рада, НР: Утицај етарског уља Inula helenium L. на раст одабраних сојева респираторних изолата
Језик публикације, ЈП: српски
Језик извода, ЈИ: енглески
Земља публиковања, ЗП: Р. Србија
Уже географско подручје, УГП: Р. Србија
Година, ГО: 2018.Издавач, ИЗ: ауторски репринт
Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.
Физички опис рада, ФО: поглавља (6), страна (63), слика (6), табела (5), графика (4), литературних навода (72)
Научна област, НО: Биологија
Научна дисциплина, НД: Микробилологија
Предметна одредница/Кључне речи, ПО: Антимикробна активност, етарско уље, Inula helenium L., респираторни изолати
УДК 547.913:982.998.12Чува се, ЧУ: Библиотека ПМФ-a, НишВажна напомена, ВН: HемаИзвод, ИЗ: Циљеви овог мастер рада су били испитивање хемијског састава етарског уља корена Inula helenium
L., као и одређивање антимикробне активности овог етарског уља у односу на одабране сојеве респираторних изолата хуманог порекла. Уједно је извршено и испитивање механизма дејства етарског уља омана методом детекције оштећења мембране и праћења динамике раста ћелијских култура третираних уљем. Дестилацијом биљног материјала омана, добијено је етарско уље чије су главне компоненте биле алантолактон (65,75%) и изоалантолактон (25,53%), а ове две компоненте су сачињавале 91,4% укупног састава испитаног етарског уља. Активност етарског уља омана се кретала у опсегу концентрација 0,07-10,0 mg/ml. Уље је било ефикасно на све тестиране изолате при чему су МИК варирале од 0,07-2,50 mg/ml, док се МБК кретале 0,15-10 mg/ml. Највећу осетљивост на уље је показао изолат S. aureus 3, док су највећу резистенцију показали два соја, и то S. aureus 1 и E. coli. На основу добијених резултата, спектрофотометријским мерењем изласка нуклеинских киселина из ћелија респираторних изолата третираних етарским уљем омана, може се закључити да ни код једног соја није детектовано масивно оштећење мембране које би изазвало смрт ћелије у периоду од 4 сата након апликације уља. Динамика раста ћелија респираторних изолата третираних етарским уљем омана је показала различите активности овог уља, при чему је код врста M. catarrhalis и S. aureus 2 уочен микробицидни ефекат, с обзиром да је уље испољило инхибиторну и микробицидну активност при истој концентрацији у оба случаја. Код осталих изолата S. aureus су се испољили различити интензитети инхибиције, која је почињала након 12 сати инкубације и довела је до разлике од 0,27 (изолат 1), 0,16 (изолат 3), 0,21 (изолат 4) јединица апсорбанце. E. coli је имала мању редукцију у односу на S. aureus, али је зато ефекат био нешто бржи, јер се редукција апсорбанце уочила пре периода инкубације од 12 сати.
Датум прихватања теме, ДП:Датум одбране, ДО:
Чланови комисије, КО: Председник:
Члан:
Члан, ментор:
63
Kristina Lj. Stanković Master radUNIVERSITY OF NIŠ - FACULTY OF SCIENCE
KEY WORDS DOCUMENTATION
Accession number, ANO:
Identification number, INO:
Document type, DT: Monograph
Type of record, TR: Textual / graphic printed material
Contents code, CC: University degree thesis
Author, AU: Kristina Lj. Stanković
Mentor, MN: Zorica Stojanović-Radić
Title, TI: The influence of Inula helenium L. essential oil on the growth of selected strains of respiratory isolates
Language of text, LT: Serbian
Language of abstract, LA: English
Country of publication, CP: Republic of Serbia
Locality of publication, LP: Serbia
Publication year, PY: 2018.
Publisher, PB: Author’s reprint
Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.
Physical description, PD: chapters (6), pages (63), puctures (6), tables (5), graphics (4), references (72)
Scientific field, SF: Biology
Scientific discipline, SD: Microbiology
Subject/Key words, S/KW: Antimicrobial activity, essential oil, Inula helenium L., respiratory isolates
UC 547.913:982.998.12
Holding data, HD: The Library of Faculty of Sciences, University of Niš
Note, N: NoAbstract, AB:
The objectives of this master study were to examine the chemical composition of the etheric oil of the root of Inula helenium L., and to determine the antimicrobial activity of this etheric oil in relation to selected strains of respiratory isolates of human origin. At the same time, the mechanism of the effect of etheric oil of the canopies was investigated by the method of detecting the damage of the membrane and monitoring the growth dynamics of oil-cell cultures. By distillation of the plant material of oman, etheric oil was obtained, the main components of which were alantolactone (65,75%) and isoalantolactone (25,53), and these two components comprised 91,4% of the total composition of the test etheric oil. The activity of the etheric oman oil was within the concentration range of 0,07-10,0 mg / ml. The oil was effective on all tested isolates, with MIC varied from 0,07 to 2,50 mg / ml, while MBC ranged 0,15-10 mg / ml. The highest sensitivity to oil was demonstrated by S. aureus 3 isolates, while the highest resistance was shown by two strains, S. aureus 1 and E. coli. Based on the obtained results, the spectrophotometric measurement of the release of nucleic acids from the cells of the respiratory isolates treated with etheric oman oil, it can be concluded that no massive damage to the membrane was detected in a single strain that would cause cell death in the 4 hours after application of the oil. The growth dynamics of the cells of respiratory isolates treated with ethane oman oil revealed various activities of this oil, with the microbicidal effect observed in the species M. catarrhalis and S. aureus 2, as the oil exhibited inhibitory and microbicidal activity at the same concentration in both cases. In the other S. aureus isolates, different intensities of inhibition began, which began after 12 hours of incubation and resulted in a difference of 0,27 (isolate 1), 0,16 (isolate 3) and 0,21 (isolate 4) units apsorbance. Escherichia coli had a lower reduction compared to S. aureus, but the effect was therefore somewhat faster, since the reduction in absorbance was observed before the incubation period of 12 h.
Accepted by the Scientific Board on, ASB:
Defended on, DE:
Defended Board, DB: President:
Member:
Member, Mentor: