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Dako ER/PR pharmDx™ Kit (Link) English Code SK310 50 tests for use with Automated Link Platforms Edition 12/18 Intended use For In Vitro Diagnostic Use. The Dako ER/PR pharmDx™ Kit is a semi-quantitative immunohistochemical (IHC) assay to identify estrogen receptor (ER) and progesterone receptor (PR) expression in normal and neoplastic tissues that are formalin-fixed and paraffin-embedded for histological evaluation. ER/PR pharmDx specifically detects the ER alpha protein as well as the PR protein located in the cell nuclei of ER and PR expressing cells, respectively. ER/PR pharmDx is indicated as an aid in identifying patients eligible for treatment with anti-hormonal or aromatase inhibitor therapies, as well as an aid in the prognosis and management of breast cancer. For ER/PR pharmDx Kit (Link), Code SK310, reagent volumes have been adjusted especially for use with the Dako Automated Link Platforms. Summary and explanation Historical studies have shown that ER/PR status is correlated with untreated outcome (i.e. prognostic for well differentiated invasive breast cancer) and especially correlated with response to anti-hormonal therapy e.g. tamoxifen. Estrogens have been found to be preferentially concentrated in the estrogen target organs of animals and in human breast cancers and it is well documented that the mitogenic effects of estrogen are mediated by ER.1 Investigations into the biological mechanisms for breast cancer growth have found that the growth rate is dependent on the presence of estrogen or progesterone or both in most breast cancers. Thus, estrogen receptor and progesterone receptor status in mammary carcinomas is considered to be validated prognostic and predictive factors for patient management for anti-hormonal therapy.1-5 The Dako ER/PR pharmDx assay was developed to provide a standardized test system that utilizes a clinically validated scoring system for the determination of ER/PR status applicable in the management of breast cancer patients.5-9 Principle of procedure The ER/PR pharmDx Kit contains reagents required to complete a two-step IHC staining procedure for formalin-fixed, paraffin-embedded specimens. Following incubation with the primary monoclonal antibody to human ER or PR proteins or the Negative Control Reagent, the validated protocol employs a ready-to-use visualization reagent based on dextran technology. This reagent consists of both secondary goat anti-mouse immunoglobulin molecules and horseradish peroxidase molecules linked to a common dextran polymer backbone, thus eliminating the need for sequential application of link antibody and peroxidase-conjugated antibody. The enzymatic conversion of the subsequently added chromogen results in formation of a visible reaction product at the antigen site. The specimen may then be counterstained and coverslipped. Results are interpreted using a light microscope. Control slides containing formalin-fixed, paraffin-embedded human cell lines are provided for quality control of the kit reagent performance. ER/PR pharmDx Kit (Link), Code SK310, is applicable for automated staining using Dako Automated Link Platforms. Materials provided ER/PR pharmDx™ Kit (Link) (Code SK310) The materials listed below are sufficient for processing 50 tests (50 slides incubated with Primary Antibody to ER Protein, 50 slides incubated with Primary Antibody to PR Protein, and 50 slides incubated with the corresponding Negative Control Reagent) and 20 ER/PR pharmDx Control Slides. The number of tests is based on the use of 200 µL of each reagent per slide except Epitope Retrieval Solution and Wash Buffer. The kit provides materials sufficient for a maximum of 10 individual staining runs. Quantity

Description

1 x 1 L ER/PR pharmDx™ Epitope Retrieval Solution (10x)

Citrate buffer with an antimicrobial agent.

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Quantity

Description

1 x 35 mL

ER/PR pharmDx™ Peroxidase-Blocking Reagent

Solution containing 0.5% hydrogen peroxide, detergents, enzyme inhibitors, and preservative, pH 2.

1 x 12 mL ER/PR pharmDx™ ER Antibody Cocktail

Monoclonal mouse anti-human antibodies to human ER, Clones 1D5 and ER-2-123 (IgG1 and IgG2a), in tissue culture supernatant in a Tris-HCl buffer, containing stabilizing protein and 0.015 mol/L sodium azide.

1 x 12 mL ER/PR pharmDx™ PR Antibody

Monoclonal mouse anti-human antibody to PR, Clone PgR 1294 (IgG1), in tissue culture supernatant in a Tris-HCl buffer, containing stabilizing protein and 0.015 mol/L sodium azide.

1 x 12 mL ER/PR pharmDx™ Negative Control Reagent

Monoclonal mouse IgG1 and mouse IgG2a antibodies in tissue culture supernatant in a Tris-HCl buffer, containing stabilizing protein and 0.015 mol/L sodium azide.

1 x 35 mL ER/PR pharmDx™ Visualization Reagent

Dextran polymer conjugated with horseradish peroxidase and affinity-isolated goat anti-mouse immunoglobulins. Supplied in Tris/HCl buffer containing stabilizing protein and an antimicrobial agent.

2 x 50 mL ER/PR pharmDx™ DAB+ Substrate Buffer

Substrate buffer solution, pH 7.5, containing < 0.1% hydrogen peroxide, stabilizers, enhancers, and an antimicrobial agent.

1 x 2 mL ER/PR pharmDx™ DAB+ Chromogen

5% 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride chromogen solution.

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Quantity

Description

10 x Bottles User-Fillable Reagent Bottle, 12 mL capacity

The bottles should be used for mixing and containing DAB+ Substrate-Chromogen Solution (see also Reagent Preparation section).

2 x 1 L Wash Buffer (10x)

Tris/HCl buffer with a detergent and an antimicrobial agent.

4 x 5 Slides ER/PR pharmDx™ Control Slides

Each slide contains sections of two pelleted, formalin-fixed, paraffin-embedded cell lines, which represent a moderate level of ER or PR protein expression (dependent on primary antibody applied to slide) and a negative cell line. Cell line A: CAMA-1, positive for ER and PR protein. Cell line B: HT-29, negative for ER and PR protein.

NOTE: All reagents are formulated specifically for use with this test. For the test to perform as specified, no substitutions should be made. Materials required, but not supplied Counterstain: Hematoxylin, alcohol or water-based, such as Hematoxylin for Automated Link Platforms (Code SK308) Coverslips Distilled or deionized water (reagent-quality water) Drying oven, capable of maintaining 56–60 °C Ethanol, absolute and 95% Light microscope (4x–40x objective magnification) Mounting medium, such as Dako Faramount (Code S3025) or Dako Glycergel (Code C0563) Positive and Negative Tissues to use as process controls (see Quality Control Section) Pressure cooker, properly calibrated, capable of maintaining 125 °C or 121 °C Slides, SuperFrost Plus, charged slides or Dako Silanized Slides (Code S3003) (see Specimen Preparation section) Staining jars or baths Timer Xylene, toluene, or xylene substitutes ER/PR pharmDx Kit (Link), Code SK310, has been formulated for use with the Dako Automated Link Platforms. Please refer to the appropriate Dako Automated Link Platform User Guide for further information. Precautions 1. For professional users. 2. This product contains sodium azide (NaN3), a chemical highly toxic in pure form. At product concentrations, though not classified as

hazardous, NaN3 may react with lead and copper plumbing to form highly explosive build-ups of metal azides. Upon disposal, flush with large volumes of water to prevent azide build-up in plumbing.

3. As with any product derived from biological sources, proper handling procedures should be used for specimens as well as reagents.10

4. Incubation times, temperatures, or methods other than those specified may give erroneous results. 5. Reagents have been optimally diluted. Further dilution may result in loss of antigen staining. 6. Do not substitute primary antibodies or negative control reagents with primary antibodies and negative control reagents of different

manufactured lots (lot numbers appear on vial labels) or with reagents from other manufacturers. 7. As a general rule, persons under 18 years of age are not allowed to work with this product. Users must be carefully instructed in the

proper work procedures, the dangerous properties of the product and the necessary safety instructions. Please refer to Safety Data Sheet (SDS) for additional information.

8. Wear appropriate Personal Protective Equipment to avoid contact with eyes and skin.10

9. Unused solution should be disposed of according to local, State, and Federal regulations. 10. Safety Data Sheet available for professional users on request.

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Danger ER/PR pharmDx™ Peroxidase-Blocking Reagent: < 0.1% 3(2H)-Isothiazolone, 5-chloro-2-methyl-, mixt. with 2-methyl-3(2H)- isothiazolone H314 Causes severe skin burns and eye damage. H317 May cause an allergic skin reaction. P280 Wear protective gloves. Wear eye or face protection. Wear protective clothing. P261 Avoid breathing vapor. P264 Wash hands thoroughly after handling. P272 Contaminated work clothing should not be allowed out of the workplace. P304 + P340 + P310

IF INHALED: Remove victim to fresh air and keep at rest in a position comfortable for breathing. Immediately call a POISON CENTER or physician.

P301 + P310 + P330 + P331

IF SWALLOWED: Immediately call a POISON CENTER or physician. Rinse mouth. Do NOT induce vomiting.

P303 + P361 + P353 + P363 + P310

IF ON SKIN (or hair): Take off immediately all contaminated clothing. Rinse skin with water or shower. Wash contaminated clothing before reuse. Immediately call a POISON CENTER or physician.

P302 + P352 IF ON SKIN: Wash with plenty of soap and water. P333 + P313 If skin irritation or rash occurs: Get medical attention. P305 + P351 + P338 + P310

IF IN EYES: Rinse cautiously with water for several minutes. Remove contact lenses, if present and easy to do. Continue rinsing. Immediately call a POISON CENTER or physician.

P405 Store locked up. P501 Dispose of contents and container in accordance with all local, regional, national and international regulations.

Danger DAB+ Chromogen: 1-5% biphenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammonium tetrachloride H350 May cause cancer. H341 Suspected of causing genetic defects. P201 Obtain special instructions before use. P202 Do not handle until all safety precautions have been read and understood. P281 Use personal protective equipment as required. P308 + P313 IF exposed or concerned: Get medical attention. P405 Store locked up. P501 Dispose of contents and container in accordance with all local, regional, national and international regulations.

Warning Wash Buffer (10X): 5-10% Sodium chloride, 5-10% 2-Amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol hydrochloride H319 Causes serious eye irritation. P280 Wear eye or face protection. P264 Wash hands thoroughly after handling. P305 + P351 + P338

IF IN EYES: Rinse cautiously with water for several minutes. Remove contact lenses, if present and easy to do. Continue rinsing.

P337 + P313 If eye irritation persists: Get medical attention. Storage Store ER/PR pharmDx kit at 2–8 °C. Control slides must also be stored at 2–8 °C. Do not use kit after expiration date printed on outside of box. There are no obvious signs to indicate instability of this product, therefore, positive and negative controls should be run simultaneously with patient specimens. If reagents are stored under any conditions other than those specified in the package insert, they must be validated by the user.11 Specimen preparation Tissue specimens must be properly handled to preserve the tissue for IHC staining. Standard methods of tissue processing should be used for all specimens.12

Paraffin-embedded sections Formalin-fixed and paraffin-embedded tissues are suitable for use. Tissue specimens should be blocked into a thickness of 3 or 4 mm and fixed for 18–24 hours. The tissues are then dehydrated and cleared in a series of alcohols and xylene, followed by infiltration by molten paraffin. The paraffin temperature should not exceed 60 °C. Properly fixed and embedded tissue blocks expressing ER or PR will keep indefinitely prior to sectioning and slide mounting if stored in a cool place (15–25 °C).12,13

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Tissue paraffin blocks should be cut into sections of 3–5 µm. Tissue sections should be mounted on SuperFrost Plus, Dako Silanized Slides (Code S3003), or charged slides and placed in drying racks. The slide racks should be tapped firmly on an absorbent towel to remove water trapped under paraffin and on glass and then dried at room temperature for one hour. The rack of slides should then be placed in a 56–60 °C incubator for one hour. After removal from the incubator, slides should be held at room temperature until cool and paraffin has hardened. To preserve antigenicity, tissue sections, mounted on slides, should be stained within 2 months of sectioning when held at room temperature (20–25 °C). Consult the Dako Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods14 or References 15 and 16 for further details on specimen preparation. The use of this test on decalcified tissues has not been validated and is not recommended. The slides required for ER/PR evaluation and verification of the tumor presence should be prepared at the same time. A minimum of 4 slide is required. One slide for tumor presence, 1 slide for ER protein evaluation, 1 slide for PR protein evaluation and 1 slide for Negative Control Reagent. Reagent preparation The following reagents must be prepared prior to staining: Epitope Retrieval Solution Prepare a sufficient quantity of Epitope Retrieval Solution by diluting Epitope Retrieval Solution (10x) 1:10 using distilled or deionized water (reagent-quality water) for the staining procedure that is planned. Unused diluted solution may be used for one week at room temperature or stored at 2–8 °C for one month. Discard Epitope Retrieval Solution after use. Wash Buffer Prepare a sufficient quantity of wash buffer by diluting Wash Buffer (10x) 1:10 using distilled or deionized water (reagent-quality water) for the wash steps. Unused diluted buffer may be used for one week at room temperature or stored at 2–8 °C for one month. Discard buffer if cloudy in appearance. DAB+ Substrate-Chromogen Solution Prepare DAB+ Substrate-Chromogen Solution in the user-fillable bottles by adding 1 drop of DAB+ Chromogen per 1 mL of DAB+ Substrate Buffer and mix. DAB+ Substrate-Chromogen Solution is stable for approximately 5 days when stored at 2–8 °C. This solution should be mixed thoroughly prior to use. Any precipitate in the solution does not affect staining quality. NOTE: The color of the DAB+ Chromogen in the bottle may vary from clear to light lavender-brown. This will not affect the performance of this product. Dilute per the guidelines above. Addition of excess DAB+ Chromogen to the DAB+ Substrate Buffer will result in deterioration of the positive signal. The user-fillable bottle containing mixed DAB+ Substrate-Chromogen Solution must be defined in the Dako Automated Link Platform before use. Refer to the appropriate Dako Automated Link Platform User Guide for further information. Staining procedure Procedural Notes The user should read these instructions carefully and become familiar with all components and instrumentation prior to use (see Precautions). All reagents should be equilibrated to room temperature (20–25 °C) prior to immunostaining. Likewise, all incubations should be performed at room temperature. Do not allow tissue sections to dry during the staining procedure. Dried tissue sections may display increased nonspecific staining. All of the required steps and incubation times for staining are preprogrammed in the Dako Link software. Please refer to the appropriate Dako Automated Link Platform User Guide for further information on programming protocols and loading slides and reagents. Deparaffinization and Rehydration Prior to staining, tissue slides must be deparaffinized to remove embedding medium and rehydrated. Avoid incomplete removal of paraffin. Residual embedding medium will result in increased nonspecific staining. This procedure should be performed at room temperature (20–25 °C). STEP 1. Place slides in a xylene bath and incubate for 5 (±1) minutes. Change bath and repeat once. STEP 2. Tap off excess liquid and place slides in absolute ethanol for 3 (±1) minutes. Change bath and repeat once. STEP 3. Tap off excess liquid and place slides in 95% ethanol for 3 (±1) minutes. Change bath and repeat once. STEP 4. Tap off excess liquid and place slides in reagent-quality water for a minimum of 30 seconds. Commence staining procedure with

Epitope Retrieval. Xylene and alcohol solutions should be changed weekly or after a maximum of 200 slides. Toluene or xylene substitutes, such as Histoclear™, may be used in place of xylene. Epitope Retrieval Pressure Cooker (preferred method: 5 minutes at 125 °C, cool to 90 °C; alternate method: 10 minutes at 121 °C, cool to 85 °C) It is very important to maintain consistency in the epitope retrieval protocol to ensure reproducibility of staining results. The pressure cooker used must be properly calibrated and capable of achieving and maintaining 125 °C (or 121 °C ) and each pressure cooker run should include the same total volume of liquid (Epitope Retrieval Solution and water in pressure cooker pan) as well as the same total number of slides. The optimal protocol is as follows: STEP 1. For each run add a consistent volume of reagent-quality water to pressure cooker pan (500 mL or consult manufacturer’s instructions).

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STEP 2. Fill each of two heat-tolerant plastic staining containers that will accommodate a 24-slide rack with 250 mL of prepared Epitope Retrieval Solution (see Reagent preparation).

STEP 3. Immerse room temperature deparaffinized sections in Epitope Retrieval Solution in the staining containers. NOTE: For consistency, during each run 48 slides should be placed in the pressure cooker, with blank slides used to fill staining racks if fewer than 48 specimen slides are to be processed; if 24 or fewer slides are to be processed, to conserve Epitope Retrieval Solution the second staining container can be filled with 250 mL of water.

STEP 4. Place the two staining containers into the pressure cooker and securely tighten the lid. STEP 5. Preferred method: Set pressure cooker to heat to 125 °C; incubate slides at 125 °C for 5 minutes. Allow pressure cooker to cool to

90 °C (approximately 30 minutes), without venting of pressure, prior to opening. Alternate method: Set pressure cooker to heat to 121 °C; incubate slides at 121 °C for 10 minutes. Allow pressure cooker to cool

to 85 °C (approximately 30 minutes), without venting of pressure, prior to opening. STEP 6. Before opening pressure cooker ensure that pressure has released. Remove the staining containers, decant Epitope Retrieval

Solution, and rinse sections in Wash Buffer or reagent-quality water. STEP 7. Soak sections in Wash Buffer for 5 (±1) minutes after epitope retrieval prior to staining. NOTE: The Epitope Retrieval Solution is designed for single use application only. Do not re-use. Automated Link Platform Protocol After epitope retrieval, the slides are placed in instrument racks and loaded on the Dako Automated Link Platform. The instrument will perform the staining process by applying the appropriate reagent, monitoring the incubation time and rinsing the slides between reagents. The reagent incubation times are preprogrammed in the Dako Link software. Refer to the appropriate Dako Automated Link Platform User Guide for further information. Counterstain (instructions for Hematoxylin) Counterstaining with hematoxylin can be performed on the Automated Link Platform by selecting the ER/PR pharmDx protocol which includes this step. Alternatively, counterstaining can be performed manually after the slides are removed from the Automated Link Platform. The colored end-product of the staining reaction is alcohol and water insoluble. Hematoxylin, either alcohol or water-based, such as Hematoxylin for Automated Link Platforms (Code SK308), may be used. Do not use regressive counterstains. NOTE: Strong counterstaining may mask weak ER or PR expression. Instructions for manual counterstaining with hematoxylin: STEP 1. Immerse slides in a bath of hematoxylin. Incubate for 1–5 minutes, depending on the strength of hematoxylin used. STEP 2. Rinse gently in a reagent-quality water bath. Ensure that all residual hematoxylin has been cleared. Mounting Use of a non-aqueous, permanent mounting medium is recommended. An aqueous mounting medium such as Dako Faramount Mounting Medium, Ready-to-use (Code S3025) or Dako Glycergel Mounting Medium (Code C0563) is also suitable. Liquefy Glycergel by warming to approximately 40(±5) °C prior to use. NOTE: Slides may be read when convenient. However, some fading may occur if slides are coverslipped with an aqueous mounting medium and exposed to strong light. To minimize fading, store slides in the dark at room temperature (20–25 °C). Quality control Deviations in the recommended procedures for tissue fixation, processing and embedding in the user’s laboratory may produce significant variability in results, necessitating regular performance of in-house controls in addition to the Dako-supplied Control Slides. In the USA, consult the quality control guidelines of the College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry. See also CLSI Quality Assurance for Immunocytochemistry Approved Guideline,15 and References 16–19 for additional information. ER/PR pharmDx Control Slides (provided) Each of the supplied control slides contains two pelleted, formalin-fixed, paraffin-embedded human cell lines, one that stains with ER and PR antibodies, and one that does not stain. Two slides should be stained in each staining procedure, one stained with the anti-ER antibody cocktail and one stained with the anti-PR antibody. The evaluation of the Dako-supplied control slide cell lines indicates the validity of the staining run. They should not be used as an aid in interpretation of patient results. Positive Control Tissue Controls should be fresh biopsy/surgical specimens fixed, processed and embedded as soon as possible in the same manner as the patient sample(s). Positive tissue controls are indicative of correctly prepared tissues and proper staining techniques. One positive tissue control for each set of test conditions should be included in each staining run. Endocervix is recommended as a control tissue that contains both ER and PR expressing cells. The tissues used for the positive tissue controls should give weak positive staining so that subtle changes in the primary antibody sensitivity can be detected. The control slides supplied with this system or specimens processed differently from the patient sample(s) validate reagent performance only and do not verify tissue preparation. Known positive tissue controls should only be utilized for monitoring the correct performance of processed tissues and test reagents, NOT as an aid in formulating a specific diagnosis of patient samples. If the positive tissue controls fail to demonstrate appropriate positive staining, results with the test specimens should be considered invalid. Negative Control Tissue Use a negative control tissue (known to be ER and PR negative) fixed, processed and embedded in the same manner as the patient sample(s) with each staining run to verify the specificity of the primary antibody and to indicate unintended cross-reactivity to cells/cellular components. The variety of different cell types present in most tissue sections offers internal negative control sites (this should be verified by the user).

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If specific staining occurs in the negative control tissue, results with the patient specimens should be considered invalid and the test should be repeated. Nonspecific Negative Control Reagent Use the supplied Negative Control Reagent in place of the primary antibody with a section of each patient specimen to evaluate nonspecific staining and allow better interpretation of specific staining at the antigen site. The incubation period for the Negative Control Reagent should correspond to that of the primary antibody. Assay Verification As this product has completed FDA review, laboratories should only have to perform a reproducibility study on a series of in-house tissues with known IHC performance characteristics representing known positive and negative tissues to ensure consistent results prior to initial use. Refer to the Quality Control procedures previously outlined in this section of the product insert and to the quality control requirements of the CAP Certification Program for Immunohistochemistry and/or CLSI Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline.15 These quality control procedures should be repeated for each new antibody lot, or whenever there is a change in assay parameters. Carcinomas with known ER and PR staining intensities and negative tissues are suitable for assay verification. Table 1: The Purpose of Daily Quality Control

Specimen Specific Antibody and Detection System

Negative Control Reagent (Nonspecific Antibody: Mouse IgG1/IgG2a) and Detection System

Dako-supplied ER/PR pharmDx Control Slide.

Controls staining procedure only. The evaluation of the Dako-supplied control slide cell lines indicates the validity of the staining run.

Positive Control (fixed and processed like patient sample): Tissue or cells containing target antigen to be detected (could be located in patient tissue). The ideal control is weakly positive staining tissue to be most sensitive to antibody or antigen degradation.

Controls all steps of the analysis. Validates reagents and procedures used for ER/PR staining.

Detection of nonspecific background staining.

Negative Control (fixed and processed like patient sample): Tissues or cells expected to be negative (could be located in patient tissue or positive control tissue).

Detection of unintended antibody cross-reactivity to cells/cellular components.

Detection of nonspecific background staining.

Patient Tissue. Detection of specific staining. Detection of nonspecific background staining. Staining interpretation Slide evaluation should be performed by a pathologist using a light microscope. All assessments are to be made on the tumor region of the specimen. For the evaluation of the immunohistochemical staining and scoring, an objective of 10x or 20x magnification is appropriate. Use intact cells for interpretation of staining results; necrotic or degenerated cells often stain nonspecifically.15 ER/PR pharmDx stains cell nuclei when using anti-ER and anti-PR. The immunostaining pattern in breast carcinoma is normally heterogeneous. Scoring is based on examining all tumor cells on the slide. A proportion score (PS) is assigned representing the estimate proportion of positive staining cells (See Figure 1). An intensity score (IS) is assigned representing the estimated AVERAGE staining intensity of positive cells. A total score (TS) is calculated from the sum of PS and IS (ranging from 0, 2–8). A positive result for both ER and PR is defined as TS ≥ 3, which was validated in numerous large clinical studies.5-8 Positive and negative cell lines are included in each ER/PR pharmDx to validate staining runs each time the assay is performed. Appropriate staining of the cell line controls provides evidence that the ER/PR pharmDx assay is functioning properly. If the staining intensity of the positive control cell line is too weak or too strong, a false negative or false positive result may be obtained and the test should be repeated. Reference images are available in the ER/PR pharmDx™ Interpretation Manual. To qualify a staining run, the staining intensity of cells stained on the cell line control slides must fall within the following criteria: Table 2: Acceptance Criteria for Positive Cell Line Controls

ER Control cell line scoring

PR Control cell line scoring

Intensity Score (based on 0–3 scale)

2–3 2–3

Negative cell line controls should exhibit no nuclear staining.

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Figure 1: Allred Scoring Guideline for ER/PR pharmDx

Scoring guidelines (“Allred Score”) modified and used with the permission of D.C. Allred, M.D.6 Table 3: Score description

Proportion Score (PS)

(proportion of tumor cells with positive nuclear

staining)

PS Observation Intensity Score (IS)

(average intensity of all positive tumor

cells)

IS Observation

0 None 0 None 1 >0 to 1/100 1 Weak 2 >1/100 to 1/10 2 Intermediate 3 >1/10 to 1/3 3 Strong 4 >1/3 to 2/3 5 >2/3 to 1

Table 4: Scoring Guideline

Total Score (TS) (sum of Proportion Score and Intensity Score)

Interpretation

0, 2 Negative ≥3 Positive

Please refer to the Dako ER/PR pharmDx™ Interpretation Manual for in-depth staining evaluation guidelines. Limitations General Limitations 1. IHC is a multistep diagnostic process that requires specialized training in the selection of the appropriate reagents; tissue selection, fixation, and processing; preparation of the IHC slide; and interpretation of the staining results. 2. Tissue staining is dependent on the handling and processing of the tissue prior to staining. Improper fixation, freezing, thawing, washing,

drying, heating, sectioning, or contamination with other tissues or fluids may produce artifacts, antibody trapping, or false-negative results. Inconsistent results may be due to variations in fixation and embedding methods, or to inherent irregularities within the tissue.

3. Excessive or incomplete counterstaining may compromise proper interpretation of results. 4. The clinical interpretation of any positive staining or its absence should be complemented by morphological and histological studies with

proper controls. Evaluations should be made within the context of the patient's clinical history and other diagnostic tests by a qualified individual. Staining must be performed in a certified licensed laboratory under the supervision of a pathologist who is responsible for reviewing the stained slides and assuring the adequacy of positive and negative controls.

5. Tissues from persons infected with hepatitis B virus and containing hepatitis B surface antigen (HBsAg) may exhibit nonspecific staining with horseradish peroxidase.20

6. Reagents may demonstrate unexpected reactions in previously untested tissue types. The possibility of unexpected reactions even in tested tissue groups cannot be completely eliminated due to biological variability of antigen expression in neoplasms, or other pathological tissues.19 Contact Dako Technical Support with documented unexpected reactions.

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7. False-positive results may be seen due to non-immunological binding of proteins or substrate reaction products. They may also be caused by pseudoperoxidase activity (erythrocytes) and endogenous peroxidase activity (cytochrome C).17

8. The reagents and instructions supplied in this system have been designed for optimal performance. Further dilution of the reagents or alteration of incubation times or temperatures may give erroneous or discordant results.

Product-specific Limitations 1. False-negative results could be caused by degradation of the antigen in the tissues over time. Specimens should be stained within

2 months of mounting of tissues on slides when stored at room temperature.10 2. For optimal and reproducible results, the ER and PR proteins require epitope retrieval when tissues are routinely fixed

(neutral buffered formalin) and paraffin embedded. 3. Do not substitute reagents from other lot numbers of this product, or from kits of other manufacturers. The only exception is the Wash

Buffer that may be replaced with Dako Wash Buffer, code S3006. 4. 5. Stained control cell lines should be used only for validation of the staining run and should not be used to score the staining reaction in

tissue sections. 6. Use of Dako ER/PR pharmDx on tissues with fixatives other than formalin has not been validated. Performance characteristics Specificity Clones 1D5 and ER-2-123 were produced in BALB/c mice using recombinant estrogen receptor (RER), a protein with molecular mass of 67 kD.21 Epitope mapping of the two antibodies contained in this ER cocktail indicates binding to amino acid sequence 15-23 of the N-terminal for clone ER-2-123 (region A), and binding to amino acid sequence 127-130 for clone 1D5 (region B). Clone PgR 1294 was raised against formalin-fixed recombinant full-length A-form of human PR.22 The antibody specifically recognizes the A and B forms of the receptor in Western blots of purified recombinant receptor, normal endometrium and cell lysates of the T-47D cell line, known to be rich in PR concentration. No cross-reactivity was found with androgen receptor, ER or glucocorticoid receptor. Epitope mapping studies have demonstrated that the antibody binds to an epitope found between aa 165 and 534 in the N-terminal transactivation domain.22 Concordance study A pilot study comparing different assay procedures and antibodies to the Allred procedure was performed on a set of 20 tissues. The assay procedure and antibodies that produced the most similar testing results to the Allred procedure were selected for further testing.9

The validity of the assay procedure and antibody selection/dilution was tested on a set of specimens assembled in tissue arrays. Testing consisted of staining and evaluation of specimens using the Allred procedure as the reference, compared to the ER/PR pharmDx staining procedure interpreted using the Allred scoring method. Distribution of staining results for positive/negative determination is presented in Tables 5 and 6 for ER and PR, respectively. Concordance to the Allred method for positive/negative hormone receptor result was 99% for each receptor.9

Table 5: 2x2 table of Dako ER test results compared to Allred Procedure ER test result

Allred Procedure ER Test Result

Positive n

Negative n

Total n

Dako ER test result

Positive n 158 0 158

Negative n 2 52 54

Total

n 160 52 212

Positive agreement = 158/160 = 0.9875

Negative agreement = 52/52 = 1.0

Concordance was 210/212=0.9906. The Kappa statistic was calculated as 0.9748, with a 95% CI of 0.9402-1.0095.

Table 6: 2x2 table of Dako PR test results compared to Allred Procedure PR test result

Allred Procedure PR Test Result

Positive n

Negative n

Total n

Dako PR test result

Positive n 128 0 128

Negative n 2 74 76

Total n

130 74 204

Positive agreement = 128/130 = 0.9846

Negative agreement = 74/74 = 1.0

Concordance was 202/204=0.9902. The Kappa statistic was calculated as 0.9789, with a 95% CI of 0.9498-1.0080.

Reproducibility Reproducibility testing including Intra-run (within a staining run), and Inter-run (between technicians and between days) was performed. Staining intensity remained within 0.5 intensity grade for each tissue among the staining runs that were performed. Immunoreactivity A summary of the ER/PR pharmDx immunoreactivity on the recommended panel of normal tissues is presented in Table 7. All tissues are formalin-fixed and paraffin-embedded. Table 7: Evaluation of Normal Tissue Staining by Dako ER/PR pharmDx

Tissue Type (# tested) Tissue Element Stained

Staining Intensity Tissue Type (# tested) Staining Intensity

ER PR Tissue Element Stained ER PR

Adrenal (3) None None Parathyroid (3) None None

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Tissue Type (# tested) Tissue Element Stained

Staining Intensity Tissue Type (# tested) Staining Intensity

ER PR Tissue Element Stained ER PR

Bone Marrow (3) None None Peripheral Nerve (3) None None Breast (3)

Ductal epithelial cells

3,3,3

3,3,3 Pituitary (3)

Pituicytes 0,1,3

1,2,3*

Brain/Cerebellum (3) None None Prostate (3) Stromal cells

1,1,2

0,2,2

Brain/Cerebrum (3) None None Salivary Gland (3) None None Cervix (3)

Basal epithelium Stromal cells

2,3,3 1,3,3

None 2,3,3

Skeletal Muscle (3) None None

Colon (3) None None Skin (3) None None Esophagus (3) None None Small Intestine (3)

Muscularis propria None

0,0,2

Heart (3) None None Spleen (3) None None Kidney (3) None None Stomach (3) None None Liver (3) None None Testis (3) None None Lung (3) None None Thymus (3) None None Mesothelial Cells (3) None None Thyroid (3) None None Ovary (3)

Surface epithelium Stromal cells

0,0,2 None

0,3,3 0,3,3

Tonsil (3) None None

Pancreas (3) Islet cells*

None

1,3,3

Uterus (3) Endometrial glands

Endometrial stroma Myometrium

2,3,3 2,2,3 2,3,3

3,3,3* 3,3,3 3,3,3

All slides were graded for Intensity only on a 0–3 scale Nuclear staining *Nuclear and cytoplasmic staining Troubleshooting Problem Probable Cause Suggested Action 1. No staining of slides. 1a. Programming error. Reagents not

used in proper order. 1a. Check slide log to verify that correct program was selected.

1b. Sodium azide in wash buffer bath. 1b. Use supplied Wash Buffer or Dako Wash Buffer (Code S3006).

2. Weak staining of slides or of the positive cell line on the control slide.

2a. Inadequate reagent incubation times. 2a. Review the slide log to confirm that reagent incubation times are correct.

2b. Inappropriate fixation method used. 2b. Ensure that only approved fixatives and fixation methods are used.

2c. Inadequate epitope retrieval. 2c. Verify that pressure cooker is functioning properly and that epitope retrieval procedure was accurately followed. (Low temperatures and/or inadequate time will cause weak staining.)

2d. Lack of reaction with DAB+ Substrate-Chromogen Solution.

2d. Verify that DAB+ Substrate-Chromogen Solution was prepared properly.

2e. Degradation of control slide. 2e. Check expiration date and kit storage conditions printed on package label.

3. Excessive background staining of slides.

3a. Paraffin incompletely removed. 3a. Use fresh clearing solutions and follow procedure outlined in the Deparaffinization and Rehydration section.

3b. Additives used in mounting sections to slides.

3b. Avoid using additives for adhering sections to glass slides. Many additives are immunoreactive.

3c. Slides not thoroughly rinsed. 3c. Review the slide log to confirm that slides were rinsed properly.

3d. Sections dried during staining procedure.

3d. Verify that the appropriate volume of reagent is being applied to slides.

3e. Slides dried while loading onto the Automated Link Platform.

3e. Ensure slides remain wet with buffer while loading and prior to initiating run.

3f. Nonspecific binding of reagents to tissue section.

3f. Check for proper fixation of the specimen and/or the presence of necrosis.

4. Tissue detaches from slides. 4a. Use of incorrect slides. 4a. Use silanized slides such as Dako Silanized Slides (Code S3003) or charged slides (Fisher SuperFrost Plus).

5. Excessively strong specific staining.

5a. Inappropriate fixation method used. 5a. Ensure that only approved fixatives and fixation methods are used.

5b. Reagent incubation times too long. 5b. Review the slide log to confirm that reagent incubation times are correct.

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Problem Probable Cause Suggested Action 5c. Inappropriate wash buffer used. 5c. Use supplied Wash Buffer or Dako Wash Buffer (Code S3006). NOTE: Refer to the Troubleshooting section in the Dako Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods,14 the Atlas of Immunohistology,19 or Immunoperoxidase Techniques. A Practical Approach to Tumor Diagnosis.16 Contact Dako Technical Support to report unusual staining.

Français Réf. SK310 50 tests à utiliser sur les Automated Link Platforms Edition 12/18 Utilisation prévue Pour utilisation diagnostique in vitro. Le Dako ER/PR pharmDx™ Kit est un dosage immunohistochimique (IHC) semi-quantitatif conçu pour identifier l’expression du récepteur des œstrogènes (ER) et du récepteur de la progestérone (PR) dans les tissus sains et néoplasiques fixés au formol et inclus en paraffine pour évaluation histologique. Le kit ER/PR pharmDx détecte spécifiquement la protéine ER alpha ainsi que la protéine PR situées dans le noyau des cellules exprimant l’ER et le PR, respectivement. Le kit ER/PR pharmDx facilite l’identification des patientes éligibles au traitement anti-hormonal ou aux inhibiteurs de l’aromatase, et contribue à établir le pronostic et la prise en charge du cancer du sein. Pour le ER/PR pharmDx Kit (Link), Réf. SK310, les volumes des réactifs ont été calculés spécialement pour l’utilisation sur les Dako Automated Link Platforms. Résumé et explication Les études menées par le passé indiquent que le statut ER/PR est corrélé à l’issue sans traitement (à savoir le pronostic pour les cancers du sein invasifs bien différenciés) et particulièrement corrélé à la réponse au traitement anti-hormonal (ex. : tamoxifène). Les œstrogènes sont concentrés en grande partie dans les organes cibles des œstrogènes chez l’animal et dans le cancer du sein chez la femme et il est avéré que les effets mitogènes des œstrogènes sont médiés par l’ER.1 Les recherches menées sur les mécanismes biologiques du développement du cancer du sein ont permis d’établir que le rythme de croissance dépend de la présence d’œstrogènes et/ou de progestérone dans la plupart des cancers du sein. Par conséquent, le statut du récepteur des œstrogènes et du récepteur de la progestérone dans les carcinomes mammaires est considéré comme un facteur pronostique et prédictif fiable dans le cadre de la prise en charge des patientes incluant un traitement anti-hormonal.1-5 Le kit Dako ER/PR pharmDx a été conçu comme un dispositif d'analyse normalisé faisant appel à un système de notation validé cliniquement pour la détermination du statut ER/PR dans la prise en charge des patientes atteintes d’un cancer du sein.5-9 Principe de la procédure Le kit ER/PR pharmDx contient les réactifs requis pour effectuer une procédure de coloration immunohistochimique en deux étapes pour des échantillons fixés au formol et inclus en paraffine. Après incubation avec l’anticorps monoclonal primaire dirigé contre les protéines ER ou PR humaines ou le réactif de contrôle négatif, le protocole validé fait appel à un réactif de visualisation prêt à l’emploi à base de dextrane. Ce réactif comporte des molécules d'immunoglobuline secondaire de chèvre anti-souris et des molécules de peroxydase de raifort liées à une chaîne polymère de dextrane commune, ce qui permet d'éliminer l'application séquentielle d'un anticorps de liaison et d’un anticorps conjugué à de la peroxydase. La conversion enzymatique du chromogène ajouté par la suite entraîne la formation d'un produit de réaction visible sur le site de l'antigène. L'échantillon peut alors être contre-coloré et recouvert d'une lamelle de protection. Un microscope optique est utilisé pour l'interprétation des résultats. Des lames de contrôle contenant des lignées cellulaires humaines fixées au formol et incluses en paraffine sont fournies pour le contrôle qualité des performances des réactifs du kit. Le ER/PR pharmDx Kit (Link), Réf. SK310, convient à une coloration automatisée sur les Dako Automated Link Platforms. Matériels fournis ER/PR pharmDx™ Kit (Link) (Réf. SK310) Les matériels répertoriés ci-dessous sont fournis en quantité suffisante pour le traitement de 50 tests (50 lames incubées avec l'anticorps primaire anti-protéine ER, 50 lames incubées avec l'anticorps primaire anti-protéine PR et 50 lames incubées avec le réactif de contrôle négatif correspondant) et 20 lames de contrôle ER/PR pharmDx. Le nombre de tests indiqué suppose l’utilisation de 200 µl de chaque réactif par lame, à l’exception de l’Epitope Retrieval Solution et du Wash Buffer. Le kit fournit la quantité suffisante de matériels pour un maximum de 10 cycles de coloration. Quantité

Description

1 x 1 l ER/PR pharmDx™ Epitope Retrieval Solution (10x)

Tampon citrate avec agent antimicrobien.

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Quantité

Description

1 x 35 ml

ER/PR pharmDx™ Peroxidase-Blocking Reagent

Solution contenant du peroxyde d’hydrogène à 0,5 %, des détergents, des inhibiteurs enzymatiques et un conservateur, de pH 2.

1 x 12 ml ER/PR pharmDx™ ER Antibody Cocktail

Surnageant de culture tissulaire d'anticorps monoclonal de souris anti-ER humain, clones 1D5 et ER-2-123 (IgG1 et IgG2a) dans un tampon Tris-HCl contenant une protéine stabilisante et de l'azide de sodium à 0,015 mol/l.

1 x 12 ml ER/PR pharmDx™ PR Antibody

Surnageant de culture tissulaire d'anticorps monoclonal de souris anti-PR humain, clone PgR 1294 (IgG1) dans un tampon Tris-HCl contenant une protéine stabilisante et de l'azide de sodium à 0,015 mol/l.

1 x 12 ml ER/PR pharmDx™ Negative Control Reagent

Surnageant de culture tissulaire d'anticorps monoclonaux de souris IgG1 et IgG2a dans un tampon Tris-HCl contenant une protéine stabilisante et de l'azide de sodium à 0,015 mol/l.

1 x 35 ml ER/PR pharmDx™ Visualization Reagent

Polymère de dextrane conjugué à la peroxydase de raifort et des immunoglobulines anti-souris de chèvre isolées par affinité. Fourni dans un tampon Tris-HCl contenant une protéine stabilisante et un agent antimicrobien.

2 x 50 ml ER/PR pharmDx™ DAB+ Substrate Buffer

Solution tampon substrat, pH 7,5, contenant du peroxyde d'hydrogène < 0,1 %, des stabilisants, des amplificateurs et un agent antimicrobien.

1 x 2 ml ER/PR pharmDx™ DAB+ Chromogen

Solution chromogène de tétrahydrochlorure de 3,3'-diaminobenzidine à 5 %.

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Quantité

Description

10 x flacons User-Fillable Reagent Bottle, 12 mL capacity

Les flacons doivent être utilisés pour mélanger et contenir la solution de substrat chromogène DAB+ (voir également la section Préparation des réactifs).

2 x 1 l Wash Buffer (10x)

Tampon Tris/HCl contenant un détergent et un agent antimicrobien.

4 x 5 lames ER/PR pharmDx™ Control Slides

Chaque lame contient des coupes de deux lignées cellulaires fixées au formol, incluses en paraffine et enrobées, présentant une expression des protéines ER et PR modérée (en fonction de l’anticorps primaire appliqué sur la lame) et une lignée cellulaire négative. Lignée cellulaire A : CAMA-1, positive aux protéines ER et PR. Lignée cellulaire B : HT-29, négative aux protéines ER et PR.

REMARQUE : Tous les réactifs sont formulés spécialement pour ce test. Pour que le test fonctionne comme indiqué, aucune substitution ne doit être effectuée. Matériels requis mais non fournis Contre-colorant : Hématoxyline, à base d’eau ou d’alcool, telle la Hematoxylin for Automated Link Platforms (Réf. SK308) Lamelles de protection Eau distillée ou déionisée (eau de qualité réactif) Étuve de séchage, capable de maintenir une température de 56 à 60 °C Éthanol, absolu et à 95 % Microscope optique (grossissement de 4x à 40x) Milieu de montage, tels les Dako Faramount (Réf. S3025) ou Dako Glycergel (Réf. C0563) Tissus positifs et négatifs à utiliser comme contrôles du processus (voir la section Contrôle qualité) Autocuiseur, correctement étalonné et pouvant maintenir une température de 125 °C ou 121 °C Lames, SuperFrost Plus, lames chargées ou Dako Silanized Slides (Réf. S3003) (voir la section Préparation des échantillons) Cuves de coloration Minuteur Xylène, toluène ou substituts de xylène Le ER/PR pharmDx Kit (Link), Réf. SK310 est conçu pour être utilisé sur les Dako Automated Link Platforms. Se référer au guide de l’utilisateur de la Dako Automated Link Platform approprié pour des instructions détaillées. Précautions 1. Pour utilisateurs professionnels. 2. Ce produit contient de l’azide de sodium (NaN3), produit chimique hautement toxique dans sa forme pure. Aux concentrations

du produit, bien que non classé comme dangereux, le NaN3 peut réagir avec le cuivre et le plomb des canalisations pour former des azides métalliques hautement explosifs. Lors de l’élimination, rincer abondamment à l’eau pour éviter toute accumulation d’azide dans les canalisations.

3. Comme avec tout produit d’origine biologique, des procédures de manipulation appropriées doivent être utilisées pour les échantillons comme pour les réactifs.10

4. Toute durée, température ou méthode d'incubation autres que celles indiquées peuvent entraîner des résultats erronés. 5. Les réactifs ont été dilués de façon optimale. Une dilution supplémentaire peut entraîner une perte de coloration des antigènes. 6. Ne pas remplacer les anticorps primaires ou les réactifs de contrôle négatif par des anticorps primaires ou des réactifs de contrôle

négatif provenant d’autres lots (les numéros de lot figurent sur les étiquettes des flacons) ou par des réactifs fournis par d'autres fabricants. 7. D'une manière générale, les personnes âgées de moins de 18 ans ne sont pas autorisées à utiliser ce produit. Les utilisateurs doivent

être formés aux procédures de travail adéquates, aux propriétés dangereuses du produit et aux instructions de sécurité nécessaires. Se reporter à la fiche de données de sécurité pour plus d'informations.

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8. Porter un vêtement de protection approprié pour éviter le contact avec les yeux et la peau.10

9. Les solutions non utilisées doivent être éliminées conformément aux réglementations locales et nationales. 10. La Fiche technique de sécurité destinée aux utilisateurs professionnels est disponible sur demande.

Danger ER/PR pharmDx™ Peroxidase-Blocking Reagent: < 0.1% 3(2H)-Isothiazolone, 5-chloro-2-methyl-, mixt. with 2-methyl-3(2H)- isothiazolone H314 Provoque des brûlures de la peau et des lésions oculaires graves. H317 Peut provoquer une allergie cutanée. P280 Porter des gants de protection. Porter un équipement de protection des yeux ou du visage. Porter des vêtements de

protection. P261 Éviter de respirer les vapeurs. P264 Se laver soigneusement les mains après manipulation. P272 Les vêtements de travail contaminés ne devraient pas sortir du lieu de travail. P304 + P340 + P310

EN CAS D'INHALATION : Transporter la victime à l'extérieur et la maintenir au repos dans une position où elle peut confortablement respirer. Appeler immédiatement un CENTRE ANTIPOISON ou un médecin.

P301 + P310 + P330 + P331

EN CAS D'INGESTION : Appeler immédiatement un CENTRE ANTIPOISON ou un médecin. Rincer la bouche. Ne PAS faire vomir.

P303 + P361 + P353 + P363 + P310

EN CAS DE CONTACT AVEC LA PEAU (ou les poils) : Enlever immédiatement tous les vêtements contaminés. Rincer la peau à l'eau ou se doucher. Laver les vêtements contaminés avant réutilisation. Appeler immédiatement un CENTRE ANTIPOISON ou un médecin.

P302 + P352 EN CAS DE CONTACT AVEC LA PEAU: Laver abondamment à l'eau/... P333 + P313 En cas d'irritation ou d'éruption cutanée : Consulter un médecin. P305 + P351 + P338 + P310

EN CAS DE CONTACT AVEC LES YEUX : Rincer avec précaution à l'eau pendant plusieurs minutes. Enlever les lentilles de contact si la victime en porte et si elles peuvent être facilement enlevées. Continuer à rincer. Appeler immédiatement un CENTRE ANTIPOISON ou un médecin.

P405 Garder sous clef. P501 Éliminer le contenu et le récipient en conformité avec toutes réglementations locales, régionales, nationales, et

internationales.

Danger DAB+ Chromogen: 1-5% biphenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammonium tetrachloride H350 Peut provoquer le cancer. H341 Susceptible d’induire des anomalies génétiques. P201 Se procurer les instructions avant utilisation. P202 Ne pas manipuler avant d'avoir lu et compris toutes les précautions de sécurité. P281 Utiliser l’équipement de protection individuel requis. P308 + P313 EN CAS d’exposition prouvée ou suspectée: Consulter un médecin. P405 Garder sous clef. P501 Éliminer le contenu et le récipient en conformité avec toutes réglementations locales, régionales, nationales, et

internationales.

Attention Wash Buffer (10X): 5-10% Chlorure de sodium, 5-10% 2-Amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol hydrochloride H319 Provoque une sévère irritation des yeux. P280 Porter un équipement de protection du visage ou des yeux. P264 Se laver soigneusement les mains après manipulation. P305 + P351 + P338

EN CAS DE CONTACT AVEC LES YEUX: Rincer avec précaution à l'eau pendant plusieurs minutes. Enlever les lentilles de contact si la victime en porte et si elles peuvent être facilement enlevées. Continuer à rincer.

P337 + P313 Si l'irritation des yeux persiste : Consulter un médecin. Conservation Conserver le kit ER/PR pharmDx entre 2 et 8 °C. Les lames de contrôle doivent être conservées entre 2 et 8 °C. Ne pas utiliser le kit après la date de péremption imprimée sur l’emballage. Aucun signe évident n'indique l'instabilité de ce produit. Par conséquent, les contrôles positif et négatif doivent être analysés en même temps que les échantillons de patient. Si les réactifs sont conservés dans des conditions autres que celles indiquées dans la notice, celles-ci doivent être validées par l’utilisateur.11 Préparation des échantillons Les échantillons de tissu doivent être manipulés de sorte à préserver le tissu pour la coloration IHC. Des méthodes standard de traitement des tissus doivent être utilisées pour tous les échantillons.12

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Coupes incluses en paraffine Les tissus fixés au formol et inclus en paraffine sont adaptés à l’utilisation de ce kit. Les échantillons doivent être inclus dans 3 à 4 mm de paraffine et fixés pendant 18 à 24 heures. Les tissus sont ensuite déshydratés et nettoyés dans une série de bains d'alcools et de xylène, puis infiltrés dans de la paraffine fondue. La température de la paraffine ne doit pas dépasser 60 °C. Les blocs de tissus inclus et fixés correctement et exprimant la protéine ER ou PR se conservent indéfiniment avant d’être coupés et montés sur lame, sous réserve qu'ils soient conservés dans un endroit frais (entre 15 et 25 °C).12,13

L'épaisseur des coupes d'échantillons de tissu doit être comprise entre 3 et 5 µm. Les coupes de tissus doivent être montées sur des lames SuperFrost Plus, Dako Silanized Slides (Réf. S3003) ou des lames chargées, puis placées dans des portoirs pour y sécher. Les portoirs de lames doivent être tapotés sur une serviette absorbante afin d'éliminer l'eau piégée entre le verre et la couche de paraffine, puis laissés à température ambiante pendant une heure. Les portoirs de lames doivent alors être placés dans un incubateur entre 56 et 60 °C pendant une heure. À leur sortie de l'incubateur, les lames doivent être maintenues à température ambiante jusqu'à refroidissement et durcissement de la paraffine. Afin de conserver l'antigénicité, les coupes de tissu, montées sur lames, doivent être colorées dans les 2 mois suivant la coupe, en étant conservées à température ambiante (entre 20 et 25 °C). Consulter le manuel Dako Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods14 (Méthodes de coloration immunohistochimique) ou les références 15 et 16 pour plus de détails sur la préparation des échantillons. L'utilisation de ce test sur des tissus décalcifiés n'a pas été validée et n'est pas recommandée. Les lames nécessaires à l'évaluation du statut ER/PR et à la vérification de la présence de tumeur doivent être préparées simultanément. Il faut au minimum 4 lames : une pour détecter la tumeur, une pour le statut ER, une pour le statut PR et une pour le réactif de contrôle négatif. Préparation des réactifs Les réactifs suivants doivent être préparés avant de procéder à la coloration : Solution de restauration de l’épitope Préparer une quantité suffisante de solution de restauration de l’épitope en diluant l’Epitope Retrieval Solution 10x 1:10 avec de l'eau distillée ou déionisée (eau de qualité réactif) pour la procédure de coloration prévue. La solution diluée restante peut être utilisée pendant une semaine à température ambiante ou conservée entre 2 et 8 °C pendant un mois. Jeter l’Epitope Retrieval Solution après utilisation. Tampon de lavage Préparer une quantité suffisante de tampon de lavage en diluant du Wash Buffer (10x) 1:10 en utilisant de l'eau distillée ou déionisée (eau de qualité réactif) pour les étapes de lavage. Le tampon dilué restant peut être utilisé pendant une semaine s’il est conservé à température ambiante ou pendant un mois s’il est conservé entre 2 et 8 °C. Jeter le tampon s'il semble trouble. Solution de substrat chromogène DAB+ Préparer la solution de substrat chromogène DAB+ dans les flacons remplissables par l’utilisateur en ajoutant une goutte de DAB+ Chromogen pour 1 ml de DAB+ Substrate Buffer, puis mélanger. La solution de substrat chromogène DAB+ est stable environ cinq jours lorsqu’il est conservé entre 2 et 8 °C. Cette solution doit être mélangée vigoureusement avant utilisation. La formation d’un précipité dans la solution n'affecte pas la qualité de la coloration. REMARQUE : La couleur du DAB+ Chromogen dans le flacon peut varier de transparent à lavande-marron clair. Cela n'affecte en rien les performances de ce produit. Diluer conformément aux instructions indiquées ci-avant. L'ajout d'une quantité trop importante de DAB+ Chromogen dans le DAB+ Substrate Buffer entraîne une détérioration du signal positif. Le flacon remplissable par l’utilisateur contenant la solution de substrat chromogène DAB+ mélangée doit être défini sur la Dako Automated Link Platform avant utilisation. Se référer au guide de l’utilisateur de la Dako Automated Link Platform approprié pour des instructions détaillées. Procédure de coloration Remarques sur la procédure L’utilisateur doit lire attentivement les présentes instructions et se familiariser avec tous les composants et instruments avant utilisation (voir la section Précautions). Tous les réactifs doivent être portés à température ambiante (20–25 °C) avant la coloration immunologique. De même, toutes les incubations doivent être effectuées à température ambiante. Ne pas laisser les lames sécher pendant la procédure de coloration. Les coupes de tissus séchées peuvent présenter une coloration non spécifique plus importante. Toutes les étapes requises et les temps d'incubation pour la coloration sont préprogrammés dans le logiciel Dako Link. Se référer au guide de l’utilisateur de la Dako Automated Link Platform approprié pour plus de détails sur les protocoles de programmation et le chargement des lames et des réactifs. Déparaffinage et réhydratation Avant la coloration, les lames de tissu doivent être déparaffinées afin d'éliminer le milieu de montage, puis réhydratées. Éviter toute élimination incomplète de la paraffine. Tout résidu de milieu d'inclusion entraîne une coloration non spécifique plus importante. Cette procédure doit être effectuée à température ambiante (20–25 °C). ÉTAPE 1. Placer les lames dans un bain de xylène et incuber pendant 5 minutes (± 1 minute). Renouveler le bain et recommencer

l'opération une fois. ÉTAPE 2. Tapoter afin d'éliminer l'excès de liquide et placer les lames dans de l'éthanol absolu pendant 3 minutes (± 1 minute).

Renouveler le bain et recommencer l'opération une fois. ÉTAPE 3. Tapoter afin d'éliminer l'excès de liquide et placer les lames dans de l'éthanol à 95 % pendant 3 minutes (± 1 minute).

Renouveler le bain et recommencer l'opération une fois. ÉTAPE 4. Tapoter afin d'éliminer l'excès de liquide et placer les lames dans de l'eau de qualité réactif pendant 30 secondes minimum.

Lancer la procédure de coloration en commençant par la restauration de l’épitope.

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Les solutions de xylène et d’alcool doivent être changées toutes les semaines, ou après 200 lames maximum. Du toluène ou des substituts de xylène, comme Histoclear™, peuvent être utilisés à la place du xylène. Restauration de l’épitope Autocuiseur (méthode privilégiée : 5 minutes à 125 °C, puis laisser refroidir à 90 °C; autre méthode possible : 10 minutes à 121 °C, puis laisser refroidir à 85 °C) Il est très important de préserver l’homogénéité du protocole de restauration de l’épitope afin de garantir la reproductibilité des résultats de coloration. L'autocuiseur utilisé doit être étalonné correctement et doit être capable d'atteindre et de conserver une température de 125 °C (ou 121 °C) et chaque cycle de l'autocuiseur doit inclure le même volume total de liquide (Epitope Retrieval Solution et eau dans le bassin de l'autocuiseur), ainsi que le même nombre total de lames. Le protocole optimal est le suivant : ÉTAPE 1. Pour chaque cycle, ajouter un volume constant d'eau de qualité réactif dans le bassin de l'autocuiseur (500 ml ou consulter

les instructions du fabricant). ÉTAPE 2. Remplir chacun des deux récipients de coloration en plastique résistant à la chaleur qui peuvent contenir un portoir de 24 lames

avec 250 ml d’Epitope Retrieval Solution préparée (voir la section Préparation des réactifs). ÉTAPE 3. Immerger les coupes déparaffinées et amenées à température ambiante dans l’Epitope Retrieval Solution dans les récipients

de coloration. REMARQUE : Pour des raisons d’homogénéité, 48 lames doivent être placées dans l'autocuiseur pendant chaque cycle, avec des blancs utilisés pour remplir les portoirs à lames si moins de 48 lames sont traitées ; si un nombre inférieur ou égal à 24 lames est traité, il est possible de remplir le deuxième récipient de coloration avec 250 ml d'eau pour économiser l’Epitope Retrieval Solution.

ÉTAPE 4. Placer les deux récipients de coloration dans l’autocuiseur et fermer hermétiquement le couvercle. ÉTAPE 5. Méthode privilégiée : Régler l’autocuiseur sur 125 °C ; incuber les lames à 125 °C pendant 5 minutes. Laisser l'autocuiseur

refroidir à 90 °C (environ 30 minutes), sans laisser échapper la pression, avant de l'ouvrir. Autre méthode possible : Régler l’autocuiseur sur 121 °C ; incuber les lames à 121 °C pendant 10 minutes. Laisser l'autocuiseur

refroidir à 85 °C (environ 30 minutes), sans laisser échapper la pression, avant de l'ouvrir. ÉTAPE 6. S'assurer que la pression a été libérée avant d'ouvrir l'autocuiseur. Retirer les récipients de coloration, laisser décanter

l’Epitope Retrieval Solution et rincer les coupes dans du Wash Buffer ou de l'eau de qualité réactif. ÉTAPE 7. Laisser tremper les coupes dans le Wash Buffer pendant 5 minutes (± 1 minute) après restauration de l’épitope et avant coloration. REMARQUE : L’Epitope Retrieval Solution est conçue pour une application unique. Ne pas réutiliser. Protocole pour les Automated Link Platforms Après la restauration de l’épitope, les lames sont placées dans les portoirs de l'instrument et chargées sur la/les Dako Automated Link Platform. L’instrument effectue le processus de coloration en appliquant le réactif approprié, en surveillant le temps d’incubation et en rinçant les lames entre les réactifs. Les temps d’incubation des réactifs sont préprogrammés dans le logiciel Dako Link. Se référer au guide de l’utilisateur de la Dako Automated Link Platform approprié pour des instructions détaillées. Contre-coloration (instructions pour l'hématoxyline) La contre-coloration à l’hématoxyline peut être effectuée sur l’Automated Link Platform en sélectionnant le protocole ER/PR pharmDx qui inclut cette étape. Par ailleurs, la contre-coloration peut être réalisée manuellement une fois les lames enlevées de la Automated Link Platform. Le produit final de la réaction de coloration n'est soluble ni dans l'alcool ni dans l'eau. Il est possible d’utiliser de l’hématoxyline à base d'alcool ou d'eau, telle la Hematoxylin for Automated Link Platforms (Réf. SK308). Ne pas utiliser de contre-colorants de régression. REMARQUE : Une forte contre-coloration peut masquer une faible expression de l’ER ou du PR. Instructions pour la contre-coloration manuelle à l’hématoxyline: ÉTAPE 1. Immerger les lames dans un bain d'hématoxyline. Incuber pendant 1 à 5 minutes, en fonction de la puissance de l'hématoxyline utilisée. ÉTAPE 2. Rincer doucement dans un bain d'eau de qualité réactif. Vérifier qu’il n’y a plus de résidus d'hématoxyline. Montage L’utilisation d’un milieu de montage permanent non aqueux est recommandée. Un milieu de montage aqueux tels les Dako Faramount Mounting Medium, Ready-to-use (Réf. S3025) ou Dako Glycergel Mounting Medium (Réf. C0563) est également adapté. Liquéfier le Glycergel en le chauffant à environ 40 °C (± 5 °C) avant utilisation. REMARQUE : Les lames peuvent être lues à tout moment. Cependant, une atténuation peut se produire si les lames sont recouvertes d'un milieu de montage aqueux et exposées à une forte lumière. Pour limiter cette atténuation, conserver les lames dans l’obscurité à température ambiante (20–25 °C). Contrôle qualité Des différences dans les procédures recommandées pour la fixation, le traitement et l'inclusion des tissus du laboratoire de l'utilisateur peuvent générer une variabilité significative des résultats, ce qui requiert des contrôles internes réguliers, en complément des lames de contrôle fournies par Dako. Aux États-Unis, consulter les consignes de contrôle qualité du Certification Program for Immunohistochemistry (Programme de certification pour l’immunohistochimie) du College of American Pathologists (CAP). Voir égalemen le document Quality Assurance for Immunocytochemistry Approved Guideline du CLSI15 et les références 16 à 19 pour plus d’informations.

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Lames de contrôle ER/PR pharmDx (fournies) Chacune des lames de contrôle fournies contient deux lignées cellulaires fixées au formol, incluses en paraffine et enrobées, l’une se colorant avec les anticorps dirigés contre l’ER et le PR et l’autre ne se colorant pas. Deux lames doivent être colorées à chaque procédure, l’une avec le cocktail d’anticorps anti-ER et l’autre avec l’anticorps anti-PR. L'évaluation des lignées cellulaires des lames de contrôle fournies par Dako indique la validité du cycle de coloration. Elles ne doivent pas être utilisées à des fins d'interprétation des résultats de patient. Tissu de contrôle positif Les contrôles doivent être des échantillons de biopsie/de chirurgie récents fixés, traités et inclus aussi rapidement que possible de la même manière que le ou les échantillon(s) de patient. Les contrôles de tissu positifs indiquent si les tissus ont été préparés correctement et si des techniques de coloration appropriées ont été utilisées. Un contrôle de tissu positif pour chaque ensemble de conditions d'analyse doit être inclus dans chaque cycle de coloration. L’endocol est recommandé comme tissu de contrôle contenant des cellules exprimant à la fois l’ER et le PR. Les tissus utilisés pour les contrôles de tissu positifs doivent présenter une faible coloration positive pour pouvoir détecter des changements de sensibilité, même minimes, de l'anticorps primaire. Les lames de contrôle fournies avec ce kit ou les échantillons traités différemment du ou des échantillon(s) de patient valident les performances des réactifs uniquement et non la préparation des tissus. Les contrôles de tissu positifs connus ne doivent être utilisés que pour vérifier les bonnes performances des tissus traités et des réactifs de test, et NON pour établir un diagnostic spécifique aux échantillons de patient. Si les contrôles de tissu positifs ne présentent pas la coloration positive appropriée, les résultats des échantillons à analyser doivent être considérés comme non valides. Tissu de contrôle négatif Utiliser un tissu de contrôle négatif (connu pour être négatif aux ER et PR) fixé, traité et inclus de la même manière que le ou les échantillon(s) de patient à chaque cycle de coloration pour vérifier la spécificité de l'anticorps primaire et détecter toute réaction croisée inattendue aux cellules ou composants cellulaires. La variété des différents types cellulaires présents dans la plupart des coupes de tissu offre des sites de contrôle négatifs internes (cela doit être vérifié par l'utilisateur). Si une coloration spécifique se produit dans le tissu de contrôle négatif, les résultats des échantillons de patient doivent être considérés comme non valides et l’analyse doit être recommencée. Réactif de contrôle négatif non spécifique Utiliser le réactif de contrôle négatif fourni au lieu de l'anticorps primaire avec une coupe de chaque échantillon de patient afin d'évaluer la coloration non spécifique et d’obtenir une meilleure interprétation de la coloration spécifique au niveau du site de l'antigène. La période d'incubation du réactif de contrôle négatif doit correspondre à celle de l'anticorps primaire. Vérification du dosage Ce produit ayant été validé par la FDA, les laboratoires doivent simplement réaliser une étude de reproductibilité sur une série de tissus détenus en interne dont les caractéristiques de performance immunohistochimiques sont connues (tissus positifs et négatifs avérés), afin de garantir l'homogénéité des résultats avant la première utilisation. Consulter les procédures de contrôle qualité mentionnées ci-avant dans la présente notice, ainsi que les exigences de contrôle qualité du CAP Certification Program for Immunohistochemistry et/ou du document CLSI Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline du .15 Ces procédures de contrôle qualité doivent être reproduites pour chaque nouveau lot d’anticorps ou dès lors qu’un changement est apporté aux paramètres du dosage. Les carcinomes dont l’intensité de coloration ER et PR est connue et les tissus négatifs sont adaptés à la vérification du dosage. Tableau 1 : Objectif du contrôle qualité quotidien

Échantillon Anticorps spécifique et système de détection

Réactif de contrôle négatif (anticorps non spécifique) : IgG1/IgG2a de souris) et système de détection

Lame de contrôle ER/PR pharmDx fournie par Dako

Procédure de coloration des contrôles uniquement. L'évaluation des lignées cellulaires des lames de contrôle fournies par Dako indique la validité du cycle de coloration.

Contrôle positif (fixé et traité comme un échantillon patient) : Tissu ou cellules contenant l'antigène cible à détecter (peut être localisé dans le tissu du patient). Le contrôle idéal est un tissu présentant une faible coloration positive pour être plus sensible à l'anticorps ou à une dégradation de l'antigène.

Contrôle toutes les étapes de l'analyse. Valide les réactifs et les procédures utilisés pour la coloration ER/PR.

Détection d'une coloration de fond non spécifique.

Contrôle négatif (fixé et traité comme un échantillon patient) : Tissus ou cellules devant être négatifs (peuvent être localisés dans un tissu de patient ou un tissu de contrôle positif).

Détection d'une réactivité croisée inattendue de l'anticorps aux cellules/éléments cellulaires.

Détection d'une coloration de fond non spécifique.

Tissu de patient. Détection d'une coloration spécifique. Détection d'une coloration de fond non spécifique.

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Interprétation de la coloration L'évaluation des lames doit être effectuée par un pathologiste à l'aide d'un microscope optique. Tous les examens doivent être réalisés dans la région tumorale de l'échantillon. Pour l'évaluation de la coloration immunohistochimique et la notation, un objectif à grossissement de 10X ou 20X est approprié. Utiliser des cellules intactes pour l'interprétation des résultats de coloration ; les cellules nécrotiques ou dégénérées se colorent souvent de manière non spécifique.15 Le kit ER/PR pharmDx colore les noyaux cellulaires avec les anticorps anti-ER et anti-PR. Le schéma de coloration immunologique du carcinome mammaire est normalement hétérogène. La notation se base sur l’examen de toutes les cellules tumorales de la lame. Un score de proportion (SP) est défini pour représenter la proportion estimée de cellules à coloration positive (voir l’illustration 1). Un score d’intensité (SI) est défini pour représenter l’intensité de coloration MOYENNE estimée des cellules positives. Le score total (ST) est calculé en ajoutant le SP et le SI (il peut être égal à 0 ou compris entre 2 et 8). Un résultat positif pour l’ER et le PR est défini comme ST ≥ 3, chiffre qui a été validé par plusieurs études cliniques à grande échelle.5-8 Des lignées cellulaires positives et négatives sont fournies avec chaque kit ER/PR pharmDx pour valider les cycles de coloration, à chaque fois qu’un dosage a lieu. Une coloration appropriée des lignées cellulaires de contrôle apporte la preuve que le kit ER/PR pharmDx fonctionne correctement. Si l'intensité de coloration de la lignée cellulaire de contrôle positif est trop faible ou trop forte, il est possible qu’il s’agisse d’un faux positif ou d’un faux négatif et le test doit être répété. Des images de référence sont disponibles dans le manuel d’interprétation du kit ER/PR pharmDx™. Pour valider un cycle de coloration, l’intensité de coloration des cellules colorées sur les lames de contrôle doit répondre aux critères suivants : Tableau 2 : Critères de validation des lignées cellulaires de contrôle positives

Contrôle ER notation de la lignée cellulaire

Contrôle PR notation de la lignée cellulaire

Score d’intensité (sur une échelle de 0 à 3)

2–3 2–3

Les lignées cellulaires de contrôle négatives ne doivent présenter aucune coloration nucléaire. Illustration 1 : Consignes de notation Allred pour ER/PR pharmDx

Consignes de notation (« Allred Score ») modifiées et utilisées avec l’autorisation du Dr D.C. Allred.6 Tableau 3 : Description de la notation Score de proportion

(SP) (proportion de cellules

tumorales présentant une coloration nucléaire positive)

Observation pour le SP Score d’intensité (SI) (intensité moyenne de toutes

les cellules tumorales positives)

Observation pour le SI

0 Aucun 0 Aucun 1 >0 à 1/100 1 Faible 2 >1/100 à 1/10 2 Intermédiaire

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3 >1/10 à 1/3 3 Forte 4 >1/3 à 2/3 5 >2/3 à 1

Tableau 4 : Consigne de notation

Score total (ST) (somme du score de proportion et du score d’intensité)

Interprétation

0, 2 Négatifs ≥3 Positifs

Se reporter au manuel d’interprétation du kit Dako ER/PR pharmDx™ pour des consignes d’évaluation de la coloration détaillées. Limites Limites générales 1. L’immunohistochimie est un processus diagnostique en plusieurs étapes qui nécessite une formation spécialisée pour le choix

des réactifs appropriés; la sélection des tissus, la fixation et le traitement; la préparation des lames IHC et l’interprétation des résultats. 2. La coloration des tissus dépend de la manipulation et du traitement corrects des tissus avant la coloration. Les fixation, congélation,

décongélation, lavage, séchage, chauffage, coupe inadaptés ou une contamination par d’autres tissus ou fluides peuvent générer des artéfacts, un piégeage des anticorps ou des faux négatifs. Des résultats incohérents peuvent être dus à des variations dans les méthodes de fixation et d'inclusion, ou à des irrégularités inhérentes au tissu.

3. Une contre-coloration excessive ou incomplète peut conduire à une interprétation erronée des résultats. 4. L’interprétation clinique de toute coloration positive ou de son absence doit être associée à des études morphologiques et histologiques

utilisant les contrôles adéquats. Les évaluations doivent tenir compte des antécédents cliniques du patient et d’autres tests diagnostiques réalisés par une personne qualifiée. La coloration doit être réalisée dans un laboratoire autorisé et certifié, sous le contrôle d'un pathologiste, responsable de l'examen des lames colorées et vérifiant la pertinence des contrôles positif et négatif.

5. Les tissus de patients infectés par le virus de l’hépatite B et porteurs de l’antigène de surface de l’hépatite B (HBsAg) peuvent présenter une coloration non spécifique avec la peroxydase de raifort.20

6. Les réactifs peuvent présenter des réactions inattendues dans des types de tissus non testés précédemment. La possibilité de réactions inattendues même dans les groupes de tissus préalablement testés ne peut pas être complètement écartée, du fait de la variabilité biologique de l'expression des antigènes dans les néoplasmes, ou autres tissus pathologiques.19 Contacter l'assistance technique Dako pour faire part de ces réactions inattendues.

7. Des faux positifs peuvent être dus à une liaison non immunologique des protéines ou des produits de réaction du substrat. Ils peuvent aussi être causés par une activité pseudoperoxydasique (érythrocytes) ou par une activité peroxydasique endogène (cytochrome C).17

8. Les réactifs fournis dans ce kit et les instructions correspondantes ont été conçus pour des performances optimales. Toute dilution supplémentaire des réactifs du kit, ainsi que toute modification des temps ou températures d’incubation, peut produire des résultats erronés ou discordants.

Limites spécifiques au produit 1. Des faux négatifs peuvent être dus à une dégradation de l'antigène dans les tissus au fil du temps. Les échantillons doivent

être colorés dans les 2 mois suivant le montage des tissus sur les lames lorsqu'ils sont conservés à température ambiante.10 2. Pour des résultats optimaux et reproductibles, les protéines ER et PR requièrent une restauration de l’épitope lorsque les tissus

sont fixés en routine (formol neutre tamponné) et inclus en paraffine. 3. Ne pas utiliser de réactifs portant un autre numéro de lot ou provenant de kits d’autres fabricants. La seule exception est le tampon de

lavage qui peut être remplacé par le Dako Wash Buffer, réf. S3006. 4. Les lignées cellulaires de contrôle colorées doivent être utilisées uniquement pour la validation du cycle de coloration et non pour noter

la réaction de coloration dans les coupes de tissus. 5. L’emploi du kit Dako ER/PR pharmDx sur des tissus fixés autrement qu'au formol n'a pas été validé. Caractéristiques de performance Spécificité Les clones 1D5 et ER 2-123 ont été produits chez des souris BALB/c à l’aide d’un récepteur des œstrogènes recombinant (RER), protéine dont la masse moléculaire est de 67 kD.21 La cartographie de l’épitope des deux anticorps contenus dans ce cocktail ER indique une liaison à la séquence d’acides aminés 15 à 23 de la partie N-terminale pour le clone ER-2-123 (région A) et une liaison à la séquence d’acides aminés 127 à 130 pour le clone 1D5 (région B). Le clone PgR 1294 a été mis en présence d'un PR humain recombinant, forme A pleine longueur, fixé au formol.22 L’anticorps a reconnu de manière spécifique les formes A et B du récepteur dans des Western blots de récepteur recombinant purifié, d’endomètre sains et de lysats cellulaires de la lignée T-47D, connue pour sa forte concentration en PR. Aucune réactivité croisée n’a été établie avec le récepteur des androgènes, l’ER ou le récepteur des glucocorticoïdes. Des études de cartographie de l'épitope indiquent que l'anticorps se lie à un épitope situé entre les acides aminés 165 et 534 dans le domaine de transactivation N-terminal.22 Étude de concordance Une étude pilote comparant différentes procédures et différents anticorps à la procédure Allred a été menée sur un jeu de 20 tissus. Les anticorps et la procédure ayant généré les résultats les plus proches de ceux de la procédure Allred ont été sélectionnés pour d’autres tests.9

La validité de la procédure et de la sélection/dilution des anticorps a été testée sur différents échantillons regroupés dans des séquences multi-tissus. Le test à consisté à colorer et à évaluer les échantillons à l’aide de la procédure Allred comme méthode de référence, puis à l’aide de la procédure de coloration ER/PR pharmDx interprétée selon la méthode de notation Allred. La répartition des résultats de la coloration (détermination positive/négative) est reproduite dans les tableaux 5 et 6 pour l’ER et le PR, respectivement. La concordance avec la méthode Allred pour les résultats positifs/négatifs était de 99 % pour chaque récepteur.9

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Tableau 5 : Tableau à double entrée des résultats du test ER Dako par rapport aux résultats de la procédure ER Allred

Résultats de la procédure ER Allred

Positifs n

Négatifs n

Total n

Résultats du test

ER Dako

Positifs n 158 0 158

Négatifs n 2 52 54

Total

n 160 52 212

Concordance pour les résultats positifs = 158/160 = 0,9875

Concordance pour les résultats négatifs = 52/52 = 1,0

La concordance totale est de 210/212 = 0,9906. La valeur Kappa est établie à 0,9748, avec un IC à 95 % de 0,9402-1,0095.

Tableau 6 : Tableau à double entrée des résultats du test PR Dako par rapport aux résultats de la procédure PR Allred

Résultats de la procédure PR Allred

Positifs n

Négatifs n

Total n

Résultats du test

PR Dako

Positifs n 128 0 128

Négatifs n 2 74 76

Total n

130 74 204

Concordance pour les résultats positifs = 128/130 = 0,9846

Concordance pour les résultats négatifs = 74/74 = 1,0

La concordance totale est de 202/204 = 0,9902. La valeur Kappa est établie à 0,9789, avec un IC à 95 % de 0,9498-1,0080.

Reproductibilité Des tests de reproductibilité incluant des analyses intracycle (au cours d’un seul cycle de coloration) et intercycles (entre différents opérateurs et sur plusieurs jours) ont été réalisés. L’intensité de coloration n’a pas varié de plus de 0,5 pour chaque tissu lors des cycles de coloration réalisés. Immunoréactivité Le Tableau 7 résume l'immunoréactivité au ER/PR pharmDx sur le panel de tissus sains recommandé. Tous les tissus étaient fixés au formol et inclus en paraffine. Tableau 7 : Évaluation de la coloration de tissus sains par Dako ER/PR pharmDx Type de tissus (nbre testés) Élément tissulaire coloré

Intensité de coloration

Type de tissus (nbre testés)

Intensité de coloration

ER PR Élément tissulaire coloré ER PR

Surrénale (3) Aucun Aucun Parathyroïde (3) Aucun Aucun Moelle osseuse (3) Aucun Aucun Nerf périphérique (3) Aucun Aucun Sein (3)

Cellules épithéliales canalaires

3,3,3

3,3,3

Hypophyse (3) Pituicytes

0,1,3

1,2,3*

Cerveau, cervelet (3) Aucun Aucun Prostate (3) Cellules stromales

1,1,2

0,2,2

Cerveau, cerebrum (3) Aucun Aucun Glande salivaire (3) Aucun Aucun Col de l’utérus (3)

Épithélium basal Cellules stromales

2,3,3 1,3,3

Aucun 2,3,3

Muscle squelettique (3) Aucun Aucun

Côlon (3) Aucun Aucun Peau (3) Aucun Aucun Œsophage (3) Aucun Aucun Intestin grêle (3)

Muscularis propria Aucun

0,0,2

Cœur (3) Aucun Aucun Rate (3) Aucun Aucun Rein (3) Aucun Aucun Estomac (3) Aucun Aucun Foie (3) Aucun Aucun Testicule (3) Aucun Aucun Poumon (3) Aucun Aucun Thymus (3) Aucun Aucun Cellules mésothéliales (3) Aucun Aucun Thyroïde (3) Aucun Aucun Ovaire (3)

Épithélium de surface Cellules stromales

0,0,2 Aucun

0,3,3 0,3,3

Amygdale (3) Aucun Aucun

Pancréas (3) Cellules des îlots

de Langerhans*

Aucun

1,3,3

Utérus (3) Glandes endométriales

Stroma endométrial Myomètre

2,3,3 2,2,3 2,3,3

3,3,3* 3,3,3 3,3,3

Toutes les lames ont été notées uniquement pour l’intensité de coloration sur une échelle de 0 à 3. Coloration nucléaire *Coloration nucléaire et cytoplasmique

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Dépannage Problème Cause probable Action recommandée 1. Coloration d’aucune lame. 1a. Erreur de programmation. Les réactifs

n’ont pas été utilisés dans l’ordre adéquat.

1a. Consulter le journal des lames pour vérifier que le programme adapté a été sélectionné.

1b. Azide de sodium dans un bain de tampon de lavage.

1b. Utiliser le tampon de lavage fourni ou le Dako Wash Buffer (Réf. S3006).

2. Faible coloration des lames ou de la lignée cellulaire positive sur la lame de contrôle.

2a. Durées d'incubation des réactifs inadéquates.

2a. Consulter le journal des lames pour vérifier que les temps d’incubation des réactifs sont corrects.

2b. Méthode de fixation inappropriée. 2b. S'assurer que seuls des fixateurs et des méthodes de fixation approuvés ont été utilisés.

2c. Mauvaise restauration de l’épitope. 2c. Vérifier le bon fonctionnement de l’autocuiseur et le bon déroulement de la procédure de restauration de l’épitope. (Des températures basses et/ou une durée inappropriée peuvent entraîner une coloration faible.)

2d. Manque de réaction à la solution de substrat chromogène DAB+.

2d. Vérifier que la solution de substrat chromogène DAB+ a été correctement préparée.

2e. Dégradation de la lame de contrôle. 2e. Vérifier la date de péremption et les conditions de conservation du kit indiquées sur l'étiquette.

3. Coloration de fond excessive des lames.

3a. La paraffine n’a pas été complètement enlevée.

3a. Utiliser une nouvelle solution de nettoyage et suivre la procédure décrite à la section Déparaffinage et réhydratation.

3b. Des additifs ont été utilisés lors du montage des coupes sur les lames.

3b. Éviter d'utiliser des additifs pour faire adhérer les coupes aux lames de verre. De nombreux additifs sont immunoréactifs.

3c. Les lames ne sont pas bien rincées. 3c. Consulter le journal des lames pour vérifier que les lames ont été correctement rincées.

3d. Les coupes ont séché au cours de la procédure de coloration.

3d. Vérifier que le volume de réactif approprié est appliqué sur les lames.

3e. Les coupes ont séché au cours du chargement sur l’Automated Link Platform.

3e. S'assurer que les lames demeurent humides à l'aide de tampon pendant leur chargement et avant de lancer le cycle.

3f. Liaison non spécifique des réactifs aux coupes de tissus.

3f. Vérifier que la fixation des échantillons est correcte et/ou rechercher toute trace de nécrose.

4. Le tissu se détache des lames. 4a. Utilisation de lames inadéquates. 4a. Utiliser des lames silanisées telles les Dako Silanized Slides (Réf. S3003) ou des lames chargées (Fisher SuperFrost Plus).

5. Coloration spécifique trop forte. 5a. Méthode de fixation inappropriée. 5a. S'assurer que seuls des fixateurs et des méthodes de fixation approuvés ont été utilisés.

5b. Durées d'incubation des réactifs trop longues

5b. Consulter le journal des lames pour vérifier que les temps d’incubation des réactifs sont corrects.

5c. Un tampon de lavage inapproprié a été utilisé.

5c. Utiliser le tampon de lavage fourni ou le Dako Wash Buffer (Réf. S3006).

REMARQUE : Consulter la section Dépannage du manuel Dako Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods,14 le guide Atlas of Immunohistology19 ou le document Immunoperoxidase Techniques. A Practical Approach to Tumor Diagnosis.16 Contacter l’assistance technique Dako pour signaler toute coloration inhabituelle.

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Deutsch Code SK310 50 Tests zur Verwendung mit Automated Link Platforms Ausgabe 12/18 Zweckbestimmung Zur In-vitro-Diagnostik. Das Dako ER/PR pharmDx™ Kit ist ein halbquantitativer immunhistochemischer (IHC) Test zum Nachweis der Expression des Östrogenrezeptors (ER) bzw. Progesteronrezeptors (PR) in für die histologische Auswertung formalinfixierten, paraffineingebetteten Proben von gesundem und neoplastischem Gewebe. ER/PR pharmDx weist speziell das ER-Alpha-Protein sowie das PR-Protein in den Zellkernen ER- bzw. PR-exprimierender Zellen nach. ER/PR pharmDx ist als Hilfsmittel bei der Auswahl von Patienten, für die eine antihormonelle Therapie bzw. eine Therapie mit Aromataseinhibitoren voraussichtlich von Nutzen ist, und in der Prognostik und Therapie von Brustkrebs indiziert. Die Reagenzienvolumina für das ER/PR pharmDx Kit (Link), Code-Nr. SK310 wurden speziell für Dako Automated Link Platforms optimiert. Zusammenfassung und Erklärung Studien haben ergeben, dass der ER-/PR-Status mit dem Verlauf ohne Therapie (z.B. Prognostik bei gut differenziertem invasivem Brustkrebs) und insbesondere mit dem Ansprechen auf eine antihormonelle Therapie wie Tamoxifen, korreliert. Wie sich herausgestellt hat, konzentrieren sich Östrogene vorzugsweise in den Östrogenzielorganen bei Tieren und in menschlichem Brustkrebsgewebe, und es ist sehr gut belegt, dass die mitogenen Wirkungen von Östrogen durch ER vermittelt werden.1 Untersuchungen der biologischen Mechanismen des Brustkrebswachstums haben ergeben, dass die Wachstumsrate bei den meisten Brustkrebsarten vom Vorhandensein von Östrogen, Progesteron oder beiden Hormonen abhängt. Daher gilt der Östrogen- bzw. Progesteronrezeptorstatus bei Mammakarzinomen als bestätigter prognostischer und prädiktiver Faktor für eine antihormonelle Therapie.1-5 Der Dako ER/PR pharmDx Test wurde als standardisiertes Testsystem entwickelt, bei dem ein klinisch validiertes Bewertungssystem für die Bestimmung des ER-/PR-Status verwendet wird, das in der Behandlung von Brustkrebspatientinnen einsetzbar ist.5-9 Verfahrensprinzip Das ER/PR pharmDx-Kit enthält Reagenzien, die für die Durchführung eines Zweischritt-IHC-Färbeverfahrens an formalinfixierten, paraffineingebetteten Proben benötigt werden. Im Anschluss an die Inkubation mit dem primären monoklonalen Antikörper gegen humanes ER- bzw. PR-Protein oder dem Negativkontroll-Reagenz verwendet das validierte Protokoll ein gebrauchsfertiges Visualisierungsreagenz auf Basis der Dextrantechnologie. Das Reagenz enthält sowohl sekundäre Ziegen-Anti-Maus-Immunglobulinmoleküle als auch mit einem gemeinsamen Dextranpolymer-Backbone verknüpfte Meerrettichperoxidasemoleküle, wodurch die sequentielle Anwendung von Link-Antikörper und peroxidasekonjugiertem Antikörper überflüssig wird. Die enzymatische Umwandlung des anschließend zugesetzten Chromogens führt zur Bildung eines sichtbaren Reaktionsprodukts an der Antigendeterminante. Danach können die Proben gegengefärbt und eingedeckt werden. Ergebnisse werden mit Hilfe eines Lichtmikroskops ausgewertet. Zur Qualitätskontrolle der Kitreagenzleistung werden Kontrollobjektträger mit formalinfixierten, paraffineingebetteten menschlichen Zelllinien zur Verfügung gestellt. ER/PR pharmDx Kit (Link), Code-Nr. SK310 eignet sich für die automatisierte Färbung mit Dako Automated Link Platforms. Mitgelieferte Materialien ER/PR pharmDx™ Kit (Link) (Code-Nr. SK310) Die unten aufgeführten Materialien (50 mit primärem Antikörper gegen das ER-Protein inkubierte Objektträger, 50 mit primärem Antikörper gegen das PR-Protein inkubierte Objektträger und 50 mit dem entsprechenden negativen Kontrollreagenz inkubierte Objektträger) sowie 20 ER/PR pharmDx Kontrollobjektträger reichen für 50 Tests. Die Anzahl der Tests entspricht für jedes Reagenz, ausgenommen Epitope Retrieval Solution und Wash Buffer, einer Menge von 200 µl pro Objektträger. Die im Kit gelieferten Materialien reichen für höchstens 10 Färbedurchläufe. Menge

Beschreibung

1 x 1 l ER/PR pharmDx™ Epitope Retrieval Solution (10x)

Zitratpuffer mit einer antimikrobiellen Substanz.

1 x 35 ml

ER/PR pharmDx™ Peroxidase-Blocking Reagent

Lösung mit 0,5 % Wasserstoffperoxid, Detergentien, Enzyminhibitoren und Konservierungsmittel, pH 2.

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Menge

Beschreibung

1 x 12 ml ER/PR pharmDx™ ER Antibody Cocktail

Monoklonaler Maus-Anti-Human-Antikörper gegen menschlichen ER, Klone 1D5 und ER-2-123 (IgG1 und IgG2a) in Gewebekulturüberstand in Tris-HCI-Puffer |mit Stabilisatorprotein und 0,015 mol/l Natriumazid.

1 x 12 ml ER/PR pharmDx™ PR Antibody

Monoklonaler Maus-Anti-Human-Antikörper gegen PR, Klon PgR 1294 (IgG1) in Gewebekulturüberstand in Tris-HCI-Puffer mit Stabilisatorprotein und 0,015 mol/l Natriumazid.

1 x 12 ml ER/PR pharmDx™ Negative Control Reagent

Monoklonale Maus-IgG1- und Maus-IgG2a-Antikörper in Gewebekulturüberstand in Tris-HCI-Puffer mit Stabilisatorprotein und 0,015 mol/l Natriumazid.

1 x 35 ml ER/PR pharmDx™ Visualization Reagent

Mit Meerrettichperoxidase und affinitätsisolierten Ziegen-Anti-Maus-Immunglobulinen konjugiertes Dextranpolymer. Geliefert in Tris/HCI-Puffer mit Stabilisatorprotein und einer antimikrobiellen Substanz.

2 x 50 ml ER/PR pharmDx™ DAB+ Substrate Buffer

Substratpufferlösung, pH 7,5, enthält <0,1 % Wasserstoffperoxid, Stabilisatoren, Beschleuniger und eine antimikrobielle Substanz.

1 x 2 ml ER/PR pharmDx™ DAB+ Chromogen

5 % 3,3'-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid in Chromogenlösung.

10 x Flaschen User-Fillable Reagent Bottle, 12 mL capacity

Diese Flaschen sind für das Mischen und die Aufbewahrung von DAB+ Substrat-Chromogenlösung bestimmt (siehe auch Abschnitt „Reagenzvorbereitung“).

2 x 1 l Wash Buffer (10x)

Tris/HCl-Puffer mit Detergens und einer antimikrobiellen Substanz.

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Menge

Beschreibung

4 x 5 Objektträger ER/PR pharmDx™ Control Slides

Jeder Objektträger enthält Schnitte von zwei pelletierten, formalinfixierten und paraffineingebetteten menschlichen Zelllinien, die eine mäßige Expression des ER- bzw. PR-Proteins aufweisen (je nach dem auf den Objektträger aufgebrachten Primärantikörper) und eine negative Zelllinie. Zelllinie A: CAMA-1, positiv auf ER- und PR-Protein. Zelllinie B: HT-29, negativ auf ER- und PR-Protein.

HINWEIS: Alle Reagenzien wurden speziell für den Gebrauch in diesem Test entwickelt. Um den Test wie beschrieben durchführen zu können, dürfen die Bestandteile nicht ausgewechselt werden. Erforderliche, aber nicht mitgelieferte Materialien Gegenfärbung: Hämatoxylin auf Alkoholbasis oder wässriger Basis wie Hematoxylin for Automated Link Platforms (Code-Nr. SK308) Deckgläser Destilliertes oder entionisiertes Wasser (Reagenzqualität) Trockenofen, der imstande ist, eine Temperatur von 56–60 °C aufrecht zu erhalten. Ethanol, absolut und 95 % Lichtmikroskop (4-fache bis 40-fache Vergrößerung) Fixiermittel, z.B. Dako Faramount (Code-Nr. S3025) oder Dako Glycergel (Code-Nr. C0563) Positive und negative Gewebe zur Verfahrenskontrolle (siehe Abschnitt Qualitätskontrolle) Korrekt kalibrierter Dampfdrucktopf, der in der Lage sein muss, eine Temperatur von 125 °C oder 121 °C zu erreichen und aufrecht zu erhalten SuperFrost Plus Objektträger, elektrostatisch geladene Objektträger oder Dako Silanized Slides (Code-Nr. S3003) (siehe Abschnitt Vorbereitung

der Probe) Färbeschalen oder Bäder Zeitmesser Xylol, Toluol oder Xylolersatz ER/PR pharmDx Kit (Link), Code-Nr. SK310 wurde für Dako Automated Link Platforms entwickelt. Weitere Informationen bitte dem entsprechenden Benutzerhandbuch für Dako Automated Link Platform entnehmen. Vorsichtsmaßnahmen 1. Zur klinischen Anwendung. 2. Dieses Produkt enthält Natriumazid (NaN3), eine in reiner Form äußerst giftige Chemikalie. Ansammlungen von NaN3 können auch

in Konzentrationen, die nicht als gefährlich klassifiziert sind, mit Blei- und Kupferabflussrohren reagieren und hochexplosive Metallazide bilden. Nach Ausgießen stets mit viel Wasser nachspülen, um Metallazidansammlungen in den Leitungen vorzubeugen.

3. Wie alle Produkte biologischen Ursprungs müssen auch diese Proben und Reagenzien entsprechend gehandhabt werden.10

4. Inkubationszeiten, Temperaturen oder Methoden, die hier nicht ausdrücklich beschrieben sind, können die Ergebnisse beeinträchtigen. 5. Die Reagenzien wurden optimal verdünnt. Weitere Verdünnung kann zu einer geringeren Antigenfärbung führen. 6. Primäre Antikörper oder negative Kontrollreagenzien nicht durch primäre Antikörper oder negative Kontrollreagenzien aus anderen

Chargen (Chargennummern befinden sich auf den Etiketten der Fläschchen) oder durch Reagenzien anderer Hersteller ersetzen. 7. Als Hauptregel ist die Arbeit mit diesem Produkt Personen unter 18 Jahren untersagt. Der Benutzer ist in der Ausführung der Arbeit den

gefährlichen Eigenschaften dieses Produktes sowie den notwendigen Sicherheitsmaßnahmen gründlich zu unterweisen. Weitere Informationen entnehmen Sie dem Sicherheitsdatenblatt (SDB).

8. Entsprechende Schutzkleidung tragen, um Augen- und Hautkontakt zu vermeiden.10

9. Nicht verwendete Lösung ist entsprechend örtlichen, bundesstaatlichen und staatlichen Richtlinien zu entsorgen. 10. Auf Anfrage ist für Fachpersonal ein Sicherheitsdatenblatt erhältlich.

Gefahr ER/PR pharmDx™ Peroxidase-Blocking Reagent: < 0.1% 3(2H)-Isothiazolone, 5-chloro-2-methyl-, mixt. with 2-methyl-3(2H)- isothiazolone H314 Verursacht schwere Verätzungen der Haut und schwere Augenschäden. H317 Kann allergische Hautreaktionen verursachen. P280 Schutzhandschuhe tragen. Augenschutz oder Gesichtsschutz tragen. Schutzkleidung tragen. P261 Einatmen von Dampf vermeiden.

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P264 Nach Gebrauch Hände gründlich waschen. P272 Kontaminierte Arbeitskleidung nicht außerhalb des Arbeitsplatzes tragen. P304 + P340 + P310

BEI EINATMEN: Bei Atembeschwerden die betroffene Person an die frische Luft bringen und in einer Position ruhigstellen, in der sie leicht atmet. Sofort GIFTINFORMATIONSZENTRUM oder Arzt anrufen.

P301 + P310 + P330 + P331

BEI VERSCHLUCKEN: Sofort GIFTINFORMATIONSZENTRUM oder Arzt anrufen. Mund ausspülen. KEIN Erbrechen herbeiführen.

P303 + P361 + P353 + P363 + P310

BEI BERÜHRUNG MIT DER HAUT (oder dem Haar): Alle kontaminierten Kleidungsstücke sofort ausziehen. Haut mit Wasser abwaschen oder duschen. Kontaminierte Kleidung vor erneutem Tragen waschen. Sofort GIFTINFORMATIONSZENTRUM oder Arzt anrufen.

P302 + P352 BEI BERÜHRUNG MIT DER HAUT: Mit viel Wasser/…/waschen. P333 + P313 Bei Hautreizung oder -ausschlag: Ärztliche Hilfe hinzuziehen. P305 + P351 + P338 + P310

BEI BERÜHRUNG MIT DEN AUGEN: Einige Minuten lang behutsam mit Wasser ausspülen. Eventuell Vorhandene Kontaktlinsen nach Möglichkeit entfernen. Weiter ausspülen. Sofort GIFTINFORMATIONSZENTRUM oder Arzt anrufen.

P405 Unter Verschluss aufbewahren. P501 Inhalt und Behälter gemäß lokalen, regionalen, nationalen und internationalen Vorschriften der Entsorgung zuführen.

Gefahr DAB+ Chromogen: 1-5% biphenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammonium tetrachloride H350 Kann Krebs erzeugen. H341 Kann vermutlich genetische Defekte verursachen. P201 Vor Gebrauch besondere Anweisungen einholen. P202 Vor Gebrauch alle Sicherheitshinweise lesen und verstehen. P281 Vorgeschriebene persönliche Schutzausrüstung verwenden. P308 + P313 BEI Exposition oder falls betroffen Ärztliche Hilfe anfordern. P405 Unter Verschluss aufbewahren. P501 Inhalt und Behälter gemäß lokalen, regionalen, nationalen und internationalen Vorschriften der Entsorgung zuführen.

Achtung Wash Buffer (10X): 5-10% Natriumchlorid, 5-10% 2-Amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol hydrochloride H319 Verursacht schwere Augenreizung. P280 Augen- oder Gesichtsschutz tragen. P264 Nach Gebrauch Hände gründlich waschen. P305 + P351 + P338

BEI KONTAKT MIT DEN AUGEN: Einige Minuten lang behutsam mit Wasser spülen. Vorhandene Kontaktlinsen nach Möglichkeit entfernen. Weiter spülen.

P337 + P313 Bei anhaltender Augenreizung: Ärztliche Hilfe hinzuziehen. Lagerung ER/PR pharmDx bei 2–8 °C aufbewahren. Kontrollobjektträger müssen ebenfalls bei 2–8 °C aufbewahrt werden. Nach Ablauf des auf der Verpackung aufgedruckten Verfalldatums nicht mehr verwenden. Es gibt keine sichtbaren Anzeichen für eine Instabilität dieses Produkts, deshalb sollten Positiv- und Negativkontrollen gleichzeitig mit den Patientenproben mitlaufen. Werden die Reagenzien anders als entsprechend den in der Packungsbeilage angegebenen Bedingungen aufbewahrt, muss deren Verwendung vom Benutzer validiert werden.11 Vorbereitung der Probe Mit Gewebeproben muss so umgegangen werden, dass sich das Gewebe noch für die IHC-Färbung eignet. Bei allen Proben müssen Standardverfahren der Gewebeverarbeitung eingesetzt werden.12

Paraffineingebettete Schnitte Formalinfixierte und paraffineingebettete Gewebe eignen sich zur Verwendung. Gewebeproben sollten auf eine Dicke von 3 oder 4 mm gebracht und 18–24 Stunden lang fixiert werden. Die Gewebe werden dann in einer Alkoholreihe und Xylol dehydriert und anschließend mit geschmolzenem Paraffin infiltriert. Die Temperatur des Paraffins darf 60 °C nicht überschreiten. Korrekt fixierte und eingebettete Gewebeblöcke, die das ER- bzw. PR-Protein exprimieren, sind vor der Anfertigung der Schnitte und deren Auftragen auf Objektträger unbegrenzt haltbar, wenn sie an einem kühlen Ort (15–25 °C) aufbewahrt werden.12,13

Die Gewebe-Paraffinblöcke sollten in Schnitte von 3–5 µm Stärke geschnitten werden. Die Gewebeschnitte werden auf SuperFrost Plus, Dako Silanized Slides (Code-Nr. S3003) oder elektrostatisch geladenen Objektträgern fixiert und in Trockenständer gesetzt. Die Trockenständer werden auf einem saugfähigen Handtuch fest abgeklopft, um unter dem Paraffin eingeschlossenes oder am Glas haftendes Restwasser zu entfernen, und anschließend eine Stunde bei Raumtemperatur getrocknet. Der Ständer mit den Objektträgern wird dann eine Stunde in einen 56–60 °C warmen Inkubator gesetzt. Nach der Entnahme aus dem Inkubator müssen die Objektträger solange bei Raumtemperatur aufbewahrt werden, bis sie vollständig abgekühlt sind und das Paraffin hart geworden ist. Zur Erhaltung der Antigenität sollten auf Objektträger aufgebrachte Gewebeschnitte innerhalb von zwei Monaten nach Anfertigung der Schnitte gefärbt werden, wenn sie bei Raumtemperatur (20–25 °C) aufbewahrt werden. Weitere Angaben zur Vorbereitung der Proben bitte dem Dako Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods14 oder den Literaturangaben 15 und 16 entnehmen. Auf entkalkten Geweben wurde dieser Test noch nicht validiert und wird deshalb nicht empfohlen.

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Die für die ER-/PR-Auswertung und die Verifizierung der Tumorpräsenz notwendigen Objektträger sollten zur gleichen Zeit präpariert werden. Es sind mindestens 4 Objektträger erforderlich. Ein Objektträger für die Tumorpräsenz, je 1 Objektträger für die Auswertung auf ER- bzw. PR-Protein und 1 Objektträger für das Negativkontrollreagenz. Vorbereitung der Reagenzien Folgende Reagenzien müssen vor der Färbung vorbereitet werden: Epitope Retrieval Solution Für das Färbeverfahren durch 1:10-Verdünnung von Epitope Retrieval Solution (10x) mit destilliertem oder entionisiertem Wasser von Reagenzqualität eine ausreichende Menge Epitope Retrieval Solution herstellen. Unverbrauchte verdünnte Lösung kann bei Raumtemperatur eine Woche oder bei 2–8 °C einen Monat aufbewahrt werden. Die Epitope Retrieval Solution nach Gebrauch verwerfen. Wash Buffer Für die Waschschritte eine ausreichende Menge Waschpuffer durch 1:10-Verdünnung von Wash Buffer (10x) mit destilliertem oder entionisiertem Wasser (Wasser von Reagenzqualität) herstellen. Unverbrauchter verdünnter Puffer kann bei Raumtemperatur eine Woche oder bei 2–8 °C einen Monat aufbewahrt werden. Getrübten Puffer entsorgen. DAB+ Substrat-Chromogenlösung Zum Ansetzen der DAB+ Substrat-Chromogenlösung in den befüllbaren Flaschen jeweils 1 Tropfen DAB+ Chromogen pro 1 ml DAB+ Substrate Buffer zugeben und mischen. Die DAB+ Substrat-Chromogenlösung ist bei Aufbewahrung bei 2–8 °C etwa fünf Tage haltbar. Die Lösung vor Gebrauch gründlich mischen. Die Qualität der Färbung wird durch ein in der Lösung auftretendes Präzipitat nicht beeinträchtigt. HINWEIS: Die Farbe von DAB+ Chromogen kann in der Flasche von klar bis leicht lavendel-braun variieren. Dies hat keinen Einfluss auf die Leistung dieses Produkts. Entsprechend den obigen Richtlinien verdünnen. Zugabe von zuviel DAB+ Chromogen zu DAB+ Substrate Buffer führt zu einer Abschwächung des positiven Signals. Die befüllbare Flasche mit der angesetzten DAB+ Substrat-Chromogenlösung muss vor dem Gebrauch in der Dako Automated Link Platform festgelegt werden. Weitere Informationen bitte dem entsprechenden Benutzerhandbuch für Dako Automated Link Platform entnehmen. Färbeverfahren Hinweise Der Benutzer sollte diese Anweisungen aufmerksam durchlesen und sich vor Gebrauch mit allen Komponenten und dem Gerät vertraut machen (siehe Abschnitt „Vorsichtsmaßnahmen“). Vor Beginn der Immunfärbung alle Reagenzien auf Raumtemperatur (20–25 °C) bringen. Alle Inkubationen sollten ebenfalls bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Gewebeschnitte dürfen während der Färbung nicht austrocknen. Trockene Gewebeschnitte können unspezifische Färbungen aufweisen. Die erforderlichen Schritte und Inkubationszeiten sind in der Dako Link Software vorprogrammiert. Anweisungen zur Programmierung bzw. zur Beladung mit Objektträgern und Reagenzien bitte dem entsprechenden Benutzerhandbuch für die Dako Automated Link Platform entnehmen. Entparaffinierung und Rehydrierung Zur Entfernung des Einbettungsmittels müssen die Gewebeschnitte vor der Färbung entparaffiniert und anschließend rehydriert werden. Eine unvollständige Entfernung von Paraffin ist zu vermeiden. Überreste des Einbettungsmittels können eine unspezifische Färbung zur Folge haben. Dieses Verfahren bei Raumtemperatur (20–25 °C) durchführen. SCHRITT 1. Die Objektträger in ein Xylolbad stellen und 5 (±1) Minuten inkubieren. Den Vorgang in einem frischen Bad wiederholen. SCHRITT 2. Überschüssige Flüssigkeit durch Abklopfen entfernen und die Objektträger 3 (±1) Minuten in absolutes Ethanol eintauchen.

Den Vorgang in einem frischen Bad wiederholen. SCHRITT 3. Überschüssige Flüssigkeit durch Abklopfen entfernen und die Objektträger 3 (±1) Minuten in 95 %iges Ethanol eintauchen.

Den Vorgang in einem frischen Bad wiederholen. SCHRITT 4. Überschüssige Flüssigkeit durch Abklopfen entfernen und Objektträger mindestens 30 Sekunden in Wasser von Reagenzqualität

eintauchen. Das Färbeverfahren mit der Epitopdemaskierung beginnen. Xylol und Alkohollösungen wöchentlich oder spätestens nach 200 Objektträgern auswechseln. Anstelle von Xylol können Toluol oder ein Xylolersatz wie Histoclear™ verwendet werden. Epitopdemaskierung Dampfdrucktopf (bevorzugt: 5 Minuten bei 125 °C, Abkühlung auf 90 °C; alternativ: 10 Minuten bei 121 °C, Abkühlung auf 85 °C) Bei der Epitopdemaskierung ist ein gleichmäßiges Vorgehen äußerst wichtig, um die Reproduzierbarkeit der Färbeergebnisse zu gewährleisten. Der Dampfdrucktopf muss korrekt kalibriert und in der Lage sein, 125 °C (oder 121 °C) zu erreichen und aufrecht zu halten, und bei jeder Verwendung des Dampfdrucktopfs muss dieselbe Menge Flüssigkeit (Epitope Retrieval Solution und Wasser in der Dampfdrucktopfschale) eingefüllt und dieselbe Anzahl Objektträger eingelegt werden. Das folgende Verfahren ist optimal: SCHRITT 1. Für jeden Durchlauf dieselbe Menge Wasser von Reagenzqualität in die Dampfdrucktopfschale einfüllen (500 ml oder gemäß

Herstellerempfehlung). SCHRITT 2. Zwei hitzebeständige Kunststoff-Färbebehälter, die ein Gestell mit 24 Objektträgern aufnehmen können, mit je 250 ml

zubereiteter Epitope Retrieval Solution füllen (siehe „Reagenzvorbereitung“).

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SCHRITT 3. Entparaffinierte, auf Raumtemperatur gebrachte Gewebeschnitte in die Epitope Retrieval Solution in den Färbeschalen eintauchen. HINWEIS: Zur Wahrung der Konsistenz müssen bei jedem Durchlauf 48 Objektträger in den Dampfdrucktopf eingelegt werden. Leere Objektträger einlegen, wenn weniger als 48 Proben verarbeitet werden; wenn weniger als 24 Proben verarbeitet werden, kann die zweite Schale mit 250 ml Wasser gefüllt werden, um Epitope Retrieval Solution zu sparen.

SCHRITT 4. Die beiden Färbeschalen in den Dampfdrucktopf einlegen und den Deckel fest aufsetzen. SCHRITT 5. Bevorzugtes Verfahren: Den Dampfdrucktopf auf 125 °C erhitzen und die Objektträger 5 Minuten bei 125 °C inkubieren.

Den Dampfdrucktopf auf 90 °C abkühlen lassen (etwa 30 Minuten), ohne den Druck abzulassen; erst dann öffnen. Alternatives Verfahren: Den Dampfdrucktopf auf 121 °C erhitzen und die Objektträger 10 Minuten bei 121 °C inkubieren.

Den Dampfdrucktopf auf 85 °C abkühlen lassen (etwa 30 Minuten), ohne den Druck abzulassen; erst dann öffnen. SCHRITT 6. Vor Öffnen des Dampfdrucktopfs überprüfen, ob der Druck zurückgegangen ist. Färbeschalen entnehmen, Epitope Retrieval

Solution abgießen und Schnitte in Wash Buffer oder Wasser von Reagenzqualität spülen. SCHRITT 7. Die Schnitte nach der Epitopdemaskierung und vor dem Färben 5 (±1) Minuten in Wash Buffer eingetaucht lassen. HINWEIS: Die Epitope Retrieval Solution ist nur für den einmaligen Gebrauch bestimmt. Nicht wiederverwenden. Automated Link Platform Protokoll Nach der Epitopdemaskierung werden die Objektträger in Ständer eingesetzt und in die Dako Automated Link Platform gestellt. Das Gerät führt das Färbeverfahren durch, indem es die entsprechenden Reagenzien zusetzt und die Inkubationszeit und das Spülen der Objektträger zwischen den Reagenzien überwacht. Die Inkubationszeiten der Reagenzien sind in der Dako Link Software vorprogrammiert. Weitere Informationen bitte dem entsprechenden Benutzerhandbuch für Dako Automated Link Platform entnehmen. Gegenfärbung (Anweisungen für Hämatoxylin) Die Gegenfärbung mit Hämatoxylin kann auf der Automated Link Platform über das ER/PR pharmDx Protokoll, das diesen Arbeitsschritt einschließt, durchgeführt werden. Wahlweise kann die Gegenfärbung auch nach Entnahme der Objektträger aus der Automated Link Plattform manuell vorgenommen werden. Das gefärbte Endprodukt der Färbungsreaktion ist sowohl in Wasser als auch in Alkohol unlöslich. Es kann Hämatoxylin auf Alkohol- oder wässriger Basis, z.B. Hematoxylin for Automated Link Platforms (Code-Nr. SK308) verwendet werden. Keine regressive Gegenfärbung verwenden. HINWEIS: Eine starke Gegenfärbung kann eine schwache ER- bzw. PR-Expression verdecken. Anleitung für die manuelle Gegenfärbung mit Hämatoxylin: SCHRITT 1. Objektträger in ein Hämatoxylin-Bad eintauchen. Je nach Stärke des benutzten Hämatoxylins 1–5 Minuten inkubieren. SCHRITT 2. Vorsichtig in einem Bad mit Wasser von Reagenzqualität abspülen. Dabei müssen alle Hämatoxylinreste vollständig entfernt werden. Fixierung Empfohlen wird ein nichtwässriges Mittel zur permanenten Fixierung. Auch wässrige Fixiermittel wie Dako Faramount Mounting Medium, Ready-to-use (Code-Nr. S3025) oder Dako Glycergel Mounting Medium (Code-Nr. C0563) sind geeignet. Glycergel vor Gebrauch durch Erwärmen auf ungefähr 40 (± 5) °C verflüssigen. HINWEIS: Objektträger können zu einem beliebigen Zeitpunkt abgelesen werden. Wenn die Objektträger jedoch mit einem wässrigen Medium fixiert und hellem Licht ausgesetzt werden, kann die Farbe leicht verblassen. Objektträger im Dunkeln bei Raumtemperatur (20–25 °C) aufbewahren, um Verblassen zu vermeiden. Qualitätskontrolle Abweichungen von den empfohlenen Verfahren zur Fixierung, Verarbeitung und Einbettung der Gewebeschnitte im Labor des Benutzers können erhebliche Unterschiede bei den Ergebnissen zur Folge haben. Aus diesem Grund müssen zusätzlich zu den von Dako gelieferten Kontrollobjektträgern regelmäßig auch Kontrollen vor Ort durchgeführt werden. In den USA siehe Richtlinien zur Qualitätskontrolle, College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry. Für weitere Angaben siehe auch CLSI Quality Assurance for Immunocytochemistry Approved Guideline15 sowie die Literaturhinweise.16–19 ER/PR pharmDx Kontrollobjektträger (mitgeliefert) Jeder der mitgelieferten Kontrollobjektträger enthält zwei pelletierte, formalinfixierte, paraffineingebettete menschliche Zelllinien, von denen eine mit ER- und PR-Antikörpern zur einer Färbung führt, während es bei der anderen nicht zu einer Färbung kommt. Bei jedem Färbeverfahren müssen zwei Objektträger gefärbt werden, und zwar einer mit dem Anti-ER-Antikörper-Cocktail und der andere mit dem Anti-PR-Antikörper-Cocktail. Durch Auswertung der Zelllinien auf dem von Dako mitgelieferten Kontrollobjektträger wird der Färbedurchlauf validiert. Diese Zelllinien sollten nicht zur Auswertung der Patientenergebnisse verwendet werden. Positives Kontrollgewebe Als Kontrollen dienen frische, durch eine Biopsie oder einen operativen Eingriff gewonnene Proben, die so schnell wie möglich und auf die gleiche Weise fixiert, verarbeitet und eingebettet werden wie die Patientenprobe(n). Positive Kontrollgewebe deuten auf sachgemäß vorbereitete Gewebe und geeignete Färbetechniken hin. In jedem Färbedurchlauf sollte für jede Gruppe von Testbedingungen ein positives Kontrollgewebe mitgeführt werden. Als Kontrollgewebe, das sowohl ER- als auch PR-exprimierende Zellen enthält, wird Schleimhaut vom Gebärmutterhals empfohlen. Die für die positiven Gewebekontrollen verwendeten Gewebe sollten eine schwache, positive Färbung aufweisen, so dass leichte Veränderungen der Empfindlichkeit des primären Antikörpers deutlich werden. Die in diesem Kit mitgelieferten Kontrollobjektträger und Proben, die abweichend von der(n) Patientenprobe(n) verarbeitet werden, validieren nur die Leistung der Reagenzien, bestätigen jedoch nicht die Gewebepräparation. Bekannterweise positive Gewebe sollten nur zur Überprüfung der korrekten Funktionsweise von verarbeiteten Geweben und Testreagenzien verwendet werden, NICHT aber als Hilfsmittel bei der spezifischen Diagnose anhand von Patientenproben. Wenn die positiven Kontrollgewebe keine Färbung aufweisen, müssen die Ergebnisse der Testproben für ungültig erklärt werden.

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Negative Kontrollgewebe Bei jedem Färbedurchlauf eine negative Kontrollgewebeprobe (als negativ auf ER bzw. PR bekannt) einsetzen, die in ähnlicher Weise wie die Patientenprobe fixiert, verarbeitet und eingebettet wurde, um die Spezifität des primären Antikörpers zu verifizieren und Hinweise auf eine Kreuzreaktivität mit Zellen und Zellkomponenten zu erhalten. Aufgrund der in den meisten Gewebeschnitten anzutreffenden Vielzahl verschiedener Zelltypen existieren interne negative Kontrollstellen (dieses ist vom Benutzer zu verifizieren). Falls das negative Kontrollgewebe Färbungen aufweist, sind die Ergebnisse der Patientenproben ungültig und der Test muss wiederholt werden. Unspezifisches negatives Kontrollreagenz Zur Beurteilung unspezifischer Färbungen und im Hinblick auf eine bessere Interpretation der spezifischen Färbung an der Antigenstelle sollte bei einem Teil jeder Patientenprobe das mitgelieferte negative Kontrollreagenz anstelle des primären Antikörpers benutzt werden. Die Inkubationszeit für das negative Kontrollreagenz sollte mit der für den primären Antikörper übereinstimmen. Assayverifikation Da dieses Produkt von der FDA geprüft wurde, sind in den Labors vor dem erstmaligen Gebrauch zur Gewährleistung einheitlicher Ergebnisse nur noch Versuche zur Reproduzierbarkeit mit einer Reihe vorhandener, bekanntermaßen positiver und negativer Gewebe mit bekannten IHC-Leistungscharakteristika erforderlich. Siehe die zuvor in diesem Abschnitt der Packungsbeilage dargestellten Qualitätskontrollmaßnahmen und die Qualitätskontrollanforderungen in „CAP Certification Program for Immunohistochemistry“ und/oder „CLSI Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline“.15 Diese Maßnahmen sind für jede neue Antikörpercharge bzw. immer dann zu wiederholen, wenn die Assayparameter verändert werden. Zur Testverifikation eignen sich Karzinome, deren Färbungsintensität mit ER- bzw. PR-Protein bekannt ist, sowie negative Gewebe. Tabelle 1: Zweck der täglichen Qualitätskontrolle

Probe Spezifischer Antikörper & spezifisches Detektionssystem

Negatives Kontrollreagenz (Unspezifischer Antikörper: Maus IgG1 / IgG2a) und Detektionssystem

ER/PR pharmDx Kontrollobjektträger, von Dako mitgeliefert.

Kontrolliert nur den Färbevorgang. Durch Auswertung der Zelllinien auf dem von Dako mitgelieferten Kontrollobjektträger wird der Färbedurchlauf validiert.

Positivkontrolle (wie Patientenprobe fixiert und verarbeitet): Gewebe oder Zellen mit nachzuweisendem Zielantigen (kann sich im Patientengewebe befinden). Als ideal gilt eine Kontrolle aus schwach positiv färbendem Gewebe, das gegenüber einem Antikörper- oder Antigenabbau sehr empfindlich ist.

Kontrolliert alle Analyseschritte. Validiert Reagenz und Verfahrensweisen für die ER-/PR-Färbung.

Nachweis unspezifischer Hintergrundfärbung.

Negativkontrolle (wie Patientenprobe fixiert und verarbeitet): Vermutlich negative Gewebe oder Zellen (können sich im Patientengewebe oder im Gewebe der positiven Kontrollprobe befinden).

Nachweis unbeabsichtigter Antikörper-Kreuzreaktivität mit Zellen und Zellbestandteilen.

Nachweis unspezifischer Hintergrundfärbung.

Patientengewebe. Nachweis spezifischer Färbung. Nachweis unspezifischer Hintergrundfärbung.

Auswertung der Färbung Die Auswertung von Objektträgern muss von einem Pathologen mithilfe eines Lichtmikroskops vorgenommen werden. Alle Untersuchungen müssen innerhalb der Tumorregion der Probe durchgeführt werden. Zur Auswertung der immunhistochemischen Färbung und Bestimmung der Färbungsintensität ist ein Objektiv mit 10facher oder 20facher Vergrößerung ausreichend. Zur Auswertung der Ergebnisse müssen intakte Zellen verwendet werden, da nekrotische oder degenerierte Zellen oft eine unspezifische Färbung aufweisen.15 ER/PR pharmDx färbt Zellkerne bei Verwendung von Anti-ER und Anti-PR. Das Immunfärbungsmuster beim Mammakarzinom ist in der Regel heterogen. Die Bewertung erfolgt anhand der Untersuchung aller Tumorzellen auf dem Objektträger. Es wird ein Proportionswert (proportion score, PS) zugewiesen, die den geschätzten Anteil der Zellen mit positiver Färbung anzeigt (siehe Abbildung 1). Außerdem wird ein Intensitätswert (intensity score, IS) zugewiesen, welcher die DURCHSCHNITTLICHE Färbungsintensität der positiven Zellen angibt. Aus der Summe von PS und IS wird ein Gesamtwert (Total Score, TS) errechnet, der bei 0 bzw. zwischen 2 und 8 liegen kann. Wie in zahlreichen, großen klinischen Studien validiert, ist ein positives Ergebnis für ER und PR als TS ≥ 3 definiert.5-8 Jedes ER/PR pharmDx-Kit enthält positive und negative Zelllinien zur Validierung der Färbedurchläufe jedes Testdurchlaufs. Die entsprechenden Färbungen der Kontrollzelllinien zeigen an, dass der ER/PR pharmDx-Assay korrekt funktioniert. Falls die Intensität der Färbung der positiven Kontrollzelllinien zu schwach oder zu stark ist, können falsch-negative oder falsch-positive Ergebnisse erhalten werden und der Test muss wiederholt werden. Abbildungen zum Vergleich sind im ER/PR pharmDx™ Auswertungshandbuch zu finden. Zur Ermittlung der Eignung eines Färbedurchlaufs muss die Färbungsintensität der gefärbten Zelllinien auf den Kontroll-Objektträgern folgende Kriterien erfüllen:

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Tabelle 2: Akzeptanzkriterien für positive Kontrollzelllinien

ER-Kontroll- Zelllinienergebnis

PR-Kontroll- Zelllinienergebnis

Intensitätswert (anhand einer Skala zwischen 0 und 3)

2–3 2–3

Negative Kontroll-Zelllinien dürfen keinerlei nukleäre Färbung aufweisen. Abbildung 1: Allred Richtlinie zum Ergebnis mit ER/PR pharmDx

Die Richtlinien zum Ergebnis („Allred Score“) wurden mit freundlicher Genehmigung durch D.C. Allred, M.D, modifiziert und verwendet.6 Tabelle 3: Beschreibung der Werte

Proportionswert (PS)

(Anteil der Tumorzellen mit positiver nukleärer Färbung)

Beobachteter PS Intensitätswert (IS) (durchschnittliche Intensität aller positiven Tumorzellen)

Beobachteter IS

0 Keine 0 Keine 1 >0 bis 1/100 1 Schwach 2 >1/100 bis 1/10 2 Mittel 3 >1/10 bis 1/3 3 Stark 4 >1/3 bis 2/3 5 >2/3 bis 1

Tabelle 4: Richtlinie zum Ergebnis

Gesamtwert (IS) (Summe aus Proportionswert und Intensitätswert)

Auswertung

0, 2 Negativ ≥3 Positiv

Richtlinien zur detaillierten Auswertung von Färbungen bitte dem Dako ER/PR pharmDx™ Auswertungshandbuch entnehmen. Beschränkungen Allgemeine Beschränkungen 1. IHC ist ein diagnostisches Mehrfachschritt-Verfahren, das hinsichtlich der Auswahl der geeigneten Reagenzien, der Auswahl, Fixierung

und Verarbeitung von Geweben sowie der Vorbereitung des IHC-Objektträgers und der Auswertung der Färbungsergebnisse ein Spezialtraining erfordert.

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2. Die Färbeergebnisse eines Gewebes sind abhängig von sachgemäßer Behandlung und Aufbereitung des Gewebes vor dem Färben. Unsachgemäßes Fixieren, Einfrieren, Auftauen, Waschen, Trocknen, Erhitzen, Schneiden oder Verunreinigung durch andere Gewebe oder Flüssigkeiten kann zu Artefakten, Antikörper-Trapping oder falsch-negativen Ergebnissen führen. Widersprüchliche Ergebnisse können auf Unterschiede bei den Fixierungs- und Einbettungsmethoden oder auf Unregelmäßigkeiten innerhalb des Gewebes zurückzuführen sein.

3. Zu starke oder unvollständige Gegenfärbung kann die sachgemäße Auswertung der Ergebnisse beeinträchtigen. 4. Die klinische Auswertung vorhandener oder fehlender Färbungen sollte durch morphologische und histologische Untersuchungen

mit entsprechenden Kontrollen ergänzt werden. Auswertungen müssen von einer qualifizierten Person unter Berücksichtigung der Krankengeschichte und anderer Diagnostiktests des Patienten vorgenommen werden. Die Färbung muss in einem offiziell zugelassenen, lizenzierten Labor unter Aufsicht eines Pathologen erfolgen, dessen Aufgabe es ist, die gefärbten Objektträger zu überprüfen und die Eignung der positiven und negativen Kontrollen zu gewährleisten.

5. Gewebe von mit dem Hepatitis-B-Virus infizierten Personen und Gewebe mit Hepatitis-B-Virus-Oberflächenantigen (HBsAg) können mit Meerrettichperoxidase eine unspezifische Färbung aufweisen.20

6. Reagenzien können in zuvor nicht getesteten Gewebetypen unerwartete Reaktionen zeigen. Selbst in getesteten Gewebegruppen kann aufgrund von biologischen Unterschieden bei der Antigenexpression in Neoplasmen oder anderen pathologischen Geweben die Möglichkeit unerwarteter Reaktionen nicht völlig ausgeschlossen werden.19 Bitte dokumentierte unerwartete Reaktionen dem technischen Kundendienst von Dako mitteilen.

7. Aufgrund der nicht-immunologischen Bindung von Proteinen oder Substrat-Reaktionsprodukten können falsch-positive Resultate auftreten. Sie können ebenfalls durch Pseudoperoxidaseaktivität (Erythrozyten) und endogene Peroxidaseaktivität (Zytochrom C) hervorgerufen werden.17

8. Die in diesem System enthaltenen Anweisungen und Reagenzien wurden für eine optimale Leistung konzipiert. Weitere Verdünnung der Reagenzien oder Abänderungen der Inkubationszeiten oder -temperaturen können zu fehlerhaften oder unstimmigen Ergebnissen führen.

Produktspezifische Beschränkungen 1. Falsch-negative Ergebnisse können die Folge eines mit der Zeit stattfindenden Antigenabbaus in den Geweben sein. Werden Proben

bei Raumtemperatur (20–25 °C) aufbewahrt, so sollten diese innerhalb von 2 Monaten nach dem Aufbringen der Schnitte auf Objektträger gefärbt werden.10

2. Zum Erzielen optimaler und reproduzierbarer Ergebnisse für die ER- bzw. PR-Proteine sind diese einer Epitopdemaskierung zu unterziehen, wenn die Gewebe routinemäßig (in neutralgepuffertem Formalin) fixiert und paraffineingebettet werden.

3. Keine Reagenzien aus anderen Chargen dieses Produkts oder aus Kits anderer Hersteller verwenden. Hiervon ausgenommen ist lediglich der Waschpuffer, anstelle dessen der Dako Wash Buffer, Code-Nr. S3006 genutzt werden kann.

4. Gefärbte Kontrollzelllinien sind nur zur Validierung des Färbedurchlaufs und nicht zur Auswertung der Färbereaktionin Gewebeschnitten heranzuziehen.

5. Die Anwendung von Dako ER/PR pharmDx auf nicht formalinfixierten Geweben ist nicht validiert. Leistungsdaten Spezifität Die Klone 1D5 und ER-2-123 wurden in BALB/c-Mäusen mit Hilfe eines rekombinanten Östrogenrezeptors (RER), einem Protein mit einem Molekulargewicht von 67 kD, erzeugt.21 Das Epitop-Mapping der beiden in diesem ER-Cocktail enthaltenen Antikörper zeigt eine Bindung an die Aminosäuresequenzen 15-23 in der N-terminalen Region für Klon ER-2-123 (Region A) und an die Aminosäure-Sequenzen 127-130 für Klon 1D5 (Region B). Klon PgR 1294 wurde gegen die formalinfixierte, rekombinante vollständige A-Form des Human-PR gezüchtet.22 In Western-Blots des gereinigten rekombinanten Rezeptors, in normaler Gebärmutterschleimhaut und Zelllysaten der Zelllinie T-47D, die bekanntermaßen hohe PR-Konzentrationen enthalten, erkennt der Antikörper speziell die A- bzw. B-Form des Rezeptors. Mit dem Androgenrezeptor, mit ER oder dem Glukokortikoid-Rezeptor trat keine Kreuzreaktivität auf. Epitop-Mapping-Studien haben nachgewiesen, dass sich der Antikörper an ein Epitop bindet, das sich zwischen aa 165 und 534 der N-terminalen Transaktivierungsdomäne befindet. 22 Konkordanzstudie An einer Gruppe von 20 Geweben wurde eine Pilotstudie zum Vergleich verschiedener Assay-Verfahren und Antikörper mit dem Allred-Verfahren durchgeführt. Das Testverfahren und die Antikörper, deren Testergebnisse dem Allred-Verfahren am nächsten kamen, wurden für weitere Tests ausgewählt.9

Die Gültigkeit des Testverfahrens sowie Auswahl und Verdünnung der Antikörper wurde an einer Gruppe von Proben getestet, die in Tissue-Arrays zusammengefasst wurden. Die Tests umfassten die Färbung und Auswertung von Proben mit dem Allred-Verfahren als Bezugsmethode im Vergleich zum ER/PR pharmDx Färbeverfahren bei Auswertung nach der Allred Bewertungsmethode. Die Verteilung der Färbungsergebnisse für die positive bzw. negative Bestimmung ist für ER bzw. PR in den Tabellen 5 und 6 angegeben. Die Konkordanz mit der Allred Methode hinsichtlich des positiven/negativen Befundes betrug für jeden Rezeptor 99 %.9

Tabelle 5: 2x2 Tabelle der Ergebnisse mit dem Dako ER-Test im Vergleich zum Ergebnis mit dem Allred ER-Test

ER-Testergebnis nach Allred

Positiv n

Negativ n

Gesamt n

Ergeb-nis

Dako ER-Test

Positiv n 158 0 158

Negativ n 2 52 54

Gesamt

n 160 52 212

Tabelle 6: 2x2 Tabelle der Ergebnisse mit dem Dako PR-Test im Vergleich zum Ergebnis mit dem Allred PR-Test

PR-Testergebnis nach Allred

Positiv n

Negativ n

Gesamt n

Ergeb-nis

Dako PR-Test

Positiv n 128 0 128

Negativ n 2 74 76

Gesamt n

130 74 204

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Positive Übereinstimmung = 158/160 = 0,9875

Negative Übereinstimmung = 52/52 = 1,0

Die Konkordanz betrug 210/212 = 0,9906 Die Kappa-Statistik wurde mit 0,9748 berechnet, mit einem VK von 95 % von 0,9402-1,0095.

Positive Übereinstimmung = 128/130 = 0,9846

Negative Übereinstimmung = 74/74 = 1,0

Die Konkordanz betrug 202/204 = 0,9902 Die Kappa-Statistik wurde mit 0,9789 berechnet, mit einem VK von 95 % von 0,9498-1,0080.

Reproduzierbarkeit Es wurden Versuche zur Reproduzierbarkeit innerhalb eines Färbedurchlaufs sowie in verschiedenen Durchläufen (verschiedene Laboranten an verschiedenen Tagen) durchgeführt. Bei allen Durchläufen blieb die Färbungsintensität für alle Gewebe innerhalb von 0,5 Intensitätsstufen. Immunreaktivität Tabelle 7 gibt einen Überblick über die ER/PR pharmDx-Immunreaktivität im empfohlenen Panel von gesunden Geweben. Alle Gewebe waren formalinfixiert und paraffineingebettet. Tabelle 7: Auswertung der Färbung von gesunden Geweben durch Dako ER/PR pharmDx Gewebetyp (Anz. getestet) Gefärbtes Gewebeelement

Färbungsintensität

Gewebetyp (Anz. getestet)

Färbungsintensität

ER PR Gefärbtes Gewebeelement ER PR

Nebenniere (3) Keine Keine Nebenschilddrüse (3) Keine Keine Knochenmark (3) Keine Keine Peripherer Nerv (3) Keine Keine Brust (3)

Duktale Epithelzellen

3,3,3

3,3,3 Hypophyse (3)

Pituizyten 0,1,3

1,2,3*

Gehirn/Zerebellum (3) Keine Keine Prostata (3) Stromazellen

1,1,2

0,2,2

Gehirn/Zerebrum (3) Keine Keine Speicheldrüse (3) Keine Keine Zervix (3)

Basalepithel Stromazellen

2,3,3 1,3,3

Keine 2,3,3

Skelettmuskel (3) Keine Keine

Darm (3) Keine Keine Haut (3) Keine Keine Speiseröhre (3) Keine Keine Dünndarm (3)

Muscularis propria Keine

0,0,2

Herz (3) Keine Keine Milz (3) Keine Keine Niere (3) Keine Keine Magen (3) Keine Keine Leber (3) Keine Keine Hoden (3) Keine Keine Lunge (3) Keine Keine Thymus (3) Keine Keine Mesothelzellen (3) Keine Keine Schilddrüse (3) Keine Keine Eierstock (3)

Oberflächenepithel Stromazellen

0,0,2 Keine

0,3,3 0,3,3

Mandeln (3) Keine Keine

Pankreas (3) Inselzellen*

Keine

1,3,3

Uterus (3) Endometriale Drüsen

Endometriales Stroma

Myometrium

2,3,3 2,2,3 2,3,3

3,3,3* 3,3,3 3,3,3

Die Intensität der Objektträger wurde nur auf einer Skala von 0 bis 3 ermittelt. Nukleäre Färbung *Nukleäre und zytoplasmatische Färbung

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Fehlerbehebung Problem Mögliche Ursache Empfohlene Maßnahme 1. Keine Färbung der Objektträger. 1a. Programmierfehler.

Reagenzien in falscher Reihenfolge verwendet.

1a. Anhand des Objektträger-Protokolls überprüfen, ob das korrekte Programm gewählt wurde.

1b. Natriumazid im Waschpufferbad.

1b. Nur den mitgelieferten Dako Wash Buffer (Code-Nr. S3006) verwenden.

2. Schwache Färbung der Objektträger oder der positiven Zelllinie auf dem Kontrollobjektträger.

2a. Unzureichende Inkubationszeiten der Reagenzien.

2a. Anhand des Objektträger-Protokolls überprüfen, ob korrekte Inkubationszeiten für die Reagenzien eingehalten wurden.

2b. Ungeeignete Fixiermethode angewendet.

2b. Nur zugelassene Fixiermittel und Fixiermethoden benutzen.

2c. Unzureichende Epitopdemaskierung.

2c. Überprüfen, ob das Wasserbad bzw. der Dampfdrucktopf korrekt funktionieren und die Epitopdemaskierung anweisungsgemäß ausgeführt wurde. (Zu niedrige Temperaturen bzw. falsche Zeiteinstellung verursachen schwache Färbung.)

2d. Keine Reaktion mit der DAB+ Substrat-Chromogenlösung.

2d. Überprüfen, ob die DAB+ Substrat-Chromogenlösung richtig angesetzt wurde.

2e. Abbau des Kontrollobjektträgers.

2e. Das auf dem Etikett aufgedruckte Verfalldatum des Kits sowie dessen Lagerungsbedingungen überprüfen.

3. Zu starke Hintergrundfärbung der Objektträger.

3a. Paraffin nicht vollständig entfernt.

3a. Frische Reinigungslösungen verwenden und die im Abschnitt Entparaffinierung and Rehydrierung beschriebenen Verfahren befolgen.

3b. Beim Aufbringen der Schnitte auf die Objektträger wurden Zusätze verwendet.

3b. Keinerlei Zusätze zur Haftung der Schnitte an der Glasoberfläche verwenden. Viele dieser Zusätze sind immunreaktiv.

3c. Objektträger nicht gründlich gespült.

3c. Anhand des Objektträger-Protokolls überprüfen, ob die Objektträger gründlich gespült wurden.

3d. Schnitte sind während der Färbung ausgetrocknet.

3d. Überprüfen, ob den Schnitten das korrekte Reagenzvolumen zugegeben wurde.

3e. Schnitte sind beim Beladen der Automated Link Platform ausgetrocknet.

3e. Objektträger müssen während des Beladens und direkt vor dem Start durch Pufferlösung feucht gehalten werden.

3f. Unspezifische Bindung der Reagenzien an Gewebeschnitte.

3f. Die Proben auf vorschriftsmäßige Fixierung und/oder Vorliegen von Nekrose überprüfen.

4. Gewebe lösen sich vom Objektträger ab.

4a. Verwendung ungeeigneter Objektträger.

4a. Silanisierte Objektträger wie Dako Silanized Slides (Code-Nr. S3003) oder elektrostatisch geladene Objektträger (Fisher SuperFrost Plus) verwenden.

5. Zu starke spezifische Färbung. 5a. Ungeeignete Fixiermethode angewendet.

5a. Nur zugelassene Fixiermittel und Fixiermethoden benutzen.

5b. Reagenzien zu lange inkubiert.

5b. Anhand des Objektträger-Protokolls überprüfen, ob korrekte Inkubationszeiten für die Reagenzien eingehalten wurden.

5c. Ungeeigneter Waschpuffer verwendet.

5c. Nur den mitgelieferten Dako Wash Buffer (Code-Nr. S3006) verwenden.

HINWEIS: Siehe Abschnitt Fehlerbehebung im Dako Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods,14 im Atlas of Immunohistology19 oder in Immunoperoxidase Techniques. A Practical Approach to Tumor Diagnosis.16 Bei ungewöhnlichen Färbeergebnissen bitte den Technischen Kundendienst von Dako verständigen. References Bibliographie Literaturhinweise 1. Elledge RM, Fuqua SAW. Estrogen and progesterone receptors. In: Harris, et al, editors. Diseases of the Breast. Philadelphia:

Lippincott, Williams & Wilkins; 2000. p. 471-3 2. Fitzgibbons PL, Page DL, Weaver D, Thor AD, Allred DC, Clark GM, et al. Prognostic factors in breast cancer. College of American

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estrogen receptor status alone for adjuvant endocrine therapy in two large breast cancer databases. J Clin Oncol. 2003;21:1973-9 4. Rhodes A, Jasani B, Balaton AJ, Miller KD. Immunohistochemical demonstration of oestrogen and progesterone receptors: correlation

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11. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, 57 FR7163, February 28, 1992 12. Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: Mosby; 1980 13. Kiernan JA. Histological and histochemical methods: Theory and practice. New York: Pergamon Press; 1981 14. Key M (ed). Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods. Fourth Edition. Dako 2006 15. Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Quality assurance for immunocytochemistry; Approved guideline. CLSI

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Edition/ Édition/ Auflage 12/18