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Garca-Vzquez, F. A.; Mats, C.

Introduccin

Actualmente la biotecnologa repro-ductiva en las diferentes especies domsti-cas se encuentra en pleno apogeo, y dichastecnologas requieren, en la mayora delos casos, de la produccin in vitro deembriones (PIV), en reas como la transg-nesis, recuperacin de razas en peligro deextincin, clulas madre, en el tratamientode la infertilidad humanaes decir que elprogreso de las nuevas biotecnologas enparte est limitado o depende del desarro-llo de la PIV embrionaria.

Vajta et al. (2010) postularon que algunos de los logros conseguidos enesta dcada incluyen el uso militar debombas de hidrgeno y atmicas, vuelos

espaciales, submarinos nucleares, descifrarel cdigo gentico,mientras que en laciencia biolgica la produccin de blasto-citos en una placa de Petri es todava unsueo inalcanzable para la mayora de losembrilogos.

La PIV es un proceso que comprendela obtencin y maduracin in vitro (MIV)de los ovocitos, la capacitacin in vitro delos espermatozoides, el cocultivo de ambosgametos o fecundacin in vitro (FIV), y elcultivo in vitro de los embriones resul-tantes (CE) hasta alcanzar el estadio de

blastocisto. Aunque se han hecho grandesprogresos en el desarrollo de las tcnicasde MIV, FIV y CE, an son necesarias nue-vas mejoras para maximizar la produccinde embriones.

En este trabajo pretendemos propor-cionar una visin general, con especialhincapi en la especie porcina, del estadoactual del cultivo embrionario in vitroincluyendo las condiciones (nivel de ox-geno, nmero de embriones) y mtodosde cultivo, composicin de los medios,as como la dinmica de cultivo y sus

alternativas. Para ello, en primer lugar,describiremos la cronologa del desarrolloembrionario temprano hasta estadio deblastocisto y las condiciones fisiolgicasque se encuentran los embriones a niveldel oviducto y del tero, as como las

diferencias fisiolgicas entre el estadio decigoto y blastocisto.

Cronologa y desarrollo

embrionario temprano

La fecundacin tiene lugar en el ovi-ducto, en la unin ampular-stmica. Laprimera divisin se produce de 17 a 19horas tras la ovulacin (Hunter, 1974). Losembriones se mantienen en el estadio de2 clulas nicamente de 6 a 8 horas; sinembargo el estadio de 4 clulas se prolon-ga durante 20-24 horas (Flint, 1981), portanto la mayora de los embriones entranen el tero en este estadio. El tero va aser el compartimento en el que se desa-rrollarn los embriones porcinos desde el

estadio de 4 clulas hasta el nacimiento.Cuando el embrin alcanza entre 8 y 16clulas, alrededor del da 4, las blasto-meras (clulas del embrin) comienzan aformar uniones estrechas adoptando unaforma lobular denominada mrula.

Cultivo embrionario in vitroen la especie porcina (I)

Francisco A. Garca-Vzquez y Carmen MatsDepartamento de Fisiologa, Facultad de Veterinaria, Universidad de Murcia

E-mail: [email protected], [email protected]. www.um.es/grupo-fisiovet.


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Cuando la mrula est formada, lasblastmeras empiezan a separarse en 2

poblaciones distintas: las clulas internasy las externas. Las clulas de la posicininterna desarrollan uniones que por unlado permiten la comunicacin intercelulary, por otro, van a mantener agrupado aeste conjunto celular. Las clulas externasvan a desarrollar uniones estrechas, que seproducen para modificar las caractersticasde permeabilidad. Despus de que se hayanformado las uniones estrechas, los fluidosempiezan a acumularse en el interior delembrin. Este acmulo de fluido se debea la accin de la bomba de sodio, la cualintroduce iones al interior de la mrula;al aumentar la concentracin de stos, el

agua difunde hacia el interior y comienzaa formarse la cavidad o blastocele en lamasa de clulas. Esta etapa, en la que elembrin an se encuentra rodeado por lazona pelcida (ZP), recibe el nombre deblastocisto y en l se diferencian segn suposicin dos poblaciones de clulas: unainterna (masa celular interna) que dar ori-gen al embrin propiamente dicho, y otra,la situada perifricamente, que origina eltrofoectodermo o trofoblasto, que intervie-ne en la ingestin selectiva de nutrientes yformar posteriormente la placenta (Hafez,2000). Las clulas del trofoblasto tienen

permeabilidad selectiva, lo cual favorece eltransporte de agua y sodio que contribuyea la formacin del blastocele (revisado porGarca-Rosell 2005); momento a partir delcual el embrin alcanza el estadio de blas-tocisto. El estadio de blastocisto se alcanzaen el da 5-6 (Figura 1).

El blastocisto sigue creciendo hastael momento de la eclosin, donde lazona pelcida (ZP) desempea una impor-tante funcin en la regulacin osmtica(Bronson y McLaren, 1970), la conten-cin de los blastmeros en el embrin(Modlinski, 1970) y la mejora de la super-vivencia del ovocito y el embrin en el ovi-ducto y en el tero (Dumont y Brummett,1985). La rotura de la ZP en los embrionesporcinos se produce en el da 6-7. Nose conocen con exactitud los factores

que causan la lisis de la ZP, pero podranestar involucrados fenmenos mecnicos,

enzimas embrionarias o factores uterinos.Tras la eclosin (blastocisto eclosionado),los blastocistos porcinos permanecen enla luz del tero hasta el da 13. Entre laeclosin y la implantacin, el desarrolloembrionario es peor soportado por lossistemas in vitro que en estadios mstempranos. Por ejemplo, la elongacin yexpansin de los blastocistos eclosionados,al ser dependiente de factores uterinos, notiene lugar in vitro. Por tanto, el desarrolloembrionario in vitro se da por concluidotras la eclosin del blastocisto.

Fisiologa dinmica en elembrin pre-implantacional

El embrin pre-implantacional es unperiodo altamente dinmico durante elcual el embrin en estadio pronuclear sedesarrolla desde una relativa quiescenciaovocitaria bajo el control gentico mater-no hasta un grupo de clulas metablica

y bioqumicamente activas bajo su propiocontrol gentico en el estadio de blasto-

cisto (Lane y Gardner, 2007). Como resul-tado de estos cambios, existen diferentesdemandas y requerimientos, para el desa-rrollo y diferenciacin embrionarios, elcual requiere de una precisa regulacin dela homeostasis, metabolismo y expresingnica. (Tabla 1).

Diferencias fisiolgicas

en el oviducto y tero

Diversos estudios en embriones demamferos han determinado que los cam-bios morfolgicos que ocurren duranteel desarrollo desde cigoto hasta estadiode blastocisto ocurren concomitantemen-te junto con cambios en el metabolismodel embrin. Los nutrientes disponiblesen el tracto reproductivo de la hembra seencuentran en estrecha relacin con elestadio de desarrollo embrionario (Tabla 2).Por ejemplo, en el estadio de precompac-

Tabla I. Diferencias en la fisiologa de los embriones de mamferos desde el etsadio de cigoto al de blastocito (Lane y Gradner, 2007).

Figura 1. Blastocisto porcino de 6 das cultivado in Vitro, eclosionando.


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tacin, es decir cuando el embrin resideen el oviducto, el fluido se caracteriza por

una alta concentracin de piruvato y delactato, y una relativa baja concentracinde glucosa. Por el contrario, el fluido ute-rino est caracterizado por unos relativa-mente bajos niveles de piruvato y lactato,y una alta concentracin de glucosa.

Cultivo embrionario

in vitro

Como hemos mencionado anterior-

mente el CE in vitro comprende la fasedesde que tiene lugar la fecundacinhasta el estadio de blastocisto. Para rea-lizar este cultivo existen diferentes alter-nativas tanto en el sistema de cultivoutilizado (mezcla de gases, aceite mineral,nmero de embriones), o en la compo-sicin del medio, as como la dinmicade cultivo (sistema esttico o dinmico,tranquilidad o estrs, simple o secuen-cial) (Figura 2). A continuacin vamosa desglosar cada uno de estos apartados.

Sistema de cultivo embrionario

Tal y como hemos descrito en elapartado anterior las condiciones de cul-tivo in vitro difieren de las situaciones invivo en muchos aspectos, y uno de estospasos crticos es la tensin de oxgeno(Karja et al. 2004). Est claro que la con-centracin de oxgeno en el oviducto y enel tero es ms baja que en la atmsfera.El nivel de oxgeno utilizado en cultivonormalmente ha sido del 20%, pero esconocido que estos niveles de oxgenoson perjudiciales en el cultivo embrio-nario in vitro debido probablemente a laformacin de radicales libres de oxgeno

que puede dar lugar a la necrosis o apop-tosis celular. Machty et al. (2001) hanobservado un incremento en el desarrolloa blastocisto y en el nmero de clulasal cultivar mrulas MIV/FIV bajo tensinreducida (5%) de O

2.

Pero el mantenimiento de bajos nive-les de oxgeno en un incubador grande

es costoso ya que hay que usar grandesniveles de N2

que desplacen el oxgeno.Por ello, se han diseado alternativascomo el uso de mini-incubadores (Karjaet al. 2004), que tambin han sido exi-tosamente usados en FIV y en clonacin.

Otro aspecto a tener en cuenta en elCE in vitro es el nmero de embrionesy el volumen de medio de cultivo. Losembriones en el tero se encuentran entrelos pliegues del mismo rodeado por unpequeo volumen de medio. En el terose han observado cantidades nicamentede 1.5-2.0 nl rodeando al embrin (y enel oviducto probablemente cantidadesde picolitros). Teniendo en cuenta estehecho, se han publicado diversos trabajosdonde el cultivo de embriones se realizen volmenes reducidos de medio y/o engrupos incrementando significativamente

el desarrollo a blastocisto, as como elnmero de clulas de los blastocistos en

varias especies (murina, humana, bovinay ovina) (revisado por Martnez, 2002).Segn Stokes et al. (2005), los embrio-nes porcinos deben cultivarse en grupos10-20 embriones/20 l de medio. Otrosautores en cambio han obtenido bue-

nos resultados utilizando 40-50 embrio-nes/500 l de medio (Mats et al. 2003).No obstante, lo que si parece estar claroes que bajo las condiciones actuales, silo embriones se cultivan individualmentesufren un arresto y no avanzan a estadioblastocisto.

Segn han descrito diversos autoresel efecto beneficioso del cultivo en grupoy/o en pequeo volumen de medio es laproduccin de factores autocrinos y/oparacrinos por parte del embrin en culti-vo (Paria y Dey, 1990; ONeill, 1998), esti-

Tabla II. Diferencias fisiolgicas entre el oviducto y el tero durante el desarrollo embrionario de los mamferos (Lane y Gradner, 2007).

Sistema cultivo

Medio cultivo

Dinmica cultivo

Co-cultivotejidos/suplementos

Gases

Aceite

Sistema Cultivo(WOW; tubos...)

Nmeros embriones yvolumen medio

Renovacin medio

Tranquilidad-estrs

Simple secuencial

- Agua

- Iones

- Carbohidratos

- Aminocidos

- Vitaminas

- Quelantes

- Antioxidantes

- Antibioticos

- Protenas/macromolculas

- Hormonas/actores crecimiento

- Bufer

Figura 2. Componentes de un sistema de cultivo embrionario.


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mulando su propio desarrollo y el de losembriones vecinos. Segn esto, el cultivoen volmenes grandes dara lugar a ladilucin de los factores beneficiosos pro-ducidos por el embrin, de tal modo quela concentracin presente en el medio decultivo no sera suficiente para ejercerdicho efecto (Gardner, 1994).

El desarrollo embrionario tambin seencuentra influenciado por la distancia ala cual se encuentren los embriones entresi al ser cultivados. Recientemente, Stokeset al. (2005) publicaron un estudio dondecultivaban los embriones porcinos conuna distancia determinada entre ellos. Eneste estudio los embriones no se movanya que la placa de petri estaba cubiertacon extractos de protena polifenlicas.Concluyeron que la distancia ptima decultivo entre embriones se encontrabaentre 60 y 180 m. En los embrio-

nes cultivados en distancias ms cortasposiblemente dichos efectos beneficiososse neutralicen debido a concentracionesaltas y localizadas de metabolitos txicoscomo el amonio. Y con distancias supe-riores a 180 m los factores beneficiososquedan diluidos.

Adems de lo descrito anteriormentedebemos tener en cuenta otros factoresque pueden influir en el desarrollo embrio-nario in vitro. A continuacin detallamosalgunos de ellos:

La mayora de las placas de cultivo quese utilizan son esterilizadas mediantexido de etileno, compuesto que puedetener un efecto adverso en el desarro-llo embrionario (Schiewe et al. 1985;Holyoak et al. 1996). Sin embargo, aa-diendo quelantes al medio de cultivo,como el EDTA, se pueden reducir estosefectos adversos.

Benzotiazoles txicos procedentes delmbolo de jeringuillas (utilizadas parael filtrado y esterilizacin del medio)tambin podra influir negativamenteen el desarrollo embrionario (Vanroose

et al. 2001).

Tambin debemos tener en cuenta quelos embriones desarrollados in vivo noestn en ningn momento expuestosa la luz ultravioleta o luz visible, pero sien condiciones in vitro, por lo que en lamedida de los posible deberamos redu-cir dicha exposicin, para evitar efectosadversos sobre los embriones.

El aceite mineralse usa para evitar que elmedio se evapore, ya que si esto ocurrecambia la osmolaridad del medio con el

consiguiente perjuicio en el desarrolloembrionario. Tambin evita cambios detemperatura y pH cuando se estnmanipulando. Sin embargo, diversosfactores lipoflicos pueden pasar almedio y ser txicos para el embrin.

La higiene en el laboratorio es tambinimportante en la produccin embrio-naria (Schiewe, 1998). La produccinde embriones in vitro debe tener lugaren un ambiente limpio. Comer y beberest totalmente prohibido, las manosdeben lavarse peridicamente conagua y jabn, y enjuagarse con alcohol

(por ejemplo, etanol), pero teniendoen cuenta que los vapores del alcoholpueden perjudicar el desarrollo embrio-nario.

Mtodos de cultivo embrionario

Histricamente el cultivo embrio-nario se ha realizado en placas de cultivo (de4 pocillos, placas de 20 mm de dimetro),en diferentes condiciones de volumen demedio y densidad embrionaria, como yahemos mencionado anteriormente. Pero

desde el punto de vista fisiolgico estossistemas no son ideales, ya que en condi-ciones in vivo, los embriones se encuentranrodeados de un volumen muy pequeo demedio. Por esta razn, se estn desarrollan-do nuevos mtodos de cultivo intentandomimetizar, en la medida de lo posible, las

condiciones in vivo para optimizar el desa-rrollo embrionario. A continuacin vamos adescribir algunos de ellos.

Micropocillos

En el ao 2000 Vajta et al. desarrollaron unnovedoso y sencillo sistema de desa-rrollo embrionario in vitro basado en elcultivo de los embriones en micropoci-llos, reduciendo de esta manera el volu-men de medio que rodea a los embrio-nes, debido a la importancia que tienecomo ya hemos mencionado anterior-

mente. Este trabajo fue realizado en laespecie bovina obteniendo resultadosde ms de un 60% de desarrollo hastaestadio de blastocisto en comparacincon los sistemas tradicionales de cultivoembrionario en placas de 4 pocillos uti-

lizando volmenes de 400 l de medio.Beneficios similares tambin han sidodemostrados en otras especies como laespecie porcina, humana y murina (Takaet al. 2005; Vajta et al. 2008).

Tubos

Recientemente, Roh et al. (2008), cultiva-ron embriones de ratn en microtubosnormalmente usados en PCR. Como yahemos descrito anteriormente, el aceiteque se usa en cultivos embrionariospuede ser perjudicial, con este siste-ma se pretende reducir o eliminar porcompleto el contacto entre el aceite yel medio de cultivo. Adems, otra delas ventajas de usar estos microtuboses que los embriones van a estar unosms cerca de otros que en una placa omicrogota; y aunque segn otros estu-dios, tienen que tener cierta separacin

entre embriones, puede ser que en lostubos la eliminacin de los productostxicos sea ms rpida y haya un mejoraprovechamiento de los nutrientes y delos factores auto- y para-crinos (Roh etal. 2008). Otro factor a tener en cuentaen este estudio es la diferencia de

toxicidad entre los dos tipos de plsticoutilizados en la placa (poliestireno) yen el tubo (polipropileno), pudiendoinfluir en el CE. Los resultados obteni-dos demostraron un mayor desarrolloen blastocistos comparados con el cul-tivo en microgotas (Roh et al. 2008).En la especie porcina todava no se harealizado ningn estudio utilizando estesistema de microtubos.

Capilares de vidrio

Otro sistema de cultivo que se est imple-

mentando es el uso microcapilares. Yaen 1965 Mulnard describi el cultivo deembriones de ratn en un microcapilarcon un dimetro interno de 1-2 mm,que fue cultivado horizontalmente enplacas de petri cubiertas de aceite. Este


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sistema se qued en el olvido hasta elao 2003, donde Thouas et al. cultivaronembriones de ratn en microcapilares devidrio (tambin denominados oviductosde vidrio), cultivados verticalmente en

1 l de medio, obteniendo blastocistoscon un mayor nmero de clulas encomparacin con el cultivo en micro-gotas. Hasta el momento este sistemano ha sido desarrollado en la especieporcina, aunque podra proporcionaruna buena herramienta y alternativa alos mtodos tradicionales.

Microfluidos y microcanales

Otra alternativa para el desarrollo embrio-nario es el uso de microfluidos enmicrocanales donde se sitan losembriones. El xito inicial del uso demicrocanales en el cultivo embrionarioen ratones (Raty et al. 2001) ha dadolugar al cultivo de embriones de otrasespecies incluida el cerdo. Walters et al.(2003) cultivaron embriones de 4 clu-las hasta el estadio de blastocisto enmicrocanales dando lugar finalmente ala produccin de lechones vivos. Kim et

al. (2009), desarrollaron un novedososistema de microfluidos basado en laestimulacin mecnica derivada de laperistalsis. Para investigar los efec-tos de la estimulacin mecnica en eldesarrollo embrionario en canales demicrofluidos, los embriones de bovinofueron cultivados en canales rectos encomparacin con canales con areasde estrechez. Adems se acopl unmaquina agitadora para crear un flujopor gravedad. Este trabajo representaun intento de mimetizar la constriccinperistltica que ocurre in vivo en el

tero (Figura 3).

Composicin medios CE

El diseo del medio de cultivo pti-mo debera ser, en principio, aqul que

imitara, en la medida de lo posible, lascondiciones ambientales a las que estsometido el embrin in vivo. De esta mane-ra vamos a promover una actividad meta-blica normal y un desarrollo mximo del

embrin in vitro. En trminos generales,un medio de cultivo embrionario debe deestar compuesto por agua, sales inorg-nicas, compuestos energticos, protenas,aminocidos, quelantes, hormonas del cre-cimiento o vitaminas, antibiticos, etc. Unavez preparados, los medios de cultivo seesterilizan por filtracin, hacindolos pasara travs de una membrana con un dime-tro de poro de 022 m. Debemos de teneren cuenta que algunos de los componentesse pueden degradar espontneamente porlo que se adicionan inmediatamente antesde su utilizacin.

En cualquier medio de cultivo hay quetener presente la osmolaridad que necesi-tan las clulas a cultivar y el mantenimien-to del pH. En cuanto a la osmolaridad, seha determinado que los valores observadosen las secreciones uterinas oscilan entrelos 280 20 mOsm/Kg. Sin embargo, exis-ten evidencias que indican que valores de

alrededor de 245 mOsm/Kg favorecen eldesarrollo embrionario (Duque y col 2003).En lo referente al pH, la mayora de losembriones de mamferos cultivados in vitrose desarrollan en pH neutro o ligeramentealcalino, encontrndose los mejores resul-tados entre 7,2 y 7,6.

Agua:

El componente que participa enmayor proporcin en la formulacin decualquier medio de cultivo es el agua, porello su grado de pureza est fuertemente

relacionado con el desarrollo embrionario(Marquant-Leguienne y Humblot 1998).El agua que se utiliza para la elaboracinde los medios de cultivo debe ser ultra-pura y libre de pirgenos. Los sistemas depurificacin del agua utilizan el principio

de smosis reversa. En estos equipos, elgrado de pureza del agua puede ser con-trolado mediante la determinacin de suresistencia al paso de la corriente elctrica(cuanto mayor sea sta, mayor ser su

pureza). La mayor resistencia ofrecida es18,3 megaohms-cm a 25C.

Sales inorgnicas:

Normalmente la composicin desales inorgnicas de un medio de cultivopretende imitar los componentes analiza-dos in vivo. Se ha determinado que el flui-do oviductal bovino y ovino se caracterizapor tener por bajos niveles de Na+ y altosniveles de K+ si se comparan con los nive-les plasmticos, por ello, estos dos ele-mentos son cuidadosamente balanceadosal formular los medios de cultivo. Entreotros elementos inorgnicos importantesen la composicin de los medios encon-tramos: magnesio, calcio, bicarbonato,sulfatos y fosfatos. Son muchas las fun-ciones de estas sales, a modo de ejemplopodemos citar el papel del cloruro sdicoque participa en la regulacin osmtica oel calcio y el potasio que son esenciales

para un desarrollo embrionario adecuado(Palasz, 1996). No obstante, en cualquiermedio de cultivo embrionario hay dos ele-mentos constantes: una fuente energticay una fuente proteica.

Fuente energtica:

La glucosa es el principal substratoenergtico que consumen las clulas; sinembargo para embriones de porcino pare-ce ser perjudicial en los primeros estadiosde desarrollo preimplantacional (Bavister,1995). Durante esta etapa del desarrollo

se presenta una falta de utilizacin deglucosa debido a la falta de actividad de laenzima fosfofructoquinasa cuya funcines acelerar la gluclisis catalizando la for-macin de fructosa 1-6 bifosfato a partirde fructosa 6 fosfato, lo que se encuentra

IN VIVO

Embrin

Direccinmovimientoembrin

rea constriccin

Aceitemineral Entrada Reservaaceite

Medio Embriones

Lmina cristal

Figura 3. Esquema de los movimientos del embrin in vivo en el aparato reproductor femenino y sistema de microcanales in vitro delcultivo embrionario (Kim et al. 2009).


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controlada alostricamente por el cocienteATP-ADP, siendo particularmente alto eneste perodo (Gardner, 1998). Adems, lapresencia de glucosa puede inhibir la fos-forilacin oxidativa cuando en este estadiolos embriones dependen de esta va paragenerar energa (Thompson, 2000). El piru-vato y el lactato son las principales fuentes

de energa en el embrin temprano duranteel desarrollo in vitro (Pinyopummintr yBavister, 1996). Sin embargo, tras la com-pactacin (estadio 8-16 clulas) el embrinutiliza la glucosa como fuente energtica yes metabolizada principalmente a lactato(Sinclair et al. 2003). La explicacin a estehecho se basa en que en el embrin en esteestadio y en respuesta a una alta demandade energa necesaria para la compactaciny la formacin y expansin del blastoce-le (Gardner, 1998), el cociente ATP-ADPpodra disminuir, y con ello, la inhibicinejercida sobre la enzima mencionada, con

lo cual aumentara el consumo de glucosa.Este metabolito tambin participa en lasntesis de precursores de cidos nucleicosy de lpidos (Gardner y Lane, 1998) y sudisponibilidad sera importante durante laeclosin fuera de la zona pelcida (Menezoy Khatchadourian, 1990). Por esta razn,aunque se ha logrado cultivar embrioneshasta el estado de blastocisto en mediossin glucosa, stos son de menor calidad yviabilidad cuando se comparan con los cul-tivados en medios con glucosa. Por tantola propuesta de Kikuchi (2004) en cuantoa la utilizacin de un cultivo secuencial,piruvato y lactato como sustratos energ-ticos durante las primeras 72 h de cultivo yglucosa a partir de ese momento, sera unaopcin de mejora.

Con respecto a los lpidos, poco sesabe acerca de la importancia que ten-dran en la produccin de energa duran-te el desarrollo embrionario temprano(Thompson, 2000), aunque podra tenercierto papel en relacin al grado de fluidezde la membrana plasmtica (Imai et al.1997; Hochi et al. 1999).

Fuente proteica:

Aminocidos

Se ha determinado que tanto el fluidooviductal como el uterino contienen altosniveles de aminocidos libres. Por otrolado, los ovocitos y embriones poseentransportes especficos de aminocidospara mantener un pool endgeno. Hastael estadio de 8 clulas, aquellos aminoci-dos presentes en niveles altos en el fluidooviductal (aminocidos no esenciales yglutamina) incrementan la divisin celu-lar y viabilidad. Tras la compactacin, los

aminocidos no esenciales y la glutaminafavorecen la formacin del blastocele ylos aminocidos esenciales son requeri-dos para el desarrollo y viabilidad de lamasa celular interna. Estudios sobre cul-tivo de embriones han demostrado que la

inclusin de aminocidos en el medio decultivo aumenta el desarrollo embrionarioy aumenta la viabilidad del blastocisto.Adems, estos elementos son utilizadoscomo fuente de energa, como buffer intra-celular (Edwars et al. 1998) y para la sn-tesis de protenas. Su incorporacin a lasclulas se ve facilitada por transportadores

de membrana especficos los cuales estnregulados en funcin del grado de desarro-llo o en respuesta a seales externas (VanWinkle, 2001). Otras funciones propuestasson reguladores de presin osmtica, depH, precursores biosintticos, antioxidan-tes, quelantes (Gardner, 2008).

Macromolculas

Varios son los sustratos que se hanutilizado como fuente de protenas en losmedios de cultivo embrionario entre los

que destacan el suero fetal bovino (SFB) yla albmina srica bovina (BSA) (Wang etal. 1997).

El suero constituye la fraccin lquidaresultante del proceso de coagulacin san-gunea y su composicin presenta peque-as variaciones dependiendo del animal.Una molcula que siempre encontramosen el suero es la albmina. Esta protenatiene carcter cido, es soluble en agua ytiene un peso molecular aproximado de69.000 kDa. La albmina adems de seruno de los componentes ms importantesdel suero sanguneo tambin es la prote-na ms abundante en el fluido oviductal(Leese, 1988).

Algunos de los efectos benficos quejustifican la utilizacin del suero y la alb-mina son (revisado por Mucci et al. 2006):

Proteger a los embriones en cultivo desustancias txicas (ej. metales pesa-dos).

Aportar factores de crecimiento y ciertashormonas.

Reducir la tensin superficial del medio(lo que evita que los embriones se

adhieran al instrumental como placasde cultivo, pipetas, tubos, etc.).

Tanto el suero como la BSA tienen unpapel similar como suplemento proteico.Sin embargo, la posible presencia de ele-mentos no identificados formando partede su composicin determinan que algunosaspectos de su funcin an no sean com-pletamente conocidos (Mucci et al. 2006).En los ltimos aos, el suero ha sido objetode numerosos estudios para determinarsi su adicin es definitivamente necesariapara mejorar los resultados de produccin

in vitro, en funcin de la cantidad y calidadde los embriones obtenidos. Los resulta-dos de estos trabajos son muy variables eincluso contradictorios y el motivo podraencontrarse en la diferente composicindel suero, ya que ste depende del estado

fisiolgico en que se encuentre el animaldel cual proceda (Palasz, 1996). Por otrolado, tambin habra que determinar enque momento del cultivo embrionario sedebera suplementar el medio. Se ha deter-minado que la adicin de suero inhibe losprimeros estadios de desarrollo aunqueestimula el desarrollo de mrulas y blas-

tocistos (Pinyopummintr y Bavister, 1994;Thompson et al. 1998), acelera el desarrolloembrionario (Gmez y Diez, 2000; Holm etal. 2002) incrementa el nmero de clulasembrionarias (Fouladi-Nashta et al. 2005)y favorece la eclosin (Wang et al. 1997;Gmez y Diez, 2000).

Con el fin de evitar la variabilidaddebida a la diferente composicin deestas dos sustancias, suero y BSA, se haestudiado el uso de polmeros sintticoscomo sustitutos de ellas en la produccinde embriones in vitro. Entre los polmeros

ms estudiados se encuentra el alcoholpolivinlico y la polivinilpirrolidona (Ectorset al. 1992; Gardner y Lane, 1998). Estoscompuestos han demostrado proveer unabuena actividad surfactante y previenen laadhesin entre gametos o con las super-ficies de contacto. No obstante, algunosautores han encontrado una menor tasade produccin de embriones as comodiferencias metablicas importantes entreembriones cultivados con o sin estoscomponentes (Thompson, 2000; Orsi yLeese, 2004).

Otros componentes:

Otros componentes que se utilizanpara suplementar el medio de cultivo sonfactores de crecimiento y hormonas comola insulina que ayudan al transporte deglucosa al blastocisto (Gardner y Kaye,1991), o agentes quelantes como el EDTAque mejora el desarrollo en los primerosestadios del embrin (revisado por Lane yGardner, 2007).

En porcino se han utilizado grancantidad de medios de cultivo para eldesarrollo embrionario in vitro desde el

estadio de cigoto hasta el de blastocisto.Entre ellos destacan el medio Whitten(Beckmann y Day, 1993), NCSU 23 (Pettersy Wells, 1993), Bavister (Polard et al.1995), BECM-3 (Dobrinsky et al. 1996) oPZM 5 (Yoshioka et al. 2008). De todosellos, tal vez el ms utilizado por losbuenos resultados obtenidos, ha sido elNCSU 23. Yoshioka et al., (2002) realizun estudio sobre medios basado en lacomposicin del fluido oviductal porcinoen el que no suplementaba con glucosay lo compar con el NCSU23. Aunquelos resultados obtenidos fueron simila-

res en cuanto a calidad embrionaria, lonovedoso de este medio fue que estabaqumicamente definido, lo cual permitela reproducibilidad de las experiencias aleliminar los preparados proteicos de losprotocolos.

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