“Cuantificación de clotiazepam en plasma humano, con cromatografía

gaseosa acoplada a un espectrómetro de masa”

Sung-Hoon Ahn, Han-Joo Maeng, Tae-Sung Koo,Dae-Duk Kim, Chang-Koo Shim, Suk-Jae Chung∗

Department of Pharmaceutics, College of Pharmacy, Seoul National University, San 56-1, Shinlim-dong, Kwanak-gu,

Seoul 151-742, South KoreaReceived 3 November 2005; accepted 21 February 2006

Available online 6 March 2006JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY B

Análisis industrial cromatográfico 2011Costantino, Andrea Rosana

Clotiazepam:

FARMACOCINETICA: Vía oral: Se absorbe rápidamente (T max. 0.5-15hs). El grado de unión a proteínas plasmáticas es del 99%. Se metaboliza en el hígado, dando lugar entre otros metabolitos activos a hidroxiclotiazepam y desmetilclotiazepam. Es eliminado mayoritariamente en la orina en la forma de metabolitos glucuronoconjugados. Su semivida de eliminación

Primeros Métodos:

• CG-ECD• CG-NPD• CG-MS• CG-MS/MS• HPLC

OBJETIVO:

Desarrollar y validar un método para determinar clotiazepam en plasma humano usando CG-MS, y su

aplicación en estudios farmacocinéticos.

“ORIENTACION PARA LA INDUSTRIA: METODOS BIOANALITICOS DE VALIDACION (FDA, MAYO 2001)”

Validar es documentar mediante el uso de investigaciones de laboratorio especificas que las características del funcionamiento del método son adecuadas y fiables para el análisis. La aceptabilidad se corresponde directamente con los criterios para validar.

Da recomendaciones generales para validar un método:•Protocolo•Obtención, envio, recepción y almacenamiento de especímenes•Preparación de muestra•Aparatos•Métodos•Parámetros:

Especificidad/ Selectividad Precisión Exactitud Linealidad Limite de cuantificación Estabilidad de solución patrón y la sustancia a analizar en la matriz biológica

bajo las condiciones de análisis y durante todo el proceso de almacenamiento incluidos los procesos de congelación y descongelación que puede sufrir.

RESULTADOS Y DISCUSION:• Estándar: Clotiazepam• Estándar interno: Diazepam

PREPARACION DE SOLUCIONES ESTANDAR:

Solución patrón: 1 mg/ml

Solución estándar de trabajo de clotiazepam

Alícuota 20µl + Blanco de plasma humano

Muestras estándar de Clotiazepam en plasma

(5, 10, 20, 50, 100 o 200 ng/ml)

Solución estándar de trabajo de

estándar interno

5µg/ml

Tratamiento o Pre-tratamiento de muestra:

Medida cuantitativa de las pérdidas

Corrección por pérdida:

Extracción:1. Sólido-Sólido2. Con fluidos supercríticos3. Liquido-Liquido4. En fase solida (FSE)

% de Recuperación= 100 x Conc. De anlito encontrada Conc. De anlito en muestra

RSD = σ total Contenido del analito

Extracción en Fase Sólida:

• Ventajas: Mas completa recuperación del analito en menos tiempo Mas eficiente separación de interferentes Menos consumo de solventes Colección mas fácil de los analitos Manualmente mas conveniente Permite la fácil remoción del material particulado Mas fácil de automatizar

• Desventajas: Variabilidad entre cartuchos SPE Adsorción irreversible de algunos analitos al material de los

cartuchos.

TECNICAS DE SPE CON FASES SOLIDAS EN CARTUCHOS

• USOS DE SPE:- Remoción de interferentes que se superponen con los analitos de interés

en ensayos subsecuentes- Remoción de contaminantes “asesinos” de columnas- Concentración y “enriquecimiento” de analitos- Desalación

• OTROS USOS:- Intercambio de un solvente por otro- Derivatización “in situ”- Almacenamiento y transporte de muestra

PASOS DE SPE:

INSTRUMENTACION:CG: HP 6890MS:5973

• COLUMNA: FSOTWCOT:- 30MTS - 0.25 mm di- 0.25 µm- RANGO DE T°: -60 A 325/350°C

• FE:HP-5MS5% fenil metil polisiloxano

• FM: gas carrier: Helio

• INYECTOR: split/splitless: Modo Split

• 2 RAMPAS DE T°:T° inicial: 150°C30°C/min hta 210°C8°C/min hta 270°C por 0.5min

Relación de splitFlujo del venteo Flujo en la columna+

Flujo en la columna=

ANALISIS CUANTITATIVO:• ALTURA:

• AREA:

- VENTAJAS:No se requiere calibraciónSimple, cálculos rápidosNo es critico el volumen de inyecciónBaja dependencia con parámetros cromatográficos

- DESVENTAJAS: Suposiciones (Respuesta uniforme del detector, todos eluyen, todos son

detectados) Cuantifica todos los componentes Todas las áreas deben ser correctas

- METODOS Normalización Adición de estándar Estándar externo Estándar interno

ESTÁNDAR INTERNO:

• VENTAJAS: Se agregan compuestos conocidos al estándar y muestra El volumen de inyección no es critico Calibro los picos de interés Corrige la respuesta del detector

• DEVENTAJAS:Comprar estándar internoEncontrar uno que funcione y ande bien para mi muestraDebo agregar un componente a mi muestra

Factores de Respuesta:

Ejemplos:

Método del estándar interno:

Curva deCalibración Empleo de un solo estándar:

Factor de respuesta relativo

• LINEALIDAD: Fue evaluado para muestras estándar de plasma 5-200ng/ml

• PRECISION Y EXACTITUD:

Precisión: < 13.5%Exactitud: 92.4 – 107.9 %

• ESPECIFICIDAD:

• SENSIBILIDAD:LQC: 5ng/ml (S/R: 5/1)Precisión: <20 %Exactitud : 80-120%

• RECUPERACIÓN:

- SIN EXTRACCION: ESTANDAR DE CLOTIAZEPAM EN METANOL (5 , 50 Y 200 NG/ML) + S. I.- CON EXTRACCION: MUESTRAS ESTANDAR DE CLOTIAZEPAM EN PLASMA (5 , 50 Y 200

NG/ML) + S. I.

• ESTABILIDAD:

La estabilidad del clotiazepam y S. I. en las 3 concentraciones (baja, media, alta), fue examinada en distintas condiciones, todas fueron comparadas con las muestras frescas.

Parámetros fueron:92.7-99.6% iguales a los del control

• FARMACOCINETICA:

CONCLUSION:

CG-MS fue desarrollado para la determinación de clotiazepam en plasma humano. Este

método tuvo adecuada sensibilidad, reproducibilidad y especificidad.

Teniendo en cuenta los parámetros farmacológicos obtenidos permite que pueda

usarse para estudios de farmacocinética de clotiazepam en seres humanos.

MUCHAS GRACIAS!!!!