Dark producción of reactive oxygen species in photosystem II membrane

particles at elevated temperature: EPR spin-trapping study

Pavel Pospíšil, Iva Šnyrychová, Jan Nauš

Profesor Eduardo UribeProfesor Eduardo Uribe

Alumno: Eduardo DíazAlumno: Eduardo Díaz

6/04/20106/04/2010

INTRODUCCIONINTRODUCCION

El oxigeno molecular es esencial para la mayoría de los El oxigeno molecular es esencial para la mayoría de los seres vivos, sirve de precursor para ROS.seres vivos, sirve de precursor para ROS.

A bajas concentraciones Ros juega un rol importante en A bajas concentraciones Ros juega un rol importante en los procesos de la célula pero cuando es producido en los procesos de la célula pero cuando es producido en exceso daña macromoléculas como proteínas, lípidos y exceso daña macromoléculas como proteínas, lípidos y ácidos nucleótidos.ácidos nucleótidos.

Ros se forma en la membrana tilacoidal cuando la Ros se forma en la membrana tilacoidal cuando la absorción de luz por los cloroplastos excede la absorción de luz por los cloroplastos excede la capacidad de utilizar la energía por el aparato capacidad de utilizar la energía por el aparato fotosintético, pero por otro lado se puede producir Ros fotosintético, pero por otro lado se puede producir Ros mediante condiciones especiales en la oscuridadmediante condiciones especiales en la oscuridad

En este trabajo e utilizo la técnica En este trabajo e utilizo la técnica EPR spin-trapping para estudiar la producción por primera vez del Ion (OH-) en la oscuridad en la membrana del PSII en una condición de stress a 47º C

MATERIALES Y METODOSMATERIALES Y METODOS

Fragmentos de la membrana de PSII de espinaca fueron Fragmentos de la membrana de PSII de espinaca fueron purificados por el método de purificación Triton x-100.purificados por el método de purificación Triton x-100.

Estos fragmentos fueron suspendidos en un medio que Estos fragmentos fueron suspendidos en un medio que contenía 400 mM de sucrosa, 15 mM de NaCl, 5 MgCl2 contenía 400 mM de sucrosa, 15 mM de NaCl, 5 MgCl2 y 40 mM de Mes (PH 6,5) y mantenidos a -80º Cy 40 mM de Mes (PH 6,5) y mantenidos a -80º C

EPR SPIN-TRAPPING EPR SPIN-TRAPPING ESPECTROSCOSPIOESPECTROSCOSPIO

EMPO fue utilizado para la detección de (OH-) EMPO fue utilizado para la detección de (OH-)

Los fragmentos de membrana fueron incubados en tubos Los fragmentos de membrana fueron incubados en tubos de Eppendorf a una temperatura de 47º C en presencia de Eppendorf a una temperatura de 47º C en presencia de 75 mM de EMPO en total oscuridad por un periodo de 75 mM de EMPO en total oscuridad por un periodo indicado en la figura posterior a esto las muestras indicado en la figura posterior a esto las muestras fueron transferidas a tubos de vidrio capilar el espectro fueron transferidas a tubos de vidrio capilar el espectro EPR fue obtenido al derivar la señal EPR de absorciónEPR fue obtenido al derivar la señal EPR de absorción

77K EPR Espectroscopio77K EPR Espectroscopio

Los fragmentos de la membrana en 40 mM de Mes (PH Los fragmentos de la membrana en 40 mM de Mes (PH 6,5) fueron calentadas en tubos de Eppendorf a 47º C 6,5) fueron calentadas en tubos de Eppendorf a 47º C posterior a esto la muestras fueron traspasadas a EPR posterior a esto la muestras fueron traspasadas a EPR tubos y fueron medidos los datostubos y fueron medidos los datos

RESULTADOSRESULTADOS

PRODUCCION DE ROS EN LA PRODUCCION DE ROS EN LA OSCURIDAD A ALTA TEMPERATURAOSCURIDAD A ALTA TEMPERATURA

EMPO reacciona con (OH_) y (O2) formando EMPO-EMPO reacciona con (OH_) y (O2) formando EMPO-OH y EMPO-OOH el espectro EPR se muestra en la OH y EMPO-OOH el espectro EPR se muestra en la figura Afigura A

El espectro EPR se obtiene usando Fenton sistema en El espectro EPR se obtiene usando Fenton sistema en Xanthine/Xanthine oxidase sistema no se detecta Xanthine/Xanthine oxidase sistema no se detecta superoxido ya que es se vuelve inestable a altas superoxido ya que es se vuelve inestable a altas temperaturastemperaturas

EFECTO DE O2 Y OH- EN EMPO-OHEFECTO DE O2 Y OH- EN EMPO-OH

Se conoce que DMP-OH puede ser formado no solo por Se conoce que DMP-OH puede ser formado no solo por el OH, para excluir que el DMP-OH pueda ser el OH, para excluir que el DMP-OH pueda ser formado por la descomposición de DMP-OOH formado por la descomposición de DMP-OOH

Encontramos que el PS2 a altas temperaturas y además en Encontramos que el PS2 a altas temperaturas y además en presencia de Mannitol prevé completamente la presencia de Mannitol prevé completamente la producción de DMP-OH por DMP-OOH producción de DMP-OH por DMP-OOH

Para encontrar DMP-OH que es formado por O2 a través Para encontrar DMP-OH que es formado por O2 a través de NaN3 o D2Ode NaN3 o D2O

EFECTO DE LA CATALAZA, PEROXIDO Y EFECTO DE LA CATALAZA, PEROXIDO Y QUELATOS EN LA PRODUCCION DE (OH-)QUELATOS EN LA PRODUCCION DE (OH-)

El mecanismo mas común para producir (OH-) se debe a El mecanismo mas común para producir (OH-) se debe a la reducción de H2O2 por una reacción fenoticala reducción de H2O2 por una reacción fenotica

El efecto de la catalaza y quelantes metálicos fue medida a El efecto de la catalaza y quelantes metálicos fue medida a altas temperaturasaltas temperaturas

Esta demostrado que la catalaza es termoestable incluso Esta demostrado que la catalaza es termoestable incluso sobre los 50º C sin embargo la actividad enzimatica se sobre los 50º C sin embargo la actividad enzimatica se reduce en presencia de altas temperaturasreduce en presencia de altas temperaturas

Pero la adición de H2O2 incrementa la producción de Pero la adición de H2O2 incrementa la producción de (OH-)(OH-)

La presencia de EDTA disminuye la producción de (OH-) La presencia de EDTA disminuye la producción de (OH-) al remover el hierro se suprime la señal de EMPO-OHal remover el hierro se suprime la señal de EMPO-OH

Según esto nosotros afirmamos que la producción de Según esto nosotros afirmamos que la producción de (OH-) se debe a una reducción metal-catalizada del (OH-) se debe a una reducción metal-catalizada del H2O2H2O2

EFECTO DE ALTO PH, CLORURO Y EFECTO DE ALTO PH, CLORURO Y CALCIO EN LA PRODUCCION DE (OH-)CALCIO EN LA PRODUCCION DE (OH-)

Un alto valor en el PH estimula la producción de H2O2 Un alto valor en el PH estimula la producción de H2O2 por la luz en el lado donador del PSII por la luz en el lado donador del PSII

A un alto pH un cofactor inorgánico llamado cloruro es A un alto pH un cofactor inorgánico llamado cloruro es reemplazado por hidróxido y este Ion puede ser reemplazado por hidróxido y este Ion puede ser oxidado hasta H2O2oxidado hasta H2O2

Recientemente se demostró que una membrana con Recientemente se demostró que una membrana con mucho cloruro presenta mucho (OH-) producido por la mucho cloruro presenta mucho (OH-) producido por la luz. Para revelar como el calor induce la producción de luz. Para revelar como el calor induce la producción de (OH-) en la oscuridad(OH-) en la oscuridad

Incrementar el ph induce formación de (OH-)Incrementar el ph induce formación de (OH-)

Se localiza la dependencia de EMPO-OH según el ph en Se localiza la dependencia de EMPO-OH según el ph en un grafico de protón con pka 7,3un grafico de protón con pka 7,3

El exceso de calcio o cloruro suprime la señal de EMPO-El exceso de calcio o cloruro suprime la señal de EMPO-OHOH

Esto indica que la producción de (OH-) se realiza en el Esto indica que la producción de (OH-) se realiza en el lado donador del PSIIlado donador del PSII

PRODUCCION DE O2 LIGADA A LA PRODUCCION DE O2 LIGADA A LA FORMACION DE OH-FORMACION DE OH-

La lipido-peroxidacion podría ser inducida por varios La lipido-peroxidacion podría ser inducida por varios factores y ROS actúa como el iniciador del sistemafactores y ROS actúa como el iniciador del sistema

Para afirmar el rol de (OH-) en la producción de O2 a una Para afirmar el rol de (OH-) en la producción de O2 a una elevada temperatura. La formación de TEMPO por elevada temperatura. La formación de TEMPO por catalaza y quelantes metálicos, cuando la catalaza o el catalaza y quelantes metálicos, cuando la catalaza o el desferal añadido antes de incrementar la temperatura no desferal añadido antes de incrementar la temperatura no tiene efecto alguno pero después se suprime la tiene efecto alguno pero después se suprime la producción de (OH-).producción de (OH-).

La producción de O2 no es afectada cuando se La producción de O2 no es afectada cuando se incrementa la temperatura en presencia de Mannitolincrementa la temperatura en presencia de Mannitol

Esto indica que la producción de (OH-) a altas Esto indica que la producción de (OH-) a altas temperatura es indeseablemente ligada a la producción temperatura es indeseablemente ligada a la producción de O2 de O2

DiscusiónDiscusión

PRODUCCION DE (OH-) A ELEVADA PRODUCCION DE (OH-) A ELEVADA TEMPERATURATEMPERATURA

En este trabajo se utilizo EPR spin traping espectroscopioEn este trabajo se utilizo EPR spin traping espectroscopio

El test EMPO resulto se sensible tanto como para (OH-) El test EMPO resulto se sensible tanto como para (OH-) como para (O2) pero para tener mediciones mas como para (O2) pero para tener mediciones mas fidedignas se comparo con DMPOfidedignas se comparo con DMPO

(OH-) ES FORMADO POR LA (OH-) ES FORMADO POR LA DESCOMPISICION DE H2O2 EN PSIIDESCOMPISICION DE H2O2 EN PSII

La catalaza y el desferal suprimen la producción de (OH-) La catalaza y el desferal suprimen la producción de (OH-) y se concluye que es formada por la reducción de y se concluye que es formada por la reducción de H2O2.H2O2.

Bajo el tratamiento de calor el (OH-) se forma a partir de Bajo el tratamiento de calor el (OH-) se forma a partir de la oxidación parcial del agua en el PSII pero es afectada la oxidación parcial del agua en el PSII pero es afectada por ciertas proteínas que al subir su temperatura y se por ciertas proteínas que al subir su temperatura y se reduce a un 70% durante 1 minuto a 47º C pero no reduce a un 70% durante 1 minuto a 47º C pero no afecta la producción de O2 eso demuestra que la afecta la producción de O2 eso demuestra que la producción de (OH-) es independiente de la producción de (OH-) es independiente de la producción de (O2) bajo las condiciones dadasproducción de (O2) bajo las condiciones dadas