dakar orstom/cnrs/university nitrogen fixation...
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4' REPUBLIOUE FRANçAISE - OFFICE DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
ET TECHNIOUE OUTRE-MER CENTRE ORSTOM DE DAKAR
Boîte Postale No 1386 DAKAR (RBpuMlque du SBnBgal)
T616phone : 21.34.80 et 22.34.76
-
. -
D e c e m b e r I 9 8 3
D A K A R O R S ' i ' O M / C N R S / U N I V E R S I T Y N I T R O G E N F I X A T I O N G R O U P
A N N U A L R E P O R T FOR 1 9 8 3 i
v
b y Y . D O M M E R G U E S '
I
. c--- -
, I
I
Cote DIRWION GENERALE : 24. RUE BAYARD, 75008 PARIS * TELEPHONE : 123-3849
1 . STEM N O D U L A T E D -. LEGUMES - .
S i n c e t h e d i s c o v e r y o f s t em n o d C l a t i o n o f S e s b a n i a
‘ r o s t r a t a i n 1 9 7 9 , many l a b o r a t o r i e s t h r o u g h o u t t h e w o r l d h a v e
i n i t i a t e d i n v e s t i g a t i o n s o n s t e m n o d u l a t e d l e g u m e s b e c a u s e o f t h e i r
h i g h N 2 - f i x i n g p o t e n t i a l i n t h e f i e l d a n d b e c a u s e t h e y c o n s t i t u t e
u n i q u e e x p e r i m e n t a l m o d e l s f o r b a s i c r e s e a r c h b o t h o n R h i z o b i u m and
t h e h o s t p l a n t s .
1 . 1 . Gene ra l c h a r a c t e r i s t i c s o f s t e m - n o d u l a t e d l e g u m e s
B. D r e y f u s , D . A l a z a r d a n d E . Duhoux e s t a b l i s h e d t h a t a
c h a r a c t e r i s t i c o f s t em n o d u l a t e d l e g u m e s i s t o b e a r p r e d e t e r m i n e d
n o d u l a t i o n s i t e s . T h e s e s i t e s a l w a y s i n c l u d e a d o r m a n t r o o t
p r i m o r d i u m w h o s e b a s e i s i n f e c t e d by t h e r h i z o b i a . The s t r u c t u r e
o f t h e n o d u l a t i o n s i t e v a r i e s g r e a t l y b e t w e e n two e x t r e m e t y p e s ,
f o r m i n g a c o n t i n u u m b e t w e e n t h e m o s t e v o l v e d t y p e s ( S e s b a n i a
r o s t r a t a and Aeschynomene a f r a s p e r a ) a n d t h e l e a s t e v o l v e d o n e s
(Aeschynomene e l a p h r o x y l o n a n d N e p t u i i i a o l e r a c e a ) e
t
R h i z o b i a s p e c i f i c t o s t e m - n o d u l a t e d l e g u m e s d i f f e r i n
two r e s p e c t s f r o m o t h e r known r h i z o b i a : ( 1 ) t h e i r n i t r o g e n a s e
a p p e a r s t o b e w e l l p r o t e c t e d a g a i n s t O w h i c h c o u l d b e a n a d a p t a t i o n
t o t h e i r l o c a t i o n i n a p h o t o s y n t h e t i c n o d u l e , ( 2 ) t h e i r a b i l i t y t o
grow i n t h e f r e e - l i v i n g s t a t e a t t h e e x p e n s e o f N w h i c h may c o n f e r
upon t h e s e b a c t e r i a a s e l e c t i v e s a p r o p h y t i c a d v a n t a g e .
2 ’
2 ’
I n s t e m - n o d u l a t e d l e g u m e s o f t h e mos t e v o l v e d t y p e s u c h a s
S e s b a n i a r o s t r a t a a n d Aeschynomene s p . n o d u l a t i o n s i t e s a r e w e l l
a b o v e t h e s o i l a n d w a t e r l e v e l , w h i c h c i r c u m v e n t s t h e p r o b l e m s o f
c o m p e t i t i o n f r o m i n d i g e n o u s r h i z o b i a when t h e stems are i n o c u l a t e d .
B e s i d e s t h e s e c h a r a c t e r i s t i c s , s t e m - n o d u l a t e d l e g u m e s
h a v e t h e u n u s u a l c a p a b i l i t y o f a c t i v e l y f i x i n g N 2 e v e n i n t h e
p r e s e n c e o f h i g h r a t e s o f combined n i t r o g e n i n t h e s o i l , w h i c h
a l l o w s more n i t r o g e n t o b e a d d e d t o a n d l e s s r emoved f r o m t h e c r o p p i n g
s y s t e m s .
I n S e s b a n i a r o s t r a t a , two t y p e s o f s t r a i n s h a v e b e e n
i s o l a t e d : s t e m - n o d u l a t i n g s t r a i n s , c a l l e d s t e m s t r a i n s , c a p a b l e o f
n o d u l a t i n g b o t h stems a n d r o o t s , and r o o t - n o d u l a t i n g s t r a i n s , c a l l e d
r o o t s t r a i n s , w h i c h n o d u l a t e o n l y r o o t s , B o t h t y p e s a r e f a s t g r o w e r s .
. Th“is r o o t - s t e m s p e c i f i c i t y c o u l d b e r e s t r i c t e d t o S. r o s t r a t a , s i n c e i t h a s n o t b e e n o b s e r v e d i n o t h e r s t em n o d u l a t e d l e g u m e s up t o now
- ( B . D r e y f u s ) .
1.2.. I n v i t r o s t u d i e s o f r h i z o b i a f r o m s t e m - n o d u l a t e d l e g u m e s
1 . 2 . 1 . R h i z o b i o e h a g e s a n d p l a s m i d s o f Rh izob ium i s o l a t e d f r o m -------- -- ------- .................................. S e s b a n i a r o s t r a t a . ----------I------
1 P . d e L a j u d i e a n d D. Bogusz i s o l a t e d two r h i z o b i o p h a g e s KS
a n d RS2 f r o m O R S 5 7 1 , a t y p i c a l stem s t r a i n o f R h i z o b i u m f o r S e s b a n i a
r o s t r a t a . T h e h o s t r a n g e o f b o t h r h i z o b i o p h a g e s was shown t o b e
r e s t r i c t e d t o stem s t r a i n ORS571, a l l r o o t s t r a i n s b e i n g r e s i s t a n t .
P h a g e RS1 h a d a n h e x a g o n a l h e a d 63nm w i d e and a t a i l 87nm l o n g and
p h a g e R S 2 a n d h e x a g o n a l h e a d 60nm w i d e . T h e s e r h i z o b i o p h a g e s c o u l d
b e u s e d f o r t y p i n g R h i z o b i u m s t r a i n s o r i s o l a t i n g .Nod- R h i z o b i u m
m u t a n t s on t h e b a s i s o f b a c t e r i o p h a g e r e s i s t a n c e .
P r e l i m i n a r y s t u d i e s showed t h a t t h e t y p i c a l stem s t r a i n
ORS571 c o n t a i n e d a 5 . 6 Mdal p l a s m i d a n d t h a t a r o o t s t r a i n o f
S e s b a n i a r o s t r a t a c o n t a i n e d a l a r g e r p l a s m i d (100 M d a l ) .
1 . 2 . 2 . G e n e t i c s o f ORS571 ( t y p i c a l s t e m s t r a i n of S e s b a n i a ..................... ............................ r o s t r a t a ) . -------- . .
I W i th t h e o b j e c t i v e o f l o c a l i z i n g t h e g e n e s o f t h e s y m b i o s i . s ,
a c o l l a b o r a t i o n h a s b e e n r e c e n t l y b s t a b l i s h e d b e t w e e n o u r l a b and
P r . M . Van M o n t a g u ' s g r o u p i n G e n t . By u s i n g t r a n s p o s o n m u t a g e n e s i s ,
2000 m u t a n t s o f ORS571 h a v e b e e n o b t a i n e d . The s c r e e n i n g o f t h e s e
m u t a n t s i s u n d e r way s i m u l t a n e o u s l y i n Gent and D a k a r .
The n i f g e n e s o f ORS571 a r e s t u d i e d a t P r . J . P . A u b e r t ' s - . l a b o r a t o r y i n P a r i s .
O n l y r h i z o b i a f r o m t h e mos t e v o l v e d t y p e s o f stem n o d u l a t e d
l e g u m e s ( e . g . , k s c h y n o m e n e a f r a s , p e r a , - A . s e n s i t i v a , - A . s c h i m p e r i )
showed s i g n i f i c a n t n i t r o g e n a s e a c t i v i t y (200-300 n m o l e s C2H4h mg -1
ï - 1
p r o t e i n ). F u r t h e r m o r e t h e s e s t r a i n s were r e p o r t e d t o grow a t t h e
e x p e n s e o f N However t h e O t e n s i o n r e q u i r e d f o r N - f i x i n g g r o w t h 2 ' 2 2 was l o w e r f o r t h e s e s t r a i n s t h a n f o r ORS571. The p r o p e r t y t o grow
o n N 2 cou1.d I
t
b e a common f e a t u r e among s t e m - n o d u l a t i n g r h i z o b i a -
(D. A l a z a r d ; 13. D r e y f u s ) .
1 . 3 . E s t a b l i s h m e n t a n d f o n c t i o n n i n e o f t h e s v m b i o s i s
S t u d i e s o n t h e i n i t i a l s t a g e s i n t h e m o r p h o g e n e s i s o f t h e
@ * - f i x i n g s t e m n o d u l e s o f S e s b a n i a r o s t r a t a h a v e b e e n s i m u l t a n e o u s l y
c a r r i e d o u t i n t h r e e l a b o r a t o r i e s w o r k i n g i n c o l l a b o r a t i o n :
t h e ORSTOM L a b o r a t o r y i n D a k a r ( B . D r e y f u s ) , t h e D e p a r t m e n t o f
M i c r o b i o l o g y , U n i v e r s i t y o f M i n n e s o t a ( B . T s i e n a n d E . L . S c h m i d t ) ,
a n d t h e C y t o l o g y l a b o r a t o r y o f t h e U n i v e r s i t y o f D a k a r ( E . Duhoux) . ’
S i m i l a r i n v e s t i g a t i o n s a r e u n d e r way t o d e t e r m i n e t h e o n t o g e n e s i s
o f n o d u l e s o n s t em n o d u l a t e d l e g u m e s o t h e r t h a n S e s b a n i a r o s t r a t a ,
e s p e c i a l l y d i f f e r e n t s p e c i e s o f Aeschynomene(D. A l a z a r d ; E . Duhoux) .
1 . 3 . 2 . L e g h e m o g l o b i n -- ---- ------------------ a n d n o d u l i n s
U s i n g t h e chroma t o g r a p h i c p r o c e d u r e , D . B o g u s ~ f r a c t i o n a t e d
r o o t n o d u l e l e g h e m o g l o b i n i n t o t h r e e c o m p o n e n t s , and stem n o d u l e
l e g h e m o g l o b i n i n t o f o u r c o m p o n e n t s . One o f t h e c o m p o n e n t s was f o u n d
t o b e s p e c i f i c t o s t e m n o d u l e s , t h e o t h e r o n e s were common t o b o t h
r o o t a n d s tem n o d u l e s . R o o t a n d stem n o d u l e l e g h e m o g l o b i n s o f
S e s b a n i a r o s t r a t a b o u n d n i c o t i n a t e *as a l r e a d y r e p o r t e d f o r s o y b e a n
l e g h e m o g l o b i n . A n t i b o d y a g a i n s t s t e m n o d u l e l e g h e m o g l o b i n d i d n o t
c r o s s - r e a c t w i t h n o d u l e e x t r a c t f r o m s o y b e a n and a l f a l f a .
U s i n g t h e i m m u n o f e r r i t i n t e c h n i q u e D . Bogusz a n d E . Duhoux
f o u n d t h a t l e g h e m o g l o b i n was p r e s e n t o n l y i n t h e p l a n t c e l l l c y t o p l a s m
o f r o o t a n d s t em n o d u l e s of S e s b a n i a r o s t r a t a . However t h e p r e s e n c e
o f a v e r y l o w amount o f l e g h e m o g l o b i n i n s i d e t h e membrane e n v e l o p e
c a n n o t b e t o t a l l y e x c l u d e d .
--
F u r t h e r i n v e s t i g a t i o n s w i l l b e d e v o t e d t o t h e i d e n t i f i c a t i o n
a n d t h e s t u d y o f S e s b a n i a n o d u l i n s .
1.4. S t u d i e s on t h e h o s t p l a n t
The n o d u l a t i o n s i t e s o f - S. r o s t r a t a a r e f o r m e d c o n t i n u o u s l y
t h r o u g h o u t t h e g r o w t h o f t h e s t e m a n d r e m a i n s e n s i t i v e t o R h i z o b i u m
i n f e c t i o n d u r i n g t h e w h o l e l i f e o f t h e p l . a n t . l n t h e a b s e n c e o f
R h i z o b i u m i n f e c t i o n , t h e do rmancy ,of t h e r o o t p r i m o r d i a c a n b e b r o k e n b y i m m e r s i n g t h e stem i n w a t e r , w h i c h i n d u c e s a d v e n t i t i o u s r o o t s , o r
b y p l a c i n g a n i n t e r n o d a l s t e m c u t t i n g i n t o a n u t r i e n t medium (M . M .
B a r r e t o ) .
__ ..X --_. I-c _-----
4
I n t h e l a t t e r c a s e , t h e u p p e r p r i m o r d i u m o f t h e c u t t i n g d e v e l o p s
i n t o a s h o o t b u d , i n d i c a t i n g t h e t r i p l e p o t e n t i a l o f t h e n o d u l a t i o n
s i t e .
The g r o w t h of r o o t p r i m o r d i a was a l s o shown t o b e
i n f l u e n c e d b y d i f f e r e n t o r g a n s o f t h e p l a n t , e s p e c i a l l y r o o t s and
b u d s , b u t t h e mecanisms i n v o l v e d h a v e n o t y e t b e e n e l u c i d a t e d ,
E . Duhoux p l a n s t o i n i t i a t e t h e s t u d y o f t h e m o r p h o l o g y
and o r g a n o g e n e s i s o f t h e f l o w e r s o f S e s b a n i a r o s t r a t a and e l u c i d a t e
t h e p r o c e s s o f p o l l i n i s a t i o n and f e c o n d a t i o n . R e l a t e d r e s u l t s s h o u l d
f a c i l i t a t e t h e d e v e l o p m e n t o f me thods f o r s e x u a l h y b r i d i z a t i o n .
The u l t i m a t e o b j e c t i v e s o f t h e i n v e s t i g a t i o n s b a s e d o n
t h e u s e of t i s s u e c u l t u r e s a r e ( 1 ) t o o b f a i n an e x p e r i m e n t a l mode l
f a c i l i t a t i n g t h e a n a l y s i s o f t h e r e l a t i o n s b e t w e e n t h e h o s t p l a n t
and t h e e n d o p h y t e , ( 2 ) t o t r a n s f e r t h e n o d u l a t i n g a b i l i t y f r o m s t e m -
n o d u l a t i n g t o n o n - s t e m - n o d u l a t i n g p l y a n t s , ( 3 ) t o d e v i s e m e t h o d s
b r e a k i n g t h e dormancy o f r o o t p r i m o r d i a e x i s t i n g on t h e stem o f
some i m p o r t a n t l e g u m e s ( e . g . A s i a n c u l t i v a r s o f s o y b e a n ) .
I n a p r e l i m i n a r y p h a s e B. D r e y f u s o b t a i n e d c a l l u s e s
f r o m h y p o c o t y l s o f S. - - r o s t r a t a and s u c c e e d e d i n t h e i n d u c t i o n o f
c o m p l e t e p l a n t s f rom t h e c a l l u s e s (December 1 9 8 3 ) . The n e x t
o b j e c t i v e s a r e ( 1 ) t o r e g e n e r a t e p l a n t s f rom c a l l u s e s o r i g i n a t i n g
f r o m n o d u l e s , a t t e m p t i n g t o d e t e c t n o d u l i n e s o r n o d u l i n e - l i k e
s u b s t a n c e s i n t h e r e g e n e r a t e d p l a n t s , ( 2 ) t o i s o l a t e and c u l t i v a t e
p r o t o p l a s t s o f d i f f e r e n t s p e c i e s o f S e s b a n b ( o n l y - S. r o s t r a t a is
stem n o d u l a t i n g ) , t h u s p r e p a r i n g !he n e x t s t e p , i . e . t h e f u s i o n
o f a n o n - n o d u l a t i n g S e s b a n i a p r o t o p l a s t w i t h a - S. r o s t r a t a p r o t o p l a s t .
1 . 5 . T o l e r a n c e o f N - f i x i n g a c t i v i t y o f S e s b a n i a r o s t r a t a t o 2 - combined n i t r o g e n
The t h r e s h o l d o f t o l e r a n c e o f N 2 - f i x i n g a c t i v i t y o f I
i S e s b a n i a r o s t r a t a t o combined n i t r o g e n h a s n o t y e t b e e n a c c u r a t e l y
d e t e r m i n e d . However p r e l i m i n a r y e x p e r i m e n t s i n d i c a t e t h a t N 2 f i x a t i o n
(ARA) by r o o t n o d u l e s was i n h i b i t e d when N O NH c o n c e n t r a t i o n i n t h e 3 4 h y d r o p o n i c c u l t u r e was h i g h e r t h a n 0.5mM w h e r e a s s t e m n o d u l e s s t i l l e x h i b i t e d a s i g n i f i c a n t ARA when N O NH c o n c e n t r a t i o n w a s 1-3mM.
3 4
5
1 . 6 . F i e l d e x p e r i m e n t s (G. R i n a u d o )
1 . 6 . 1 . A m i c r o p l o t e x p e r i m e n t showed t h a t t h e e f f e c t o f S e s b a n i a
r o s t r a t a as g r e e n manure o n t h e r i c e y i e l a was a s marked i n s o i l s
. w i t h h i g h c l a y c o n t e n t as i n s a n d y s o i l s w h e r e t h e t r i a l s h a s b e e n
c o n d u c t e d up t o now. I n b o t h s o i l t y p e s t h e y i e l d was i n c r e a s e d
2 . 5 - f o I d .
1 . 6 . 2 . N f i x a t i o n was t h e h i g h e s t u n d e r t h e c l i m a t i c c o n d i t i o n s 2 p r e v a i l i n g i n A u g u s t a n d S e p t e m b e r i n D a k a r , w h i c h c o n f i r m s t h a t
h i g h t e m p e r a t u r e s ( c a . 3 0 ° C ) a r e t h e mos t f a v o r a b l e .
1 . 6 . 3 . The m e t h o d o l o g y o f t h e u s e o f S e s b a n i a r o s t r a t a a s
g r e e n manure i n p a d d y f i e l ' d s h a s b e e n p r o g r e s s i v e l y i m p r o v e d .
2. A C T I N O R H I Z A L SYMBIOSES ( m a i n l y C a s u a r i n a - F r a n k i a s y m b i o s i s )
T h e r e a r e two m a j o r r e a s o n s f o r s t u d y i n g t h e s e s y m b i o s e s :
a ) P l a n t s ( w h i c h a r e m o s t l y p e r e n n i a l o n e s ) a s s o c i a t e d Y
w i t h F r a n k i a c a n t h r i v e i n v e r y p o o r s o i l s , w h e r e t h e y g i v e h i g h
y i e l d o f b i o m a s s o r a c t i v e l y c o n t r i b u t e t o t h e improvemen t ' o f
t h e s e s o i l s t o t h e b e n e f i t o f a g r i c u l t u r e ( r o t a t i o n a l a g r i c u l t u r e )
o r a s s o c i a t e d n o n - f i x i n g t r e e s ( e . g . p i n e s , e u c a l y p t s ) .
b ) F r a n k i a s t r a i n s e x h i b i t a h i g h w a r i a b i l i t y s u g g e s t i n g
t h a t t h i s o r g a n i s m c o u l d b e m a n i p u l a t e d when t h e n e c e s s a r y g e n e t i c
t o o l s h a v e b e e n o b t a i n e d . F u r t h e r m o r e t h e f a c t t h a t e i g h t w i d e l y
d i f f e r e n t f a m i l i e s c a n b e a s s o c i a t e d w i t h F r a n k i a s u g g e s t s t h a t t h e
t r a n s f e r o f t h e n o d u l a t i n g a b i l i t y t o p l a n t s o t h e r t h a n t h e p r e s e n t l y
known a c t i n o r h i z a l s p e c i e s w o u l d b e v e r y w o r t h w h i l e .
2 . 1 . B i o l o g y o f F r a n k i a i n v i t r o
2.1.1. ZsO_la_t_ia_n_ H . G . Diem h a s d e v e l o p e d a n i s o l a t i o l n t e c h n i q u e f o r F r a n k i a
f r o m C a s u a r i n a , p r o b a b l y t h e mos t d i f f i c u l t e n d o p h y t e t o grow i n
c u l t u r e ( b e c a u s e o f t h e v e r y low number o f n o d u l a r s t r u c t u r e s a b l e
t o g i v e c o l o n i e s ) .
't 4
-
6
2 .1 .2 . N _ m e 4 a b o l ~ . m , o f _ F E a l ~ ~ ~ - ~ ~ - ~ ~ ~ ~ o A t t h e same t ime a s T jepkema e t a l , D . G a u t h i e r e s t a b l i s h e d
t h a t some s t r a i n s o f F r a n k i a a r e a b l e t o e x h i b i t a s i g n i f i c a n t
a c e t y l e n e r e d u c t i o n a c t i v i t y i n v i t r o a n d c a n grow w i t h N as t h e s o l e
n i t r o g e n s o u r c e . 2
U s i n g s t r a i n 0RS020602, D . G a u t h i e r showed t h a t t h e
b i o s y n t h e s i s o f n i t r o g e n a s e was maximum when PO i n t h e a t m o s p h e r e
a b o v e t h e c u l t u r e was lOkPa w h e r e a s t h e n i t r o g e n a s e a c t i v i t y was
a p p a r e n t l y n o t a f f e c t e d by O z t e n s i o n . The q u e s t i o n a r o s e as t o
w h e t h e r ammonium o r i g i n a t i n g f rom n i t r o g e n a s e a c t i v i t y was
a s s i m i l a t e d t h r o u g h t h e G S - G O G A T p a t h w a y i n F r a n k i a as i t i s i n
o t h e r n i t r o g e n - f i x i n g p r o k a r y o t s . A f i r s t a t t e m p t t o a n s w e r t h i s
q u e s t i o n was t o f o l l o w t h e d e r e p r e s s i o n o f n i t r o g e n a s e b i o s y n t h e s i s
i n F r a n k i a i n t h e p r e s e n c e o f ammonium w i t h o r w i t h o u t MSX ( m e t h i o n i n e
s u l f o x i m i n e ) , known t o i n h i b i t GS and G O G A T . When MSX was a d d e d ,
n i t r o g e n a s e c o u l d b e s y n t h e t i z e d e v e n i n t h e p r e s e n c e o f ammonium,
w h i c h s u p p o r t s t h e h y p o t h e s i s t h a t G S c o u l d p l a y a r o l e i n t h e
r e g u l a t i o n o f n i t r o g e n a s e b i o s y n t h e s i s i n F r a n k i a . P r e l i m i n a r y r e s u l t s
c o n f i r m e d t h e p r e s e n c e o f G S , ' C O G A T , a n d a l a n i n e d e h y d r o g e n a s e i n
F r a n k i a g r o w i n g i n n i t r o g e n - f r e e med4'Úm. N 2 f i x a t i o n o c c u r r e d o n l y
when v e s i c l e s w e r e p r e s e n t i n t h e c u l t u r e . I n some m e d i a v e s i c l e s
c o u l d a p p e a r w i t h o u t e x p r e s s i n g any n i t r o g e n a s e a c t i v i t y . S u c h a
s i t u a t i o n i s r e m i n i s c e n t o f t h a t o f p r e h e t e r o c y s t s o f c y a n o b a c t e r i a .
2
'
D i e m showed F r a n k i a f rom C a s u a r i n a e x h i b i t e d f o u r t y p e s
o f s t r u c t u r e s : h y p h a e , v e s i c l e s , t y p i c a l s p o r a n g i a and s p o r a n g i a -
l i k e s t r u c t u r e s ( S L S ) . SLS a p p e a r t o p l a y a m a j o r r o l e as
r e g e n e r a t i o n s t r u c t u r e s .
F u t u r e i n v e s t i g a t i o n s on t h e b i o l o g y o f F r a n k i a i n v i t r o
w i l l b e d e v e l o p e d i n t h r e e d i r e c t i o n s :
a - C o l l e c t i n g s t r a i n s o f F r a n k i a - f rom C a s u a r i n a c e a e .
E f f o r t s s h a l l b e made t o o b t a i n s t r a i n s c o m p a t i b l e
w i t h A l l o c a s u a r i n a and Gymnostoma s p e c i e s .
C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e s t r a i n s w i l l b e i n i t i a t e d i n
a a t t e m p t t o e s t a b l i s h a t a x o n o m i c c l a s s i f i c a t i o n o f
t h e C a s u a r i n a s t r a i n s i n r e l a t i o n t o t h e Rhamnale
c r o s s - i n o c u l a t i o n g r o u p .' b - I m p r o v i n g t h e c u l t u r e o f F r a n k i a b y s t i m u l a t i n g t h e
p r o d u c t i o n o f S L S . Me thods w i l l d e v i s e d t o p r e p a r e
new f o r m s o f F r a n k i a i n o c u l a n t s u i t a b l e f o r l o n g
c o n s e r v a t i o n , t r a n s p o r t a t i o n and l a r g e s c a l e u t i l i z a t i o n .
- The g e n e t i c s o f F r a n k i a i s i n i t s i n f a n c y . We s t r o n g l y
f e e l t h e n e c e s s i t y o f i n i t i a t i n g s t u d i e s i n t h a t
f i e l d w i t h t h e f o l l o w i n g o b l j e c t i v e s :
. o b t a i n i n g t h e r e q u i r e d g e n e t i c t o o l s ;
2 . 2 . F u n c t i o n n i n g o f
S t r a i n s o f
. a t t e m p t i n g t o l o c a t e t h e g e n e s r e s p o n s i b l e f o r
t h e s p e c i f i c i t y i n F r a n k i a s t r a i n s ;
. a t t e m p t i n g t o i m p r o v e t h e y i e l d o f S L S .
. T h i s p r o g r a m w i l l b e i n i t i a t e d a s s o o n a s a
t h e s y m b i o s i s
F r a n k i a f r o m C a s u a r i n a i s o l a t e d up t o now
g e n e t i c i s t j o i n s o u r g r o u p . S
t h e f , a i l u r e o f i n t r o d u c t i o n o f A l l o c a s u a r i n a o u t s i d e t h e i r n a t u r a l
d i s t r i b u t i o n a r e a .
By c o n t r a s t , F r a n k i a
t h a t w e h a v e r e c e n t l y s t u d i e d )
f r o m Rhamna les ( e s p e c i a l l y C o l l e t i a
a p p e a r t o b e l o n g t o a c o n t i n u u m
r a n g i n g f r o m n o n - i n f e c t i v e I) C a s u a r i n a .- s t r a i n s t o t y p i c a l Rhamnale
s t r a i n s .
*
2.3. R e s e a r c h on t h e , h o s t p l a n t ' . 1
The i n v e s t i g t i a n s a r e t o b e i n i t i a t e d a t t h e b e g i n n i n g I. o f 1984 i n two ma in d i e c t i o n s . P-
I
2 . 3 . 1 .
T h e r e i s a s t r o n g r e q u i r e m e n t f o r m a s t e r i n g t h i s t e c h n i q u e :
- t o o b t a i n i n d e n t i c a l i n d i v i d u a l s f o r n u r s e r y o r
f i e l d e x p e r i m e n t s ;
- t o m u l t i p l y t h e " p l u s " t r e e s s c r e e n e d f o r t h e i r
g r o w t h and n o d u l a t i o n a b i l i t y .
2.3.2. R e g e n e r a t i o n o f C a s u a r i n a f r o m c a l l u s e s -- - - - - - - - -- - -- ----I -- -- -- -- - - - - -- ̂ ^ -_ - The o b j e c t i v w i l l b e m a i n l y t o o b t a i n p l a n t s w h i c h a r e
r e s i s t a n t t o h i g h l e v e s o f s a l t a n d s t i l l f i x N a c t i v e l y . T h i s
work w i l l b e c a r r i e d o t a t t h e O R S T O M S t a t i o n a n d a t t h e U n i v e r s i t y o f 2
D a k a r ( E . Duhoux) .
2.4. A s s e s s m e n t o f N f i x a t i o n i n t h e f i e l d 2 I r o n i c a l l y , 90% ( o r m o r e ) o f p e o p l e w o r k i n g o n N f i x a t i o n 2
are n o t c o n c e r n e d w i t h t h e amount o f N t h a t i s a c t u a l l y f i x e d i n , * i ! 2
I2 i
* * G, 8
t h e f i e l d . A s a m a t t e r o f f a c t , m e a s u r i n g N 2 f i x a t i o n i n t h e f i e l d i s
a d i f f i c u l t v e n t u r e , Two t y p e s o f p r o b l e m s a r e e n c o u n t e r e d . The f i r s t
o n e s a r e r e l a t e d t o t h e m e t h o d o l o g y , t h e s e c o n d o n e s a r e s p e c i f i c t o
p e r e n n i a l p l a n t s ( l a r g e vo lume o f s o i l e x p l o r e d b y r o o t s ; r e c y c l i n g
o f e l e m e n t s t h r o u g h l i t t e r f a l l ) .
*
By c o m p a r i n g f o u r m e t h o d s o f a s s e s s m e n t ( t h e d i f f e r e n c e
m e t h o d , t h e u s u a l i s o t o p e d i l u t i o n t e c h n i q u e , t h e A v a l u e m e t h o d ,
t h e f r a c t i o n a t i o n m e t h o d ) , w e a r r i v e d a t t h e c o n c l u s i o n t h a t , i n
c o n d i t i o n s s i m u l a t i n g t h o s e p r e v a i l i n g i n t h e f i e l d ( m i c r o p l o t
s t u d i e s ) , t h e d i f f e r e n c e m e t h o d and t h e u s u a l i s o t o p e m e t h o d
o v e r e v a l u a t e d ( b y ca .30%) t h e a c t u a l N 2 f i x a t i o n i f t h e A v a l u e
m e t h o d was c o n s i d e r e d a s t h e r e f e r e n c e me thod . I f a n a l y s e s a r e
c a r e f u l l y p e r f o r m e d t h e f r a c t i o n a t i o n m e t h o d g i v e s d ’a t a t h a t a r e
p r o b a b l y s i m i l a r t o t h o s e o b t a i n e d w i t h t h e i s o t o p e d i l u t i o n m e t h o d s .
I n a f i e l d e x p e r i m e n t c a r r i e d o u t i n S e n e g a l i n 1982-15183
u s i n g a p u r e s t r a i n c u l t u r e ( O R S 0 2 1 0 0 1 ) as a n i n o c u l a n t w e f o u n d
t h a t f i x a t i o n e x p r e s s e d a s g N 2 t r e e
were 4 . 5 months o l d , b u t i t . w a s 2 . 3 1 +- 1 . 4 7 ( c o n f i d e n c e i n t e r v a l )
d u r i n g t h e i n t e r v a l o f t i m e b e t w e t n 4.5-11 m o n t h s , i n d i c a t i n g t h a t . N2 f i x a t i o n d r a m a t i c a l l y i n c r e a s e d w i t h p l a n t a g e .
t r e e s o c c u r r e d . T h e s e v a r i a t i o n s c a n b e a t t r i b u t e d n e i t h e r t o t h e
e n d o p h y t e ( t r e e s were i n o c u l a t e d w i t h a p u r e s t r a i n o f F r a n k i a and
c o n t a m i n a t i o n by e x t e r n a l s t r a i n s was u n l i k e l y ) n o r t o t h e s o i l
h e t e r o g e n e i t y ( t h e s o i l was c a r e f u l l y h o m o g e n i z e d b e f o r e f i l l i n g
t h e m i c r o p l o t s ) , The o b s e r v e d v a r i a t i o n s were p r o b a b l y r e l a t e d
t o t h e h o s t p l a n t g e n o t y p e . E x p l o i t i n g s u c h a v a r i a b i l i t y w o u l d
p r o b a b l y b e a f r u i t f u l a p p r o a c h t o i n c r e a s e N2 f i x a t i o n o f C a s u a r i n a
s t a n d s .
- 1 was n e g l i g i b l e t i l l t h e t r e e s
L a r g e v a r i a t i o n s i n t h e N - f i x i n g a c t i v i t y o f i n d i v i d u a l 2
F u t u r e f i e l d s t u d i e s w i l l b e d i r e c t e d :
3 . 1 . t o e s t a b l i s h i n g t h e t i m e c o u r s e o f N 2 f i x a t i o n f rom O
t o 3 y e a r o l d C a s u a r i n a , u s i n g t h e A v a l u e a n d t h e
d i f f e r e n c e me thod . T h i s s t u d y s h o u l d a l l o w t h e
c a l i b r a t i o n o f t h e d i f f e r e n c e m e t h o d , w h i c h i s a
n e c e s s i t y s i n c e 1 5 N s t u d i e s c a n n o t b e u s e d as a r o u t i n (
t e c h n i q u e i n l a r g e f i e l d s t u d i e s .
3 . 2 . t o e v a l u a t i n g t h e n e e d f o r d o u b l e i n o c u l a t i o n w i t h
-- F r a n k i a a n d m y c o r r h i z a l f u n g i ( e c t o - o r e n d o - ) .
L a r g e s c a l e e x p e r i m e n t s w i l l b e s e t up i n S e n e g a l
a n d E g y p t ( i n c o l l a b o r a t i o n w i t h t h e U. o f A l e x a n d r i a )
* ?
- F I X I N G LEGUMINOUS TREES (NFT) 3 * 52. -- T h i s p r o g r a m , c h a r a c t e r i z e d by i t s a p p l i e d c h a r a c t e r , w i l l
b e p a r t i a l l y s p o n s o r e d by t h e N a t i o n a l Academy o f S c i e n c e s (USA).
I t i s c a r r i e d o u t i n c o l l a b o r a t i o n w i t h ISRA/CNRF. 9
' P h a s e 1 . D e t e r m i n i n g s u i t a b l e NFT f o r r e f o r e s t a t i o n o f s a h e l i a n
a n d s o u d a n i a n a r e a s o f W e s t e r n A f r i c a . P r e l i m i n a r y s t u d i e s a r e
d i r e c t e d t o f i n d i n g o u t t h e m o s t a c t i v e l y N - f i x i n g s p e c i e s among
t h e f o l l o w i n g t r e e s w h i c h a r e a l r e a d y known t o h a v e a s a t i s f ' a c t o r y
g r o w t h r a t e :
P r o s o p i s j u l i f l o r a , E r y t r o p h l a e u m g u i n e e n s e , P r o s o p i s a f r i c , a n a
A c a c i a h o l o s e r i c e a , A l b i z i a f e r r u g i n e a , C o r d y l a p i n n a t a , P a r k i a
b i g l o b o s a , D a n i e l l a o g e a .
F o r e a c h o f t h e l i s t e d s p e c i e s , t h e i n v e s t i g a t i o n s w i l l b e as f o l l o w s :
- c o l l e c t i o n o f R h i z o b i u m s t r a i n s a n d e v a l u a t i o n of t h e i r e f f e c t i v i t y ;
- s t u d y o f t h e ' h o s t s p e c t r u m o f t h e s t r a i n s ;
- n u r s e r y e x p e r i m e n t s f o r a s s e s s i n g t h e N - f i x i n g p o t e n t i a l a n d
2
-
2 t h e n e e d f o r i n o c u l a t i o n w i t h Rh izob ium and e n d o m y c o r r h i z a l f u n g i .
P h a s e 2 . F o r t h e mos t p r o m i s i n g s p e c i e s , e v a l u a t i o n o f t h e g r o w t h
a n d d e v e l o p m e n t c h a r a c t e r i s t i c s , p a r x i c u l a r l y a s s e s s m e n t o f t h e
N 2 - f i x i n g c a p a b i l i t i e s .
Up t o now t h e m a i n e f f o r t was d i r e c t e d t o s t u d y i n g A c a c i a
h o l o s e r i c e a w h i c h seems t o b e a p r o m i s c u o u s h o s t , b u t an a c t i v e N - f i x i n g s p e c i e s ( p r e c i s e d a t a w i l l b e a v a i l a b l e when t h e 15 N a n a l y s i s
u n d e r way a r e c o m p l e t e d ) . B e c a u s e o f i t s marked s e n s i t i v i t y t o P ,
A c a c i a h o l o s e r i c e a r e s p o n d s t o m y c o r r h i z a l i n f e c t i o n (G. m o s s e a e )
o n l y i n v e r y P d e f i c i e n t s o i l s . Thus P f e r t i l i z a t i o n combined w i t h
m y c o r r h i z a l i n o c u l a t i o n may d e p r e s s t h e g r o w t h o f A c a c i a h o l o s e r i c e a .
F i e l d e x p e r i m e n t s showed a s a t i s f a c t o r y b u t t r a n s i e n t r e s p o n s e t o
R h i z o b i u m i n o c u l a t i o n . I n o c u l a t i o n w i t h Glomus m o s s e a e d i d n o t a f f e c t
t h e g r o w t h , h o w e v e r i t r e s u l t e d i n t h e improvemen t o f t h e s t a n d
h o m o g e n e i t y and i n c r e a s e d t h e s u r v i v a l o f t r a n s p l a n t e d t r e e s .
t
2
-
- f i x a t i o n b y A c a c i a c y a n o p h y l l a K2 _II
T h i s A c a c i a p l a y s an i m p o r t a n t r o l e i n N o r t h e r n A f r i c a , -- w h e r e i t i s u s e d f o r r e c l a m a t i o n o f s a n d y s o i l s , p r o d u c t i o n o f wood,
c h a r c o a l and f o r a g e .
I n c o l l a b o r a t i o n w i t h t h e U n i v e r s i t y o f D a k a r ( E . Duhoux) l
a n d I n s t i t u t N a t i o n a l d e R e c h e r c h e s F o r e s t i è r e s de. T u n i s i e ( I D R C
p a r t i a l l y s p o n s e r i n g t h e p r o j e c t ) we h a v e j u s t i n i t i a t e d a r e s e a r c h
10
p r o g r a m w i t h t h e f o l l o w i n g o b j e c t i v e s :
- s e l e c t i n g t h e h o s t p l a n t e x h i b i t i n g t h e b e s t N - f i x i n g p o t e n t i a l ;
- o b t a i n i n g , b y t i s s u e c u l t u r e , p l a n t s t h a t a r e t o l e r a n t t o h i g h 2
. l e v e l s o f s a l t i n t h e s o i l ;
- d e v e l o p i n g a n i n v i t r o me thod o f v e g e t . a t i v e p r o p a g a t i o n o f
- A . c y a n o p h y l l a ;
- c h e c k i n g i n t h e f i e l d t h e r e s u l t s o b t a i n e d i n v i t r o . - 4 . THE A Z O L L A - A N A B A E N A SYMBIOSIS
4 . 1 . G e n e t i c s t u d i e s o n Anabaena
The f i r s t o b j e c t i v e o f t h e i n v e s t i g a t i o n s wgs t o compare
t h e p l a s m i d c o n t e n t and t h e Nase s t r u c t u r e g e n e s o f s y m b i o t i c
Anabaena e x t r a - c t e d f rom f i v e s p e c i e s o f A z o l l a (A, p i n n a t a ,
A . c a r o l i n i a n a A f i l i c u l o i d e s , A . m e x i c a n a , A . m i c r o p h y l l a ) - --y _ * - - t o t h e r e l a t e d c h a r a c t e r i s t i c s of n o n - s y m b i o t i c Anabaena i n o r d e r t o
i d e n t i f y t h e ma in g e n e t i c t r a i t s i n v o l v e d i n t h e s y m b i o s i s .
R e s u l t s o b t a i n e d t o d a t e a r e ' as f o l l o w s :
- -
4 . 1 . 1 . Compar i son o f t h e p l a s m i d c o n t e n t o f s y m b i o t i c and non-
s y m b i o t i c s t r a i n s o f Anabaena (C. F r a n c h e ) - ........................... S t r a i n s o f Anabaena e x t r a c t e d f r o m A z o l l a c a r o l i n i a n a ,
A . f i l i c u l o i d e s and A . m e x i c a n a c o n t a i n e d o n e 25 Mdal p l a s m i d - --- - w h e r e a s nb p l a s m i d was f o u n d i n Anabaena e x t r a c t e d f rom A z o l l a
p i n n a t a o r A . m i c r o p h y l l a . By c o n t r a s t n o n - s y m b i o t i c t r o p i c a l s t r a i n s
o f Anabaena h a d a v a r i a b l e number o f p l a s m i d s ( 1 t o 5 , g e n e r a l l y 3)
w i t h m o l e c u l a r w e i g h t s r a n g i n g from 1 . 5 t o 1 2 0 Y d a l . U n t i l now no
s p e c i f i c f u n c t i o n c o u l d b e a t t r i b u t e d t o t h e s e p l a s m i d s .
-
4 . 1 . 2 . Homology b e t w e e n t h e n i t r o g e n a s e s t r u c t u r e g e n e s o f ------ ------------------ -----------_---- ------- ............................. --- _-----__- --_---- Anabaena v a r i a b i l i s s t r a i n PCC7120 ( n o n s y m b i o t i c
A n a b a e n a ~ - a n d - t . r a l _ D N R _ e x t r a c t e d _ f y o m _ f ~ ~ ~ - ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ Anabaena a z o l l a e (C, F r a n c h e and G. S t a n i e r ) . -------------- --
Nif HDK g e n e s o f s y m b i o t i c a n d n o n - s y m b i o t i c Anabaena w e r e c l e a r l y homologous . F o r b o t h g r o u p s o f Anabaena t h e a r r a n g e m e n t o f
n i f HDK g e n e s was q u i t e s i m i 1 a r ; n í . f K was n o t a d j a c e n t t o nif H, and
- n i f D. P r e l i m i n a r y r e s u l t s s u g g e s t t h a t , l i k e t h e n o n - s y m b i o t i c
s t r a i n o f Anabaena PCC7120, t h e s y m b i o t i c s t r a i n s o f Anabaena h a v e
s e v e r a l c o p i e s o f n i f H g e n e .
- 7
- -
The r e s t r i c t i o n map o f A . a z o l l a e f r a g m e n t s homologous - t o t h e n i f HDK g e n e s o f PCC7120 was s i m i l a r f o r t h e d i f f e r e n t
s t r a i n s o f A . - a z o l l a e , s u g g e s t i n g t h a t . o n l y o n e r e l a t i v e l y p r i m i t i v e
s t r a i n o f A . a z o l l a e e x i s t s .
- s
- 5
4 . 2 . M i c r o p l o t s t u d i e s (P. Reynaud)
F a c t o r s a f f e c t i n g t h e g r o w t h a n d N f i x a t i o n o f A z o l l a
p i n n a t a v a r . a f r i c a n a were s t u d i e d . An e x p e r i m e n t was d e v i s e d t o
s t u d y N 2 f i x a t i o n and t h e f a t e o f N Z - f i x e d , u s i n g t h e i s o t o p i c
d i l u t i o n m e t h o d .
2
5 . N O N S Y M B I O T I C AE (P. Reynaud) Ø
The s t a t i s t i c a l a n a l y s i s o f d a t a f r o m 8 2 b i o t o p e s showed
t h a t t h e f o l l o w i n g f a c t o r s w h i c h m o s t a f f e c t e d t h e d i s t r i b u t i o n o f
N Z - f i x i n g b l u e - g r e e n a l g a e ( B G A ) w e r e : pH ( p o s i t i v e e f f e c t ) , p l a n t
c o v e r ( p o s i t i v e e f f e c t ) , soil w a t e r c o n t e n t ( n e g a t i v e e f f e c t ) ,
a b u n d a n c e o f n o n N 2 - f i x i n g B G A ( p o s i t i v e o r n e g a t i v e e f f e c t ) .
t h a t a l g a l i z a t i o n o f r i c e b y BGA w a s ' s u c c e s s f u l o n l y when p e r f o r m e d
a t t h e m i d d l e ' o f t h e g r o w t h c y c l e , a c o n s e q u e n c e o f t h e s e n s i t i v i t y
o f BGA t o e x c e s s i v e l i g h t a n d c o m p e t i t i o n w i t h o t h e r a l g a l s t r a i n s .
M i c r o p l o t e x p e r i m e n t s a t t h e O R S T O M B e l A i r s t a t i o n i n d i c a t e d
,_--..._-, ". ..,.. ---- II-- -",**.-'-,"W . . .