d e l a u n a c t i v a d o r d e l a c i c l a s a l a p ...se regula la excitabilidad neuronal....

EfEcto dE bloquEo dE la forskolina, un activador dE la adEnilato ciclasa, sobrE

la corriEntE dE potasio tipo rEctificador tardío

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CIUDAD JUÁREZ

Ricardo Duarte JáquezRector

David Ramírez PereaSecretario General

Manuel Loera de la RosaSecretario Académico

Daniel Constandse CortezDirector del Instituto de Ciencias Biomédicas

Luis Enrique Gutiérrez CasasCoordinador General de Investigación y Posgrado

Ramón Chavira ChaviraDirector General de Difusión Cultural y Divulgación Científica

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CIUDAD JUÁREZ

EfEcto dE bloquEo dE la forskolina, un activador dE la adEnilato ciclasa, sobrE

la corriEntE dE potasio tipo rEctificador tardío

Eduardo iván acosta GómEz

ciEncias dE la salud

CoordinaCión General de investiGaCión y PosGrado

Lisbeily Domínguez Ruvalcaba Coordinadora de la ColeCCión

Acosta Gómez, Eduardo Iván.

Efecto de bloqueo de la forskolina, un activador de la adenilato ci-clasa, sobre la corriente de potasio tipo rectificador tardío / Eduardo Iván Acosta Gómez. Ciudad Juárez, Chih. : Universidad Autónoma de Ciudad Juárez, 2013. (Colección Textos Universitarios, Serie Investi-gación)

32 p.; 30 cm.

Incluye bibliografía Colección Reportes Técnicos de Investigación ISbN: 978-607-7953-80-7Serie ICb, Vol. 11. ISbN: 978-607-520-001-9

Contenido:

1.– Introducción. 2.– Planteamiento. 3.– Metodología. 4.– Resultados. 5.– Conclusiones.

D. R. © Acosta Gómez, Eduardo Iván.

La edición, diseño y producción editorial de este documento estuvo a cargo de la Direc-ción General de Difusión Cultural y Divulgación Científica, a través de la Subdirección de Publicaciones.

índicEResumen 7Palabras clave 8Abstract 9Keywords 10Usuarios potenciales 10Reconocimientos 10

i. introducción

ii. plantEamiEnto

iii. antEcEdEntEs y justificación

iv. mEtodoloGía

Cultivo celular 17Registros electrofisiológicos 18Tabla 1 19

7

v. rEsultados

La forskolina suprime a la IKV y a la corriente de potasio generada por las subunidades Kv2.1 21Efecto dosis–dependiente de la forskolina sobre corrientes generadas por las subunidades Kv2.1 22Figura 1 22Figura 2 23La forskolina produce potenciales de acción de tipo adaptativo dependiente de la frecuencia 24Figura 3 25

v. conclusionEs

Referencias 29

7

rEsumEn

La función de comunicación celular con el entorno, se inicia con la percepción del mensaje externo, función llevada a cabo por proteínas receptoras. Una vez captado el estímulo, éste se traduce en un mensaje interno a través de distintos mecanismos de señalización celular.

En la transducción de señales se investigan muchas moléculas naturales o sinté-ticas, muchas de ellas para ser usadas como instrumentos farmacológicos y con esto poder manipular las cascadas de señalización que median una variedad de procesos celulares. Sin embargo, algunos de estos compuestos podrían actuar recíprocamente con otras proteínas celulares entre ellas los canales iónicos. Por ejemplo, parte cen-tral de este reporte es sobre la forskolina (7 beta-acetoxy-8, 13-epoxy-1 alfa, 6 beta, 9 alfa-trihidroxy-labd-14-ene-11-uno), derivado de una planta conocida como Coleus forskholii y se ha utilizado durante siglos en la medicina hindú, debido a su capacidad para actuar y activar de forma no hormonal sobre uno de los reguladores celular más importante del cuerpo humano, el compuesto adenosin monofosfato cíclico (AMPc). Como es bien sabido, este nucleótido es vital para el organismo, ya que actúa como se-gundo mensajero intracelular, activando o inhibiendo otras enzimas que desempeñan un sin número de funciones específicas en las células de un organismo.

En este proyecto se llevó a cabo el estudio de la forskolina sobre el voltaje de la membrana celular, denominada fijación de corriente. Así como su efecto sobre los registros de la corriente de potasio tipo rectificador tardío, en neuronas del ganglio cervical superior de rata y que es independiente de AMPc. Encontramos que la co-rriente de potasio tipo rectificador tardío denominada IKV, puede ser directamente afectada, a lo cual se observó un bloqueo reversible de dicha corriente por la forskoli-na. A partir de estos datos obtuvimos una IC50= 32 μM. A pegado a lo anterior como los canales de Kv2.1 contribuyen a generar la IKV, más lejos probamos el efecto de forskolina en células humanas embrionarias de riñón (HEK-293) transfectadas con la subunidad Kv2.1. También conjuntamente se evaluó el impacto de esta regulación sobre el patrón de disparo que tiene lugar en este tipo de neuronas.

El bloqueo directo de canales de potasio por forskolina limita la utilidad de este fármaco en estudios sobre la modulación de la liberación de neurotransmisor y exci-tabilidad neuronal.

8

Efecto de bloqueo de la forskolina, un activador de la adenilato ciclasa, sobre la corriente de potasio tipo rectificador tardío

9

Palabras clave: Forskolina, Canales de Potasio, Neuronas simpáticas.


9

abstract

The function of cellular communication with the environment, begins with the perception of the external message, function carried out by receptor pro-teins. Once the stimulus caught, this is translated in an internal message across different mechanisms of cellular signaling.

In signal transduction research many natural or synthetic molecules are used as pharmacological tools to manipulate the signaling pathways mediating a variety of cellular processes. However, some of these compounds could be interacting with ion channels. For example, a central part of this report is on the Forskolin effect (7 beta-acetoxy-8, 13-epoxy-1 alpha, 6 beta, 9 alpha-trihidroxy-labd-14-ene-11-uno), deriva-tive of a plant known as Coleus forskholii, that has been used for centuries in Hindu medicine, due to its aptitude to act and activate in a not hormonal form one of the most important cellular regulators of the human body, the compound cyclic adenosin-monophosfate (cAMP). It is well known that this nucleotide is vital for the organism, since it acts as the second intracellular messenger, activating or disabling others enzymes that recover many specific functions in the cells of an organism.

In this project I study the effect of the Forskolin on potassium current that is in-dependent from cAMP, on the cell voltage, with current clamp. As well as its effect on the record of potassium current, type late rectifier of the in neurons of the cervical superior ganglion of rat. We found that the neuronal potassium current type late rec-tifier named, IKV, can be directly affected, observing a reversible blockage because of Forskolin. From this data we obtained reduced both IKV and Kv2.1-mediated cur-rents without a significant change in the steady-state activation curve of Kv2.1 chan-nels. At 0 mV Forskolin reduced the current amplitude with an IC50 of 32 μM. To plaster the previous data, the channels of Kv2.1 contribute to generate the IKV, be-yond that we prove the Forskolin effect in human embryonic kidney cells (HEK-293) transfected with the subunit Kv2.1. Also the impact of this regulation on the pattern of shot that takes place in this type of neurons was evaluated.

The direct block of potassium channels by Forskolin limits the usefulness of this drug in studies on modulation of neuroexcitability and neurotransmitter release.

10


11

Keywords: Forskolin, K+ channels, sympathetic neurons.

Usuarios potenciales: Alumnos de licenciatura y posgrado, farmacólogos, médicos.

Reconocimientos: Primeramente a la UACJ–ICb por el apoyo de las instalaciones y equipo utilizado,

ya que sin esto no se hubiera podido llevar acabo ningún tipo de experimento. En se-gundo lugar al PROMEP, ya que por medio de éste se obtuvieron los reactivos y ma-terial consumible para poder llevar a cabo este proyecto. También un agradecimiento muy especial al Dr. Humberto Cruzblanca Hernández, M. en C. Luis Ángel Chávez y Q.F.b. Mario Morales Ávalos, de la Universidad de Colima, Centro Universitario de Investigaciones biomédicas, con el cual se colaboró en este proyecto y parte de los resultados obtenidos se obtuvieron en dicha universidad. Y por último, a la médico Edith Sandoval por su ayuda para la correcta traducción del abstract.


11

i. introducción

La función de comunicación celular con el entorno, se inicia con la percepción del mensaje externo, función llevada a cabo por proteínas receptoras. Una vez captado el estímulo, éste se traduce en un mensaje hacia dentro de la célula, a través de distintos mecanismos de señalización celular. Estos me-

canismos transmiten señales que resultan en la regulación de funciones celulares de-terminadas dependiendo los receptores membranales que reciben señales específicas y llevan a la célula a seguir un mecanismo específico de señalización. Actualmente se sabe que múltiples cascadas de señalización en una misma célula comparten nume-rosos componentes. Esta promiscuidad puede entenderse por el hecho de que todas estas vías se encuentran interconectadas y con esto las respuestas pueden generarse de forma más rápida y eficiente (Pujades, 2000). Comprender cómo la célula recibe y coordina señales del entorno inmediato y de otras células del organismo, es esencial para entender los procesos fisiológicos básicos celulares. Este conocimiento a nivel ce-lular es indispensable para comprender como se regulan variables fisiológicas sisté-micas como la presión arterial, la osmolaridad del plasma sanguíneo, la excitabilidad del sistema nervioso entre otros.

La modulación de canales iónicos por la súper familia de receptores 7 dominios transmembranales o acoplados a proteínas G es el principal mecanismo por el cual se regula la excitabilidad neuronal. Éstos, una vez estimulados, disparan cascadas de señalización, permitiendo a la célula responder estímulos externos. Sin embargo no solo la modulación de proteínas o canales iónicos se lleva a cabo por receptores y más aun por la gran familia de receptores acoplados a proteínas G. Si no también por fármacos. Ejemplo de ello y parte central de este reporte es sobre la forskolina, derivado de una planta conocida como y se ha utilizado durante siglos en la medicina hindú, debido a su capacidad para actuar y activar de forma no hormonal sobre uno de los reguladores celular más importante del cuerpo humano, el compuesto AMPc. Como es bien sabido, este nucleótido es vital para el organismo, ya que actúa como se-gundo mensajero intracelular, activando o inhibiendo otras enzimas que desempeñan funciones específicas en las células de un organismo. Sin embargo como en este caso y de manera independiente de receptores puede llevar a tener efectos sobre algunos elementos involucrados en las cascadas de señalización celular, produciendo otros efectos no descritos aun.

13

ii. plantEamiEnto

En la investigación de señales de transducción, muchas moléculas sinteti-zadas en nuestro organismo como moléculas o fármacos creados en labo-ratorios o sintetizados en la naturaleza, son usadas como herramientas farmacológicas, lo anterior para la manipulación de vías de señalización

celular que se encuentran involucradas en un sinfín de procesos celulares. Por men-cionar un ejemplo la forskolina (FSK), un activador de la adenilato ciclasa, inhibe, en sistemas de expresión heterológo, canales de potasio (K+) clonados y que es indepen-dientemente de la síntesis de adenosin monofosfato (AMPc). Este último se sabe que se ve incrementado por la acción de la adenilato ciclasa, siendo un segundo mensajero por excelencia en la señalización intracelular y en la modulación de procesos fisio-lógicos. Sabiendo lo anterior y siendo que los canales de K+ son parte fundamental en la repolarización de potenciales de acción en sistemas excitables y más aun, que el bloqueo de estos canales iónicos pudieran ocasionar aumento o decremento de la excitabilidad neuronal, esto se traduciría en un aumento o disminución en el núme-ro de potenciales de acción generados por un estímulo dado. Por tal motivo se hace necesario investigar si la FSK tiene algún efecto sobre canales de K+ expresados en sistemas de expresión homólogos y heterólogos, y que se encuentran involucrados en el aumento de la excitabilidad celular de manera directa e independiente de AMPc. Además de llevar a cabo el estudio de que por sí sola la FSK, tiene efecto directo sobre los canales de potasio, pudiera estar influyendo en el comportamiento de las neuro-nas, y lo anterior se vería traducido con una disminución de potenciales de acción en las neuronas del GCS un ganglio meramente simpático.

15

iii. antEcEdEntEs y justificacion

La modulación de canales de K+ es uno de los más importantes mecanismos usados por receptores acoplados a proteínas G (GPCR), para regular la exci-tabilidad neuronal. Por mencionar alguno, en neuronas simpáticas de rata del ganglio cervical superior (GSC) los receptores muscarínicos M1, Angio-

tensina II AT1 y bradicinina b2, incrementan la probabilidad de disparo de potencia-les de acción, a través de la inhibición de la corriente de potasio tipo M (IKM) (Delmas y brown, 2005). Los mecanismos usados por los GPCR para cerrar a los canales M (Kv7.2/Kv7.3) son ya identificados. Se sabe que la depleción de los niveles de fosfati-dilinositol 4, 5-bifosfato (PIP2) de la membrana celular es la señal usada por los recep-tores M1 y AT1 (Suh y cols., 2006; Winks y cols., 2005; Zaika y cols., 2006), y donde el receptor b2 utiliza el complejo Ca-Calmodulina, como el mensajero inhibitorio de esta corriente, del cual el Ca2+ es liberado desde cisternas de calcio sensitivas o sensibles a Inositol trifosfato (IP3) (Cruzblanca y cols., 1998; Gamper y Shapiro, 2003).

Otras corrientes de K+ activadas por voltaje que contribuyen a regular la excita-bilidad de las neuronas GSC incluyen: 1) la rápida activación e inactivación de la corriente de K+ tipoAA (I); 2) otro tipo de IA pero con una inactivación lenta (IAS); 3) La corriente de potasio tipo rectificador tardía (IKV), (Malin y Nerbonne, 2000). El relati-vo nivel de densidad de corriente de cada una de estas corrientes de K+ y su cinética, da el tipo de patrón de disparo en las células del SCG. (Malin y Nerbonne, 2000, 2002; Wang y McKinnon, 1995). Además hay diferencias sutiles a nivel molecular, que las neuronas GSC expresan IA e IKV, este último es generado por canales homomericos formados por Kv2.1 y Kv2.2, donde solo el Kv2.1 contribuye a la IKV, de tal motivo que en estas células se expresan IA, IAS, IKV Malin y Nerbonne, 2002).

Los canales formados por Kv2.1 constituyen el mayor componente de la corriente de K+ tipo rectificador tardío en globo pálido, hipocampo y neuronas corticales pira-midales (baranauskas y cols., 1999; Murakoshi y Trimmer, 1999). En estas neuronas centrales los canales conformados por Kv2.1 preferentemente se localizan el cuerpo celular y dendritas proximales (Hwang y cols., 1993; Misonou y cols., 2004), aquí re-gulan la excitabilidad somato-dendrítica dependiente de frecuencia (Du y cols., 2000). En neuronas del GCS, agonistas muscarínicos y Angiotensina II incrementan la IKV e inhiben a la corriente de potasio tipo M (IKM), siendo estas al parecer fundamentales

16


17

para la estabilización de potenciales de acción de manera tónica (Malin y Nerbonne, 2002; Acosta y cols., 2007; Cruzblanca, 2006), sin embargo, el impacto de esta regula-ción por receptores acoplados a proteínas G o fármacos sobre estos canales involucra-dos en la generación de disparos o potenciales de acción repetitivos, no han sido bien entendidos y estudiados.

En la investigación de señales de transducción involucradas en procesos fisiológicos comúnmente son usadas herramientas farmacológicas para encontrar la naturaleza de las vías de señalización que subyacen diferentes procesos celulares (Nahorski, 2006). Por ejemplo, la FSK es comúnmente usada como un activador de la adenilato ciclasa, en el estudio de señales de señalización AMPc dependiente. Sin embargo evidencia re-ciente indica que la FSK puede tener acciones independientes de AMPc, sobre recepto-res nicotínicos a acetilcolina y corrientes de K+ rectificador tardío (Garber y cols., 1990; Hoshi y cols., 1988; Wagoner y Pallota, 1988). Recientemente se ha encontrado en cé-lulas HEK-293 que la FSK bloquea canales formados por las subunidades de K+, Kv1.1 (Un tipo de rectificador tardío) y Kv1.4 (un tipo IA) (Matthias y cols., 2002), así como re-cientemente se ha encontrado que bloquea a un canal de K+ activado por sodio (Nuwer y cols., 2009). A pesar de la creciente evidencia que revela, que diferentes subunidades de Kv son directamente blanco por la FSK, no hay ningún estudio complementario, donde se explore el impacto de la FSK sobre el bloqueo de canales de K+ que participan en la excitabilidad neuronal. Esto nos hace preguntarnos si la corriente de K+ tipo rec-tificador tardío, siendo esta muy importante para el establecimiento de potenciales de acción de manera tónica (Malin y Nerbonne 2002), puede ser directamente afectada por la FSK, además si esto a su vez tiene un impacto en la regulación de disparos de espiga repetitivos en neuronas GSC de rata en cultivo primario.


17

iv. mEtodoloGía

Cultivo celular

Los experimentos se realizaron en neuronas del ganglio cervical superior, mante-nidas en cultivo primario (rata Wistar, de 2-4 semanas de edad). Las ratas se aneste-siaron con cloroformo y posteriormente se sacrificaron por decapitación, se disecaron rápidamente ambos ganglios, los cuales se encuentran a nivel de la bifurcación de las arterias carótidas. Una vez extraídos, los ganglios se limpian y se decapsulan cuidado-samente para evitar dañar a las neuronas contenidas en ellos. Con el fin de facilitar la difusión de las enzimas durante la etapa de dispersión enzimática, se realizaron varios cortes transversales del GCS. Las enzimas que se emplearan en la dispersión serán: papaína (Roche; 20 U/ml), colagenasa (Sigma; 1.8 mg/ml) y dispasa II (Roche; 5 mg/ml), disueltas en solución de Hanks modificada (Tabla 1); las soluciones se mantuvieron frías y continuamente se oxigenaron hasta antes de su uso, ya que esto permite una mayor sobrevivencia de las neuronas. Después de haber incubado con las enzimas, los trozos de ganglio se pasaron repetidamente a través de pipetas Pasteur con puntas pulidas al calor, con el fin de facilitar la disociación mecánica de las células. Una vez lograda la disociación del tejido, las enzimas se diluyeron, añadiendo medio DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Médium; GIbCO); la suspensión se centrifugó a 1500 rpm durante 3 min. Posteriormente se resuspendieron las neuronas con sumo cuidado en medio fresco conteniendo además 10% de suero bovino fetal (SFb), para la inactivación total de las enzimas utilizadas en la dispersión celular. Más aun se centrifugó por se-gunda ocasión a 1500 rpm durante 3 min. Después, las neuronas fueron nuevamente resuspendidas en una pequeña cantidad de volumen, para posteriormente ser sembra-das en pedazos de vidrio (≈ 4 x 4 mm) tratados previamente con poli-lisina (500 ng/ml) (SIGMA); se dejaron reposar durante 2 horas para que las células se adhieran al vidrio. Después de este periodo a las neuronas se les adicionó DMEM + 10% SFb + una mezcla de antibiótico y antimicótico (ver soluciones) y se incubaron por lo menos durante 8 h. La incubación se llevara a cabo a 37oC y en una atmósfera de 5% CO2, hasta antes de su empleo para los experimentos electrofisiológicos.

18


iv. mEtodoloGía

Para el mantenimiento de las células HEK-293 se mantuvieron en medio DMEM conteniendo 5% de SFb inactivado al calor, con 0.2% de antibiótico/antimicótico, y en una incubadora a 37 oC y en una atmósfera de 5% de CO2. Se recambió el mencionado medio cada 3 días. Después de alcanzar aproximadamente un 70% de confluencia, las células fueron transfectadas con el cDNA que codifica para la subunidad Kv2.1 de rata (amablemente cedido por James S. Trimmer, Universidad de California, Davis, CA. al Dr. Humberto Cruzblanca Hernández del Centro Universitario de Investigaciones biomédicas de la Universidad de Colima y con el cual se está colaborando en este pro-yecto) y utilizando lipofectamina (Invitrogen) acorde al procedimiento recomendado por los fabricantes. Los plásmidos a transfectar contiene al Kv2.1 y la proteína verde fluorescente (GFP) donde la co-transfección se hizo en un radio 5:1 respectivamente. Al día siguiente de haber transfectado las células se sembraron en pedacitos de vidrio y se llevó a cabo el posterior registro de 5–24 horas después. Cabe mencionar que esta parte se hará en colaboración con el Dr. Humberto Cruzblanca Profesor Investigador del Centro Universitario de Investigaciones biomédicas de la Universidad de Colima.

Registros electrofisiológicos

Para el registro de la IKV y la corriente generada por las subunidades Kv2.1, se transfirió uno de los fragmentos de vidrio conteniendo neuronas o las células HEK-293 a una cámara de registro de capacidad de 200 μl y se bañaron con solución Ringer Nor-mal (Tabla 1) a una tasa de 2.5 ml/min. La IKV se registró mediante la técnica de “patch-clamp” en la configuración de “célula entera”, se utilizaron pipetas de vidrio con una resistencia de 1 – 2 MΩ. Los registros se realizaron con el amplificador EPC10 (HEKA elektronics). Para el registro de la IKV se bloquearon previamente las corrientes de Na+ y Ca2+ con 500 nM de Tetrodotoxina (TTX) y 200 μM de CdCl2, respectivamente, siendo ésta la solución control (Tabla 1). La IKV se generó con pulsos comando despolarizantes de 100 ms de duración, en el rango de - 50 a 0 mV (el voltaje de sujeción fue de -50 mV). Antes de su adquisición a 5 KHz, la IKV se filtró a 1 kHz.

Para la medición de las corrientes de cola generadas por las corrientes menciona-das en el párrafo anterior, se midieron las diferencias entre el promedio de un seg-mento de 2 ms al principio de la corriente de cola y un promedio durante los últimos 5 ms del registro de la corriente.

Para el estudio de los potenciales de acción generados en las neuronas del GCS en la configuración de célula completa con fijación de corriente se llevó a cabo con el amplificador EPC-10 (HEKA electronics) y el software patch-master. La generación de potenciales de acción se llevó a cabo con inyección de corriente (100 a 250 pA) por 1.5 s y esta se filtro a 10 KHz. La estadística se llevó a cabo por promedios y estos serán comparados buscando significancia con la prueba de “t Student” entre dos grupos (p < 0.05).

Solución Antibiótico-Antimicótico (100X): Penicilina G sódica: 10.000 unida-


19

iv. mEtodoloGía

des/ml, Sulfato de Estreptomicina 10.000 μg/ml y Anfotericina b 25 μg/ml en 0.85% de solución salina.

Solución Interna estándar de la pipeta para el registro de la IKV y la co-rriente generada por las subunidades Kv2.1 (mM): KCl, 175; MgCl2, 5; HEPES, 5; Na2-ATP, 3; Na-GTP, 0.1; bAPTA, 0.1; Leupeptina, 0.08; pH 7.4 con KOH.

Los reactivos que se utilizaron son los siguientes: Colagenasa, poly-L-lisina, HE-PES, Na-GTP, TTX y forskolina (SIGMA, St. Louis, MO); bAPTA (Molecular Probes, Eugene, OR); papaína, dispasa II, leupeptina y K-ATP (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania); DMEM, antibiótico/antimicótico, SFb y lipofectamina (GIb-CO/Invitrogen Co, Carlsbad, CA).

Tabla 1

Reactivo Hanks (mM) Ringer (mM) Control (mM)

NaCl 137 160 160

KCl 5.4 2.5 2.5

KH2PO4 0.44 - -

NaH2PO4 0.34 - -

HEPES 5 10 10

CaCl2 - 5 5

MgCl2 - 1 1

Glucosa 5 8 8

Tetrodo toxina - - 0.0005

Cd2+ - - 0.1

EGTA

PH 7.4 7.4 7.4

v. rEsultados

21

La forskolina suprime a la IKV y a la corriente de potasio generada por las subunidades Kv2.1

En neuronas simpáticas de ganglio cervical superior la muscarina o angio-tensina II incrementan a la IKV a través de una vía de señalización que es insensible a la toxina pertussis (Cruazblanca 2006; Acosta y cols., 2007). Para evaluar si la vía del AMPc se encuentra presenta en la modulación de

la IKV, las neuronas fueron expuestas a 20 μM de forskolina una concentración sufi-cientemente alta para activar a la adenilato ciclasa (Sokolova y cols., 2006). Inespera-damente la FSK rápida y reversiblemente bloqueó a la IKV (Figura 1a), sugiriendo de entrada un modo directo de acción del fármaco sobre los canales de potasio nativos, que son responsables de generar la IKV. Por tal motivo decidimos seguir el estudio de la FSK en células HEK-293, transfectadas con la subunidad Kv 2.1, debido a las siguientes razones: a) los canales homoméricos formados por Kv2.1 en gran parte contribuyen a generar la IKV neuronal (Malin y Nerbonne, 2002) y; b) Por otro lado generar corrientes homoméricas, en sistemas de expresión homologo evita la conta-minación de la corriente, por otros canales de potasio endógenos voltaje dependientes y que se encuentran presentes dichos canales en neuronas GCS. Como se esperaba, la FSK de manera reversible redujo la amplitud de la corriente de potasio tipo rec-tificador tardío, nativa en neuronas GCS y por las subunidades Kv2.1 en las células HEK-293 (la Figura 1b).

a 1

22

1

500 pA 2 nA

50 ms

1: Control2: FSK

b

22


v. rEsultados

700 20 μM 25 μM

600

500

400

300 1.25

1.50

1.75

2.00

50 50

Time (s) Time (s)

l KV t

ail c

urre

nt (p

A)

KV

2. t

ail c

urre

nt (n

A)

100 100150 1500 0

Figura 1. En a se muestra el efecto de la FSK 20 μM sobre la corriente IKV nativa de las neuronas GCS, y en b el efecto de la FSK 25 μM sobre la co-rriente generada por las subunidades Kv2.1 en células HEK-293. Los trazos representativos de las corrientes control (1) y el efecto de la FSK (2) sobre estas (arriba), las líneas discontinuas muestran el nivel de corriente cero. Cursos temporales del efecto de bloqueo de la FSK sobre las corrientes ge-neradas IKV en neuronas e IKV en células HEK-293, cada 4 segundos (abajo).

Efecto dosis–dependiente de la forskolina sobre corrientes generadas por las subunidades Kv2.1

Para evaluar el potencial bloqueo que tiene la FSK sobre los canales formados por las subunidades Kv2.1, las células HEK-293 fueron bañadas por concentraciones cre-cientes en el rango de 1 – 100μM. La corriente de las subunidades Kv2.1, se genero con un pulso comando de -50mV a 0mV durante 100 ms, el efecto de la FSK (1μM) (inser-ción de la Figura 2b) fue relativamente bajo. Así pues la FSK redujo la amplitud de la corriente de cola de una manera dosis–dependiente (Figura 2a) en base a lo anterior se obtuvo una concentración inhibitoria al 50%, IC50, de 32μM (Figure 2b) y donde el máximo efecto de bloqueo de la corriente fue de 91 ± 2% (n = 9) con 100μM de FSK. Ade-más de prácticamente suprimir la corriente de cola, esta concentración de FSK produjo una visible corriente de inactivación observada durante los 100 ms de despolarización (inserción en la Figura 2b).

a FSK (μM)

31 25 100

2

KV

2.1

tail

curr

ent

(nA

)

Time (s)

1

00 50 100 150 200


23

v. rEsultados

b

% S

upp

ress

ion

of t

ail c

urre

nt

[Forskolin] (μM)

100 c

1 5 nA25

100

80

60

40 50 ms

20

01 10 100

Figura 2: En a se aprecia el bloqueo en el tiempo de manera dosis–depen-diente de la FSK 1μM (círculos vacíos), 25μM (triángulos vacíos) y 100μM (cuadrados vacíos) sobre la amplitud de las corrientes de cola generadas en células HEK-293. Se observa una curva dosis–respuesta para la obtención de la IC50, la cual fue de 32μM, la línea es un ajuste de la ecuación de Hill para así obtener el dato anterior (b). Dentro de b, también se puede apreciar la corriente característica y generada por los Kv2.1 donde a una concentra-ción de 100μM hay inactivación de esta. Las líneas discontinuas es el nivel de corriente cero.

La forskolina produce potenciales de acción de tipo adaptativo dependiente de la frecuencia

Las corrientes de potasio voltaje dependientes, tienen un papel determinante sobre el patrón de disparo de las neuronas. Por ejemplo en las neuronas GCS la IKV contri-buye en la fase tardía de la repolarización del potencial de acción y tiene un papel significativo en la fase temprana de lo que se conoce como hiperpollarización, se ha encontrado que la sobre expresión de la subunidad Kv2.1 promueve el disparo tónico en las neuronas del GCS (Malin y Nerbonne, 2002; Marsh y brown, 1991). Por lo tan-to, nos interesó buscar si el efecto de la supresión de los canales Kv2.1 expresados en células HEK-293, podrían reflejar algún efecto sobre las propiedades de disparo en las neuronas del GCS. Sobre la base de respuesta a un estímulo por corriente depolari-

24


v. rEsultados

zante, se ha visto que las neuronas GCS pueden ser clasificadas como fásicas (generan solo uno o dos potenciales de acción), de adaptación (genera de tres a ocho potenciales de acción) y tónico (por arriba de ocho potenciales de acción) (Jia y cols., 2008; Malin y Nerbonne, 2000; Wang y McKinnon, 1995). Usamos solo células de tipo adaptativo ya que son las más abundantes (54%) que las células tónicas (10%) (Jia y cols., 2008). La figura 3 muestra la respuesta que tiene lugar en las neuronas al aplicar 150 pico amperios (pA) de corriente depolarizante. Como era de esperase las células mostraron la generación de potenciales de acción de tipo adaptativo, ya que generaron 8 poten-ciales de acción al principio de un estímulo de corriente de 1500 mili segundos (ms) de duración. Sin embargo, en presencia de 100μM de FSK la generación de potenciales de acción adaptativos fue incrementado, ya que las neuronas solo obtuvieron 2 poten-ciales de acción (Figura 3a). A concentraciones menores de FSK (35μM), las células del GCS tienen también la tendencia a disparar menos, sin embargo, con las concentracio-nes más altas el efecto observado fue estadísticamente significativo, sobre una amplia gama de corriente inyectada como estímulo (Figura 3b).


25

v. rEsultados

a

40 40

-40 -40

-80 500 ms-80

0 0

Vm

(mV

)

Control FSK

b

20 20

15 15

10 10

5 5

0 0100 100150 150200 200250 250

# of

sp

ikes

# of

sp

ikes

FSK (35 μM) FSK (100 μM)

Current (pA) Current (pA)

Figura 3. Se aprecia en a, la generación de potenciales de acción gracias a un estímulo de inyección de corriente de 150 pA antes y después de la aplicación de FSK, con la técnica de Patch-Clamp en configuración de célu-la entera, fijación de corriente. Claramente se puede apreciar que en pre-sencia de la FSK es considerablemente menor el número de potenciales de acción. En b se muestra el promedio de los potenciales de acción generados al estimular con una amplia gama de inyección de corriente depolarizante, de manera control (barras negras) y al aplicar FSK (barras vacías) a 35μM (iz-quierda) y 100μM (derecha) en la misma célula. Los datos obtenidos fueron de entre una n= 16 – 18 neuronas.

27

v. conclusionEs

Los resultados reportados aquí son que la FSK suprime las corrientes de po-tasio generadas por las subunidades Kv2.1 en células HEK-293, y donde en neuronas simpáticas incrementan el número de las neuronas que disparan de manera adaptativa. Se sugiere que la FSK bloquea canales formados por

las subunidades Kv2.1 por medio de un mecanismo de canal abierto lo anterior por las siguientes razones: a) la FSK induce una moderada inactivación de la corriente de potasio, observada a distintas concentraciones y de manera voltaje dependiente (Figura 2). En resumen compuestos que producen bloqueo como es el caso de la FSK a los canales Kv2.1, puede hacerlo a través de un bloqueo por canal abierto (Hille, 2001; Kuo, 1998; Snyders y cols., 1992; Tytgat y cols., 1997). Pero cabe aclarar que esta inferencia considerablemente se vería fortalecida con un estudio más a detalle de las corrientes de cola generadas en las IKV en neuronas del GCS y sobre la corriente generada por las subunidades Kv2.1 en las células HEK-293; esto en parte se llevará a cabo en la segunda parte de este proyecto. En base a lo anterior evidencia cercana, donde células PC12, demostraron que la FSK suprime una corriente de potasio tipo rectificador tardío por un mecanismo de canal abierto, donde este fármaco se une a los canales llamados Kz (Hoshi y cols., 1988; Wagoner and Pallota, 1988). La IC50 del bloqueo para los canales Kz fue de 19 μM, un valor el cual se encuentra cercano del rango para la supresión de la corriente Kv2.1 (32 μM) en neuronas GCS. Otros miembros de la familia de Kv se han identificado como blanco de la FSK, dentro de estos incluye a los canales formados por Kv1.1 y los Kv1.4 (Matthias y cols., 2002). Sin embargo comparando estos hallazgos con los canales Kv2.1, la FSK tiene un me-nor efecto para suprimir estas corrientes de potasio, porque los valores reportados de la IC50 son <100μM y 245μM, respectivamente (Matthias y cols., 2002).

Por otro lado tenemos que el efecto más visible de la FSK sobre las neuronas adaptativas del GCS es debido a: un incremento en la adaptación dependiente de la frecuencia de los potenciales de acción y por ende un decremento en el número de potenciales de acción en las neuronas GCS (Figura 3). El decremento en la excitabi-lidad por la FSK, probablemente no sea por bloqueo de canales de sodio, ya que se ha reportado que este fármaco no tiene efecto sobre dichas corrientes (Hoshi y cols., 1988), sin embargo cabe corroborar esta información en neuronas del GSC.

La FSK más bien podría estar actuando en la regulación de corrientes de potasio

28


29

que regulan el disparo repetitivo de las neuronas GCS, como serian además de la IKV, la corriente de potasio tipo A (IA), la corriente M principalmente (IKM). Sin em-bargo a manera de comprobarlo, se sugiere que ni la IA ni la IKM son responsables del cambio en el patrón de disparo de estas neuronas a adaptativas, lo anterior debi-do a: a) la supresión genética del Kv4.2, subunidad la cual en neuronas GCS genera a la IA disminuye el porcentaje de células fásicas e incrementa la cantidad de células adaptativas por lo tanto un efecto contrario a lo observado aquí (Malin y Nerbone, 2000), sin embargo aunque reduce IA, produce fenotipos de potenciales de acción similares a los fásicos. b) El bloqueo de la IKM, ya sea por receptores acoplados a pro-teínas G o bloqueadores selectivos del canal M, promueven el disparo tónico en neuro-nas (Delmas y brown, 2005; Zaika y cols., 2006), sin embargo ya que la FSK tiene al parecer también efecto sobre los canales M, se hace necesario llevar a cabo un estudio más a detalle sobre este efecto. Por tal motivo hasta aquí, pareciera que la evidencia mostrará que la disminución de potenciales de acción es principalmente debida por el bloqueo de canales Kv2.1 por qué: a) los canales Kv2.1 se activan sustancialmente durante el potencial de acción (Malin y Nerbonne, 2002); b) en la adaptación de las neuronas solo los canales Kv2.1 contribuyen a generar IKV (Malin y nerbonne, 2002); c) el fenotipo de potenciales de acción fásicos, e inducidos por la FSK es de acuerdo o va en el mismo sentido que el fenotipo tónico producido por una sobreexpresión de canales Kv2.1 en neuronas GCS (Malin y Nerbonne, 2002). La disminución de la probabilidad de disparo, merece sin lugar a duda una prueba experimental y análisis más a detalle, sin embargo, se siguiere que el bloqueo de los canales Kv2.1 y tal vez Kv2.2; ya que este último podría estar contribuyendo en la generación de la IKV. El potencial de acción se hace más largo (Marsh y brown, 1991) y el número de potencia-les de acción gradualmente disminuyen probablemente favoreciendo la subsecuente inactivación de canales de sodio.

El hecho es que la FSK fuertemente bloquea las corrientes Kv2.1 por un mecanis-mo totalmente independiente de las proteínas conocidas de transducción de señales, limitando por ende la utilidad de estas moléculas en los estudios de corto y largo plazo de la excitabilidad, especialmente en las neuronas que expresan este canal de potasio formado por las subunidades Kv2.1 y posiblemente Kv2.2.


29

REFEREnCIAS

Acosta E, Mendoza V, Castro E, Cruzblanca H (2007). Modulation of a delayed-recti-fier K+ current by angiotensin II in rat sympathetic neurons. 98: 79-85.

baranauskas G, Tkatch T, Surmeier DJ (1999). Delayed rectifier currents in rat glo-bus pallidus neurons are attributable to Kv2.1 and Kv3.1/3.2 K+ channels. 19: 6394- 6404.

Cruzblanca H (2006). An M2-like muscarinic receptor enhances a delayed rectifier K+ current in rat sympathetic neurones. 149: 441-449.

Cruzblanca H, Koh D-S, Hille b (1998). bradykinin inhibits M current via phospho-lipase C and Ca2+release from IP3-sensitive Ca2+ stores in rat sympathetic neurons. 95: 7151-7156.

Delmas P, brown DA (2005). Pathways modulating neural KCNQ/M (Kv7) potas-sium channels. 6: 850-862.

Du J, Haak LL, Phillips-Tansey E, Russell JT (2000). Frequency-dependent regula-tion of rat hippocampal somato-dendritic excitability by the K+ channel subunit Kv2.1. J 522: 19-31.

Gamper N, Shapiro MS (2003). Calmodulin mediates Ca2+-dependent modulation of M-type K+channels. 122: 17-31.

Garber SS, Hoshi T, Aldrich EW (1990). Interaction of forskolin with voltage-gated K+ channels in PC12 cells. 10: 3361-3368.

Hille b (2001) Sinauer Associates Inc: Sunderland, MA.Hoshi T, Garber SS, Aldrich RW (1988). Effect of forskolin on voltage-gated K+ chan-

nels is independent of adenylate cyclase activation. 240: 1652-1655.Hwang PM, Fotuhi M, bredt DS, Cunningham AM, Snyder SH (1993). Contrasting

immunohistochemical localization in rat brain of two novel K+ channels of the Shab subfamily. 13: 1569-1576.

Jia Z, bei J, Rodat-Despoix L, Liu b, Jia Q, Delmas P, Zhang H (2008). NGF inhi-bits M/KCNQ currents and selectively alters neuronal excitability in subsets of sympathetic neurons depending on their M/KCNQ current background. 131: 575-587.

Kuo C-C (1998). Imipramine inhibition of transient K+ current: an external open channel blocker preventing fast inactivation. 12: 2845-2857.

Malin SA, Nerbonne JM (2000). Elimination of the fast transient in superior cervical ganglion neurons with the expression of Kv4.2W362F : Molecular dissection of IA. 20: 5191-5199.

Malin, SA, Nerbonne JM (2002). Delayed rectifier K+ currents, IK, are encoded by Kv2 α-subunits and regulate tonic firing in mammalian sympathetic neurons. 22: 10094-10105.

Marsh SJ, brown DA (1991). Potassium currents contributing to action potential re-polarization in dissociated cultured rat superior cervical sympathetic neurones.

30


133: 298-302.Matthias K, Seifert G, Reinhardt SS, Steinhäuser C (2002). Modulation of voltage-

gated K+ channels Kv1.1 and Kv1.4 by forskolin. 43: 444-449.Murakoshi H, Trimmer JS (1999). Identification of the Kv2.1 K+ channels as a major

component of the delayed rectifier K+ current in rat hippocampal neurons. 19: 1728-1735.

Nahorski SR (2006). Pharmacology of intracellular signalling pathways. 147: S38-S45.

Nuwer MO, Picchione KE, bhattacharjee A (2009). cAMP-dependent kinase does not modulate the Slack sodium-activated potassium channel. 57: 219-226.

Pujades C. (2000). http://www.biomeds.net/biomedia/R24/noticia1.htm.\Rouse S.T, Hamilton S.E, Potter L.T, Nathanson N.M & Conn P.J, (2000). Neuroscience Letters 278: 61-64.

Snyders DJ, Knoth KM, Roberds SL, Tamkun MM (1992). Time-, voltage-, and sta-tedependent block by quinidine of a cloned human cardiac potassium channel. 41: 322-330.

Sokolova IV, Lester HA, Davidson N (2006). Postsynaptic mechanisms are essential for forskolin-induced potentiation of synaptic transmission. 95: 2570-2579.

Suh b-C, Inoue T, Meyer T, Hille b (2006). Rapid chemically induced changes of PtdIns(4,5)P2 gate KCNQ ion channels. 314: 1454-1457.

Tytgat J, Maertens Ch, Daenens P (1997). Effect of fluoxetine on a neuronal, volta-gedependent potassium channel (Kv1.1). 122: 1417-1424.

Wagoner PK, Pallotta bS (1988). Modulation of acetylcholine receptor desensitiza-tion by forskolin is independent of cAMP. 240: 1655-1657.

Wang H-S, McKinnon D (1995). Potassium currents in rat prevertebral and paraverte-bral sympathetic neurones: control of firing properties. 485: 319-335.

Winks JS, Hughes S, Filippov AK, Tatulian L, Abogadie FC, brown DA, Marsh SJ (2005). Relationship between membrane phosphatidylinositol-4,5-bisphospha-te and receptormediated inhibition of native neuronal M channels. 25: 3400-3413.

Zaika O, Lara LS, Gamper N, Hilgemann DW, Jaffe Db, Shapiro MS (2006). An-giotensin II regulates neuronal excitability via phosphatidylinositol 4,5-bis-phosphate-dependent modulation of Kv7 (M-type) K+channels. 575: 49-67.

d e l a u n a c t i v a d o r d e l a c i c l a s a l a p ...se regula la excitabilidad neuronal....

Documents