ctb biorreactores
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BiotecnologBiotecnologa Industriala IndustrialProducciProduccin industrial de Metabolitos n industrial de Metabolitos
BiorreactoresBiorreactores
CONCEPTOS y TECNICAS de CONCEPTOS y TECNICAS de BIOTECNOLOGIABIOTECNOLOGIA
((FCEyNFCEyN UBA )UBA )
Miryan CassanelloPINMATE Dep. Industrias, FCEyN-UBA
E-mail: [email protected]
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Estadstica: ao 2002(Fuente: Kent y Riegel, 2007)
Relevancia econmica de los productos generados industrialmente mediante procesos biotecnolgicos
Productos Productos biotecnolbiotecnolgicosgicos:: estn en todos los sectores de la
drogas (genricas y no-genricas)
productos de belleza
procesamiento de alimentos para humanos y animales
procesamiento textil y artculos de limpieza
aplicaciones industriales: produccin masiva de alcohol
suplementos nutricionales
vida diaria:
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Productos Organismo tpico utilizado Mercado mundial(ton/ao)
Alcoholes Etanol Saccharomyces cerevisiae 20 millones
Butanol/acetone Clostridium acetobutylicum 2.000cidosorgnicos
Acido ctrico Aspergillus niger 230.000Acido glucnico Aspergillus niger 50.000Acido lctico Lactobacillus delbrueckii 20.000
Aminocidos Acido L-glutmico
Corynebacterium glutamicum 300.000
L-lisina Brevibacterium flavum 30.000L-fenilalanina Corynebacterium glutamicum 2.000L-arginina Brevibacterium flavum 2.000
Antibiticos Penicilinas Penicillium chrysogenum 40.000Cefalosporinas Cephalosporium acremonium 10.000Tetraciclinas Streptomyces aureofaciens 10.000
Productos obtenidos mediante procesos biotecnolProductos obtenidos mediante procesos biotecnolgicosgicos
(Fuente: Doran, 1995)(Fuente: Doran, 1995)
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Producto Organismo tpico utilizado Mercado mundial(ton/ao)
Enzimas Proteasas Bacillus spp. 600-Amilasa Bacillus amyloliquefaciens 400Glucoamilasa Aspergillus niger 400Glucosa isomerasa Bacillus coagulans 100Pectinasa Aspergillus niger 10
Polmeros Xantanos Xanthomonas campestris 5.000Dextrano Leuconostoc mesenteroides 200
Vitaminas B12 Propionibacterium shermanii 10Vacunas Difteria Corynebacterium diphterie < 50 kg/ao
Ttanos Clostridium tetani PequeaProtenasteraputicas
Insulina Escherichia coli recombinante < 20 kg/aoInterfern-2 Escherichia coli recombinante 10Hormona de crecimiento
Escherichia coli recombinante o clulas recombinantes de mamferos
Pequea
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BIOTECNOLOGIABIOTECNOLOGIA
BiotecnologBiotecnologaaROJAROJA
BiotecnologBiotecnologaaBLANCABLANCA
BiotecnologBiotecnologaaVERDEVERDE
BiotecnologBiotecnologaaAZULAZUL
Biotecnologa BLANCA (o industrial): Aplicacin en la industria en general, productos qumicos, nuevos materiales, biocombustibles, etc.
Biotecnologa VERDE: Aplicacin en agro-alimentos
Biotecnologa AZUL: Aplicacin en organismos marinosBiotecnologa ROJA:
Aplicacin en medicina
IngenierIngenieraa QuQumicamicaQuQumicamicaBiologBiologaa
BioquBioqumicamica
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BIOTECNOLOGIA BIOTECNOLOGIA INDUSTRIALINDUSTRIAL
Biotecnologa : actividad multidisciplinaria que comprende la aplicacin de los principios cientficos y de la ingeniera al procesamiento de materiales por agentes biolgicos para proveer bienes y servicios. (Definicin de la OECD)
Agentes biolgicos: clulas microbianas, animales, vegetales y enzimas.
Bienes: cualquier producto industrial (alimentos, bebidas, productos medicinales, etc.
Servicios: especialmente los relacionados con la purificacin de aguas y tratamiento de efluentes.
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Bibliografa libros de textoBioprocess Engineering. Basic concepts, Michael L. Shuler, FikretKargi, Prentice Hall Int. Series, 2nd Ed. 2002.Kent and Riegels Handbook of Industrial Chemistry andBiotechnology, J.A. Kent (Ed.), Chapter 30: Industrial Biotechnology: Discovery to Delivery, G. Chotani, T. Dodge, A. Gaertner, M. Arbige, Springer, 11th Ed. 2007.Principios de Ingeniera de los bioprocesos, Pauline M. Doran, Editorial Acribia S.A, Zaragoza, Espaa. 1995. (Traducido 1998)Biochemical Engineering Fundamentals, James E. Bailey, David. F. Ollis, McGraw-Hill Int. Ed., 2nd. Ed. 1986.Biochemical engineering and biotechnology, Ghasem Najafpour, Elsevier, (2007) ISBN-10: 0444528458; ISBN-13: 978-0444528452Bioreaction Engineering Principles, Jens Nielsen, John Villadsen, Gunnar Lidn. Springer, 2da. Ed. (2005). ISBN-10: 0306473496; ISBN-13: 978-0306473494
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Bibliografa algunos reprints de biotecnologia industrialXu, J., Ge, X., Dolan, M.C., Towards high-yield production of pharmaceutical proteins with plant cell suspension cultures. Biotechnology Advances 29 (2011) 278299Brennan, L., Owende, P., Biofuels from microalgaeA review of technologies for production, processing, and extractions of biofuels and co-products. Renewable and Sustainable Energy Reviews 14 (2010) 557577Huang, T-K., McDonald, K.A., Review: Bioreactor engineering for recombinant protein production in plant cell suspension cultures. Biochemical Engineering Journal 45 (2009) 168184Rosche, B., Li, X.Z., Hauer, B., Schmid, A., Buehler, K., Microbial biofilms: a concept for industrial catalysis? Trends in Biotechnology 27 (2009) 636643Lacaze, G., Wick, M., Cappelle, S., Emerging fermentation technologies: Development of novel sourdoughs. Food Microbiology, 24 (2007) 155160Gavrilescu, M., Chisti, Y., Biotechnologya sustainable alternative for chemicalindustry. Research review paper. Biotechnology Advances, 23 (2005) 471499Butler, M., Animal cell cultures: recent achievements and perspectives in the production of biopharmaceuticals. Appl Microbiol Biotechnol, 68 (2005) 283291Kretzmer, G., Industrial processes with animal cells. Appl Microbiol Biotechnol, 59(2002) 135142
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Objetivo de la produccin industrial de clulas o de
microorganismos
Producir las mismas clulas o microorganismos (biomasa) en gran escala
Producir en gran escala compuestos (intracelulares o extracelulares) resultantes del crecimiento celular (metabolitos)
Metabolitos Primarios
Metabolitos Secundarios
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Metabolitos primariosMetabolitos primarios-Molculas generalmente sencillas, que participan de los caminos metablicos esenciales. Son casi idnticos en todos los organismos.
-Son ms baratos y sencillos de producir, tienen bajo contenido de actividad biolgica y frecuentemente son commodities
1. Componentes esenciales de las clulas/microorganismos: protenas, cidos nuclicos, polisacridos (gelanos, xantanos) y polisteres, cidos grasos (insaturados), esteroles.
2. Derivados del metabolismo intermedio: azcares (fructosa, ribosa, sorbosa), cidos orgnicos (gluconato, cido lctico, ctrico, actico, propinico, succnico, fumrico), alcoholes (xilitol, etanol, glicerol, sorbitol, butanol), aminocidos (Lys, Thr, Glu, Trp, Phe), vitaminas (B2, B12), nucletidos saborizantes (cidos inocnico y guanlico), polisacridos y polisteres de reserva.
Microorganismos productores: bacterias, levaduras y hongos
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Metabolitos secundariosMetabolitos secundarios-Molculas mas complejas, que participan de caminos metablicos no-esenciales, pero confieren capacidades de supervivencia en situaciones de stress.
-Son muy variados y su estructura es fuertemente dependiente de la especie y variedad utilizada para su produccin. Se generan en condiciones particulares y son ms valiosos y complicados de producir alto contenido de actividad biolgica
-Generalmente son productos especiales (alto precio). Funcionan en los organismos que los producen como:1. Armas contra otros microorganismos (antibiticos, toxinas,
inhibidores enzimticos, pesticidas)2. Factores de crecimiento (hormonas)3. Ionforos4. Agentes de interaccin microbiana5. Efectores externos
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PROCESOS BIOTECNOLOGICOS o PROCESOS BIOTECNOLOGICOS o FERMENTACIONESFERMENTACIONES
Biorreactoro
Fermentador
Procesos que se llevan a cabo en un bio-reactor mediante los cuales se transforman los sustratos de un medio de cultivo (materias primas) en metabolitos y/o en biomasa (productos) empleando para este fin microorganismos, clulas o enzimas.
Operaciones unitarias
Operaciones unitarias
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Principales etapas de un proceso biotecnolPrincipales etapas de un proceso biotecnolgico industrial:gico industrial:
1)Propagacin de cultivos: comienza en un tubo de ensayo o un tubo congelado o liofilizado donde se conserva la cepa de inters, o de una colonia del microorganismo previamente seleccionado. Se propaga en el laboratorio progresivamente aumentando el volumen del medio de cultivo.
EsterilizacinPreparacin de
medios
FermentacinSeparacin
Purificacin
Propagacin de los cultivos
2)Fermentacin: Se prepara el medio de nutrientes y se esteriliza. Se siembra un tanque de inculos cuyo volumen depende de la escala industrial. Vinoculos~50-1000L y Vfermentador industrial~10-1000 m3).
Tratamiento de efluentes
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3)Separacin y purificacin: operaciones mecnicas de ruptura de clulas; separacin de insolubles por filtracin, centrifugacin o sedimentacin; separaciones primarias por extraccin, absorcin, adsorcin, ultrafiltracin; purificacin por extraccin lquido-lquido, extraccin en dos fases acuosas o cromatografa de afinidad; aislamiento y acondicionamiento del producto.
Principales etapas de un proceso biotecnolPrincipales etapas de un proceso biotecnolgico industrial:gico industrial:
EsterilizacinPreparacin de
medios
FermentacinSeparacin
Purificacin
Tratamiento de efluentes
Propagacin de los cultivos
4)No tiene relacin directa con el producto pero es una etapa imprescindible por los volmenes involucrados y para preservar el medio.
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SelecciSeleccin (n (screeningscreening))En la seleccin del microorganismo/clula, se debe tener en cuenta:
1. La cepa a utilizar debe ser genticamente estable.
2. La velocidad de crecimiento debe ser alta.
3. La cepa debe estar libre de contaminantes.
4. Sus requerimientos nutricionales deben cubrirse con medios de cultivo de costo reducido.
5. Deben ser de fcil conservacin por largos perodos de tiempo sin prdida de sus caractersticas.
6. Debe realizar el proceso fermentativo completo en tiempo corto.
7. Si el objetivo es un producto, este debe ser de alto rendimiento y de fcil recuperacin a partir del medio de cultivo.
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Los nuevos mtodos de screening incorporan tcnicas de ingeniera gentica para crear diversidad.
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PreparaciPreparacin de medios de cultivo n de medios de cultivo EsterilizaciEsterilizacin n
Los componentes de los medios de cultivo son los efectores externos de naturaleza qumica que deben cumplir con los requerimientos del crecimiento y de formacin de productos y suministrar energa para el mantenimiento celular.
Componentes de un medio de cultivo:
1. Macronutrientes, agregados en concentraciones de g/L, fuentes de C, N, S, P, K y Mg
2. Micronutrientes o elementos trazas, representados por las sales de Fe, Mn, Mo, Ca, Zn y Co, agregados en conc. de mg o g/L
3. Factores de crecimiento, constituidos por compuestos orgnicos que no son sintetizados por las clulas y de funcin metablica especfica; se suministran en baja concentracin (vitaminas, algunos aminocidos, etc.)
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PreparaciPreparacin de medios de cultivo n de medios de cultivo EsterilizaciEsterilizacin n
Los medios pueden clasificarse considerando la naturaleza qumica de los componentes en:
1. Medios sintticos o medios qumicamente definidos
2. Medios complejos, en cuya composicin intervienen sustancias de origen animal o vegetal (ej.: extracto de levadura, macerado de maz, harina de soja, etc.) que aportan las sustancias fundamentales pero son qumicamente indefinidas y de composicin variable.
Cualquiera sea el medio de cultivo, se debe esterilizar previamente a ponerse en contacto con el inculo. Esterilizar significa eliminar toda forma de vida de un medio o material. Generalmente se llevaa cabo por filtracin o calentamiento.
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SeparaciSeparacin y purificacin y purificacin (n (downstreamdownstream)): depende de la eficiencia del proceso y del producto a obtener
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Cintica de crecimiento de biomasaDefinicionesCrecimiento en cultivos discontinuos o batch: Factores que afectanCuantificacin de la velocidad de crecimiento: Modelos, Ecuacin de MonodCrecimiento en cultivos continuos: Quimiostato, turbidistato
Fermentaciones Fermentaciones -- fermentadores o fermentadores o biorreactoresbiorreactoresEs el corazn del proceso y debe optimizarse para evitar posteriores etapas de separacin y purificacin.
Fermentaciones
Para el diseo de los biorreactores se debe considerar la cintica del crecimiento de las clulas o microorganismos (biomasa) y la velocidad de formacin de los productos deseados.
discontinuas o batchsemicontinuas (fed-batch)continuas
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CinCintica de crecimiento microbianotica de crecimiento microbiano
nX P X S ++
El crecimiento microbiano es un ejemplo de reaccin auto-cataltica. La velocidad de crecimiento est relacionada con la concentracin de clulas.
biomasa decantidadmayor aresextracelul
productos biomasa ustratoS ++
aumento en el nmero de clulasaumento del tamao de las clulasCrecimiento
dtdX
X1
neta X: concentracin msica de clulas (g/L)t: tiempo (h)
Velocidad especfica neta de crecimiento (h-1):
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La velocidad especfica neta de crecimiento es la diferencia entre la velocidad de crecimiento y la velocidad de desaparicin de biomasa por muerte celular o por metabolismo endgeno:
Tambin se puede expresar la velocidad en funcin de la concentracin de nmero de clulas en lugar de la concentracin msica de las mismas. Si no se pueden medir las dos, se prefiere la concentracin msica.
Formas de medir la concentracin de clulas
DirectosIndirectosMtodos
Se busca un mtodo rpido, fcil de seguir en lnea o de respuesta rpida.
dgneta k=
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DeterminaciDeterminacin de la concentracin de la concentracin mn msica de csica de clulas:lulas:Mtodos directos (en ausencia de otros slidos en suspensin):
Masa de clulas secas (centrifugado/filtrado/lavado/secado)Volumen de clulas centrifugadas en condiciones estndarAbsorcin de luz por clulas en suspensin
Mtodos indirectos: se basan en un efecto que inducen, como ser la velocidad de consumo de un sustrato o de formacin de un producto.
Productos: etanol, CO2Sustratos: consumo de O2 o de un sustrato base de C o NPropiedades fsico-qumicas: viscosidad, pH
Ejemplo: seguir la concentracin de ATP, proporcional a la masa de clulas.
UZL O ATP uciferinal luciferasa2 ++ Sensible> 10-12 gATP/L
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CinCintica de crecimiento de un cultivo en tica de crecimiento de un cultivo en batchbatch
Etapas:Etapas:1) de latencia o
induccin2) de crecimiento
exponencial 3) de desacelera-
cin4) estacionario5) de muerte o
declinacin celular
1) 1) LatenciaLatencia:: adaptacin del inculo al medio. Depende del inculo (edad y tamao) y de los nutrientes. Se puede adaptar ex-situ.
2) 2) Crecimiento exponencial:Crecimiento exponencial: rpida multiplicacin de clulas crecimiento balanceado (composicin de clulas constante).
3) 3) DesaceleraciDesaceleracin:n: por consumo de un nutriente esencial o generacin de subproductos txicos crecimiento desbalanceado, las clulas deben readaptarse a las condiciones hostiles.
4) 4) Estacionario:Estacionario: velocidad de crecimiento nula. Las clulas an son activas y pueden producir metabolitos secundarios (ej. antibiticos, hormonas) productos de la desregulacin celular
5) 5) Muerte:Muerte: baja el nmero de clulas, difcil definir el lmite con la etapa anterior.
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1) 1) LatenciaLatencia:: adaptacin del inculo al medio. Depende del inculo (edad y tamao) y de los nutrientes. Se puede adaptar ex-situ.
2) 2) Crecimiento exponencial:Crecimiento exponencial: rpida multiplicacin de clulas crecimiento balanceado (composicin de clulas constante).
3) 3) DesaceleraciDesaceleracin:n: por consumo de un nutriente esencial o generacin de subproductos txicos crecimientodesbalanceado, las clulas deben readaptarse a las condiciones hostiles.
4) 4) Estacionario:Estacionario: velocidad de crecimiento nula. Las clulas an son activas y pueden producir metabolitos secundarios (ej. antibiticos, hormonas) productos de la desregulacin celular
5) 5) Muerte:Muerte: baja el nmero de clulas, difcil definir el lmite con la etapa anterior.
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t0netanetag
netaeXX dtX
dX dtdX
X1 ===
Crecimiento balanceado: todos los componentes de las clulas crecen con la misma velocidad la composicin media de las mismas permanece constante. Es vlido para la etapa de crecimiento etapa de crecimiento exponencialexponencial. En este perodo, la velocidad de crecimiento es independiente de los nutrientes y resulta en una cintica de primer orden.
netad0
)2ln( X2X ==Tiempo necesario para duplicar la biomasa:
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Crecimiento no balanceado: los componentes de las clulas no crecen con la misma velocidad la composicin media se modifica. Esta situacin caracteriza especialmente a la etapa estacionariaetapa estacionariaEl estrs producido por la falta de nutrientes o por la existencia de subproductos o toxinas inhibidoras que generan un medio hostil induce una reestructuracin de las clulas para adaptarse a las nuevas condiciones.
dgnetag k=Puede ocurrir:La concentracin msica de clulas (X) es constante pero baja el nmero de clulas viables.X baja por lisis de clulas. Puede aparecer un segundo perodo de crecimiento, los productos de lisis o las clulas muertas constituyen un sustrato alternativo (crecimiento crptico).X constante pero su metabolismo es activo; cambia la regulacin celular produciendo metabolitos secundarios.
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Coeficiente de mantenimientoCoeficiente de mantenimiento:: se emplea para definir la velocidad especfica de consumo de sustrato para energa de mantenimiento.
mdtSd
X1 - m
=EnergEnerga de mantenimientoa de mantenimiento:: necesaria para mantener la membrana celular activa y el transporte de nutrientes, y para funciones metablicas esenciales como la movilidad y la reparacin de estructuras daadas.
Si no hay sustrato disponible, el mantenimiento inducir prdida de masa celular (metabolismo endgeno para adaptarse al medio).
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Otras definiciones: Coeficientes de rendimientoOtras definiciones: Coeficientes de rendimiento: se definen en base a la cantidad consumida de otro componente.Rendimiento de formacin de clulas por masa de sustrato consumida (g clulas/g S)YX/S es un valor constante en la etapa de crecimiento exponencial.Luego de la etapa de crecimiento exponencial, YX/S deja de ser constante, es un rendimiento aparente porque el sustrato se emplea para otros fines:
tenimiento-man para
energia
cimiento-cre para
energiaproductos de
formacionbiomasa de
formacion SSSSS +++=
Tambin se pueden definir rendimientos basados en otros componentes:
SPY ;
DOXY P/SOX 2
==
/
SXY S/X
=
-
g/g 4,19,0Y ; g/g 6,04,0Y2X/OS/X
==
Ejemplo: Organismos creciendo en condiciones aerbicas en glucosa; para la mayora de las bacterias y levaduras:
(en condiciones anaerbicas suelen ser menores)
Los rendimientos dependen del medio y de la fuente de C.
Para la mayora de los casos:
=
consumido C de gbiomasa g
g/g 4,01 Y S/X
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(c) qP no-asociada al crecimiento celular (etapa estacionaria, donde la g=0) ej.: metabolitos secundarios como antibiticos.
RelaciRelacin del crecimiento de biomasa con la formacin del crecimiento de biomasa con la formacin de n de productos:productos:
gX/PP YdtdP
X1q ==Definimos la velocidad especfica de formacin
de producto, qP
X/PgP Y q ==
+= gP q
Se encuentran 3 situaciones:(a) qP asociada al crecimiento celular, ej: produccin de una enzima constitutiva de la biomasa (metabolito primario).
(b) qP parcialmente asociada (etapa de desaceleracin y estacionaria), ej: fermentacin de cido lctico, xantanos y algunos metabolitos secundarios.
0 ;tetanconsq gP ===
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RelaciRelacin del crecimiento de biomasa con la formacin del crecimiento de biomasa con la formacin de n de productos:productos:
dtdX
X1 Y Y
dtdP
X1q X/PgX/PP ===
gP q = += gP q =PqAsociada Parcialmente asociada No asociada
Metabolitos primarios Metabolitos secundarios
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Factores que influyen Factores que influyen Temperatura del medioTemperatura del medio
-psicrfilos (Top < 20C)-mesfilos (20
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Por encima de Top ocurre muerte celular disminuye el nmero de clulas viables cuando la velocidad de muerte supera la de crecimiento.
Ambas velocidades siguen una ecuacin tipo Arrhenius con
Ea 1020 kcal/mol Ed 6080 kcal/molLa muerte celular es ms sensible a T que el crecimiento (importante para la esterilizacin)
La T tambin afecta la velocidad de formacin de producto pero la Top y la Ea suelen ser distintas.
Tambin influye sobre el YX/S porque para T>Top, la energa de mantenimiento es mayor baja YX/SPara organismos inmovilizados puede cambiar el control.
)/exp(' RTEA ag = )/exp( RTEAk ddd =
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Factores que influyen Factores que influyen pHpH del mediodel medio
Variacin de la velocidad especfica de crecimiento con el pH. Existe un pH ptimo para cada tipo de clula, generalmente prximo a 7. Se puede
incrementar el rango adaptando las clulas por incrementos pequeos.
Rango de pH ptimo
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El pH ptimo suele ser distinto para el crecimiento que para la formacin de producto.
Los pH aceptables varan en 1 o 2 unidades respecto del ptimo.El pH ptimo depende de la biomasa, el rango va de 3 a 8.
- levaduras: 3 6 - hongos: 3 7 - clulas vegetales: 5 6 - clulas animales: 6,5 7,5
Algunos organismos pueden regular el pH empleando energa de mantenimiento.
El pH puede variar mucho por efecto del medio (fuente de N, aminocidos, CO2)
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Factores que influyen Factores que influyen concentraciconcentracin de On de O22 disuelto (DO):disuelto (DO):Es un sustrato importante para las fermentaciones aerbicas.Debido a la baja solubilidad del O2 en agua, puede ser un limitante de la velocidad de crecimiento. La solubilidad del oxgeno en agua depende de la presin, de la temperatura y de las sales disueltas (a presin atmosfrica es 7ppm).La concentracin crtica de oxgeno disuelto CO2,critica es aquella por debajo de la cual comienza a controlar la velocidad de crecimiento: 510% de la concentracin de saturacin para bacterias y levaduras y 1050% de la concentracin de saturacin para hongos (segn el tamao)
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Transporte de oxgeno a las clulas
El O2 se introduce por burbujeo y su concentracin depende de la agitacin.
= bO*OLGL 22 CCakOTR
Velocidad de consumo de oxgeno (OUR):
22 O/X
gO Y
XXqOUR
==
Velocidad de transferencia:
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Factores que influyen Factores que influyen otros factoresotros factores
Potencial redox: afecta las reacciones de xido-reduccin. Esta relacionado con la concentracin de O2, el pH y las concentraciones de otros iones.Potencial de reduccin del medio:
Se puede reducir bajando la concentracin de O2 (burbujeo de nitrgeno) o por agregado de agentes reductores (cistena, Na2S, HCl).
Concentracin de CO2 disuelta puede afectar. Puede ser txica para algunas clulas y necesaria para otras. Se regula modificando la concentracin en la corriente de burbujeo.
Fuerza inica: afecta el transporte de ciertos nutrientes desde y hacia el interior de las clulas. Depende de la concentracin y de la carga de los iones en el medio:
( ) ( ) ( )( )+++= HP060EmVE2O0
loglog,
=i
2ii2
1 ZcFI
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GeneraciGeneracin de calor por crecimiento microbianon de calor por crecimiento microbiano4050% de la energa suministrada por las fuentes de C se convierten en ATP (forma en que las clulas acumulan energa) el resto se libera como calor. El calor liberado se puede calcular a partir de las entalpas de combustin del sustrato y de la biomasa formada:
celulas OH CO 22 ++Ciclo entlpicopara calcular el calor generado
Combustin de las clulasHc (kJ/g)
Crecimiento microbiano y respiracin
1/YH (kJ/g clula)
OH COO Sustrato 22)g/kJ(H sustrato,
del combustion
2S + +
cS/XS
S/XH
Hc
S/X
SHYH
YY
Y1H
YH
=+=
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Algunos valores tpicos: Hc ~ 20 25 kJ/g clulasYH ~0,42 g/kcal (glucosa); 0,30 g/kcal (malato); 0,18 g/kcal (etanol)
0,12 g/kcal (metanol); 0,061 g/kcal (metano)
El grado de oxidacin del sustrato afecta fuertemente la cantidad de calor que evoluciona por el metabolismo de las clulas.
Para clulas en crecimiento activo, el requerimiento para mantenimiento es bajo la evolucin de calor est directamente relacionada con el crecimiento.
Velocidad total de generacin de calor en una fermentacin batch se calcula considerando la velocidad de crecimiento.
En una fermentacin aerbica, se correlaciona con la velocidad de consumo de oxgeno, dado que es el aceptor final de electrones.
VY1X QH
netagenerado =
2OgeneradoQ 12,0 Q =
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Configuraciones de refrigerantes en biorreactores: (a) camisa externa (b) serpentn externo (c) serpentn interno helicoidal (d) serpentn interno tipo deflector (e) intercambiador de calor externo
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Reactor Reactor batchbatch de de escala laboratorioescala laboratorio
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Reactor Reactor batchbatch de de escala industrialescala industrial
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EstequiometrEstequiometraa del crecimiento microbiano y formacidel crecimiento microbiano y formacin de n de productosproductos Procesos complejos reflejan el transcurso de miles de reacciones intracelulares.
Es importante poder comparar el rendimiento y la generacin de calor que se obtiene empleando distintos sustratos la estequiometra de conversin de sustratos a biomasa y a productos extracelulares se suele representar por ecuaciones pseudoqumicas simples.
22 32nm CO e OH d NOCH c NH b O a OCH ++++ CHmOn representa un mol del carbohidrato empleado como sustrato
CHON representa un mol del material celular
La composicin del material celular depende del tipo de organismo. Un mol de material biolgico es aquel que contiene un tomogramo de C
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Composicin elemental de la bacteria Escherichia coliElemento % en masa seca
C 50O 20N 14H 8P 3S 1K 1Na 1Ca 0.5Mg 0.5Cl 0.5Fe 0.2
Otros 0.3
92% de la masa seca total esta formado por C, O, N, H
Componentes minoritarios no se tienen en cuenta en la frmula mnima
Por que una frmula mnima escrita como: CHaObNd ?
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Balances elementales:
22 32nm CO e OH d NOCH c NH b O a OCH ++++
= ++=++=+ +=
c 3b :N 2e d c 2a n :O
2d c 3b m :He c 1 :C
Cociente respiratorio (RQ): moles de CO2 producidos por mol de O2 consumido provee una indicacin del estado metablico y puede emplearse para controlar el proceso.
ae
consumidos O molesgenerados CO moles
RQ2
2 ==
Los balances para H y O pueden no dar informacin correcta por la gran masa de agua que tienen las clulas se requiere informacin adicional.
Los coeficientes estequiomtricos y la frmula mnima se calculan planteando balances elementales, la informacin del cociente respiratorio y un balance de electrones disponibles.
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Para las reacciones mas complejas, con formacin de productos extracelulares, se agregan componentes Fhay un coeficiente estequiomtrico ms y se requiere mayor informacin.Adems, los balances elementales no se relacionan con los cambios de energa involucrados en la reaccin.Fse desarroll el concepto de grado de reduccin, , para poder plantear balances de electrones y protones en bioreacciones.
Balance de electrones disponibles:
Grado de reduccin: nmero de equivalentes de electrones disponibles por tomo-gramo de C. Los electrones disponibles son aquellos que se transfieren al O2 al formarse CO2 o H2O.
= productos,i iisustratos,i iireduccion de grados: ; costriestequiome.coef: ii
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CinCintica de crecimiento microbiano: Modelostica de crecimiento microbiano: Modelos
nX P X S ++ ( )
dtdX
X1kdgneta
biomasa decantidadmayor productos biomasa ustrato ++ aresextracelulS
X: concentracin msica de clulas (g/L)t: tiempo (h)
neta: Velocidad especfica neta de crecimiento (h-1)g: Velocidad especfica de crecimiento de biomasa (h-1)kd: constante de muerte celular o disminucin de masa celular por metabolismo endgeno (h-1)
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CuantificaciCuantificacin de la cinn de la cintica de crecimiento: modelos cintica de crecimiento: modelos cinticosticosDescripcin detallada Fdebera involucrar diferenciaciones en la estructura de la clula y la segregacin del medio de cultivo en unidades que pueden tener diferentes concentraciones y propiedades fsico-qumicas Fmodelos estructurados-segregados
Modelos EstructuradosFTienden a representar la estructura de las clulas. Pueden dividir la clula en sus componentes y considerar las reacciones y cambio de metabolismo que tienen lugar en cada zonade la clula, como respuesta a cambios en el medio.
Modelos SegregadosFTienen en cuenta que el medio no es homogneo, permiten variaciones de concentraciones de biomasa y de nutrientes y diferencias en las propiedades fisicoqumicas del medio (viscosidad, densidad, pH, T, etc.). Tambin permiten considerar la posibilidad de agregacin de clulas.
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El grado de realismo y complejidad de un modelo depende del depende del objetivo objetivo Fse debe elegir el modelo ms simple capaz de
representar en forma adecuada al sistema que nos interesa.
No estructurados
No segregados
Estructurados
No segregados
No estructurados
Segregados
Estructurados
Segregados
M
A
Y
O
R
C
O
M
P
L
E
J
I
D
A
D
MAYOR CAPACIDAD DE REPRESENTAR LA REALIDAD
Son ms realistas, pero
son complejos y demandantes de
tiempo de clculo.
-
Modelos No-EstructuradosFSuponen una composicin fija de la clula (equivalente a suponer crecimiento balanceado). -Son estrictamente vlidos para la etapa de crecimiento exponencial en batch-No andan bien para transientes, salvo que la respuesta de la clula sea rpida y/o las perturbaciones sean leves.
Modelos No-SegregadosFConsideran un medio homogneo. -Representan adecuadamente muchos casos.
Nos restringimos a los modelos No-estructurados/No-segregados
-
S (M)
g(h-1)
Modelos cinModelos cinticos de crecimiento: controlados por sustratoticos de crecimiento: controlados por sustrato
FSuponen que la cintica depende solamente de un nico sustrato esencial (por ej., glucosa). Los cambios en los otros sustratos no afectan. Ms difundido FF Modelo de Modelo de MonodMonod
Supone que un Supone que un nico sistema nico sistema enzimenzimtico controla el consumo de tico controla el consumo de
sustrato y que dicho sistema sustrato y que dicho sistema determina la velocidad de determina la velocidad de crecimiento de biomasacrecimiento de biomasa.
La premisa es generalmente falsa, pero la ecuacin de Monod ajusta
una amplia gama de resultados experimentales y es la expresin ms empleada para el diseo de
fermentadores.
SKS s
mg +=
-
S (M)
g(h-1)
SKS s
mg +=
m: mxima velocidad especfica de crecimiento de biomasa
smg KS cuando >>=Ks: constante de saturacin o de
velocidad media
sm21
g KS cuando ==
Monod da buenos resultados para cultivos con baja velocidad de crecimiento y baja densidad de clulas. Para cultivos concentrados se usan expresiones similares, modificando Ks:
SSKS 0S
mg
0+=
SSKK
So 0ss
mg
01++=
-
Nociones de diseNociones de diseo de fermentadores o o de fermentadores o biorreactoresbiorreactoresLa eleccin del tipo de reactor y de la estrategia de operacin define la produccin a obtener y la pureza del producto (nmero y tipo de impurezas, reactivos sin convertir). Tambin determina si se puede lograr un producto de calidad constante y una operacin confiable.En bioprocesos los reactores representan un gran % del capital.
Tipos de reactores comnmente empleados
Discontinuos o batch: una vez que se carga, el proceso ocurre sin ingreso de sustrato ni salida de productos.
Continuos (quimiostato): hay alimentacioncontinua de sustrato y retiro continuo de productos
Semicontinuos (Fed-batch): hay ingreso continuo o intermitente de sustratos, sin retiro de productos.
-
Reactores discontinuos o batchProduccin de biomasa o de un producto asociado a crecimiento (metabolito primario):En un batch se observan 4 etapas:1) Preparacin para la nueva operacin (limpieza, esterilizacin,
llenado del reactor)2) Sembrado y perodo de induccin3) Perodo de crecimiento exponencial4) Recuperacin del producto del reactor
La suma del tiempo involucrado en las etapas 1+2 y 4 es un tiempo muerto, tm, a considerar en el diseo del reactor vara con el tamao del reactor y con el tipo de fermentacin pero generalmente es del orden de las horas (310 hs)tiempo total de operacin para llegar a una concentracin final de biomasa Xf :
+= 0
f
netamc X
X1tt ln
-
La concentracin final de biomasa, Xf , depende de la cantidad de sustrato limitante del crecimiento y del rendimiento:
( )SSYXX 0S/X0f =La mayora de las fermentaciones operan con una relacin Xf/X0 de aproximadamente 1020. La velocidad de produccin de biomasa por operacin del reactor batch, rb , se calcula dividiendo la masa total que podemos formar por el tiempo que lleva la operacin:
( ) ( ) m0fneta 0SXb tXX1SY
r += ln/ /
Una operacin en un quimiostato en condiciones ptimas conduce a una produccin significativamente superior. De todos modos, la De todos modos, la mayormayora de las fermentaciones son procesos discontinuosa de las fermentaciones son procesos discontinuos..
smkg
3
3mkg
-
Por qu? En muchos casos no interesa el producto asociado a crecimiento;el crecimiento de las clulas puede incluso inhibir la produccin del producto deseado. En esos casos el producto deseado se genera solo con velocidades de dilucin muy bajas, muy por debajo de la que lleva a la ptima productividad de biomasa.
Para Para producciproduccin de metabolitos secundarios, la productividad n de metabolitos secundarios, la productividad en un en un batchbatch puede superar significativamente a la de un puede superar significativamente a la de un quimiostatoquimiostato. .
Otra razn importante para que se prefiera la operacin discontinua es la inestabilidad gentica. Los microorganismos que se emplean suelen ser especies que han sido manipuladas y tienenmenor velocidad de crecimiento que las originales.
Un Un quimiostatoquimiostato impone una selecciimpone una seleccin severa cuando hay n severa cuando hay mezclas de cultivo, conduciendo a la cepa de mayor velocidad mezclas de cultivo, conduciendo a la cepa de mayor velocidad de crecimiento.de crecimiento.
-
Por qu? Otro factor a tener en cuenta es la operabilidad y la confiabilidad de la operacin. Los reactores batch conducen a productos con mucha variabilidad genera problemas en las etapas de purificacin. Sin embargo en los sistemas continuos una falla mecnica o de control de alguna variable de operacin o de la esterilizacin del proceso puede conducir a problemas severos.
Las consecuencias de una falla de operaciLas consecuencias de una falla de operacin son mas graves n son mas graves en un sistema continuo y las pen un sistema continuo y las prdidas mayores. rdidas mayores.
La economa de mercado influye en la seleccin del reactor. Un sistema continuo es un sistema dedicado a un dado proceso unnico producto.
Muchos productos de fermentaciones se requieren en pequeMuchos productos de fermentaciones se requieren en pequeas as cantidades y su demanda es difcantidades y su demanda es difcil de proyectar. Los sistemas cil de proyectar. Los sistemas batchbatch son mson ms verss verstiles, el mismo reactor puede emplearse tiles, el mismo reactor puede emplearse para distintos productos.para distintos productos.
-
Cultivos continuosCultivos continuosFse agrega un medio con nutrientes frescos en forma continua, a un volumen de control que contiene las clulas. Se retiran continuamente productos y parte de las clulas.-Cuando se alcanza el estado estacionario, X, S y P permanecen constantes en un dado punto del reactor.-Los cultivos continuos proveen un medio de cultivo constante para el crecimiento de las clulas y para la formacin de productos
FFcalidadcalidad uniforme de los productosuniforme de los productos-Pueden ser una herramienta importante para determinar como un microorganismo responde al medio, y para generar un producto en condiciones ptimas.
Sistemas para lograr cultivos
continuos
Quimiostato
Turbidistato
Flujo Pistn Ideal (FPI): mezclado radial mezclado radial perfecto y mezclado axial nuloperfecto y mezclado axial nulo; poco empleado, salvo para inmovilizados
Sistemas con mezclado mezclado perfectoperfecto: Tanques continuos idealmente agitados (TCIA)
-
Quimiostato: el crecimiento de biomasa suele estar controlado por un nutriente esencial y el resto se agrega en exceso. Las condiciones qumicas del medio son constantes.
-
Turbidistato: la concentracin de clulas en el reactor se mantiene constante. La alimentacin se regula mediante el monitoreo de la densidad ptica del cultivo. Se alimenta medio fresco cuando la turbidez supera un lmite prefijado. El volumen se mantiene constante retirando una cantidad de fluido equivalente a la que se agrega.Se usa menos que el quimiostato porque es ms elaborado y porque el medio cambia.
Puede ser muy til para seleccionar subpoblaciones que puedan soportar condiciones de stress, porque la concentracin de clulas se mantiene constante.
-
FPI (Flujo Pistn Ideal):
como no hay retromezclado, los elementos de fluido con clulas activas no pueden inocular elementos de fluido nuevos aguas arriba se requiere el reciclo continuo de clulas para inoculacin continua del medio fresco alimentado.
Un FPI es equivalente a un batch, en el cual la posicin en el reactor equivale a un dado tiempo en el reactor batch.
Equipos con clulas inmovilizadas (trickling filters) se asemejan a un FPI y no necesitan el reciclo, se usan extensamente en tratamiento de efluentes.
L(+G,S)
L(+G,S)
-
Fotobiorreactor tubular helicoidal de 1000 L (Murdoch University, Australia)
Recuperacin de microalgas a partir del medio de cultivo por filtracin
Cyanotech Corporation(www.cyanotech.com), Hawaii, USA.
-
Cultivos continuos: Quimiostato idealEs un tanque agitado que se opera con circulacin continua (TCIA) del medio de cultivo. La mayora requiere control (pH, T y CO2).Se alimenta medio estril (X0= 0) a un tanque perfectamente agitado (y aireado si es fermentacin aerbica). Se deja salir la suspensin de clulas para mantener las concentraciones y el volumen de lquido constante.
Burbujeo de gas
FvS0, X0, P0
FvS, X, P
Volumen de lquido = volumen de reactor = V
Las concentraciones a la salida del reactor son
iguales a las del interior por la hiptesis de mezclado perfecto
-
Balances de masa FEcuaciones de diseoPlanteando balances de masa para los distintos componentes, se obtienen las ecuaciones de diseo.
=
+
V.C. del dentro
acumulada Masa
V.C. del dentro
generada Masa
V.C. del dentro
consumida Masa
reactivos loscon
VC al entra que Masa
productos loscon
VC del saleque Masa
Si el volumen de control V.C. es un QUIMIOSTATO
Un quimiostato opera en estado estacionario F se cancela el trmino de acumulacin de masa:
+
=
+
V.C. del dentrogenerada Masa
reactivos los con V.C. al entra que Masa
V.C. del dentro consumida Masa
productos loscon V.C. del sale que Masa
-
Gas
FvS0, X0, P0
FvS, X, P
V
Quimiostato - ecuaciones de diseo
Balance de masa de clulas:
+
=
+
V.C. del dentrogenerada Masa
reactivos los con V.C. al entra que Masa
V.C. del dentro consumida Masa
productos loscon V.C. del sale que Masa
XVXFXF neta0VV += ( )XkVXFXF dg0VV += Definiendo el factor de dilucin como caudal/volumen: D = FV/V( )XkDXDX dg0 += Si se alimenta medio estril (X0= 0) y el mecanismo endgeno es despreciable( )XkDXDX dg0 += gD =
FV: caudal volumtrico de medio de cultivo agregado (L/h)
-
Importancia de este resultado: En un quimiostato en EE, alimentado con medio estril y en condiciones en las que el metabolismo endgeno es despreciable,la velocidad o factor de dilucin, D, iguala a la velocidad de crecimiento de clulas
FF se puede manipular la velocidad de crecimiento como un parmetro independiente modificando las variables de operacin
FF el quimiostato es una herramienta experimental poderosaSi la velocidad de crecimiento sigue la expresin de Monod
SKS
D sm
g +== S: concentracin de sustrato limitante
del crecimiento de biomasa en EE
Si se impone un factor de dilucin D > m , las clulas no se podrn reproducir lo suficientemente rpido para mantenerse F se lavan, o se vaca el quimiostato (washout)
gD =
-
FV: caudal volumtrico de medio de cultivo agregado (L/h)S: concentracin de sustrato limitante del crecimiento (g/L)V: volumen del reactor (L)g: velocidad especifica de crecimiento de biomasa (1/h)X: concentracin de biomasa (g/L)qP (gP/gclulas/h): velocidad especfica de productos extracelularesYMX/S (g clulas/gS) : mximo rendimiento de biomasa a partir de SYP/S (gP/gS) : rendimiento de producto extracelular a partir de S
BM sustrato en estas condiciones (EE y sin metabolismo endgeno):
0VS/P
PMS/X
gV SF Y1XVq
Y1XV SF =++
+
=
+
V.C. del dentrogenerada Masa
reactivos los con V.C. al entra que Masa
V.C. del dentro consumida Masa
productos loscon V.C. del sale que Masa
Formacin de biomasa Formacin de producto
-
Concentracin msica de clulas en estas condiciones (EE y sin metabolismo endgeno): ( )
Yq
X Y
X SSDS/P
PM
S/X
g0 +=
Como adems g = D , si la formacin de productos extracelulares es despreciable: ( ) SSY X 0MS/X =
Estrictamente, depende de la concentracin de sustrato y de la velocidad de crecimiento, no es exactamente igual para cualquier S0
MS/XY
La productividad en un fermentador continuo se obtiene como el producto del factor de dilucin por la
concentracin de clulas, DX (g/Lh)
-
Productividad en un quimiostato, suponiendo vlida Monod (EE sin metabolismo endgeno ni formacin de productos extracelulares): se obtiene del producto del factor de dilucin por la concentracin de clulas, DX (g/Lh):
La velocidad de dilucin que maximiza la produccin de biomasa se obtiene de derivar DX con respecto a D e igualar a cero:
+= 0ss
m)X(op SKK
1 D
Es muy difcil lograr una operacin estable para D m. Generalmente, se usa un valor de D algo menor que Dop(X) como solucin de compromiso para mejorar la estabilidad con buena productividad.
Normalmente Ks
-
)
= opmsop
0opM
S/Xop D
KDSDY DX
Reemplazando la expresin de Dop en la ecuacin que da la productividad de biomasa DX:
Se obtiene la mxima productividad de biomasa que se puede alcanzar en un quimiostato en EE, sin metabolismo endgeno y sin formacin de productos extracelulares:
) ( )( )0sss00s
sm
MS/Xop SKKKSSK
K1Y DX ++
+=
Normalmente Ks
-
Efecto del factor de dilucin sobre la concentracin de clulas, concentracin de sustrato y la productividad. D (1/h) S (kg/m3) X (kg/m3)0.06 0.006 0.427
0.12 0.013 0.4340.24 0.033 0.4170.31 0.04 0.4380.43 0.064 0.4220.53 0.102 0.4270.6 0.122 0.4340.66 0.153 0.4220.69 0.17 0.430.71 0.221 0.390.73 0.21 0.352
0
0.1
0.2
0.3
0 0.2 0.4 0.6 0.8
DX (kg/h.m3)
D (h-1)
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0 0.2 0.4 0.6 0.80
0.2
0.4
0.6
0.8
1
X (kg/m3)
S (kg/m3)
D (h-1)
0S
m
-
Algunas aplicaciones de los sistemas continuos:- produccin de algunas protenas - tratamiento de efluentes, en particular cuando se emplean
microorganismos o enzimas inmovilizadas.- produccin de etanol- produccin de productos asociados a crecimiento, especialmente en gran escala (por ejemplo, cido lctico)
Modificaciones de los sistemas continuos para emplearse en bioprocesosQuimiostato con reciclo
La generacin de biomasa es autocataliticaF mayor concentracion de biomasa lleva a mayor velocidad de crecimiento.Para lograr en un quimiostato una concentracin de biomasa mayor, se pueden reingresar al reactor las clulas que salen.
-
Quimiostato con reciclo: el reciclo de clulas incrementa la productividad y tambin la estabilidad en algunos sistemas, dado que minimiza las perturbaciones (ej.: en tratamiento de efluentes, muy sujeto generalmente a las variaciones en la alimentacin).
Gas
FvS0,X0,P0
FvS1,X2,P1V
Fv(1+)S1,X1,P1
FvS1,cX1,P1
Separador de clulas: puede ser por filtracin, centrifugacin o sedimentacin
: relacin de reciclo basada en caudales volumtricos.
c: factor de concentracin relacin de la concentracin de clulas en la corriente de reciclo sobre la que sale del reactor
-
Balances de biomasa :
=
+
V.C. del dentro
acumulada Masa
V.C. del dentro
generada Masa
V.C. del dentro
consumida Masa
reactivos loscon
VC al entra que Masa
productos loscon
VC del saleque Masa
Gas
FvS0,X0,P0
FvS1,X2,P1V
Fv(1+)S1,X1,P1
FvS1,cX1,P1
( ) ( ) 0XV cXF XF XF 1 1neta1V0V1V =++ fresca reciclo
En EE: dX1/dt = 0 y si se alimenta medio
estril X0=0 ( ) ( )1V1V1neta cXFXF 1XV +=
( ) c1Dneta +=
-
Gas
FvS0,X0,P0
FvS1,X2,P1V
Fv(1+)S1,X1,P1
FvS1,cX1,P1
[ ] )c1(1Dneta +=Como c > 1 (1-c) < 0
D neta
-
BM sustrato limitante (en EE y en ausencia de productos extracelulares):
( ) 1V0VS/P
1PMS/X
1g1V SF SF Y1XVq
Y1XV SF1 +=+++
( ) ( ) 1V10VMS/X
1g SF1S SF Y1XV ++=
( )10MS/Xg
1 SSY DX =
[ ] )c1(1D0k Si netagd +=== ( )( )c-11 SSY X 10M
S/X1 +
=
La concentracin de clulas en un quimiostato en EE con reciclo se incrementa por el factor 1/[1+(1-c)]
-
Si es vlida Monody para kd=0
[ ] +==+= )c1(1D
SKS
netas
mg
( )[ ]( )[ ]Dc-11
Dc-11K S
m
s
++= ( )[ ]
( )[ ]( )[ ]
+++= Dc-11
Dc-11K S
c-11Y
Xm
s0
MS/X
1
sin reciclo
con reciclo
X1,sr
Velocidad de Velocidad de generacigeneracin de n de
biomasabiomasa
c = 2 ; = 0.5
Gas
FvS0,X0,P0
FvS1,X2,P1
V
Fv(1+)S1,X1,P1
FvS1,cX1,P1X1,cr
-
Quimiostatos mltiples en cascada: en algunas fermentaciones, particularmente para la produccin de metabolitos secundarios (ej.: un antibitico), conviene separar las etapas de crecimiento de biomasa y de formacin del producto deseado pues las condiciones ptimas son diferentes FF con mcon mltiples ltiples quimiostatosquimiostatos, se pueden fijar condiciones , se pueden fijar condiciones distintas en cada uno: distintas en cada uno: pHpH, temperatura, , temperatura, concconc. de nutrientes. de nutrientes
por ejemplo, se pueden ajustar las condiciones para tener:-Un primer tanque donde se promueva el crecimiento de biomasa-Un segundo tanque donde se promueva la formacin de producto(*)
(*) el crecimiento ser desbalanceado y un modelo no-estructurado no es el ms apropiado. Los resultados sern aproximados.
-
V1 V2
X1S1
X2S2
Fv,X2,S2Fv,X1,S1Fv,S0,X0
Fv,S0,X0Quimiostatos mltiples en cascada:
Primer quimiostato
en EE, vlido Monod y con metabolismo endgeno despreciable
1m
1s1 D
DK S =
( )10MS/X1 S SYX =Segundo quimiostato
BM de biomasa EEen 0dt
dXVXVXF XF 2222,neta22V1V ==+
( )
==
2
122,neta22,neta12
2
V
XX
1D XXXVF
Como X1 < X2 neta,2 < D2
-
Ejemplo de aplicacin de un sistema multietapa con agregado de una corriente: cultivo de clulas modificadas por ingeniera gentica
En general se agregan promotores a los sistemas con clulas que contienen ADN recombinante para inducir la produccin de la protena de inters. La presencia del promotor favorece la produccin de la protena pero reduce la velocidad de crecimiento de las clulas que contienen plsmidos, respecto de las que lo han perdido.
un quimiostato de una nica etapa tendr problemas de inestabilidad gentica.
empleando un sistema de 2 etapas: Primer quimiostato para produccin de clulas (sin promotor)Segundo quimiostato para produccin de la protena (c/promotor):
Se logra mantener la estabilidad gentica por el continuo agregado de clulas frescas.
-
Operacin con alimentacin semi-continua Fed-batch: En este tipo de sistemas se agregan nutrientes frescos al fermentador en forma continua o intermitente. Muy apropiado para mitigar problemas de inhibicin por sustrato
V0
S0,X0,P0
X0,S0,P01)Carga
X,S,P
V
Fv,S0 (X0)
2)Realimentacin
Xf,Sf,Pf
Vf
Xf,Sf,Pf
3)Recuperacin del producto
1) Desde la carga hasta el momento de la realimentacin peridica, el sistema se comporta como un batch:
0M
S/Xm SYX =Xm es la mxima X a alcanzar con S0 , que se da cuando S
-
Operacin con alimentacin semi-continua Fed-batch:Cuando X Xm , se agrega una corriente de nutrientes frescos con un caudal volumtrico Fv y de una concentracin S0. La variacin de volumen es: ( ) tFvVV Fv
dtdV
0 +==Durante la realimentacin, el BM de biomasa es:
Como el sustrato se consume casi todo dX/dt 0 (condicin de estado cuasi-estacionario). Luego: Dneta
X,S,P
V
Fv,S0 (X0)
2)RealimentacinX,S,P
V
Fv,S0 (X0)
X,S,P
V
Fv,S0 (X0)
2)Realimentacin
( ) ( )DXdtdX DXDX
dtdV
VXXX
VF
dtdX
netaneta0neta0V +=+=
( )dtdVX
dtdXV
dtVXdXVXF neta0V +==+ acumula segenera seentra =+
Como D porque V, neta va disminuyendo continuamente.
-
Operacin con alimentacin semi-continua Fed-batch:BM para el sustrato:
Si no consideramos la formacin de productos y dado que la masa de sustrato se mantiene siempre baja y constante:
( ) ( ) ( ) tYSFVXXV YSF XVdtXVd M
S/X0V00M
S/X0Vneta +== (es igual en ausencia de metabolismo endgeno)
Es decir, la masa de clulas generadas es linealmente proporcional al tiempo, lo cual se observa experimentalmente en un fed-batch.
X,S,P
V
Fv,S0 (X0)
2)RealimentacinX,S,P
V
Fv,S0 (X0)
X,S,P
V
Fv,S0 (X0)
2)Realimentacin( )M
S/X
g0V Y
XVSF
=
( )dtVSd
YXVq
Y
XVSF
S/P
PM
S/X
g0V =
acumula se onsumec se entra =
-
Operacin con alimentacin semi-continua Fed-batch:
Variacin de las concentraciones de biomasa, sustrato y producto, y de la velocidad de crecimiento y volumen del cultivo en funcin del tiempo, para el primer ciclo de un reactor alimentado (fed-batch):
0
200
400
600
800
1000
0 0.5 1 1.5 20
0.2
0.4
0.6V (mL)
V (mL)X (g/L)P (g/L)
X (g/L)P (g/L)
(h-1)
(h-1)
t (h)
-
Sistemas con microorganismos inmovilizados: la inmovilizacin de microorganismos tiene aplicacin si los productos son extracelulares
Ventajas sobre los cultivos con clulas en solucin:Proveen una alta concentracin de clulasLas clulas se usan en forma continua y se eliminan costosos procesos de recuperacin y reciclo de clulasSe eliminan el problema del washout a altas velocidades de dilucinSe pueden lograr altas productividadesSe puede lograr un medio local favorable que conduce a mayores rendimientos y una mejor performance del biocatalizadorEn algunos casos mejora la estabilidad genticaEn algunos casos disminuye el dao por abrasin de las clulas
-
Sistemas con microorganismos inmovilizados
Desventajas respecto de los cultivos en solucin:
El problema ms grave es que no se pueden emplear para productos que no sean excretados de las clulas
La inmovilizacin generalmente conduce a problemas de limitaciones por transferencia de masa
El sistema se torna muy heterogneo por las limitaciones de transporte y es difcil de controlar
Si las clulas estn vivas, el crecimiento y la evolucin de gases ocasiona problemas y puede conducir a ruptura del soporte.
Los mtodos de inmovilizacin son similares a los que se utilizan para enzimas. Se complica con las clulas vivas.
-
InmovilizacinActiva: captura o unin de clulas por
mtodos fsicos o qumicos
Pasiva: formacin de biofilms, crecimiento de mltiples capas de clulas sobre un soporte slido
Tambin se pueden emplear reactores de membrana, generalmente tubulares (la estructura se asemeja a un intercambiador de calor de carcasa y tubos). Los tubos son de una membrana semipermeable. Las clulas se inoculan en la carcasa y el sustrato se bombea por los tubos, a los cuales difunde el producto.
Un buen soporte debe ser rgido y qumicamente inerte; debe contener a las clulas firmemente y tener alta capacidad.
-
Esquema de una columna de burbujeo
Fermentadores: Equipos comnmente empleados Tanques agitados Columnas de burbujeoAir-lift o reactor de arrastreLechos rellenos
Esquema de un tanque agitado
H/D~12
H/D~36
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Tanques agitados de escala laboratorio
-
Tanques agitados de escala laboratorio con clulas
inmobilizadas
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Fermentadores comerciales de escala laboratorio (V ~ 2Fermentadores comerciales de escala laboratorio (V ~ 2--20 litros)20 litros)
Global Medical Instrumentation http://www.gmi-inc.com
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Fermentadores de escala bancoFermentadores de escala banco--piloto (V ~ 15piloto (V ~ 15--75 litros)75 litros)
-
Fermentadores de Fermentadores de escala pilotoescala piloto
V ~ 100V ~ 100--1000 litros1000 litros
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Biorreactor de escala piloto
-
Planta piloto de bioprocesos
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Esquema de un tanque Esquema de un tanque agitado de mayor escala agitado de mayor escala
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Variables que se controlan en un Variables que se controlan en un biorreactorbiorreactor industrialindustrial
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Esquema de un fermentador tipo tanque agitado de escala industrial (100m3).
H ~ 15 m de alto
D ~ 4,2 m de dimetro
Tiene lneas de vapor para realizar la esterilizacin in situ de las vlvulas, caeras y sellos. Se debe esterilizar tambin el aire que ingresa por filtracin o por calentamiento.
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Biorreactor de escala industrial
-
Reactor tanque industrial-generalmente de acero inoxidable 316L SS, puede operar presurizado.-debe minimizar zonas muertas y permitir la insercin de sensores-relacin de aspecto H/D=2.53.0 para crecimiento de bacterias porquemejora la transferencia de oxgeno. Para clulas animales se usan tanquesde baja relacin de aspecto H/D=1.5 para facilitar el mezclado-se debe poder vaciartotalmente-si tiene menos de500L pueden ser de vidrio
-
Reactor tanque agitado: tipos de turbinas empleadas y efectos en la agitacin que inducen
Agitacin inducida por turbinas radiales del tipo Rushton
Agitacin inducida por turbinas axiales
-
Interior de un tanque agitado
-
Reactor tanque agitado: efecto de los baffles
Los baffles mejoran notablemente la turbulencia, rompen los vrtices que se forman por la agitacin. Se los ubica levemente desplazados de la pared para disminuir la formacin de zonas estancas.
-
Reactor tanque agitado: efecto de los baffles en un reactor de 2L
400rpm sin baffles 400rpm con baffles
vrtice
-
Agitacin y distribucin de gas en reactores agitados
La determinacin de la velocidad de transferencia de oxgeno y el calor liberado son claves para el diseo de los fermentadores.
La velocidad de transferencia de O2 depende de la dispersin de gas, que es funcin del tipo de reactor; ej: en tanques agitados, aumenta al aumentar la velocidad de agitacin.
> RPM
-
Influencia de la velocidad de agitacin sobre la turbulencia y la dispersin de gas inducida por agitacin mecnica en un reactor de laboratorio de 2L.
300 rpm 450 rpm 750 rpm
-
Tomografa de una seccin del reactor agitado.
Jets gaseosos de los inyectores de gas
Perfil de velocidades (cm/s) del lquido en un reactor gas-lquido agitado. Se
observa la formacin del vrtice caracterstico de las turbinas radiales.
Reactor agitado en suspensin de escala
banco: 20cm de dimetro y de alto (volumen ~ 8L)
Fraccin gaseosa (adimensional)
-
Reactor tanque agitado:
Problemas ocasionados por la evolucin de espuma:
-peligro de contaminacin
-complica la circulacin de gases
-complica el mezclado
-cambian las velocidades de transferencia masa y de calor
vrtice
-
Columna de burbujeo de escala banco: V~10LConfiguraciones comunes de fermentadores: columnas de burbujeo
-
Columnas de burbujeo
Regmenes de flujo en columnas de burbujeo: depende del caudal de gas y del distribuidor que se emplee
-
Columnas de burbujeo para el cultivo de algas
-
Configuraciones de recirculacin interna inducida por el flujo de aire Air-lift
Air-lift con insercin de
aire en el tubo central
Air-lift con insercin de aire en el anillo y mezclado en el tubo
central
Air-lift con insercin de aire en el tubo central y recirculacin
inducida
Configuraciones comunes de fermentadores
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Reactor air-lift de laboratorio con entrada de aire en el anillo circular
Riser: zona donde se hace la inyeccin de aire, el flujo es
ascendente y contiene burbujas
Downcomer: zona donde el lquido desciende, a lo sumo tiene pequeas
burbujas disueltas
Zona donde se produce la separacin entre el gas que se
libera hacia el exterior del reactor y el lquido que recircula
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Shear Stress Kinetic Energy
Air-lift vertical con mezclado en el tubo central: perfiles de velocidades, energa cintica y tensin de deformacin
Escala banco
(0,2 x 2)m
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Reactor de tipo air-lift circulante
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Airlifts de forma triangular para el cultivo de algas (planta piloto de cogeneracin de energa del MIT)
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Configuraciones comunes de fermentadores
Reactores de lecho fijo uso frecuente en tratamiento de efluentes y en producciones dedicadas
Reactores trickle-beds o de lecho a goteoCocorriente Contracorriente
Columnas de burbujeo rellenas
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Inmovilizacin pasiva (biofilms):Los biofilms son grupos de clulas que crecen en multicapas
sobre soportes slidos. El soporte puede ser inerte o biolgicamente activo. La formacin de biofilms es comn en equipos de fermentacin industriales (ej: tratamiento de efluentes y fermentaciones de hongos). La interaccin entre las clulas y el soporte puede ser muy compleja. Los biofilms presentan ventajas y desventajas similares a las de los sistemas de microorganismos inmovilizados en forma activa.Las condiciones dentro de un biofilm grueso varan con la posicin y afectan la fisiologa de las clulas porque los nutrientes difunden hacia el interior del film y los productos hacia fuera.El espesor del biofilm afecta la performance: biofilms muy finos van a dar baja velocidad de crecimiento por la baja concentracin de biomasa y los muy gruesos tienen problemas difusionales, que pueden ser o no un inconveniente, dependiendo de lo que se quiera lograr. Normalmente existe un espesor de film optimo para el crecimiento de biomasa y otro para la formacin de productos.
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Estrategias de escalado:
-Multiplicacin
-Reglas de uso-Anlisis del rgimen y escalado hacia menor tamao
La multiplicacin implica replicar muchas veces el resultado que se obtiene en un reactor de escala relativamente pequea, en lugar de llevar a cabo el proceso en un reactor de mayor tamao.
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Produccin de cido glucnico
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Produccin de gluconato de sodio con A. niger
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Produccin de antibitico
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Produccin de lisina (10000 ton/ao) en 20 fermentadores de 250 m3
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Drogas medicinales
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% de uso en la industria Criterio de escalado
30 Potencia/Volumen
30 kLaLG
20 Velocidad en la punta del agitador
20 Concentracin de oxgeno
Reglas de uso : basadas en anlisis dimensional y criterios de similaridad de algunos parmetros
Otras: velocidad (rpm) del agitador o impeler; dimetro del agitador; caudal desplazado por el impeler; caudal desplazado por el impeler, por unidad de volumen; numero de Reynolds
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La concentracin de oxgeno es diferente en distintas zonas del reactor. Se puede simular considerando varios reactores con distinta alimentacin de oxgeno
Anlisis del rgimen y escalado hacia menor tamao
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Modelo del sistema que supone dos compartimientos con distinta concentracin de oxigeno