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CSA II Biotin-free Tyramide Signal Amplification System Code K1497 For use with mouse primary antibodies

English

Limited use license

This system embodies technology developed by and licensed from NEN Life Science Products, Inc. U.S. Patent No. 5,196,306. This product is distributed and sold to the End-User pursuant to a license from NEN LIFE SCIENCE PRODUCTS, INC. for use by the End-User in manual or automated processing on Dako instrumentation only of glass microscope slides or other support material (other than microarrays and bio-chips) containing cell or tissue specimens for examining those specimens under a microscope (including automated image capture and analysis systems) for the purpose of detecting target nucleic acids or proteins. Purchase does not include or carry any right to resell or transfer this product either as a stand alone product or as a component of another product. Any use of this product other than the licensed use without the express written authorization of NEN LIFE SCIENCE PRODUCTS, INC. is strictly prohibited.

Intended use

For In Vitro diagnostic use. These instructions apply to the CSA II (code K1497). CSA II is a biotin-free tyramide signal amplification system for immunohistochemistry. This system is intended for use with primary antibodies from mouse supplied by the user for the qualitative identification of antigens by light microscopy in normal and pathological formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. This system may be used with manual procedures and/or with Dako instrumentation. Refer to the “General Instructions for Immunohistochemical Staining” of IHC procedures for: (1) Principle of Procedure, (2) Materials Required, Not Supplied, (3) Storage, (4) Specimen Preparation, (5) Staining Procedure, (6) Quality Control, (7) Troubleshooting, (8) Interpretation of Staining, (9) General Limitations.

Summary and explanation

The CSA II System is a highly sensitive immunohistochemical (IHC) staining procedure incorporating a signal amplification method based on the peroxidase-catalyzed deposition of a fluorescein-labelled phenolic compound, followed by a secondary reaction with a peroxidase-conjugated anti-fluorescein.1-5 In the procedure, a mouse primary antibody is first detected with a peroxidase-conjugated secondary antibody. The next step utilizes the bound peroxidase to catalyze oxidation of a fluorescein-conjugated phenol (fluorescyl-tyramide) which then precipitates onto the specimen. The procedure is continued with detection of the bound fluorescein by a peroxidase-conjugated anti-fluorescein. Staining is completed using diaminobenzidine/hydrogen peroxide as chromogen/substrate, and can be observed with a light microscope. In comparison to standard immunohistochemical methods, such as labelled streptavidin biotin (LSAB) or avidin-biotin complexes (ABC), tyramide amplification methods have been reported to be many fold more sensitive.3,4 The CSA II System is a simplified version of the extremely sensitive Catalyzed Signal Amplification System (code K1500) that utilizes biotinyl-tyramide. The highly sensitive CSA II System allows for the detection of very small quantities of target protein, as well as for the use of low affinity antibodies. This reagent system utilizes fluorescyl-tyramide, rather than biotinyl-tyramide, and does not contain avidin/biotin reagents, thus eliminating potential background staining due to reactivity with endogenous biotin.6,7

Principles of procedure

The specimens are first incubated with Peroxidase Block for five minutes to quench endogenous peroxidase activity. The specimens are then incubated for five minutes with a protein block to suppress nonspecific binding of subsequent reagents, followed by a 15-minute incubation with an appropriately characterized and diluted mouse primary antibody or negative control reagent (user provided). This is followed by sequential 15-minute incubations with anti-mouse immunoglobulins-HRP, fluorescyl-tyramide hydrogen peroxide (amplification reagent) and anti-fluorescein-HRP. Staining is completed by a five-minute incubation with 3,3' diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)/hydrogen peroxide, which results in a brown precipitate at the antigen site.

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Reagent provided Code K1497

The following materials are included in this kit:

Quantity Description 1x15 mL Peroxidase Block

3% hydrogen peroxide in water.

1x15 mL Protein Block

Serum-free protein in buffer with 0.015 mol/L sodium azide.

1x15 mL Anti-Mouse Immunoglobulins-HRP

Anti-mouse immunoglobulins conjugated to horseradish peroxidase in buffer containing stabilizing protein and an antimicrobial agent.

1x15 mL Amplification Reagent

Fluorescyl-tyramide and hydrogen peroxide in buffer containing stabilizing protein and an antimicrobial agent.

1x15 mL Anti-Fluorescein-HRP

Anti-fluorescein antibody conjugated to horseradish peroxidase in buffer containing stabilizing protein and an antimicrobial agent.

1x18 mL Buffered Substrate

Buffer containing hydrogen peroxide and a preservative.

1x1 mL Liquid DAB Chromogen

3,3'-diaminobenzidine chromogen solution.

Materials required, but not supplied

Antibody diluent, such as Antibody Diluent with Background Reducing Components (code S3022) Control specimens, positive and negative Counterstain, such as Lillie’s Modified Mayer’s Hematoxylin (code S3301 for use on the Dako Autostainer or code S3302 for Manual Staining) Light microscope Mounting media such as Glycergel® Mounting Medium (code C0563), Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (code S3025), or a nonaqueous permanent mounting medium, such as Permanent Mounting Media (code S3026) Mouse primary antibodies and negative control reagents Wash buffer, such as TBST (Tris Buffered Saline With Tween), 10x Concentrate (code S3306) Automated Staining Dako Autostainer (code S3400) or Autostainer Plus (code S3800). Refer to the Dako Autostainer User Guide for necessary components Optional materials required, but not supplied Refer to primary antibody specification sheet Target retrieval solution, modified citrate buffer (pH 6.1), such as Target Retrieval Solution, Ready-to-use (code S1700) or 10x Concentrate (code S1699) Water bath (capable of maintaining 95–99°C), steamer, pressure cooker or autoclave for performing target retrieval

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Precautions

Product Specific 1. For professional users. 2. This product contains sodium azide (NaN3), a chemical highly toxic in pure form. At product concentrations,

though not classified as hazardous, build-ups of NaN3 may react with lead and copper plumbing to form highly explosive metal azides. Upon disposal, flush with large volumes of water to prevent azide build-up in plumbing.8,24

3. Minimize microbial contamination of reagents or increase in nonspecific staining may occur. 4. As with any product derived from biological sources, proper handling procedures should be used. 5. Wear appropriate Personal Protective Equipment to avoid contact with eyes and skin. 6. Unused solution should be disposed of according to local, State and Federal regulations. 7. Safety Data Sheet available for professional users on request. General 1. Do not use reagents beyond expiration date. 2. Do not substitute reagents from kits of other manufacturers. 3. Do not store system components or perform staining in strong light, such as direct sunlight. Note: Slides must be protected from light during the Amplification Reagent incubation step.

Warning Amplification Reagent: 10-30% Glycerol H320 Causes eye irritation. P280 Wear eye or face protection. P264 Wash hands thoroughly after handling. P305 + P351 + P338

IF IN EYES: Rinse cautiously with water for several minutes. Remove contact lenses, if present and easy to do. Continue rinsing.

P337 + P313 If eye irritation persists: Get medical attention.

Danger DAB Chromogen: 1-5% biphenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammonium tetrachloride H350 May cause cancer. H341 Suspected of causing genetic defects. P201 Obtain special instructions before use. P202 Do not handle until all safety precautions have been read and understood. P281 Use personal protective equipment as required. P308 + P313 IF exposed or concerned: Get medical attention. P405 Store locked up. P501 Dispose of contents and container in accordance with all local, regional, national and

international regulations.

Storage

Reagents of CSA II System are to be stored at 2–8°C. Do not freeze. Do not use after expiration printed on reagent vials and kit label. There are no obvious signs to indicate instability of these products. Therefore, positive and negative controls should be tested simultaneously with patient specimens. If unexpected staining is observed which cannot be explained by variation in laboratory procedures and a problem with the kit is suspected, contact Dako Technical Support.

Reagent preparation

Wash Buffer Investigation has shown that 0.05 mol/L Tris-HCl, pH 7.6, containing 0.3 mol/L NaCl and 0.1% Tween 20, without sodium azide, significantly aids in minimizing background staining with this system. A recommended wash buffer is TBST 10x (code S3306). Wash buffers containing sodium azide inactivate horseradish peroxidase and result in negative staining. Store unused buffer at 2–8°C. Discard buffer if cloudy in appearance. Automated Staining Automation Buffer, 10x (code S3006) can be used for the general wash buffer rinses on the Dako Autostainer for the CSA II automated protocol, but a 5–10 minute auxiliary wash with TBST (code S3306) should be used after the hydrogen peroxide, the primary antibody and the anti-mouse-HRP reagents. Distilled or deionized water may be used for rinsing after the substrate-chromogen and counterstain steps. Manual Staining Tissue sections should be washed in up to three fresh baths of TBST (code S3306) for 3–5 minutes between each step of the CSA II protocol. DAB Substrate-Chromogen Preparation One mL of the substrate-chromogen is sufficient for up to ten tissue sections.

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STEP 1 Depending on the number of slides to be stained, transfer enough 1 mL aliquots of buffer from

the Buffered Substrate bottle into a test tube. STEP 2 For each 1 mL of Buffered Substrate, add 1 drop (20 µL) from the Liquid DAB Chromogen bottle.

Mix immediately. The prepared substrate-chromogen is stable approximately five days when stored at 2–8°C. This reagent should be mixed thoroughly prior to use. Any precipitate developing in the reagent does not affect staining quality. Dilution of Concentrated Primary Antibody and Negative Control Dilute primary antibody using a diluent containing stabilizing protein. Use of Antibody Diluent with Background Reducing Components (code S3022) is highly recommended for minimizing background staining. An appropriate negative control reagent consists of mouse immunoglobulin of the same isotype as the primary antibody diluted to an immunoglobulin concentration equivalent to that of the diluted primary antibody.

Specimen preparation Prior to IHC staining, tissues must be fixed and processed. Fixation prevents autolysis and putrefaction of excised tissues, preserves antigenicity, enhances the refractive index of tissue constituents and increases the resistance of cellular elements to tissue processing. Tissue processing includes dehydration, clearing of dehydrating agents, infiltration of embedding media, embedding and sectioning of tissues. The most common fixatives for IHC tissue preparations are discussed in the “General Instructions for Immunohistochemical Staining”. These are guidelines only. Optimal procedures must be determined and verified by the user.

Paraffin-embedded specimen preparation

Survival of tissue antigens for immunological staining may depend on the type and concentration of fixative, on fixation time, and on the size of the tissue specimen to be fixed.10-15 It is important to maintain optimal, standardized fixation conditions whenever possible in order to obtain reproducible staining. Where possible, use of thinner specimens coupled with shorter fixation times is recommended. Prolonged exposure to fixatives may result in the masking of antigens and contribute to reduced staining. After fixation, tissues are dehydrated using graded alcohols, cleared with xylene or xylene substitute, and infiltrated with paraffin wax. The tissue is subsequently embedded with paraffin wax in molds or cassettes, which facilitate tissue sectioning. To minimize denaturing of antigens, do not expose tissues to temperatures in excess of 60°C during processing. Tissue blocks may be stored or sectioned on completion of embedding. Properly fixed and paraffin-embedded tissues will keep indefinitely if stored in a cool place (15–22°C). Mounting of Tissue Sections Sectioned tissues cut from paraffin-embedded blocks are collected on clean glass slides. Tap slides to remove as much water as possible. Water droplets remaining on the tissue during the drying process may adversely affect tissue staining. Dry in an oven for one to two hours at 60°C or less or allow to dry at room temperature for 15–24 hours. For increased adhesion of tissue sections during IHC staining procedures, use of poly-L-lysine coated slides, charged slides or Silanized Slides (code S3003) is suggested. Use of silanized or charged slides is strongly recommended for staining procedures requiring target retrieval.

Automated and manual staining procedure

Procedural Notes The user should read these instructions carefully and become familiar with the kit contents prior to use. All reagents should be equilibrated to room temperature (20–25°C) prior to immunostaining; likewise, all incubations are optimized for performance at room temperature. The reagents and instructions supplied in this kit have been designed for optimal performance. Further dilution of the ready-to-use reagents may give erroneous results. Note: For Automated Staining, the tinted Dako Autostainer cover should be closed during the Amplification Reagent step for optimal staining performance. For Manual Staining, protect slides from light during the incubation of the Amplification Reagent. Do not allow tissue sections to dry during the staining procedure. Dried tissue sections may display nonspecific staining. Cover slides exposed to drafts. If prolonged incubations are used, place slides in a humid environment. For reduction of nonspecific background staining it is recommended that tissue sections be rinsed with TBST according to the wash buffer recommendations in Reagent Preparation section. Deparaffinization of Tissue Sections Prior to staining, tissue slides must be deparaffinized to remove embedding medium and then rehydrated. Avoid incomplete removal of paraffin. Residual embedding medium will result in increased nonspecific staining. Proteolytic Digestion and Target Retrieval Formaldehyde is known to induce conformational changes in the antigen molecules by forming intermolecular cross-linkages. Excessive formalin fixation can mask antigenic sites and diminish specific staining. In standard IHC procedures, these sites may be revealed with proteolytic digestion of tissue prior to immunostaining.

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Note: Use of proteolytic digestion may result in high background staining with the CSA II System and is therefore not recommended. Target retrieval using heat is the preferred alternative to proteolytic digestion, resulting in a slight increase in background staining concurrent with a significant increase in specific staining with many primary antibodies. To determine if target retrieval treatment of tissues is warranted, see the specification sheet provided with the primary antibody; for some primary antibodies this procedure is required. The recommended target retrieval procedure involves immersion of tissue sections mounted on slides in a modified citrate buffer (pH 6.1) such as Target Retrieval Solution, Ready-to-use (code S1700), or 10x Concentrate (code S1699); refer to package insert for complete instructions and heating prior to IHC staining. Rinse thoroughly with wash buffer solution and continue with the staining procedure. Note: Increased background staining may result from the use of a high pH (pH 10) target retrieval solution with CSA II System and is therefore not recommended. Automated Staining Procedure STEP 1 Select Protocol Template Auto Program STEP 2 Place reagents and buffer in the Dako Autostainer reagent rack STEP 3 Load the slides on to the Dako Autostainer STEP 4 Start the run STEP 5 Remove slides from the Dako Autostainer STEP 6 Proceed with mounting Note: Counterstaining is included in the recommended programming grid. Counterstaining can be run manually on the lab bench as an alternative option. Manual Staining Procedure STEP 1 PEROXIDASE BLOCK Tap off excess liquid. Using a lintless tissue, carefully wipe around the specimen to remove any

remaining liquid and to keep reagent within the prescribed area. Apply enough Hydrogen Peroxide to cover specimen. Incubate 5 (±1) minutes. Rinse gently with distilled water or wash buffer solution from a wash bottle (do not focus flow

directly on tissue) and place in a fresh wash buffer bath.

STEP 2 PROTEIN BLOCK Tap off excess liquid and wipe slide as before. Apply enough Protein Block to cover specimen. Incubate 5 (±1) minutes. Do not rinse off protein block. STEP 3 PRIMARY ANTIBODY OR NEGATIVE CONTROL REAGENT Tap off excess Protein Block and wipe slide as before. Apply enough user-prepared primary antibody or negative control reagent to cover specimen. Incubate 15 (±1) minutes unless otherwise specified in primary antibody specification sheet. Rinse gently with wash buffer solution from a wash bottle and place in up to three fresh TBST

buffer baths for 3–5 minutes each.

STEP 4 ANTI-MOUSE IMMUNOGLOBULINS-HRP Wipe slide as before. Apply enough Anti-Mouse Immunoglobulins-HRP to cover specimen. Incubate 15 (±1) minutes. Rinse slide as in Step 3. Place in up to three fresh wash buffer baths for 3–5 minutes each. STEP 5 AMPLIFICATION REAGENT Note: Slides must be protected from light during this incubation step for optimal staining. Wipe slide as before. Apply enough Amplification Reagent to cover specimen. Incubate 15 (±1) minutes protected from light. Rinse slide as before. Place in up to three fresh wash buffer baths for 3–5 minutes each. STEP 6 ANTI-FLUORESCEIN-HRP Wipe slide as before. Apply enough Anti-Fluorescein-HRP to cover specimen. Incubate 15 (±1) minutes. Rinse slide as before. Place in up to three fresh wash buffer baths for 3–5 minutes each. STEP 7 LIQUID DAB SUBSTRATE-CHROMOGEN Wipe slide as before. Apply enough prepared Liquid DAB Substrate- Chromogen to cover specimen. Incubate 5 (±1) minutes. Rinse with distilled or deionized water.

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STEP 8 PROCEED WITH COUNTERSTAIN AND MOUNTING

Dako Autostainer Programming Grid for CSA II

The programming grid above is a Dako Protocol Template containing protocol elements to run CSA II. This example includes the recommended reagents and incubation times for an optimal CSA II run for the Autostainer (code S3004) and Autostainer Plus (code S3800). Set up a protocol template and Auto Program with these recommended steps and incubation times. The primary antibody and pretreatment has been inserted as an example. Application of Target Retrieval is antibody specific and may not be required.

Quality control

Differences in tissue processing and technical procedures in the user’s laboratory may produce significant variability in results, necessitating regular performance of in-house controls. See references 16 through 18 for additional quality control information. Positive Control Tissue Known positive control tissues should be utilized for monitoring the correct performance of processed tissues and test reagents. If the positive control tissues fail to demonstrate positive staining, results with the test specimens should be considered invalid. Negative Control Reagent Use a negative control reagent in place of the primary antibody with a section of each test specimen to evaluate nonspecific staining and to allow better interpretation of specific staining at the antigen site. If panels of antibodies are used on serial tissue sections, the negatively staining areas of one slide may serve as a negative/nonspecific binding background control for other antibodies. Refer to the “General Instructions for Immunohistochemical Staining” for further information on positive and negative controls.

Staining interpretation

The positive control specimens should be examined first to ascertain that all reagents are functioning properly. The presence of a brown-colored end product at the site of the target antigen is indicative of positive reactivity. If the positive control specimens fail to demonstrate positive staining, results with the test specimens should be considered invalid. The negative control specimens should be examined to verify the specific labelling of the target antigen by the primary antibody. The absence of specific staining in the negative control specimens confirms the specificity of the primary antibody. Nonspecific staining, if present, will be of dot-like or diffuse appearance. The high sensitivity of this system is due to its great level of signal amplification; any nonspecific background staining present will also be amplified. For this reason, use of negative control reagents on a section of each control and test specimen is recommended as an aid in interpretation of staining (see Limitations for more discussion on nonspecific staining). Sporadic light staining of connective tissue may be observed in sections from excessively formalin-fixed tissues. Use intact cells for the interpretation of staining results. Necrotic or degenerated cells often stain nonspecifically. False-positive results may be seen due to non-immunologic binding of reagents to tissue sections.

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Limitations

For optimal staining intensity, protect slides from light during the Amplification Reagent incubation (Step 5). Use of proteolytic digestion may result in high background staining with the CSA II System and is therefore not recommended. For reduction of nonspecific background staining it is recommended that tissue sections be rinsed with wash buffer (see Reagent Preparation) and incubated at room temperature in up to three fresh baths of wash buffer for three to five minutes each between each reagent step in the CSA II System protocol. Endogenous immunoglobulin, present in human tissue specimens, may exhibit various levels of cross-reactivity with secondary anti-immunoglobulin antibodies. The anti-mouse immunoglobulin-HRP secondary antibody used in this system has been absorbed with normal human serum to reduce cross-reactivity. However, due to the high sensitivity of this system, cross-reactivity to endogenous immunoglobulin may still be detected in some specimens. Background staining due to endogenous immunoglobulin is best recognized as staining in the negative control around blood and lymph vessels, in connective tissue, and in extravascular tissue spaces. Certain types of epithelium, particularly those associated with the digestive tract, may also display endogenous immunoglobulin. Staining due to endogenous immunoglobulin may also be increased by using target retrieval methods. For this reason, use of appropriate negative control reagents and tissues are required for interpreting any positive staining where presence of endogenous immunoglobulin is suspected. Endogenous peroxidase or pseudoperoxidase activity can be found in hemoproteins such as hemoglobin, myoglobin, cytochrome, and catalase, as well as in certain leucocytes.19,20 This activity can be eliminated by incubating specimens with Peroxidase Block for 5 minutes (Step 1 of the CSA II System protocol) prior to the application of the primary antibody. Tissues containing hepatitis B surface antigen (HBsAg) may exhibit nonspecific staining with horseradish peroxidase.21

Automated troubleshooting

Problem Probable Cause Suggested Action 1. No staining of slides. 1a. Programming error.

Reagents not used in proper order.

1a. Review application of reagents.

1b. Reagent vials were not loaded in the correct locations in the reagent racks.

1b. Check the Reagent Map to verify the proper location of reagent vials.

1c. Insufficient reagent in reagent vial.

1c. Ensure that enough reagent is loaded into the reagent vials prior to beginning the run. Refer to Reagent Map for volumes required.

1d. Sodium azide in buffer bath. 1d. Use fresh, azide-free buffer. 2. Weak staining of

slides. 2a. Slides not incubated long

enough with antibodies or substrate.

2a. Review recommended incubation times.

2b. Antigen under investigation requires target retrieval.

2b. Perform target retrieval.

2c. Specimens exposed to light during Amplification Reagent incubation.

2c. Protect specimens from light during Amplification Reagent incubation.

2d. Antibody concentration too low.

2d. Re-titer antibody.

3. Excessive background staining of slides.

3a. Specimens contain high levels of endogenous immunoglobulin.

3a. Compare test tissue with the negative control tissue for differences.

3b. Specimens contain high endogenous peroxidase activity.

3b. Use longer incubation time of hydrogen peroxide (Step 1).

3c. Paraffin incompletely removed.

3c. Use fresh xylene or toluene baths. If several slides are stained simultaneously, the second xylene bath should contain fresh xylene.

3d. Slides not thoroughly rinsed. 3d. Ensure that the Dako Autostainer is properly primed prior to running. Check to make sure that adequate buffer is provided for entire run. Include auxiliary washes with TBST (code S3306) as specified.

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3e. Sections dried during staining.

3e. Verify that the appropriate volume of reagent is being applied to slides. Make sure the Dako Autostainer is run with the hood in the closed position and that it is not exposed to excessive heat or drafts.

3f. Slides dried while loading the Dako Autostainer.

3f. Ensure slides remain wet with buffer while loading and prior to initiating the run.

3g. Nonspecific binding of reagents to tissue section.

3g. Use longer incubation time of Protein Block (Step 2).

3h. Nonspecific binding of primary antibody to specimen.

3h. Dilute primary antibody in diluent containing carrier protein. Antibody Diluent with Background Reducing Components (code S3022) is recommended.

3i. High pH Target Retrieval Solution used for heat retrieval prior to staining.

3i. Use a modified citrate buffer (pH 6.1) for target retrieval.

3j. Proteolytic digestion used prior to staining.

3j. Avoid use of proteolytic digestion with this staining system.

4. Tissue detached from slides.

4a. Use of incorrect slides. 4a. Use charged (SuperFrost Plus) or silanized slides such as Dako’s Silanized Slides (code S3003).

Manual troubleshooting

Problem Probable Cause Suggested Action 1. No staining of slides. 1a. Reagents not used in proper

order. 1a. Review application of reagents.

1b. Sodium azide in buffer bath. 1b. Use fresh, azide-free buffer. 2. Weak staining of

slides. 2a. Sections retain too much

solution after wash bath. 2a. Gently tap off excess solution before

wiping around slides. 2b. Slides not incubated long

enough with antibodies or substrate.

2b. Review recommended incubation times.

2c. Antigen under investigation requires target retrieval.

2c. Perform target retrieval.

2d. Specimens exposed to light during Amplification Reagent incubation.

2d. Protect specimens from light during Amplification Reagent incubation.

2e. Antibody concentration too low.

2e. Re-titer antibody.

3. Excessive background staining of slides.

3a. Specimens contain high levels of endogenous immunoglobulin.

3a. Compare test tissue with the negative control tissue for differences.

3b. Specimens contain high endogenous peroxidase activity.

3b. Use longer incubation time of hydrogen peroxide (Step 1).

3c. Paraffin incompletely removed.

3c. Use fresh xylene or toluene baths. If several slides are stained simultaneously, the second xylene bath should contain fresh xylene.

3d. Slides not thoroughly rinsed. 3d. Use fresh solutions in buffer baths and wash bottles. TBST is recommended. Incubation sections in up to three fresh TBST baths for 35 m inutes each between protocol steps.

3e. Faster than normal substrate- chromogen reaction due to excessively high room temperature.

3e. Use shorter incubation time with substrate-chromogen solution.

3f. Sections dried during staining procedure.

3f. Use humidity chamber. Wipe only 3 to 4 slides at a time before applying reagent.

3g. Nonspecific binding of reagents to tissue section.

3g. Use longer incubation time of Protein Block (Step 2).

3h. Nonspecific binding of primary antibody to specimen.

3h. Dilute primary antibody in diluent containing stabilizing protein. Antibody Diluent with Background Reducing Components (code S3022) is recommended.

3i. High pH Target Retrieval Solution used for heat Retrieval prior to staining.

3i. Use a modified citrate buffer (pH 6.1) for target retrieval.

3j. Proteolytic digestion used prior to staining.

3j. Avoid use of proteolytic digestion with this staining system.

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4. Tissue detached from slides.

4a. Use of incorrect slides. 4a. Use charged (SuperFrost Plus) or silanized slides such as Dako’s Silanized Slides (code S3003).

5. Run-to-run variability of staining intensity.

5a. Variations in room temperature.

5a. Regulate room temperature to narrow range.

5b. Slight variations in length of reagent incubations.

5b. Time incubations consistently.

5c. Variations in number and incubation times of wash buffer baths.

5c. Follow identical protocol run-to-run.

NOTE: Refer to the Troubleshooting section in the Handbook Immunochemical Staining Methods, 3rd Edition,14 Atlas of Immunohistology21 or Immunoperoxidase Techniques, A Practical Approach to Tumor Diagnosis.23 Contact Dako Technical Support at to report unusual staining.

Français Réf. K1497

Pour utilisation avec des anticorps primaires de souris

Licence d’utilisation restreinte

Ce kit fait appel à une technologie mise au point et brevetée par NEN Life Science Products, Inc. Brevet américain N° 5,196,306. Ce produit est distribué et vendu à l’Utilisateur final selon les termes de la licence accordée par NEN LIFE SCIENCE PRODUCTS, INC. pour être utilisé dans le cadre du traitement manuel ou automatique sur les instruments Dako uniquement de lames de microscope ou autres matériels de support (autres que des microréseaux et puces à ADN) contenant des échantillons de cellules ou de tissus pour examen de ces échantillons au microscope (y compris des systèmes d’analyse et de capture d’image automatisée) en vue de détecter des acides nucléiques ou des protéines cibles. L’achat n’entraîne ni ne comporte aucun droit de revente ou de transfert de ce produit, que ce soit en tant que produit à proprement parler ou en tant que composant d’un autre produit. Toute utilisation de ce produit autre que celle indiquée dans la licence sans l’autorisation écrite expresse de NEN LIFE SCIENCE PRODUCTS, INC. est strictement interdite.

Utilisation prévue

Pour utilisation diagnostique in vitro. Ces instructions concernent le produit CSA II (réf. K1497). Le CSA II est un kit d’amplification du signal par tyramide sans biotine, destiné à une utilisation en immunohistochimie. Ce kit est conçu pour être utilisé avec des anticorps primaires de souris (fournis par l’utilisateur) en vue de l’identification qualitative des antigènes par microscopie optique dans différents tissus fixés au formol et inclus en paraffine, sains et pathologiques. Ce kit peut être utilisé avec les procédures manuelles et/ou sur les instruments Dako. Consulter le document « General Instructions for Immunohistochemical Staining » (« Instructions générales de coloration immunohistochimique ») des procédures IHC pour : (1) Principe de procédure, (2) Matériaux requis mais non fournis, (3) Conservation, (4) Préparation des échantillons, (5) Procédure de coloration, (6) Contrôle qualité, (7) Dépannage, (8) Interprétation de la coloration, (9) Limites générales.

Résumé et explications

Le CSA II System est un outil de coloration par immunohistochimie (IHC) très sensible qui incorpore une méthode d'amplification du signal reposant sur le dépôt, catalysé par la peroxydase, d’un composé phénolique marqué à la fluorescéine, suivi d’une réaction secondaire à un anticorps anti-fluorescéine conjugué à la peroxydase.1-5 Au cours de la procédure, un anticorps primaire de souris est tout d’abord détecté par un anticorps secondaire conjugué à la peroxydase. L’étape suivante utilise la peroxydase liée pour catalyser l’oxydation d’un phénol conjugué à la fluorescéine (fluorescyl-tyramide) qui précipite alors sur l’échantillon. La procédure se poursuit par la détection de la fluorescéine liée par un anticorps anti-fluorescéine conjugué à la peroxydase. La coloration s’achève par l’utilisation de diaminobenzidine/peroxyde d’hydrogène comme chromogène/substrat, et peut alors être observée par microscopie optique. Par comparaison avec les méthodes d’immunohistochimie standard, de type biotine marquée à la streptavidine (LSAB) ou complexes avidine-biotine (ABC), les méthodes d’amplification par la tyramide s’avèrent beaucoup plus sensibles.3,4 Le CSA II System est une version simplifiée du kit Catalyzed Signal Amplification System (réf. K1500) ultra-sensible qui utilise un complexe biotinyle-tyramide. Le CSA II System haute sensibilité permet de détecter de très petites quantités de protéines cibles et peut également être utilisé avec des anticorps de faible affinité. Ce kit de réactif utilise le complexe fluorescyl-tyramide, et non l’association biotinyle-tyramide, et ne contient pas de réactifs avidine/biotine, ce qui élimine le risque de coloration de fond due à une réactivité à la biotine endogène.6,7

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Principes de la procédure

Les échantillons sont tout d’abord incubés avec l’agent de blocage de la peroxydase pendant cinq minutes pour éliminer toute activité de la peroxydase endogène. Ils sont ensuite incubés pendant cinq minutes avec un agent de blocage des protéines pour supprimer toute liaison non spécifique des réactifs appliqués par la suite, puis pendant quinze minutes dans un anticorps primaire de souris dilué et caractérisé de manière appropriée ou un réactif de contrôle négatif (fourni par l'utilisateur). Ensuite, on procède à plusieurs incubations de quinze minutes avec un conjugué peroxydase de raifort/anti-immunoglobulines de souris, du peroxyde d’hydrogène fluorescyl-tyramide (réactif d’amplification) et un conjugué peroxydase de raifort/anti-fluorescéine. La coloration se termine par une incubation de cinq minutes avec un conjugué peroxyde d’hydrogène/3,3’-diaminobenzidine tétrahydrochlorure (DAB) qui entraîne un précipité brun sur le site de l’antigène.

Réactifs fournis Réf. K1497

Les matériels suivants sont fournis dans le kit:

Quantité Description 1x15 mL Agent de blocage de la peroxydase

3 % de peroxyde d’hydrogène dans de l’eau.

1x15 mL Agent de blocage des protéines

Protéine sans sérum dans un tampon à 0,015 mol/L d’azide de sodium.

1x15 mL Anti-immunoglobulines de souris/peroxydase de raifort

Anticorps anti-immunoglobulines de souris conjugué à de la peroxydase de raifort dans un tampon contenant une protéine stabilisante et un agent antimicrobien.

1x15 mL Réactif d’amplification

Fluorescyl-tyramide et peroxyde d’hydrogène dans un tampon contenant une protéine stabilisante et un agent antimicrobien.

1x15 mL Anti-fluorescéine/peroxydase de raifort

Anticorps anti-fluorescéine conjugué à de la peroxydase de raifort dans un tampon contenant une protéine stabilisante et un agent antimicrobien.

1x18 mL Tampon substrat

Tampon contenant du peroxyde d’hydrogène et un conservateur.

1x1 mL Chromogène DAB liquide

Solution chromogène de 3,3'-diaminobenzidine.

Matériels requis mais non fournis

Diluant d’anticorps, de type Antibody Diluent with Background Reducing Components (réf. S3022) Échantillons de contrôle, positif et négatif Contre-colorant, de type Lillie’s Modified Mayer’s Hematoxylin (réf. S3301 pour utilisation sur le Dako Autostainer ou réf. S3302 pour coloration manuelle) Microscope optique Milieu de montage, de type Glycergel Mounting Medium (réf. C0563) ou Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (réf. S3025) ou milieu de montage permanent non aqueux, de type Permanent Mounting Media (réf. S3026) Anticorps primaires de souris et réactifs de contrôle négatif Tampon de lavage, de type TBST (Tris Buffered Saline With Tween), 10x Concentrate (réf. S3306) Coloration automatisée Dako Autostainer (réf. S3400) ou Autostainer Plus (réf. S3800). Se référer au Guide de l'utilisateur du Dako Autostainer pour connaître les composants nécessaires.

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Matériels facultatifs requis mais non fournis Consulter la fiche technique de l’anticorps primaire Solution de restauration des cibles, tampon citrate modifié (pH 6,1), par exemple : Target Retrieval Solution, Ready-to-use (réf. S1700) ou 10x Concentrate (réf. S1699) Bain-marie (pouvant maintenir la température entre 95 et 99 °C), incubateur, autocuiseur ou autoclave pour la restauration des cibles

Précautions

Spécifications produit 1. Pour utilisateurs professionnels. 2. Ce produit contient de l’azide de sodium (NaN3), produit chimique hautement toxique dans sa forme pure.

Aux concentrations du produit, bien que non classé comme dangereux, l’accumulation de NaN3 peut réagir avec le cuivre et le plomb des canalisations pour former des azides de métal hautement explosifs. Lors de l’élimination, rincer abondamment à l’eau pour éviter toute accumulation d’azide dans les canalisations.8,24

3. Réduire toute contamination microbienne des réactifs faute de quoi une augmentation non spécifique de la coloration peut se produire.

4. Comme avec tout produit d’origine biologique, des procédures de manipulation appropriées doivent être respectées.

5. Porter un vêtement de protection approprié pour éviter le contact avec les yeux et la peau 6. Les solutions non utilisées doivent être éliminées conformément aux réglementations locales et nationales. 7. La Fiche technique de sécurité destinée aux utilisateurs professionnels est disponible sur demande. Généralités 1. Ne pas utiliser les réactifs au-delà de la date de péremption. 2. Ne pas utiliser de réactifs provenant de kits d'autres fabricants. 3. Ne pas stocker les composants du kit ni effectuer de coloration sous une lumière vive, telle la lumière

directe du soleil. Remarque : Les lames doivent être à l’abri de la lumière lors de l’incubation du réactif d’amplification.

Attention Amplification Reagent: 10-30% Glycérol H320 Provoque une irritation des yeux. P280 Porter un équipement de protection du visage ou des yeux. P264 Se laver soigneusement les mains après manipulation. P305 + P351 + P338

EN CAS DE CONTACT AVEC LES YEUX: Rincer avec précaution à l'eau pendant plusieurs minutes. Enlever les lentilles de contact si la victime en porte et si elles peuvent être facilement enlevées. Continuer à rincer.

P337 + P313 Si l'irritation des yeux persiste : Consulter un médecin.

Danger DAB Chromogen: 1-5% biphenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammonium tetrachloride H350 Peut provoquer le cancer. H341 Susceptible d’induire des anomalies génétiques. P201 Se procurer les instructions avant utilisation. P202 Ne pas manipuler avant d'avoir lu et compris toutes les précautions de sécurité. P281 Utiliser l’équipement de protection individuel requis. P308 + P313 EN CAS d’exposition prouvée ou suspectée: Consulter un médecin. P405 Garder sous clef. P501 Éliminer le contenu et le récipient en conformité avec toutes réglementations locales,

régionales, nationales, et internationales.

Conservation

Les réactifs du kit CSA II System doivent être conservés entre 2 et 8 °C. Ne pas congeler. Ne pas utiliser après la date de péremption imprimée sur l’étiquette des flacons de réactif et du kit. Il n’y a aucun signe indiquant l’instabilité de ces produits. Par conséquent, les contrôles positif et négatif doivent être testés en même temps que des échantillons de patient. Si une coloration inattendue est observée, ne pouvant être expliquée par un changement des procédures du laboratoire et en cas de suspicion d’un problème dans le kit, contacter l’assistance technique Dako.

Préparation des réactifs

Tampon de lavage Les recherches ont montré que le tampon Tris-HCl à 0,05 mol/L, de pH 7,6, contenant du NaCl à 0,3 mol/L et du Tween 20 à 0,1 %, sans azide de sodium, facilite de manière significative la réduction du bruit de fond avec ce kit. Le TBST 10x (réf. S3306) est recommandé comme tampon de lavage. Les tampons de lavage contenant de l’azide de sodium inactivent la peroxydase de raifort et entraînent une coloration négative. Conserver le tampon non utilisé entre 2 et 8 °C. Jeter le tampon s’il semble trouble. Coloration automatisée L’Automation Buffer, 10x (réf. S3006) peut être utilisé comme tampon de lavage général lors des étapes de lavage du protocole automatisé CSA II sur Dako Autostainer mais un rinçage complémentaire de 5 à 10 minutes avec du TBST (réf. S3306) doit être effectué après le peroxyde d’hydrogène, l’anticorps primaire et les réactifs anti-souris-peroxydase de raifort. De l’eau distillée ou déionisée peut être utilisée pour le

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rinçage après les étapes de substrat-chromogène et de contre-coloration. Coloration manuelle Les coupes de tissus doivent être rincées dans un à trois bains de TBST (réf. S3306) pendant 3 à 5 minutes entre chaque étape du protocole CSA II. Préparation du substrat-chromogène DAB. Un mL de substrat-chromogène suffit pour 10 coupes de tissus. ÉTAPE 1 En fonction du nombre de lames à colorer, transférer 1 mL d’aliquotes de tampon du flacon de

substrat tamponné dans un tube à essai. ÉTAPE 2 Pour chaque mL de tampon substrat, ajouter 1 goutte (20 µL) du flacon de chromogène DAB

liquide. Mélanger immédiatement. Le substrat-chromogène ainsi préparé est stable environ cinq jours lorsqu’il est conservé entre 2 et 8 °C. Ce réactif doit être mélangé vigoureusement avant utilisation. La formation d’un précipité dans le réactif n'affecte pas la qualité de la coloration. Dilution de l’anticorps primaire concentré et du contrôle négatif Diluer l’anticorps primaire dans du diluant contenant une protéine stabilisante. L’utilisation d’Antibody Diluent with Background Reducing Components (réf. S3022) est fortement recommandée pour minimiser la coloration de fond. Un réactif de contrôle négatif approprié est composé d’immunoglobulines de souris du même isotype que celles de l’anticorps primaire, diluées à une concentration équivalente à celle de l’anticorps primaire dilué.

Préparation des échantillons

Avant la coloration IHC, les tissus doivent être fixés et traités. Leur fixation évite l’autolyse et la putréfaction des tissus excisés, préserve l’antigénicité, améliore l’indice de réfraction des composants tissulaires et accroît la résistance des éléments cellulaires au traitement des tissus. Le traitement des tissus inclut la déshydratation, l’élimination des agents déshydratants, l’infiltration du milieu d’inclusion, l’inclusion et la coupe des tissus. Les fixateurs les plus courants pour la préparation IHC des tissus sont présentés dans les « General Instructions for Immunohistochemical Staining » (« Instructions générales de coloration immunohistochimique »). Il ne s’agit là que de conseils. Les procédures optimales doivent être déterminées et vérifiées par l’utilisateur.

Préparation des échantillons pour inclusion en paraffine

La survie des antigènes tissulaires pour coloration immunologique peut dépendre du type et de la concentration du fixateur, du temps de fixation et de la taille de l’échantillon de tissu fixé.10-15 Il est très important de préserver des conditions de fixation optimales et standard dans la mesure du possible afin d’obtenir une coloration reproductible. Si possible, utiliser des échantillons plus fins et des temps de fixation réduits. Une exposition prolongée aux fixateurs peut provoquer le masquage des antigènes et contribuer à diminuer la coloration. Après fixation, les tissus sont déshydratés dans des bains d’alcool à différents grades, rincés au xylène ou avec un substitut de xylène, puis infiltrés à la paraffine. Les tissus sont ensuite inclus en paraffine dans des moules qui facilitent ensuite leur coupe. Pour éviter de dénaturer les antigènes, ne pas exposer les tissus à des températures supérieures à 60 °C au cours du traitement. Les blocs de tissus peuvent être stockés ou coupés dès la fin de l’inclusion. Des tissus fixés et inclus en paraffine correctement peuvent être conservés indéfiniment dans un endroit frais (15–22 °C). Montage des coupes de tissus Les coupes de tissus réalisées dans les blocs inclus en paraffine sont recueillies sur des lames de verre propres. Tapoter les lames pour éliminer le plus d’eau possible. Les gouttes d’eau qui restent sur les tissus au cours du processus de séchage peuvent altérer la coloration. Sécher dans une étuve pendant une à deux heures à 60 °C maximum ou laisser à température ambiante pendant 15 à 24 heures. Pour une meilleure adhérence des coupes de tissus au cours des procédures de coloration par IHC, il est recommandé d’utiliser les lames enduites de poly-L-lysine, des lames chargées ou des Silanized Slides (réf.S3003). L’utilisation de lames silanisées ou chargées est par ailleurs fortement recommandée pour les procédures de coloration faisant appel à la restauration des cibles.

Procédure de coloration manuelle et automatique

Remarques sur la procédure L’utilisateur doit lire attentivement les présentes instructions et se familiariser avec le contenu du kit avant utilisation. Tous les réactifs doivent être amenés à température ambiante (20–25 °C) avant coloration ; de même, toutes les incubations offrent des performances optimales à température ambiante. Les réactifs fournis dans ce kit et les instructions correspondantes ont été conçus pour des performances optimales. Une dilution supplémentaire des réactifs prêts à l’emploi peut générer des résultats erronés. Remarque : Pour la coloration automatisée, le couvercle coloré du Dako Autostainer doit être fermé au cours de l’étape faisant appel au réactif d’amplification pour garantir des performances de coloration optimales. Pour la coloration manuelle, conserver les lames à l’abri de la lumière au cours de l’incubation du réactif d’amplification.

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Ne pas laisser les lames sécher pendant la procédure de coloration. Les coupes de tissus séchées peuvent présenter une coloration non spécifique. Couvrir les lames exposées aux courants d'air. Si la durée d’incubation est prolongée, placer les lames dans un environnement humide. Pour réduire le bruit de fond non spécifique, il est recommandé de rincer les coupes de tissus au TBST conformément aux recommandations d’utilisation des tampons de lavage de la section Préparation des réactifs. Déparaffinage des coupes de tissus Avant la coloration, les lames de tissu doivent être déparaffinées afin d'éliminer le milieu d’inclusion, puis réhydratées. Éviter toute élimination incomplète de la paraffine. Tout résidu de milieu d'inclusion entraîne une coloration non spécifique plus importante. Digestion protéolytique et restauration des cibles Le formol est connu pour induire des modifications conformationnelles des molécules des antigènes en favorisant des liaisons croisées intermoléculaires. Une fixation excessive au formol peut donc masquer les sites antigéniques et atténuer la coloration spécifique. Dans les procédures IHC standard, ces sites peuvent être révélés par digestion protéolytique des tissus avant coloration. Remarque : L’utilisation de la digestion protéolytique peut provoquer une importante coloration de fond avec le kit CSA II System et n’est donc pas recommandée. La restauration des cibles par la chaleur est l’alternative de prédilection car elle augmente peu la coloration de fond tout en augmentant de manière significative la coloration spécifique avec de nombreux anticorps primaires. Pour déterminer si le traitement de restauration des cibles est garanti sur les tissus, voir la fiche technique fournie avec l’anticorps primaire car pour certains anticorps primaires, cette procédure est requise. La procédure de restauration des cibles recommandée implique l’immersion des coupes de tissus montées sur lames dans un tampon citrate modifié (pH 6,1) de type Target Retrieval Solution, Ready-to-use (réf. S1700) ou 10x Concentrate (réf. S1699) ; consulter la notice pour des instructions détaillées sur le chauffage avant la coloration IHC. Rincer abondamment avec la solution de tampon de lavage et poursuivre la procédure de coloration. Remarque : Un accroissement de la coloration de fond peut se produire avec une solution de restauration des cibles à pH élevé (pH 10) sur le CSA II System ; les solutions de ce type ne sont donc pas recommandées. Procédure de coloration automatisée ÉTAPE 1 Sélectionner le programme Protocol Template Auto (Protocole maître auto). ÉTAPE 2 Placer les réactifs et le tampon dans le portoir du Dako Autostainer. ÉTAPE 3 Charger les lames sur le Dako Autostainer ÉTAPE 4 Lancer le cycle. ÉTAPE 5 Retirer les lames du Dako Autostainer. ÉTAPE 6 Procéder au montage. Remarque : La contre-coloration est incluse dans la grille de programme recommandée. La contre-colorartion peut également être effectuée manuellement. Procédure de coloration manuelle ÉTAPE 1 AGENT DE BLOCAGE DE LA PEROXYDASE Secouer pour enlever l’excès de liquide. À l’aide d’un tissu non pelucheux, essuyer avec

précaution autour de l'échantillon pour enlever tout liquide restant et maintenir le réactif dans la zone indiquée.

Appliquer suffisamment de peroxyde d’hydrogène pour recouvrir l’échantillon. Incuber pendant 5 minutes ± 1 minute. Rincer doucement à l’eau distillée ou avec une solution tampon contenue dans un flacon de

lavage (ne pas diriger le jet directement sur les tissus) et placer dans un bain de tampon renouvelé.

ÉTAPE 2 AGENT DE BLOCAGE DES PROTÉINES Tapoter pour enlever l’excès de liquide et essuyer les lames comme décrit ci-avant. Appliquer suffisamment d’agent de blocage des protéines pour recouvrir l’échantillon. Incuber pendant 5 minutes ± 1 minute. Ne pas rincer l’agent de blocage des protéines. ÉTAPE 3 ANTICORPS PRIMAIRE OU RÉACTIF DE CONTRÔLE NÉGATIF Tapoter pour enlever l’excès d'agent de blocage des protéines et essuyer les lames comme

décrit ci-avant. Appliquer suffisamment d’anticorps primaire préparé par l’utilisateur ou de réactif de contrôle

négatif pour recouvrir l’échantillon. Incuber pendant 15 minutes ± 1 minute sauf indication contraire dans la fiche technique de

l’anticorps primaire. Rincer doucement avec une solution tampon contenue dans un flacon de lavage et placer dans

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un à trois bains de TBST renouvelé, pendant 3 à 5 minutes à chaque fois.

ÉTAPE 4 ANTI-IMMUNOGLOBULINES DE SOURIS/PEROXYDASE DE RAIFORT Essuyer les lames comme décrit ci-avant. Appliquer suffisamment d’anticorps anti-immunoglobulines de souris-peroxydase de raifort pour

recouvrir l’échantillon. Incuber pendant 15 minutes ± 1 minute. Rincer les lames comme indiqué à l’étape 3. Placer dans un à trois bains de tampon de lavage

renouvelé, pendant 3 à 5 minutes à chaque fois. ÉTAPE 5 RÉACTIF D’AMPLIFICATION Remarque : Les lames doivent être conservées à l’abri de la lumière pendant cette étape

d’incubation pour une coloration optimale. Essuyer les lames comme décrit ci-avant. Appliquer suffisamment de réactif d’amplification pour recouvrir l’échantillon. Incuber pendant 15 minutes ± 1 minute à l’abri de la lumière. Rincer les lames comme indiqué ci-avant. Placer dans un à trois bains de tampon de lavage

renouvelé, pendant 3 à 5 minutes à chaque fois. ÉTAPE 6 ANTI-FLUORESCÉINE-PEROXYDASE DE RAIFORT Essuyer les lames comme décrit ci-avant. Appliquer suffisamment d’anti-fluorescéine-peroxydase de raifort pour recouvrir l’échantillon. Incuber pendant 15 minutes ± 1 minute. Rincer les lames comme indiqué ci-avant. Placer dans un à trois bains de tampon de lavage

renouvelé, pendant 3 à 5 minutes à chaque fois. ÉTAPE 7 SUBSTRAT-CHROMOGÈNE DAB LIQUIDE Essuyer les lames comme décrit ci-avant. Appliquer suffisamment de substrat-chromogène DAB liquide pour recouvrir l’échantillon. Incuber pendant 5 minutes ± 1 minute. Rincer à l’eau distillée ou déionisée. ÉTAPE 8 PROCÉDER À LA CONTRE-COLORATION ET AU MONTAGE

Grille de programmation du Dako Autostainer pour CSA II

La grille de programmation (ci-dessus) est un modèle de protocole Dako contenant les éléments de protocole permettant d’utiliser le kit CSA II. Cet exemple inclut les réactifs et temps d’incubation recommandés pour utiliser de manière optimale le CSA II sur l’Autostainer (réf. S3004) et l’Autostainer Plus (réf. S3800). Il convient de définir un modèle de protocole et de programmation automatique en respectant les étapes et temps d’incubation recommandés. L’anticorps primaire et le prétraitement ont été ajoutés à titre d’exemple. L’application de la solution de restauration des cibles est spécifique à l’anticorps et n’est pas forcément nécessaire.

Contrôle qualité

Les différences dans les procédures techniques et le traitement des tissus du laboratoire peuvent générer une variabilité significative des résultats, ce qui requiert des contrôles internes réguliers. Voir les références 16 à 18 pour plus d’informations sur le contrôle qualité. Tissu de contrôle positif Les tissus de contrôle positif connus ne doivent être utilisés que pour vérifier les bonnes performances des tissus traités et des réactifs de test. Si les tissus de contrôle positif ne présentent pas de coloration positive appropriée, les résultats des échantillons à analyser doivent être considérés comme non valides.

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Réactif de contrôle négatif Utiliser un réactif de contrôle négatif au lieu de l'anticorps primaire avec une coupe de chaque échantillon de patient afin d'évaluer la coloration non spécifique et d’obtenir une meilleure interprétation de la coloration spécifique au niveau du site de l'antigène. Si des panels d’anticorps sont utilisés sur des coupes de tissus en série, les zones sans coloration d’une lame peuvent servir de contrôle de fond négatif/de liaison non spécifique pour les autres anticorps. Consulter les « General Instructions for Immunohistochemical Staining » (« Instructions générales de coloration immunohistochimique ») pour plus d’informations sur les contrôles positifs et négatifs.

Interprétation de la coloration

Les échantillons de contrôle positif doivent être examinés en premier lieu pour vérifier que tous les réactifs fonctionnent correctement. La présence d’un produit final de couleur marron sur le site de l’antigène cible est le signe d’une réaction positive. Si les contrôles positifs ne présentent pas de coloration positive, les résultats des échantillons à analyser doivent être considérés comme non valides. Les échantillons de contrôle négatif doivent être examinés pour vérifier le marquage spécifique de l’antigène cible par l’anticorps primaire. L’absence de coloration spécifique dans les contrôles négatifs confirme la spécificité de l’anticorps primaire. Une coloration non spécifique, le cas échéant, présente une apparence diffuse ou en pointillés. La grande sensibilité de ce kit repose sur le niveau élevé d’amplification du signal ; une coloration de fond non spécifique, si présente, sera également amplifiée. Pour cette raison, l’utilisation de réactifs de contrôle négatif sur une coupe de chaque échantillon de contrôle et à analyser est recommandée pour faciliter l’interprétation de la coloration (voir la partie Limites pour plus d'informations sur la coloration non spécifique). Une légère coloration sporadique du tissu conjonctif peut également être observée dans des coupes provenant de tissus fixés au formol de manière excessive. Utiliser des cellules intactes pour l’interprétation des résultats de coloration. Les cellules nécrotique ou dégénérées se colorent souvent de manière non spécifique. Des faux positifs peuvent être dus à une liaison non immunologique des réactifs aux coupes de tissus.

Limites

Pour une intensité de coloration optimale, conserver les lames à l’abri de la lumière au cours de l’étape d’incubation avec le réactif d’amplification (étape 5). L’utilisation d’une digestion protéolytique peut provoquer une forte coloration de fond avec le CSA II System et n’est donc pas recommandée. Pour réduire la coloration de fond non spécifique, il est recommandé de rincer les coupes de tissus avec un tampon de lavage (voir Préparation des réactifs) et de laisser incuber à température ambiante dans un à trois bains de tampon de lavage renouvelé pendant 3 à 5 minutes à chaque fois et ce entre chaque étape de réactif dans le protocole du CSA II System. Les immunoglobulines endogènes, présentes dans les échantillons de tissu humain, peuvent présenter des niveaux divers de réactivité croisée avec les anticorps secondaires anti-immunoglobulines. L’anticorps secondaire anti-immunoglobulines de souris-peroxydase de raifort utilisé dans ce kit a été absorbé avec du sérum humain normal pour réduire la réactivité croisée. Cependant, du fait de la haute sensibilité de ce kit, une réactivité croisée aux immunoglobulines endogènes peut tout de même être détectée dans certains échantillons. Une coloration de fond due aux immunoglobulines endogènes est mieux reconnue comme une coloration dans le contrôle négatif autour des vaisseaux sanguins et lymphatiques, dans le tissu conjonctif et dans les espaces extravasculaires. Certains types d’épithéliums, notamment ceux associés au tube digestif, peuvent également présenter des immunoglobulines endogènes. La coloration due aux immunoglobulines endogènes peut également être accrue par l’emploi de méthodes de restauration des cibles. Pour cette raison, l’utilisation de réactifs et de tissus négatifs appropriés est nécessaire pour interpréter une coloration positive si l’on suspecte la présence d’immunoglobulines endogènes. Une activité endogène peroxydasique ou pseudoperoxydasique peut se manifester dans les hémoprotéines comme l'hémoglobine, la myoglobine, les cytochromes et la catalase, ainsi que dans certains leucocytes.19,20 Cette activité peut être éliminée en incubant les échantillons avec l’agent de blocage de la peroxydase pendant cinq minutes (étape 1 du protocole CSA II System) avant application de l’anticorps primaire. Les tissus porteurs de l'antigène de surface de l'hépatite B (HBsAg) peuvent présenter une coloration non spécifique à la peroxydase de raifort.21

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Détection des pannes pour la procédure automatisée

Problème Cause probable Action recommandée 1. Coloration d’aucune

lame. 1a. Erreur de programmation. Les

réactifs n’ont pas été utilisés dans l’ordre.

1a. Revoir l’application des réactifs.

1b. Les flacons de réactifs n'ont pas été chargés dans les bons emplacements des portoirs.

1b. Vérifier le Plan des réactifs pour s'assurer du bon placement des flacons de réactifs.

1c. Quantité de réactif insuffisante dans le flacon.

1c. S'assurer qu'il y a assez de réactif dans les flacons chargés avant de lancer le cycle. Se référer au Plan des réactifs pour connaître les volumes requis.

1d. Azide de sodium dans un bain de tampon.

1d. Utiliser un nouveau tampon sans azide.

2. Coloration faible des lames.

2a. Les lames ne sont pas incubées assez longtemps avec les anticorps ou le substrat.

2a. Revoir les temps d’incubation recommandés.

2b. L’antigène étudié nécessite une restauration des cibles.

2b. Effectuer une restauration des cibles.

2c. Les échantillons ont été exposés à la lumière au cours de l’incubation avec le réactif d'amplification.

2c. Conserver les échantillons à l’abri de la lumière au cours de l’incubation avec le réactif d’amplification.

2d. Concentration en anticorps trop faible.

2d. Titrer à nouveau l’anticorps.

3. Coloration de fond excessive des lames.

3a. Les échantillons contiennent des niveaux élevés d’immunoglobulines endogènes.

3a. Comparer les tissus à tester avec le contrôle négatif pour voir les différences.

3b. Les échantillons présentent une forte activité peroxydasique endogène.

3b. Prolonger le temps d’incubation du peroxyde d’hydrogène (étape 1).

3c. La paraffine n’a pas été complètement enlevée.

3c. Utiliser de nouveaux bains de xylène ou de toluène. Si plusieurs lames se colorent en même temps, le second bain de xylène doit contenir du xylène fraîchement renouvelé.

3d. Les lames ne sont pas bien rincées.

3d. S'assurer que le Dako Autostainer est correctement amorcé avant de lancer le cycle. Vérifier que le tampon adéquat est fourni pour le cycle entier. Ajouter des rinçages supplémentaires avec le TBST (réf. S3306) comme indiqué.

3e. Les coupes ont séché au cours de la coloration.

3e. Vérifier que le volume de réactif approprié est appliqué sur les lames. S'assurer que le capot du Dako Autostainer est fermé avant de l'allumer et que l'appareil n'est pas exposé à une chaleur excessive ou à des courants d'air.

3f. Les lames ont séché pendant leur chargement dans le Dako Autostainer.

3f. S'assurer que les lames demeurent humides à l'aide de tampon pendant leur chargement et avant de lancer le cycle.

3g. Liaison non spécifique des réactifs aux coupes de tissus.

3g. Prolonger le temps d’incubation de l’agent de blocage des protéines (étape 2).

3h. Liaison non spécifique de l’anticorps primaire à l’échantillon.

3h. Diluer l’anticorps primaire dans du diluant contenant une protéine de transport. L’Antibody Diluent with Background Reducing Components (réf. S3022) est recommandé.

3i. Une solution de restauration des cibles à pH élevé a été utilisée pour une restauration par la chaleur avant coloration.

3i. Utiliser un tampon citrate modifié (pH 6,1) pour la restauration des cibles.

3j. Une digestion protéolytique a été effectuée avant coloration.

3j. Éviter la digestion protéolytique avec ce kit de coloration.

4. Le tissu se détache des lames.

4a. Utilisation de lames inadéquates.

4a. Utiliser des lames chargées (SuperFrost Plus) ou des lames silanisées telles les Silanized Slides (réf. S3003) de Dako.

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Détection des pannes pour la procédure manuelle

Problème Cause probable Action recommandée 1. Coloration d’aucune

lame. 1a. Les réactifs n’ont pas été

utilisés dans l’ordre. 1a. Revoir l’application des réactifs.

1b. Azide de sodium dans un bain de tampon.

1b. Utiliser un nouveau tampon sans azide.

2. Coloration faible des lames.

2a. Les coupes conservent trop de solution après un bain de lavage.

2a. Tapoter doucement pour éliminer l’excès de solution avant d’essuyer autour des lames.

2b. Les lames ne sont pas incubées assez longtemps avec les anticorps ou le substrat.

2b. Revoir les temps d’incubation recommandés.

2c. L’antigène étudié nécessite une restauration des cibles.

2c. Effectuer une restauration des cibles.

2d. Les échantillons ont été exposés à la lumière au cours de l’incubation avec le réactif d'amplification.

2d. Conserver les échantillons à l’abri de la lumière au cours de l’incubation avec le réactif d’amplification.

2e. Concentration en anticorps trop faible.

2e. Titrer à nouveau l’anticorps.

3. Coloration de fond excessive des lames.

3a. Les échantillons contiennent des niveaux élevés d’immunoglobulines endogènes.

3a. Comparer les tissus à tester avec le contrôle négatif pour voir les différences.

3b. Les échantillons présentent une forte activité peroxydasique endogène.

3b. Prolonger le temps d’incubation du peroxyde d’hydrogène (étape 1).

3c. La paraffine n’a pas été complètement enlevée.

3c. Utiliser de nouveaux bains de xylène ou de toluène. Si plusieurs lames se colorent en même temps, le second bain de xylène doit contenir du xylène fraîchement renouvelé.

3d. Les lames ne sont pas bien rincées.

3d. Utiliser de nouvelles solutions dans les bains de tampon et les flacons de lavage. Le TBST est recommandé. Incuber les coupes dans un à trois bains de TBST renouvelé, pendant 3 à 5 minutes à chaque fois entre les différentes étapes du protocole.

3e. La réaction du substrat-chromogène est plus rapide que la normale du fait d’une température ambiante trop élevée.

3e. Raccourcir le temps d’incubation avec la solution de substrat chromogène.

3f. Les coupes ont séché au cours de la procédure de coloration.

3f. Utiliser une chambre humide. Essuyer seulement 3 à 4 lames en même temps avant d’appliquer le réactif.

3g. Liaison non spécifique des réactifs aux coupes de tissus.

3g. Prolonger le temps d’incubation de l’agent de blocage des protéines (étape 2).

3h. Liaison non spécifique de l’anticorps primaire aux échantillons.

3h. Diluer l’anticorps primaire dans du diluant contenant une protéine stabilisante. L’Antibody Diluent with Background Reducing Components (réf. S3022) est recommandé.

3i. Une solution de restauration des cibles à pH élevé a été utilisée pour une restauration par la chaleur avant coloration.

3i. Utiliser un tampon citrate modifié (pH 6,1) pour la restauration des cibles.

3j. Une digestion protéolytique a été effectuée avant coloration.

3j. Éviter la digestion protéolytique avec ce kit de coloration.

4. Le tissu se détache des lames.

4a. Utilisation de lames inadéquates.

4a. Utiliser des lames chargées (SuperFrost Plus) ou des lames silanisées telles les Silanized Slides (réf. S3003) de Dako.

5. Variabilité inter-cycles de l’intensité de coloration.

5a. Variations de la température ambiante.

5a. Réguler la température ambiante pour qu’elle varie moins.

5b. Légères variations dans la durée d’incubation des réactifs.

5b. Respecter à la lettre les temps d’incubation.

5c. Variations du nombre d’incubations et de leur durée pour les bains de tampon de lavage.

5c. Suivre le même protocole d’un cycle à l’autre.

REMARQUE : Consulter la section Dépannage des ouvrages Handbook Immunochemical Staining Methods, 3rd Edition,14 Atlas of Immunohistology21 ou Immunoperoxidase Techniques, A Practical Approach to Tumor Diagnosis.23 Contacter l’assistance technique Dako pour faire part de toute coloration inhabituelle.

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Deutsch Code K1497

Zur Verwendung mit primären Maus-Antikörpern

Eingeschränkte Nutzungslizenz

Dieses System enthält von NEN Life Science Products, Inc. entwickelte und lizenzierte Technologie (US-Patentnr. 5,196,306). Dieses Produkt wird gemäß einer Lizenz von NEN LIFE SCIENCE PRODUCTS, INC. zur Verwendung in manuellen oder automatischen Verfahren mit Dako-Geräten vertrieben und an Endverbraucher verkauft. Es darf ausschließlich mit auf Glas-Objektträgern oder anderen Trägermaterialien (ausgenommen Mikroarrays und Biochips) aufgetragenen Zell- oder Gewebeproben zur Untersuchung dieser Proben unter einem Mikroskop (einschließlich automatischer Bilderfassungs- und -analysesysteme) zum Zweck des Nachweises von Ziel-Nukleinsäuren oder -proteinen verwendet werden. Der Erwerb berechtigt weder zum Wiederverkauf noch zur Weitergabe dieses Produkts als eigenständiges Gerät oder als Bestandteil eines anderen Produkts. Über den lizenzierten Verwendungszweck hinaus ist jede andere Verwendung dieses Produkts ohne ausdrückliche schriftliche Genehmigung seitens NEN LIFE SCIENCE PRODUCTS, INC. strengstens untersagt.

Verwendungszweck

Zur In-vitro-Diagnostik. Diese Anweisungen gelten für das CSA II (Code K1497). CSA II ist ein biotinfreies Tyramid-Signal-Amplifikationssystem für die Immunhistochemie. Dieses System dient zur qualitativen Identifizierung von Antigenen in normalen und pathologischen formalinfixierten, paraffineingebetteten Geweben durch Lichtmikroskopie unter Verwendung vom Anwender bereitgestellter primärer Maus-Antikörper. Es ist in manuellen Verfahren und/oder mit Dako-Geräten anwendbar. Die „General Instructions for Immunohistochemical Staining“ (Allgemeine Richtlinien zur immunhistochemischen Färbung“) für IHC-Verfahren geben Aufschluss über: (1) Verfahrensprinzip, (2) Erforderliche, aber nicht mitgelieferte Materialien, (3) Aufbewahrung (4) Vorbereitung der Probe, (5) Färbeverfahren, (6) Qualitätskontrolle, (7) Fehlersuche und -behebung, (8) Auswertung der Färbung, (9) Allgemeine Einschränkungen.

Zusammenfassung und Erklärung

Das CSA II-System ist ein hochempfindliches, immunhistochemisches (IHC-) Färbeverfahren mit integrierter Signalamplifikation auf der Basis einer durch Peroxidase katalysierten Abscheidung einer fluoresceinmarkierten Phenolverbindung, gefolgt von einer zweiten Reaktion mit peroxidasekonjugiertem Anti-Fluorescein.1-5 Durch das Verfahren wird zuerst mit einem peroxidasekonjugierten sekundären Antikörper ein primärer Maus-Antikörper nachgewiesen. Im nächsten Schritt dient die gebundene Peroxidase als Katalysator für die Oxidation eines fluoresceinkonjugierten Phenols (Fluorescein-Tyramid), das dann auf der Probe ausgefällt wird. Es folgt der Nachweis des gebundenen Fluoresceins durch ein peroxidasekonjugiertes Anti-Fluorescein. Die Färbung wird durch Diaminobenzidin/Wasserstoffperoxid als Chromogensubstrat abgeschlossen und ist mit einem Lichtmikroskop darstellbar. Verfahren der Tyramid-Amplifikation sind um ein Vielfaches empfindlicher als Standardverfahren der Immunhistochemie wie die Labelled-Streptavidin-Biotin (LSAB)- oder die Avidin-Biotin-Komplex (ABC)-Methode.3,4 Das CSA II System ist eine vereinfachte Version des hochempfindlichen Catalyzed Signal Amplification Systems (Code K1500), das Biotinyltyramid verwendet. Es ermöglicht den Nachweis sehr kleiner Mengen des Zielproteins und eignet sich ebenfalls für niedrig-affine Antikörper. Da dieses System Fluoresceintyramid anstelle von Biotinyltyramid verwendet und keine Avidin/Biotin-Reagenzien enthält, wird eine potenzielle Hintergrundfärbung durch Reaktivität mit endogenem Biotin unterdrückt.6,7

Verfahrensprinzip Zur Unterdrückung der Endogene-Peroxidase-Aktivität wird die Probe zunächst fünf Minuten mit Peroxidase-Block inkubiert. Um die unspezifische Bindung der im Anschluss verwendeten Reagenzien zu verhindern, werden die Proben anschließend weitere fünf Minuten mit einem Protein-Block inkubiert. Es folgt eine 15-minütige Inkubation mit einem entsprechend gekennzeichneten und verdünnten primären Maus-Antikörper oder einer Negativkontrolle (vom Anwender bereitgestellt). Danach wird nacheinander je 15 Minuten mit Anti-Maus Immunglobulin-HRP, Fluoresceintyramid-Wasserstoffperoxid (Amplifikationsreagenz) und Anti-Fluorescein-HRP inkubiert. Eine fünfminütige Inkubation mit 3,3’ Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid (DAB)/Wasserstoffperoxid schließt die Färbung ab, die sich als braun gefärbtes Präzipitat am Ort des Antigens darstellt.

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Mitgelieferte Reagenzien

Code K1497 Dieses Kit enthält folgende Materialien:

Menge Beschreibung 1 x 15 ml Peroxidase-Block

3 % Wasserstoffperoxid in Wasser.

1 x 15 ml Protein Block

Serumfreies Protein in Puffer mit 0,015 mol/L Natriumazid.

1 x 15 ml Anti-Maus-Immunglobulin-HRP

Mit Meerrettichperoxidase konjugierte Anti-Maus-Immunoglobuline in einem Puffer mit Stabilisatorprotein und einem antimikrobiellen Wirkstoff.

1 x 15 ml Amplifikationsreagenz

Fluoresceintyramid und Wasserstoffperoxid in Puffer mit Stabilisatorprotein und einer antimikrobiellen Substanz.

1 x 15 ml Anti-Fluorescein-HRP

Mit Meerrettichperoxidase konjugierte Anti-Fluorescein-Antikörper in einem Puffer mit Stabilisatorprotein und einem antimikrobiellen Wirkstoff.

1 x 18 mL Gepuffertes Substrat

Puffer mit Wasserstoffperoxid und Konservierungsmittel.

1 x 1 mL Liquid DAB Chromogen

3,3'-Diaminobenzidin-Chromogenlösung.

Erforderliches, aber nicht mitgeliefertes Material

Antibody Diluent, beispielsweise Antibody Diluent with Background Reducing Components (Code S3022) Positive und negative Kontrollproben Gegenfärbung wie Lillie’s Modified Mayer’s Hematoxylin (Code S3301 zur Verwendung mit dem Dako Autostainer oder Code S3302 für Manual Staining) Lichtmikroskop Fixiermittel wie Glycergel Mounting Medium (Code C0563), Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (Code S3025) oder nichtwässriges permanentes Fixiermittel wie Permanent Mounting Media (Code S3026) Primäre Maus-Antikörper und Negativkontrolle Waschpuffer, beispielsweise TBST (Tris Buffered Saline With Tween), 10x Concentrate (Code S3306) Automatisierte Färbung Dako Autostainer (Code S3400) oder Autostainer Plus (Code S3800). Benötigte Komponenten dem Benutzerhandbuch zum Dako Autostainer entnehmen. Erforderliche, aber nicht mitgelieferte Materialien (optional) Siehe Sicherheitsdatenblatt des primären Antikörpers Demaskierungslösung, modifizierter Zitratpuffer (pH 6,1), wie Target Retrieval Solution, Ready-to-use (Code S1700) oder 10x Concentrate (Code S1699) Für die Demaskierung: Wasserbad, das geeignet ist, eine Temperatur von 95–99 °C aufrechtzuerhalten, Dampfbad, Dampfdrucktopf oder Autoklav

Vorsichtsmaßnahmen

Produktspezifisch 1. Nur für Fachpersonal bestimmt. 2. Dieses Produkt enthält Natriumazid (NaN3), eine in reiner Form äußerst giftige Chemikalie. Ansammlungen

von NaN3 können auch in Konzentrationen, die nicht als gefährlich klassifiziert sind, mit Blei- und Kupferabflussrohren reagieren und hochexplosive Metallazide bilden. Nach der Entsorgung stets mit viel Wasser nachspülen, um Azidansammlungen in den Leitungen vorzubeugen.8,24

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3. Jegliche mikrobielle Verunreinigung der Reagenzien vermeiden, da diese zu unspezifischen Färbungen führen.

4. Wie alle Produkte biologischen Ursprungs muss auch dieses entsprechend gehandhabt werden. 5. Entsprechende Schutzkleidung tragen, um Augen- und Hautkontakt zu vermeiden. 6. Nicht verwendete Lösung ist entsprechend örtlichen, bundesstaatlichen und staatlichen Richtlinien zu entsorgen. 7. Auf Anfrage ist für Fachpersonal ein Sicherheitsdatenblatt erhältlich. Allgemein 1. Reagenzien nach Ablauf des Verfalldatums nicht mehr verwenden. 2. Keine Reagenzien aus Kits anderer Hersteller verwenden. 3. Systemkomponenten nicht bei starker Lichteinwirkung lagern und keine Färbungen bei hellem Licht, wie

z.B. direktem Sonnenlicht, vornehmen. Hinweis: Die Objektträger müssen während des Inkubationsschritts mit dem Amplifikationsreagenz vor Licht geschützt werden.

Achtung Amplification Reagent: 10-30% Glycerol H320 Verursacht Augenreizungen. P280 Augen- oder Gesichtsschutz tragen. P264 Nach Gebrauch Hände gründlich waschen. P305 + P351 + P338

BEI KONTAKT MIT DEN AUGEN: Einige Minuten lang behutsam mit Wasser spülen. Vorhandene Kontaktlinsen nach Möglichkeit entfernen. Weiter spülen.

P337 + P313 Bei anhaltender Augenreizung: Ärztliche Hilfe hinzuziehen.

Gefahr DAB Chromogen: 1-5% biphenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammonium tetrachloride H350 Kann Krebs erzeugen. H341 Kann vermutlich genetische Defekte verursachen. P201 Vor Gebrauch besondere Anweisungen einholen. P202 Vor Gebrauch alle Sicherheitshinweise lesen und verstehen. P281 Vorgeschriebene persönliche Schutzausrüstung verwenden. P308 + P313 BEI Exposition oder falls betroffen Ärztliche Hilfe anfordern. P405 Unter Verschluss aufbewahren. P501 Inhalt und Behälter gemäß lokalen, regionalen, nationalen und internationalen

Vorschriften der Entsorgung zuführen.

Aufbewahrung

Reagenzien des CSA II Systems bei 2–8 °C aufbewahren. Nicht einfrieren. Nach Ablauf des auf den Reagenzgläsern oder Kit-Etiketten aufgedruckten Datums nicht mehr verwenden. Es gibt keine offensichtlichen Anzeichen für eine eventuelle Produktinstabilität. Positiv- und Negativkontrollen sollten daher zum gleichen Zeitpunkt wie die Patientenproben getestet werden. Falls es zu einer unerwarteten Färbung kommt, die sich nicht aus Unterschieden bei Laborverfahren erklären lässt und auf ein Problem mit dem Kit hindeutet, muss der technische Kundendienst von Dako verständigt werden

Vorbereitung der Reagenzien

Waschpuffer Die Forschung hat ergeben, dass 0,05 mol/L Tris-HCl, pH 7,6, mit 0,3 mol/L NaCl und 0,1% Tween 20, ohne Natriumazid, die Hintergrundfärbung bei diesem System deutlich reduziert. Als Waschpuffer wird TBST 10x (Code S3306) empfohlen. Natriumazid-haltige Waschpuffer inaktivieren die Meerrettichperoxidase (HRP) und haben eine negative Färbung zur Folge. Nicht verwendeten Puffer bei 2–8 °C aufbewahren. Getrübten Puffer verwerfen. Automatisiertes Färbeverfahren Automation Buffer, 10x (Code S3006) kann grundsätzlich für die Spülgänge mit Waschpuffer mit dem Dako Autostainer für das automatisierte Verfahren mit CSA II verwendet werden, allerdings sollte nach den Schritten mit Wasserstoffperoxid, dem primären Antikörper und den Anti-Maus-HRP Reagenzien jeweils zusätzlich 5–10 Minuten mit TBST (Code S3306) gespült werden. Nach den Substrat- und Gegenfarbstoffschritten kann mit destilliertem oder entionisiertem Wasser gespült werden. Manuelles Färbeverfahren Gewebeschnitte sollten zwischen den einzelnen Schritten des CSA II-Verfahrens bis zu dreimal 3–5 Minuten in frischem TBST (Code S3306) gespült werden. Ansetzen der DAB Substrat-Chromogenlösung Ein mL Substratchromogen ist für bis zu zehn Gewebeschnitte ausreichend. SCHRITT 1 Je nach Anzahl der zu färbenden Objektträger eine hinreichende Menge an Puffer-Aliquoten von

1 mL des gepufferten Substrats in ein Reagenzglas geben. SCHRITT 2 Für jeden Milliliter (1 mL) gepufferten Substrats einen Tropfen (20 µL) Liquid DAB Chromogen

zugeben. Sofort mischen.

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Das angesetzte Substratchromogen ist bei Aufbewahrung zwischen 2–8 °C etwa fünf Tage haltbar. Das Reagenz ist vor Gebrauch gründlich zu mischen. Die Qualität der Färbung wird durch ein eventuell auftretendes Präzipitat nicht beeinträchtigt. Verdünnung des konzentrierten primären Antikörpers und der Negativkontrolle Den primären Antikörper mit einem Stabilisatorprotein-haltigen Lösungsmittel verdünnen. Zur Verminderung einer Hintergrundfärbung wird Antibody Diluent with Background Reducing Components (Code S3022) dringend empfohlen. Eine geeignete Negativkontrolle enthält Maus-Immunglobulin eines mit dem primären Antikörper identischen Isotyps, verdünnt auf eine Immunglobulin-Konzentration, die der Konzentration des verdünnten primären Antikörpers entspricht.

Vorbereitung der Probe

Vor der IHC-Färbung muss das Gewebe fixiert und verarbeitet werden. Eine Fixierung schützt vor Autolyse und Zerfall des exzidierten Gewebes, erhält die Antigenität, verstärkt den Refraktionsindex der Gewebeteile und steigert die Resistenz der Zellelemente gegen Gewebeverarbeitung. Zur Gewebeverarbeitung gehört Dehydrierung, Abscheidung von Dehydrierungsmitteln, Infiltration des Einbettungsmediums, Einbetten und Schneiden des Gewebes. Die am häufigsten verwendeten Fixiermittel für IHC-Gewebepräparate sind in den „General Instructions for Immunohistochemical Staining“ (Allgemeine Richtlinien zur immunhistochemischen Färbung) aufgeführt. Diese Angaben sind nur Richtlinien. Optimale Verfahren müssen vom Anwender bestimmt und verifiziert werden.

Vorbereitung paraffineingebetteter Schnitte

Die Erhaltung der Gewebeantigene für die Immunfärbung kann von Art und Konzentration des Fixiermittels sowie von der Fixierzeit und der Größe des zu fixierenden Gewebeschnitts abhängen.10-15 Für eine reproduzierbare Färbung ist es ist daher wichtig, möglichst immer unter optimalen standardisierten Fixierbedingungen zu arbeiten. Empfohlen werden möglichst dünne Probenschnitte und kurze Fixierzeiten. Eine zu lange Einwirkzeit von Fixiermitteln kann die Antigenmaskierung und Abschwächung der Färbung zur Folge haben. Nach der Fixierung werden die Gewebeproben mit Alkohol in verschiedenen Verdünnungsstufen dehydriert, mit Xylol oder Xylolersatz gereinigt und in Paraffin getränkt. Anschließend wird das Gewebe zur Erleichterung des Schneidens in Formen oder Kassetten in Paraffin eingebettet. Um die Antigendenaturierung zu minimieren, die Gewebe während der Verarbeitung keinen Temperaturen über 60 °C aussetzen. Gewebeblöcke können nach dem Einbetten gelagert oder geschnitten werden. Richtig fixierte und einbettete Gewebe sind bei Aufbewahrung an einem kühlen Ort (15–22 °C) unbegrenzt haltbar. Fixieren von Gewebeschnitten Aus paraffineingebetteten Blöcken entnommene Gewebeschnitte sind auf saubere Objektträger aus Glas aufzubringen. Objektträger abklopfen, um möglichst viel Wasser zu entfernen. Während des Trocknens auf dem Gewebe verbleibende Wassertröpfchen können die Gewebefärbung beeinträchtigen. Zwei Stunden in einem Brutschrank bei höchstens 60 °C trocknen oder 15–24 Stunden bei Raumtemperatur trocknen lassen. Für eine bessere Haftung der Gewebeschnitte während des IHC-Färbeverfahrens werden mit Poly-L-Lysin beschichtete oder elektrostatisch geladene Objektträger bzw. Silanized Slides (Code S3003) empfohlen. Silanisierte oder elektrostatisch geladene Objektträger werden für Färbeverfahren, die eine Demaskierung erfordern, dringend empfohlen.

Automatisierte und manuelle Färbeverfahren

Hinweise Vor der Verwendung sollte der Anwender diese Anweisungen sorgfältig durchlesen und sich mit dem Inhalt des Kits vertraut machen. Vor Beginn der Immunfärbung alle Reagenzien auf Raumtemperatur (20–25 °C) bringen; die Inkubationen sind gleichfalls für die Durchführung bei Raumtemperatur optimiert. Die in diesem Kit enthaltenen Anweisungen und Reagenzien wurden für eine optimale Leistung konzipiert. Eine weitere Verdünnung der gebrauchsfertigen Reagenzien kann zu fehlerhaften Ergebnissen führen. Hinweis: Um eine optimale Färbeleistung zu erzielen, ist bei automatisierter Färbung während des Inkubationsschritts mit dem Amplifikationsreagenz der getönte Deckel des Dako Autostainers geschlossen zu halten. Bei manueller Färbung sind die Objektträger während des Inkubationsschritts mit dem Amplifikationsreagenz vor Licht zu schützen. Gewebeschnitte dürfen während der Färbung nicht austrocknen. Ausgetrocknete Gewebeschnitte können unspezifische Färbungen aufweisen. Dem Luftzug ausgesetzte Objektträger abdecken. Falls längere Inkubationszeiten erforderlich sind, die Objektträger in eine feuchte Umgebung stellen. Zur Reduzierung einer unspezifischen Färbung wird das Spülen der Gewebeschnitte mit TBST entsprechend den Waschpufferempfehlungen im Abschnitt Reagenzvorbereitung empfohlen. Entparaffinieren von Gewebeschnitten Zur Entfernung des Einbettungsmediums müssen die Gewebeschnitte vor der Färbung entparaffiniert und anschließend rehydriert werden. Eine unvollständige Entfernung von Paraffin ist zu vermeiden. Überreste des Einbettungsmediums können eine unspezifische Färbung zur Folge haben.

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Proteolytische Andauung und Demaskierung Es ist bekannt, dass Formaldehyd durch Bildung intermolekularer Vernetzungen konformative Veränderungen an den Antigenmolekülen auslöst. Zu starke Formalinfixierung kann Antigenerkennungsstellen maskieren und die spezifische Färbung vermindern. Diese Stellen können in immunhistochemischen Standardverfahren durch proteolytische Gewebeandauung von der Immunfärbung demaskiert werden. Hinweis: Von einer proteolytischen Andauung wird beim CSA II System daher wegen der möglichen starken Hintergrundfärbung abgeraten. Die Antigendemaskierung mit Wärme ist der proteolytischen Andauung vorzuziehen, da sie zwar die Hintergrundfärbung leicht verstärkt, bei vielen primären Antikörpern zugleich aber auch die spezifische Färbung deutlich intensiviert. Dem jedem primären Antikörper beigefügten Sicherheitsdatenblatt ist zu entnehmen, ob die Gewebedemaskierung erlaubt ist; bei manchen primären Antikörpern ist sie erforderlich. Das empfohlene Demaskierungsverfahren besteht aus dem Eintauchen der auf Objektträgern fixierten Gewebeschnitte in einen modifizierten Zitratpuffer (pH 6,1) wie Target Retrieval Solution, Ready-to-use (Code S1700), oder 10x Concentrate (Code S1699); vollständige Anweisungen, auch zu einer Wärmebehandlung vor der immunhistochemischen Färbung, bitte der Packungsbeilage entnehmen. Anschließend gründlich mit Waschpufferlösung spülen und das Färbeverfahren fortsetzen. Hinweis: Von der Anwendung einer Demaskierungslösung mit hohem pH (pH 10) mit dem CSA II System wird wegen der möglichen erhöhten Hintergrundfärbung abgeraten. Automatisiertes Färbeverfahren SCHRITT 1 Programm Protocol Template Auto wählen SCHRITT 2 Reagenzien und Puffer in den Reagenzständer des Dako Autostainers stellen SCHRITT 3 Dako Autostainer mit Objektträgern beladen SCHRITT 4 Durchlauf starten SCHRITT 5 Objektträger aus dem Dako Autostainer nehmen SCHRITT 6 Mit der Fixierung fortfahren Hinweis: Die Gegenfärbung ist im empfohlenen Programmierraster enthalten. Alternativ kann die Gegenfärbung im Labor manuell vorgenommen werden. Manuelles Färbeverfahren SCHRITT 1 PEROXIDASE-BLOCK Überschüssige Flüssigkeit abklopfen. Den Bereich um die Probe herum mit einem flusenfreien

Tuch sorgfältig abtupfen, um restliche Flüssigkeit zu entfernen und das Reagenz an der vorgesehenen Stelle zu behalten.

Genügend Wasserstoffperoxid zugeben, um die Probe zu bedecken. 5 (±1) Minuten inkubieren. Mit destilliertem Wasser oder Pufferlösung aus einer Waschflasche (Strahl nicht direkt auf das

Gewebe richten) gründlich spülen und in ein frisches Pufferbad legen.

SCHRITT 2 PROTEIN-BLOCK Überschüssige Flüssigkeit abklopfen und Objektträger wie zuvor abwischen. Genügend Protein-Block zugeben, um die Probe zu bedecken. 5 (±1) Minuten inkubieren. Den Protein-Block nicht abspülen. SCHRITT 3 PRIMÄRER ANTIKÖRPER ODER NEGATIVKONTROLLE Überschüssigen Protein-Block abklopfen und Objektträger wie zuvor abwischen. Genügend gebrauchsfertigen primären Antikörper oder Negativkontrolle zugeben, um die Probe

abzudecken. Wenn im Sicherheitsdatenblatt des primären Antikörpers nicht anders angegeben,

15 (±1) Minuten inkubieren. Mit Waschpufferlösung aus einer Waschflasche vorsichtig abspülen und bis zu dreimal

3–5 Minuten in frischem TBST Puffer spülen.

SCHRITT 4 ANTI-MAUS IMMUNOGLOBULIN-HRP Objektträger wie zuvor abwischen. Genügend Anti-Maus Immunglobulin-HRP zugeben, um die Probe zu bedecken. 15 (±1) Minuten inkubieren. Objektträger wie in Schritt 3 abspülen. Dreimal je 3–5 Minuten in ein frisches Waschpufferbad

stellen. SCHRITT 5 AMPLIFIKATIONSREAGENZ Hinweis: Die Objektträger müssen während dieses Inkubationsschritts vor Licht geschützt

werden, um eine optimale Färbung zu erzielen. Objektträger wie zuvor abwischen. Genügend Amplifikationsreagenz zugeben, um die Probe zu bedecken. Vor Licht geschützt 15 (±1) Minuten inkubieren. Objektträger wie zuvor abspülen. Dreimal je 3–5 Minuten in ein frisches Waschpufferbad stellen.

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SCHRITT 6 ANTI-FLUORESCEIN-HRP Objektträger wie zuvor abwischen. Genügend Anti-Fluorescein-HRP zugeben, um die Probe zu bedecken. 15 (±1) Minuten inkubieren. Objektträger wie zuvor abspülen. Dreimal je 3–5 Minuten in ein frisches Waschpufferbad stellen. SCHRITT 7 LIQUID DAB SUBSTRATCHROMOGEN Objektträger wie zuvor abwischen. Eine ausreichende Menge der vorbereiteten Liquid DAB Substratpuffer-Chromogenlösung

zugeben, um die Probe zu bedecken. 5 (±1) Minuten inkubieren. Mit destilliertem oder entionisiertem Wasser spülen. SCHRITT 8 MIT GEGENFÄRBUNG UND FIXIERUNG FORTFAHREN.

Dako Autostainer Programmierraster für CSA II

Das obige Programmierraster ist eine Kontrollmatrix und enthält Protokollelemente zur Verwendung mit CSA II. Dieses Beispiel nennt die empfohlenen Reagenzien und Inkubationszeiten für optimale Durchläufe mit CSA II auf dem Autostainer (Code S3004) und dem Autostainer Plus (Code S3800). Mit den empfohlenen Schritten und Inkubationszeiten ist eine Protokollmatrix zu erstellen und die automatische Programmierung vorzunehmen. Als Beispiel wurden der primäre Antikörper und die Vorbehandlung eingegeben. Die Demaskierung ist antikörperspezifisch und nicht in allen Fällen erforderlich.

Qualitätskontrolle

Da Unterschiede bei der Gewebeverarbeitung und technischen Verfahren im Labor des Anwenders zu sehr unterschiedlichen Ergebnissen führen können, müssen regelmäßige Leistungskontrollen vor Ort durchgeführt werden. Weitere Angaben zur Qualitätskontrolle siehe Literaturhinweise 16 bis 18. Positives Kontrollgewebe Bekanntermaßen positive Kontrollgewebe sollten zur Überprüfung der korrekten Funktionsweise der verarbeiteten Gewebe und Testreagenzien verwendet werden. Wenn die positiven Kontrollgewebe keine Färbung aufweisen, müssen die Ergebnisse der Testproben als ungültig erklärt werden. Negativkontrolle Zur Beurteilung unspezifischer Färbung und im Hinblick auf eine bessere Interpretation der spezifischen Färbung an der Antigenstelle sollte bei einem Teil jeder Patientenprobe anstelle des primären Antikörpers eine Negativkontrolle benutzt werden. Bei Einsatz von Antikörper-Panels an seriellen Gewebeschnitten können die Bereiche eines Objektträgers, die eine negative Färbung aufweisen, für andere Antikörper als Negativkontrolle bzw. Kontrolle einer unspezifischen Hintergrundbindung dienen. Weitere Informationen über Positiv- und Negativkontrollen siehe „General Instructions for Immunohistochemical Staining“ (Allgemeine Richtlinien zur immunhistochemischen Färbung).

Auswertung der Färbung

Die Positivkontrollproben sollte zuerst untersucht werden, damit gewährleistet ist, dass alle Reagenzien korrekt funktionieren. Ein braunes Endprodukt an der Zielantigenstelle zeigt eine positive Reaktivität an. Wenn die positiven Kontrollproben keine Färbung aufweisen, müssen die Ergebnisse der Testproben als ungültig erklärt werden.

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Die Negativkontrolle sollte zur Verifizierung der spezifischen Markierung des Zielantigens durch den primären Antikörper untersucht werden. Das Fehlen einer spezifischen Färbung in den Negativkontrollproben bestätigt die Spezifität des primären Antikörpers. Eine eventuelle unspezifische Färbung erscheint punktförmig oder diffus. Die hohe Empfindlichkeit dieses Systems ist durch seinen ausgeprägten Amplifikationsgrad bedingt; jede unspezifische Hintergrundfärbung wird ebenfalls amplifiziert. Aus diesem Grund werden zur Unterstützung der Auswertung der Färbungsergebnisse Negativkontrollen auf einem Teil jeder Kontrolle und an Testproben empfohlen (eine eingehende Erörterung unspezifischer Färbungen bitte dem Abschnitt „Beschränkungen“ entnehmen). Bei Schnitten aus übermäßig formalinfixiertem Gewebe kann es sporadisch zur leichten Einfärbung des Bindegewebes kommen. Für die Auswertung der Färbeergebnisse nur intakte Zellen verwenden. Nekrotische oder degenerierte Zellen weisen oft eine unspezifische Färbung auf. Aufgrund nicht-immunologischer Bindung von Reagenzien an Gewebeschnitte können falsch-positive Resultate auftreten.

Beschränkungen

Für eine optimale Färbeintensität die Objektträger während des Inkubationsschritts mit dem Amplifikationsreagenz vor Licht schützen (Schritt 5). Von einer proteolytischen Andauung wird beim CSA II System daher wegen der möglichen starken Hintergrundfärbung abgeraten. Zur Reduktion der unspezifischen Hintergrundfärbung wird empfohlen, die Gewebeschnitte zwischen den einzelnen Reagenzienschritten des CSA II System mit Waschpuffer abzuspülen (siehe Abschnitt „Vorbereitung der Reagenzien“) und bei Raumtemperatur bis zu dreimal je drei bis fünf Minuten in frischem Waschpuffer zu inkubieren. In humanen Gewebeproben vorhandenes endogenes Immunglobulin kann mit sekundären Anti-Immunglobulin-Antikörpern unterschiedlich stark kreuzreagieren. Die bei diesem System verwendeten sekundären Anti-Maus Immunglobulin-HRP Antikörper wurden zur Verminderung möglicher Kreuzreaktivität mit normalem Humanserum absorbiert. Aufgrund der hohen Empfindlichkeit dieses Systems gegen endogene Immunglobuline kann es allerdings bei manchen Proben dennoch zur Kreuzreaktivität kommen. Eine Hintergrundfärbung durch endogene Immunglobuline in der Negativkontrolle ist als Färbung um Blut- und Lymphgefäße herum, im Bindegewebe und in extravaskulären Geweberäumen besonders gut sichtbar. Auch bestimmte Epitheltypen, besonders aus dem Verdauungstrakt, können endogene Immunglobuline aufweisen. Eine Färbung durch endogene Immunglobuline kann auch durch Demaskierungsverfahren verstärkt werden. Aus diesem Grund sind, falls das Vorliegen endogener Immunglobuline vermutet wird, geeignete Negativkontrollen und -gewebe für die Auswertung jeder positiven Färbung unerlässlich. In Hämoproteinen wie Hämoglobin, Myoglobin, Cytochrom und Katalase sowie in bestimmten Leukozyten kann Endogene-Peroxidase-Aktivität oder Pseudoperoxidase-Aktivität auftreten.19,20 Dieses kann durch fünfminütige Inkubation der Proben mit Peroxidase-Block vor Zugabe des primären Antikörpers (Schritt 1 des CSA II System-Protokolls) vermieden werden. In Gewebe, das Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HbsAg) enthält, kann mit Meerrettich-Peroxidase eine unspezifische Färbung auftreten.21

Automatische Fehlerbehebung

Problem Mögliche Ursache Empfohlene Maßnahme 1. Keine Färbung der

Objektträger. 1a. Programmierfehler.

Reagenzien in falscher Reihenfolge verwendet.

1a. Reagenzienverwendung überprüfen.

1b. Reagenzgläser wurden nicht in die korrekten Positionen der Reagenzständer gestellt.

1b. Anhand des Positionierungsschemas für die Reagenzien die korrekte Position der Reagenzgläser überprüfen.

1c. Nicht genügend Reagenz im Reagenzglas.

1c. Vor Beginn des Testdurchlaufs überprüfen, ob genügend Reagenz in die Reagenzgläser eingefüllt wurde. Die benötigten Volumina dem Positionsschema für Reagenzien entnehmen.

1d. Natriumazid im Pufferbad. 1d. Frischen azidfreien Puffer verwenden. 2. Schwache Färbung

der Objektträger. 2a. Objektträger nicht lange

genug mit Antikörpern oder Substrat inkubiert.

2a. Empfohlene Inkubationszeiten überprüfen.

2b. Für das untersuchte Antigen ist Demaskierung erforderlich.

2b. Demaskierung durchführen.

2c. Proben waren während der Inkubation mit dem Amplifikationsreagenz Licht ausgesetzt.

2c. Proben während der Inkubation mit dem Amplifikationsreagenz vor Licht schützen.

2d. Antikörperkonzentration zu niedrig.

2d. Antikörper erneut titrieren.

3. Zu starke Hintergrundfärbung der Objektträger.

3a. Proben mit hohem Gehalt an endogenem Immunglobulin.

3a. Testgewebe mit dem Gewebe der Negativkontrolle vergleichen und Unterschiede ermitteln.

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3b. Proben weisen hohe

Endogene-Peroxidase-Aktivität auf.

3b. Inkubationszeit mit Wasserstoffperoxid

verlängern (Schritt 1).

3c. Paraffin nicht vollständig entfernt.

3c. Bäder mit frischem Xylol oder Toluol verwenden. Werden mehrere Objektträger gleichzeitig gefärbt, sollte das zweite Xylolbad in frischem Xylol erfolgen.

3d. Objektträger nicht gründlich gespült.

3d. Autostainer muss vor dem Durchlauf vorschriftsmäßig vorgefüllt sein. Prüfen, ob ausreichend Puffer für den gesamten Durchlauf vorhanden ist. Zusätzliche Waschschritte mit TBST (Code S3306) wie angegeben durchführen.

3e. Schnitte sind während der Färbung ausgetrocknet.

3e. Überprüfen, ob den Schnitten das korrekte Reagenzvolumen zugegeben wurde. Der Deckel des Dako Autostainers muss beim Betrieb geschlossen sein; das Gerät darf weder extremer Hitze noch Zugluft ausgesetzt werden.

3f. Schnitte sind beim Beladen des Dako Autostainers ausgetrocknet.

3f. Objektträger müssen während des Beladens und direkt vor dem Start durch Pufferlösung feucht gehalten werden.

3g. Unspezifische Bindung der Reagenzien an Gewebeschnitte.

3g. Inkubationszeit mit Protein-Block verlängern (Schritt 2).

3h. Unspezifische Bindung der primären Antikörper an die Probe.

3h. Den primären Antikörper mit einem trägerproteinhaltigen Lösungsmittel verdünnen. Empfohlen wird Antibody Diluent with Background Reducing Components (Code S3022).

3i. Vor der Färbung wurde Demaskierungslösung mit hohem pH für die Wärmedemaskierung verwendet.

3i. Demaskierung mit einem modifizierten Zitratpuffer (pH 6,1) vornehmen.

3j. Vor der Färbung ist eine proteolytische Andauung erfolgt.

3j. Proteolytische Andauung bei diesem System unterlassen.

4. Gewebe vom Objektträger abgelöst.

4a. Verwendung ungeeigneter Objektträger

4a. Geladene (SuperFrost Plus) oder silanisierte Objektträger wie Dako Silanized Slides (Code S3003) verwenden.

Manuelle Fehlerbehebung

Problem Mögliche Ursache Empfohlene Maßnahme 1. Keine Färbung der

Objektträger. 1a. Reagenzien in falscher

Reihenfolge verwendet. 1a. Reagenzienverwendung überprüfen.

1b. Natriumazid im Pufferbad. 1b. Frischen azidfreien Puffer verwenden. 2. Schwache Färbung

der Objektträger. 2a. Schnitte enthalten nach dem

Waschbad zu viel Lösung. 2a. Vor dem Abwischen der Objektträger

überschüssige Lösung vorsichtig abklopfen. 2b. Objektträger nicht lange

genug mit Antikörpern oder Substrat inkubiert.

2b. Empfohlene Inkubationszeiten überprüfen.

2c. Für das untersuchte Antigen ist Demaskierung erforderlich.

2c. Demaskierung durchführen.

2d. Proben waren während der Inkubation mit dem Amplifikationsreagenz Licht ausgesetzt.

2d. Proben während der Inkubation mit dem Amplifikationsreagenz vor Licht schützen.

2e. Antikörperkonzentration zu niedrig.

2e. Antikörper erneut titrieren.

3. Zu starke Hintergrundfärbung der Objektträger.

3a. Proben mit hohem Gehalt an endogenem Immunglobulin.

3a. Testgewebe mit dem Gewebe der Negativkontrolle vergleichen und Unterschiede ermitteln.

3b. Proben weisen hohe Endogene-Peroxidase-Aktivität auf.

3b. Inkubationszeit mit Wasserstoffperoxid verlängern (Schritt 1).

3c. Paraffin nicht vollständig entfernt.

3c. Bäder mit frischem Xylol oder Toluol verwenden. Werden mehrere Objektträger gleichzeitig gefärbt, sollte das zweite Xylolbad in frischem Xylol erfolgen.

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3d. Objektträger nicht gründlich

gespült.

3d. In Puffer-Bädern und Waschflaschen

frische Lösungen verwenden. TBST wird empfohlen. Zwischen den einzelnen Verfahrensschritten die Inkubationsschnitte bis zu dreimal je 3–5 Minuten in ein frisches TBST-Bad stellen.

3e. Substratchromogenreaktion wegen zu hoher Raumtemperatur schneller als normal.

3e. Kürzere Inkubationszeit für Substratchromogenlösung verwenden.

3f. Schnitte sind während der Färbung ausgetrocknet.

3f. Feuchtkammer verwenden. Vor Reagenzzugabe jeweils nur drei bis vier Objektträger zugleich abwischen.

3g. Unspezifische Bindung der Reagenzien an Gewebeschnitte.

3g. Inkubationszeit mit Protein-Block verlängern (Schritt 2).

3h. Unspezifische Bindung der primären Antikörper an die Probe.

3h. Den primären Antikörper mit einem Stabilisatorprotein-haltigen Lösungsmittel verdünnen. Empfohlen wird Antibody Diluent with Background Reducing Components (Code S3022).

3i. Vor der Färbung wurde Demaskierungslösung mit hohem pH für die Wärmedemaskierung verwendet.

3i. Demaskierung mit einem modifizierten Zitratpuffer (pH 6,1) vornehmen.

3j. Vor der Färbung ist eine proteolytische Andauung vorgenommen worden.

3j. Proteolytische Andauung bei diesem System unterlassen.

4. Gewebe vom Objektträger abgelöst.

4a. Verwendung ungeeigneter Objektträger.

4a. Geladene (SuperFrost Plus) oder silanisierte Objektträger wie Dako Silanized Slides (Code S3003) verwenden.

5. Schwankungen in der Färbeintensität bei verschiedenen Durchläufen.

5a. Schwankungen in der Raumtemperatur.

5a. Raumtemperatur in einem engen Temperaturbereich konstant halten.

5b. Leichte Abweichungen bei den Inkubationszeiten der Reagenzien.

5b. Konstante Inkubationszeiten einhalten.

5c. Abweichungen in der Anzahl und den Inkubationszeiten der Waschpufferbäder.

5c. Bei jedem Durchlauf identische Abläufe einhalten.

HINWEIS: Siehe Abschnitt Fehlerbehebung im Handbook – Immunochemical Staining Methods, 3rd Edition14, Atlas of Immunohistology21, oder Immunoperoxidase Techniques. A Practical Approach to Tumor Diagnosis.23 Bei ungewöhnlichen Färbungen den technischen Kundendienst von Dako verständigen.

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Edition/ Édition/ Auflage 12/18