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Diagnostic des mycoses profondesDiagnostic des mycoses profondes
Boualem SENDIDBoualem SENDIDBoualem SENDIDBoualem SENDID
ParasitologieParasitologie--Mycologie,Mycologie, Inserm U995Inserm U995--22
InstitutInstitut de Microbiologie, CHRU de Lillede Microbiologie, CHRU de Lille
Colloque National des Biologistes des HôpitauxColloque National des Biologistes des HôpitauxLille, 4Lille, 4--8 octobre 20108 octobre 2010
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Agents fongiques responsables d’infections invasives chez lepatient hospitalisé (USA)*
Type d’infection Proportion %
Candidose 59
Aspergillose 14
Cryptococcose 9
Histoplasmose 4Histoplasmose 4
Coccidioidomycose 3
Blastomycose 3
Fusariose 1
Scedosporiose 1
Zygomycose 1
Autres 5
*Fothergill AW, Focus on Fungal infections 18, 2008
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49%
10%
5%3% 2% 0%
1%
C. albicans
C. glabrata
C. parapsilosis
C. tropicalis
Distribution des espèces de levures isoléesd’hémoculture (AP-HP, 2002-2007, 1824)*
17%
13%
C. tropicalis
Cr. neoformans
C. krusei
C. kefyr
C. guilliermondii
Autres
Données de l’Observatoire des levures,CNRMA
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50%
60%
70%
80%
90%
100%
other species
C. krusei
C. parapsilosis
C. tropicalis
C. glabrata
C. albicans
Distribution des espèces Candida isolées d’hémocultureau CHRU Lille (430 isolats, 1993-2003)
0%
10%
20%
30%
40%
ICU
Surgery
Solidtum
ors
Gastroenterology
Onco-haem
atology
Pediatrics
Other w
ards
Sendid B et al. BMC Infect Dis. 2006
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Aspergillose invasive, pathologies sous-jacentes(Surveillance nationale 2005-2006, 331 cas)*
Hémopathies malignes 81%Pathologies resp. chron. 11%Cancer 5%Transplantation d’organes 3%
45% Hémopathies malignes
Réseau SAIF, CNRMA
0%
5%
10%
15%
20%
25%
30%
35%
40%
45%
LAM LAL Lymphomes LLC Autres
Hémopathies malignes
28%
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Aspergillose invasive et transplantation
Allogeneic – Unrelated 10.3%
Allogeneic – Related 6.7%
Lung Transplant 8.4%
Heart Transplant 6.2%
Autologous BMT 2.6%
Liver Transplant 1.7%
Pancreas Transplant 1.3%
Kidney Transplant 0.7%
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Infections fongiques invasives,un problème de santé publique persistant
Morbidité1
Durée de séjour à l’hôpital étendue : 3 -30 days.Surcoût par patient : 6.214- 92.266 $
Mortalité1,3
Associée à la candidémie : 10-40 %;Traitement retardé (>12 h): 23-46%.Traitement retardé (>12 h): 23-46%.Associée à l’aspergillose : 50-90%
Traitement antifongique2 : 10.5% des charges totalesExemple (2005)4: 2.8 M€ par an pour un hôpital de 3000 lits (France)
Origine : difficultés du diagnostic clinique et biologiqueEx. Hémoculture, sensibilité < 50%; LBA <30%Diagnostic précoce (pronostic favorable)?
1Pfaller M. CMR, 2007: 2Rentz AM. CID, 19983Morgan JM, Infect. Control. Hosp Epidemiol. 20054 Sendid B, BMC Infect Dis 2006
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Stratégies diagnostiques desinfections fongiques invasivesinfections fongiques invasives
(IFI)
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HISTOLOGIE
Diagnostic de certitude, mais biopsies rarement réalisées (gestesinvasifs)
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• Candidose profonde : diagnostic tardif, en particuliersuspicion de candidose hépato-splénique (images de micro-abcès), atteinte médullaire…
IMAGERIE
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Valeur majeure nonspécifique
retardé
Halo Condensation CroissantJ0 - J5 J5 - J10 J10 - J20
IMAGERIE : Aspergillose invasive
IMAGERIE
Aspergillose Invasive
Caillot D, 2001
Neutropénie PNN >> 500
spécifique
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C. albicans
C. glabrata.
C. krusei
C.tropicalis
Milieu chromogène identification présomptive :
Mycologie: méthodes conventionnelles
Levur
Galerie d’identification
Résultats disponibles en 24-72h
Tests d’agglutination :
res
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Milieux d’isolement :
Sabouraud + antibiotiquesGélose au sang
Milieu d’identificationmilieu CzapecExtrait de Malt
FILAM
Mycologie: méthodes conventionnelles
Incubation :25-30°CAtmosphère aérobieDurée 48h- plusieurs jours
MENTEUX
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Amplification et séquençage des régions ITS (gène 18RNAr)« Internal Transcribed Spacer »
18S ADNr 5,8 S 26S ADNr
ITS1 ITS2pITS1
Intérêts :Diagnostic de mycoses invasives (examen direct positif, culture négative)Diagnostic d’espèce pour les mycoses rares
Levures émergentes (ex. C. haemulonii, candidémies)Champignons filamenteux rares (Fusarium sp.)
pITS2
Taille: 400-600 pb
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Identification des champignons par MALDI-TOF
Spores de AspergillusSpectre
MatrixDHB
MALDI-TOF-MS
ME. Bougnoux/A. Alanio, ICAAC 2009
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MALDI-TOF MS: Une révolution en microbiologie cliniquePlus de 500 références dans PubMed..
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Aspergillus sp. Pics de référence des 28 espèces
FumigatiFumigati FlaviFlavi TerreiTerrei NigriNigri NidulantesNidulantes UstiUsti
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Aspergilli : Taxonomie
GenreSection
Complexe d’espèces
Fumigati
FlaviN. pseudofischeri
35 espèces
Hong et al., 2008
Aspergillus
Flavi
Nigri
Terrei
NidulantesA. lentulus
N. udagawae
A. viridinutans
A. fumigatiaffinis
A. fumigatus
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Identification des levures en routine hospitalière(700 souches, 17 espèces différentes, 50 souches de référence*
C dubliniensis
P cactophila
No
mb
red
eso
uch
es
Résultats d’identification par SM
Résultats d’identification par méthodes conventionnelles
Première identificationDeuxième identificationDiscordance
No
mb
red
eso
uch
es
99% de corrélation avec la galerie API32C
* Sendid B. 2010, J Mycol Med, sous presse
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Examen mycologique
• Sites normalement stériles (LCR, liquide pleural, liquide articulaire, bile…): valeur diagnostique très élevée, mais prélèvements peu réalisés
Stratégies diagnostiques des mycosesprofondes
Hémocultures : 50 % pour Candida ; inutilisables pour Aspergillus
• Sites "ouverts", susceptibles d’être colonisés ou contaminés (trachée,LBA) : interprétation difficile
- Importance de la densité fongique et la fréquence d’isolement (LBA,Urines…)
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La colonisation fongique
• La colonisation est un préalable à toute invasion- Facteur de risque majeur d’infection
• Colonisation de plusieurs sites périphériques:Facteur de risque indépendant de candidose invasive
Eggimann, 2004
Le % de patients colonisés augmente au cours deL’hospitalisation
Eggiman P. Lancet Infect Dis. 2003
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La colonisation fongique, en pratique…
650 patients suivis en USI; 29 patientscolonisés :11 ont développé des CI
Index de colonisation (IC, ICC)*:
mieux cibler les patients justifiantd’un traitement antifongique
*Pittet D, Annals of Surgery 1994Pittet D, Am J Med 1991
Seuil 0.5 atteint 5-6 jours avant l’infection
• Valeur prédictive, pas testée en prospectif,• Stratégie non validée en réanimation médicale• Difficultés de mise en œuvre ++
(Hamidfar R et al, SRLF 2004)
Se Sp VPP VPN
>ou= 2 sites colonisés100 22 44 100
Index de colonisation (>0,5)100 69 66 100
Index de colonisation corrigé100 100 100 100
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‘‘Candida Score’’ pour identifier les patients justifiantd’un traitement antifongique
A "Candida score » >2.5 accurately selectedpatients who would benefit from
early antifungal treatment.
Leon C. Crit Care Med 2006; 34: 730-737
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Justification des tests alternatifs à la culture
• Faible sensibilité des méthodes conventionnelles (hémoculture: 50%,LBA < 30%)
• Patients à haut risque d’IFI, souvent traités de manière empirique, faiblerendement des cultures, nécessité de documenter l’épisode infectieux*
• Amélioration de la précocité du diagnostic biologique
• Suivi l’efficacité thérapeutique
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Probabiliste
Prophylactique
72%
Répartition de la consommation antifongique enhématologie adulte et pédiatrique en 2005
Documenté
24,7%
3,3%
Thèse, Bérénice Bro , 2007
Total : 1 731 300 €
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Tests sérologiques : détection du mannane et desanticorps anti-mannane
PlateliaPlatelia®® CandidaCandidaantigèneantigène
100100°°CC
PlateliaPlatelia®® CandidaCandidaanticorpsanticorps
Sendid et al. J Clin Microbiol 1999Yera et al. EJCMID 2001Sendid et al. J Med Microbiol 2002Sendid et al. J Clin Microbiol 2004
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Nouvelle génération de Tests PlateliaTM Candida
Nom* Platelia™Candida Ag PlusInterprétation des résultats C<62.5pg/ml : Négative pour la présence d’antigène mannane
62.5pg/ml=<C<125pg/ml : Intermédiaire pour la présence d’antigène mannaneC>=125pg/ml : Positif pour la présence d’antigène mannane
Nom** Platelia™Candida Ab PlusInterprétation des résultats C<5AU/ml : Négatif pour la présence d’anticorps anti-mannane
5=<C<10AU/ml : Intermédiaire pour la présence d’anticorps anti-mannaneC>=10AU/ml : Positif pour la présence d’anticorps anti-mannane
* Test plus sensible; ** Faible dilution de sérum (1:400)
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En pratique : Détection conjointe Mnn/Ac Mnn
60
80
100
Sen
sib
ilit
é(%
)
Exemple : Valeurs cinétiques des tests Platelia Ag et Acau cours d’une candidose systémique chez un patientde réanimation
60
80
100
6
8
10
Tit
res
d’a
nti
co
rps
an
ti-m
an
nan
e(A
.U)
Ma
nn
an
ém
ie(n
g/m
l)
Ac
0
20
40
n samples/patient(n patients/category)
Sen
sib
ilit
é(%
)
1(19)
2(17)
3(13)
4(9)
5(5)
6(3)
Herent et al. JCM 1992
Jours
-20 -10 0 10 20 30
0
20
40
60
0
2
4
6
Isolement de Candidad’une hémoculture (J0)
Tit
res
d’a
nti
co
rps
an
ti
Ma
nn
an
ém
ie(n
g/m
l)
Un prélèvement dès l’admission et un suivibi-hebdomadaire pour les patients à haut risque
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Early diagnosis of invasive candidiasis with mannanantigenemia and antimannan antibodies
Prella M, Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2004
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Contribution des tests Platelia® au diagnostic descandidoses systémiques
EN RÉSUMÉ…
• Diagnostic de 80 % des candidoses déterminées par lesespèces les plus pathogènes du genre, C. albicans, C.glabrata et C. tropicalis
• Sensibilité plus faible (40-50%) pour les autres espèces
• Précocité : 4 jours en moyenne avant positivité del’hémoculture
•Tests automatisés, adaptés à la surveillance d’un grandnombre de patients à risque.
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PATAGPATAG
GOLDGOLD
Galactomannane
Présent sur de nombreuses
2M1 2M1 2M1 6M1a a a
Galf
Galf
1
5b
6
n>4
PLATELIA ASPERGILLUS
GOLDTEMGOLDTEM
GOLDSEMGOLDSEM
Présent sur de nombreusesGlycoprotéines avecMMr > 40 kDa
JP Latgé, IP Paris.
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Détection du galactomannane sérique (ELISA)Patients avec cancers
Etude prospective de 797 patients3294 échantillons sériques
153 épisodes d’AI; 31 confirmés, 67 probables, 55 possibles
Sp 94.8 98.2 98,2 adultes 47.6 (enfants)
Se 29.4 65 confirmés16 probables26 possibles
VPP 58 92% chez non-allogréffé43% chez allogreffé
VPN 85
Herbrecht, R, J Clin Oncol, 2002Valeur diagnostique, 2 sérums consécutifs + > un résultat isolé
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Dépistage de patients à haut risqued’aspergillose invasive (AI)
La détection d’antigène GM est plus sensible et plus spécifique que la TDM etla culture
La positivité de l’antigène GM précède les signes radiologiques (TDM) et laculture d’une semaine (moyenne)culture d’une semaine (moyenne)
L’antigène GM était positif 6 à 10 jours avant l’apparition des symptomescliniques
L’antiggène GM était plus sensible (comparé à la RT-PCR aux b-glucanes)pour la prédiction d’un diagnostic positif d’AI chez le patient d’onco-hématologie.
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Faux positifs
• Réactivité croisée avec d’autres champignons (Cryptococcus,Histoplasma) ou bactéries (bifidobacterium)
• Apport exogène de galactomannane, alimentaire, antibiotiques(Pipéraciline/Tazobactam, interférence variable selon les lots)(Pipéraciline/Tazobactam, interférence variable selon les lots)
• Solutés de nutrition parentérale (Ribaud, ICAAC 2007)
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Détection d’anticorps anti-Aspergillus par ELISA
ELISA indirect 2h30
Utilisation d’un antigène recombinant
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Détection d’anticorps anti-Aspergillus par ELISA
Groupes :1A : chronic pulmonary aspergillosis1b : ABPA
2 : Mutiple colonization (culture ++)
Thorez S, Sendid B, Hennequin C, ICAAC 2010
2 : Mutiple colonization (culture ++)3: 1 seul prélèvement BP +4: Culture - et IPD négative5: Témoins sains
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Limulus assay
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Fungitell ® assay: Associates of Cape Cod, Agrément FDA 2004
Le fungitell est préparé à partir d’un lysat d’amebocytes (GR du crap)traités (dépourvus de facteur C, activable par le LPS).
Test enzymatique (durée 40 min)
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- Miyazaki T et al. J Clin Microbiol 1995
Spécificité large:
Candida,
1,3-glucanes, un marqueur panfongique
- Miyazaki T et al. J Clin Microbiol 1995- Obayashi T et al. J Med Vet Mycol 1992- Obayashi T et al. Lancet 1995
- Mitsutake KT et al. J Clin Microbiol 1996
- Pazos C et al. J Clin Microbiol 2005
Candida,Aspergillus,Pneumocystis,Fusarium,Scedosporium
Exception:Cryptococcus (très faible quantité)Zygomycoses
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170 Healthy subjects
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B-D-Glucanes et infections déterminées par Candida sp.
+Valeurs de référence :
80
120
-
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Détection d’ADN fongique par PCR
Beaucoup de questions : certaines sont résolues d’autres pas…
• Echantillon biologique : Sang total, Plasma, Sérum ?
• Cible amplification ? ADNr, autres ?• Cible amplification ? ADNr, autres ?
• Type de PCR, conventionnelle, temps réel
• Extraction: Manuelle, automatique
• Volume d’échantillon: 5 ml, 1ml, 200 L…?
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SeptiFast permet l’identification de
25 agents pathogènes couvrants 90% des infections, en moins de 6 heures.
MRSA (mecA)
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Sang total EDTA(3 ml)
SeptiFastTechnique RT-PCR sur LightCycler 2.0 CE/IVDdirectement sur sang prélevé sur EDTA
Prélèvement Lyse Extraction SeptiFast Rendu
approx. 5 heures
MagNA LyserInstrument LightCycler 2.0
Instrument
Coût : 150 € /analyse
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Etude prospective interventionnelle temps-réel SeptiFast enréanimation médicale, CHRU de Lille (Evaluation en cours en hématologie)
SF pos SF neg
HCpos
5SF=S. aureus/HC=C. glabrataSF=S.marcescens/HC =S. marcescens SF
= C. tropicalis/HC= C. albicans
SF= S.aureus/HC = S.aureus
2Inhib*/ HC = E. coli
SF Neg/ HC = Leuconostoc
(pas dans le panel SeptiFast)
* Leucocytose > 30.000/mm3
SF= S.aureus/HC = S.aureusSF=S.marcescens/HC =S. marcescens
HCneg
72 E. coli/ HC neg
2 S. aureus / HC neg
2 Klebsiella/HC neg1 P. aeruginosa
74 dont 2 SF = INH*
Wallet F, Clin Microbiol Infecttion, soumis
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Patientsà risque
Admissions
RéanimationChirurgieLeucémiesTumeurs solidesTransplantationGreffésPrématurésBrûlés….
Facteurs de risque associésChimiothérapie (mucite)AntibiotiquesCorticothérapieCathéter veineux central
QUELS PATIENTS ?
Cathéter veineux centralScore de gravité élevéColonisation fongique
Mycose profonde
Syndrome infectieux résistantaux antibiotiques
SurveillanceMycologiqueSérologique
A quel moment ?Aide à la décision thérapeutique
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Patientsà risque
Admissions
LeucémiesTumeurs solidesTransplantationGreffésPrématurésBrûlés….
Facteurs de risque associésChimiothérapie (mucite)NeutropénieAntibiotiquesCorticothérapieCathéter veineux centralScore de gravité élevéColonisation fongique
Mycose profonde
Stratégie diagnostique des mycoses profondes en hématologie
A l’admission : Début de chimiothérapie :
Décisionthérapeutique
T. empirique
Bilan mycologiqueBouche, nez, urines, selle, crachatsAspiration bronchiqueBilan sérologique- Mnn; GM; BDG (VPN:- Anticorps Candida, Aspergillus
Surveillance bi- hebdomadaireGM, BDG, Mnn
Recherche active des foyers infectieux si :*2x GM+ avec ou sans BDG (Aspergillose)**2x Mnn+ avec ou seul BDG (candidose)***2x BDG (autres mycoses)
*Foyers aspergillairesImagerie (TDM, Echographie)Aspirations bronchiques (X)LBA, Biopsies, LCRPCR sérum ++
**Foyers candidosiquesHémoculturesImagerie (Echographie)Lésions cutanéesBiopsies
***Autres mycoses profondesImagerie (TDM, IRM)Biopsies
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Stratégie de prise en charge diagnostique de l’aspergillose invasive
Clin Infect Dis 2005;41:1242-50
![Page 51: DDiiagnagnoosticstic ddeses mymycosescoses … · DDiiagnagnoosticstic ddeses mymycosescoses pprofonrofonddeses BBoouuaalleemm SENSENDDIIDD PPararasasiitoltologiogie-e-Mycologie,](https://reader036.vdocuments.us/reader036/viewer/2022071505/6125a215e159277c0c277a5a/html5/thumbnails/51.jpg)
Evaluation des facteurs de
Stratégie diagnostique des candidoses profondes en réanimation
Admission
Bilan mycologique « de référence »Bouche, nez, urines, selle, crachatsAspiration bronchiqueBilan sérologique « de référence »BDG, Mnn/Ac Mnn
Recherche de foyers infectieux:- Hémocultures- Imagerie (Echographie)- Biopsies
Décision thérapeutique
DialogueBio-clinique
- +Surveillance
+-
Evaluation des facteurs derisque associés
AntibiotiquesCathéter veineux centralScore de gravité élevéChirurgie
Bilan mycologiqueBouche, nez, urines, selle, crachatsAspiration bronchique
Surveillance 2x /semaine
Bilan sérologiqueBDG, Mnn, Ac
+
- Surveillance
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Diagnostic mycologique conventionnel est :
- Perfectible (répéter les prélèvements)- Indispensable
identification du genre, d’espèceTests de sensibilité aux antifongiques
- Biomarqueurs alternatifs à la culture:
Conclusions
- Biomarqueurs alternatifs à la culture:
- Outils de screening, identification des patients justifiantd’une recherche active du foyer infectieux (Hémocultures, TDM)- Contributifs si réalisés de manière régulière (2X/semaine)