cromatografia liquidachapitre_6_(hplc)[1]

5/8/2018 Cromatografia liquidaChapitre_6_(HPLC)[1] - slidepdf.com

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CHAPITRE

6

La chromato ra hie li uide haute

erformance HPLC



1. Introduction5

70.09

0.1

2. Pompes8

10

0.06

0.07

0.08

2 7 3 n m

.

4. Colonnes et Phases

2

34 6

9

12 13

1411

0.04

0.05

A b s o r b a n c e a t

5. Détecteurs0.02

0.03

.

0

.

0 10 20 30 40 50 60

Retention Time (min)

Analysis of photodegradation products of metoclopramide solutions

‐. , . . .



.

HPLC : phase mobile liquide

phase stationnaire très finement divisée

Injection de l’éluant sous des pressions de plusieurs centaines

e ars pour o ten r un t su sant.

Possibilit d agir de mani re tr s pr cise sur la s lectivit

entre les composés par le choix de la PS et de la composition

Exploitation des interactions soluté/PM/PS



.

ompes m r ques conçues pour ma n en r un non

pulsé et stable.

2, 2, 2,…

nécessité de dégazer les solvants par ultrasons ou barbotage

d’hélium.

Eluant de composition fixe : mode isocratique 1 pompe

= ’

binaire, ternaire ou quaternaire selon le nombre de solvants

qu’elle peut mélanger



solvant A solvant B solvant A solvant B

vanne

chambre de mélange pompe 1 pompe 2de débit

chambre de mélangepompe haute colonnepression

Gradient basse pression Gradient haute pression



Pompe quaternaire



.

n ect on rap e un vo ume pr c s vanne aute press on

plusieurs voies manuelle ou automatique

Fonctionnement en 2 temps :

•Chargement : communication entre pompe et colonne seulement, ntro uct on e c ant on press on atmosp r que a e une

seringue dans un petit volume tubulaire appelé boucle (nombreux choix

de volumes)

•Injection : insertion de l’échantillon dans le flux de PM par rotation de la

vanne

inversion du sens de circulation dans la boucleBonne reproductibilité des volumes si la boucle a été totalement

remplie par l’échantillon (volume prélevé de 5 à 10 fois > volume

boucle)



Boucle d’injection reproductibilité du volume injecté



.

o onne = u e ro , ca r , en ac er

Phase stationnaire maintenue entre 2 disques poreux situés à ses extrémités dont les volumes morts sont aussi faibles que possible

Tendance : réduction de la longueur et du diamètre interne

Diminution du débit jusqu’à quelques µL/min

onsomma on r u e uan

Meilleure résolutionPlus grande sensibilité



Colonnes :

Type ID(mm)

Sample Load(approx.)

TypicalFlow Rate

RelativeSensitivity

Applications

Analytical 4.6 0.1 – 1.5 mg 0.5 ‐3 ml/min Standard separations

Solvent saver 3.0 150 ‐ 500 µg 0.3 ‐ 1.5 ml/min +Save solventStandard HPLC

instruments

Narrowbore 2.1 50 – 120 µg 0.1 ‐ 0.5 ml/min ++High sensitivityLimited sampleLC/MS

Microbore 1.0 10 ‐ 50 µg 10 ‐ 100 µL/min +++

Limited sampleLC/MS

Very high sensitivityCapillary 0.5 ‐ 0.3 1 ‐ 10 µg 1 ‐15 µl/min ++++ LC/MS

Peptides and proteins

Nano 0.1 ‐ 0.075 100 ‐ 200 n 200 ‐ 500 nl min +++++Very high sensitivityLC MS

Peptides and proteins

Semi‐prep 9.4 1 ‐ 10 mg 5 ‐ 10 ml/min mg preparative separation

‐ ‐



Phases :• Chromato ra hie sur hase normale

• Chromatographie sur phase inverse• Chromatographie par paires d’ions• ’

• Chromatographie par exclusion stérique (cf chap 7)

• Chromatographie chirale



•Type (monolithique, poreuse, non poreuse)

•Matériaux de base (silice, zircone, polymère,…)

•

et forme des particules,…)

, …



Type

Majorité : particules poreuses de diamètre entre 3 et 10 µm’

à 400 m2/g).

L’espace inter‐particule permet des débits de 1 à 3 mL/min avec des pressions accep a es.



≈ 1995 : introduction des particules sphériques non poreuses

But : augmenter l’efficacité

Mais : ‐ volume inter‐particule important élargissement des pics

‐ ↓ de la surface ↓ de la capacité de chargement

‐ ’

≈ 1990‐2000 :Colonnes monolithiques :

et mésopores de 20 à 500 Å

occupant 80% du volume de la



‐

Alumine 6‐12

Zircone 7‐13

Polymères

(styrène/divinylbenzène)1‐13

Graphite poreux 1‐13



Géométrie

Diamètre des particules

Uniformité des particulesTaille des pores

Particule sphérique de

silice macroporeuse



Chimie de la silice

Très polaire par la présence des fonctions silanols séparation basée sur les coefficients d’adsorption

Hydrogen bonded vicinal silanol goups

Siloxanebonds

so a e

silanol goups

Geminal



Modifications chimiques de la silice : les silices greffées

xat on e mo cu es organ ques sur es onct ons s ano s par es a sons covalentes ajustement de la polarité séparation basée sur les coefficients

de partage

monomérique

monoc oros ane

polymériquedi‐ ou trichlorosilane



2 17 3

R = (CH2) 7CH3 octyl (C8)

= 2 3 6 5

R = (CH2)6C6H5 phenyl hexyl

R = CH NH amino ro l Bonded

R = (CH2)3CN cyanopropyl

R = (CH ) OCH CH(OH)CH OH diol

phases



End‐capping

Silanisation secondaire avec du TMS désactivation des sites de

silanols restés libres

O

Si

Si

OH OH

soluté

OH

Augmentation du taux de couverture

Moins d’interactions solutés – silanolssoluté

XMoins d’interférences dans le processus

chromatographique

O

Si

O

Si

OO

OO

SiSi

SiSi

Moins de tailingMeilleure reproductibilité



Chromatographie sur phase normale ‐ silice poreuse

SiO2



Phase normale : mode d’interaction

Adsorption

Interactions polaires – ponts hydrogènes

Phase stationnaire polaire Phase mobile : solvants non ou peu polaires



Chromatographie sur phase inverse

Partage entre PM et PS

Phase stationnaire apolaire Phase mobile : solvants polaires

SiO2



Exemple RP – C18

Source : Thermo Fisher



Reverse – phase avec 100% H2O comme PM ???

H O

MeCNMeCN

MeCN

MeCN

MeCN

MeCN

22

H2O

MeCN conditions normales

ex: H2O/ACN 50/50

conditions initiales

H O

H2O

H O

2

H2OH2O

H2O

H2O après 10 volumes de colonnede PM à 100% H2O



everse – p ase avec 2

comme : so u on

« polar shielding »

MeCN

MeCN

H2OH2O

H2O H2O

MeCN

e

MeCNMeCN



Phases greffées et interactions hydrophiles

HILIC modePeut être considérée comme une chromatographie en phase normale avec

une p ase mo e aqueuse‐organ queColonnes HILIC plus polaires que colonnes RP augmentation du % d’eau

dans la PM diminution de la rétention (inverse de la RP)

Séparation d’oligosaccharides par HILIC, variation du % eau de la PM



Exemples : HILIC mode

Phase amino propyl

Mixte : RP, HILIC, échange anion faible suivant PM

Source : Phenomenex



Phase cyano propyl

CN

CN

O

O

O

OVerapamil

Nicardipine

N

O

OCH3H3CO

ONifedipine

Source : Grace Davison

2



Phase Zic HILIC

zwitterionic

Source : SeQuant



C18 RP mode

NH RP mode

S.U. Bajad et al JCA, 1125 (2006) 76‐88

mo eO

C H 2O H

H

HO H

H O H

SiO2

HILIC modeN H 2H

O OO OH

Amide HILIC modeH H

NH2

NH2 HILIC modeO

N

N

OOPPP

OH OH



Phase en graphite poreux :

Particules sphériques de carbone poreux

sorp on

Hydrophobesπ – π

Dipôles‐dipôles induits

Source Thermo Fisher



Phase en graphite poreux :




Qualité HPLC pas de stabilisants, filtrés 0.45 µm, dégazés

Mode isocratique : un (mélange de) solvant(s)Mode gradient : variation de la composition durant l’élution

Phase normale : solvant peu ou non polaire (Hexane, CH2Cl2)Phase inverse : solvant polaire (H2O, MeOH, ACN)

Modification de la polarité de la PM

modification du coefficient de distribution K (CS/CM) modification du facteur de rétention k



4 types d’interactions entre molécules de solvant et de soluté :• ionique (quand soluté et solvant ont des moments dipolaires)• de dispersion (due à l’attraction entre elles des molécules voisines)• diélectriques (favorisent la dissolution des solutés ioniques dans les

so van s po a res• par ponts H (entre donneur et accepteur de protons)

Solvant Indice de

polarité

Densité

(g/ml)

Limite UV

(nm)

Indice de

réfraction

Pt

d’ébullition

(°C)

Eau 10 1 190 1.333 100

Méthanol 5.1 0.791 205 1.326 65

Acétonitrile 5.8 0.786 190 1.341 82

Isopropanol 3.9 0.785 210 1.384 82

Tetrahydrofurane

. .



Solvent properties and miscibility




2

Analyse sur RP18 avec différents mélanges CH3CN/H20

Débit : 1 ml/min

100 % ACN 40 % ACN



PP + NBPP + NB

80 % ACN

sec. sec.

PP

NB

PP + NB

sec.sec.

60 % ACN 20 % ACN

PP

PPNB

sec. sec.



Elution à gradient :

Utilisée quand l’élution isocratique ne permet pas une bonne séparation

ou que la séparation est trop longue

Gradient : changement continu de la phase mobile pendant la séparation

Séparation d’un mélange

’

a) Isocratique : ACN/H20 50/50

b) Isocratique : ACN/H20 70/30

c) Gradient : 30 à 85 % d’ACN

en 7 minutes

ffé f l d d



Différents profils de gradient



Elution à gradient : effet du profil de gradient

Choix d’une colonne HPLC



Choix d une colonne HPLC

organicsoluble

MW < 2000

a ueoussoluble

organicsoluble

>

aqueousso u e



hexane

organic

soluble

methanolmethanol/H2O

acetonitrile

acetonitrile/H Osoluble

MW < 2000soluble

non‐ionicaqueoussoluble

ionic



normal phase

hexanesoluble

adsorption

normal phasebonded

reversed phaseorganicsoluble methanol

reversed phaseMW < 2000

2

acetonitrileacetonitrile/H2O

THF

gel permeationGPC

soluble



non‐ionicreverse p ase

bonded

MW < 2000

aqueous reversed phaseon e

using ionization control

ionic reversed phasebonded

us ng on‐pa r ng

ion exchange



organicsoluble

gel‐permeation

MW > 2000

gel‐filtration

aqueoussoluble

ion‐exchange modewith wide pore material

reverse phase modewith wide pore material



Chromatographie par paires d’ions

Objectif : améliorer la séparation de composés ioniques ou très polaires qui ont

’

Nécessité d’augmenter la rétention diminution de leur caractère ionique

Solutions :

Modifier le pH

Ajouter à la PM un composé porteur à la fois d’une chaîne carbonée et d’un

groupement de charge opposée à celle du composé à séparer

Création d’une paire d’ions globalement neutre, stable et lipophile qui sera

Soluté ionisé Paire d’ions

(acides) A

‐

+

R

+↔

A

‐

R

+

(bases) BH+ + R

‐↔ BH

+R‐

Soluté hydrophile Paire d’ions hydrophobe

= agen pa ran

Moins retenu en RP Mieux retenue en RP



Soit un soluté acide ionisé A‐ pairé par R+.

La aire d’ions formée en solution est retenue ar la colonne l’é uilibre de

rétention du soluté est décrit par :

A‐R+ (phase mobile) ↔ A‐R+ (phase stationnaire)

La rétention dépend de :

1) la fraction des molécules de soluté A dans la PM (déterminée par le pH de

2) la concentration de l’agent pairant et sa tendance à former une paired’ions

3) la valeur de k (facteur de rétention ou de capacité) de la paire d’ions A‐R+

Agents pairant typiques :

• Alkylsulfonates (R‐SO3‐), acides carboxyliques (TFA,…), BF4

‐, ClO4‐, …)

• Sels de tetraalkylammonium (R4N+)



X : principe actif, base forte

X1, X2, X3 : produits de dégradation de X, bases fortes

B et HP : acide benzoïque et acide hydroxybenzoïque, produits de dégradation de MP et PP

Conditions chromatographiques :

a e ac a e, p = .

b) 45% MeOH/55% acétate + 65 mM octane sulfonate



Chromatographie chirale (énantiosélective)

Pourquoi?

Propriétés pharmacologiques des stéréoisomères parfois très différentes.

Exemple: stéréosélectivité dans l’action des médicaments.

Principe :

proportionnelles à l’abondance de chacune des deux formes.Formation de complexes diastéréomères réversibles entre les 2 énantiomères et un

agent complexant chiral (sélecteur chiral, CS)

(R)‐X + (R)‐CS ↔ (R)‐X…(R)‐CS et (S)‐X + (S)‐CS ↔ (S)‐X…(S)‐CS

Deux méthodes :

•PS chirale

• + a c ra



Phase mobile avec sélecteur chiral

PS classique en phase inverse ou en phase normale

PM contenant un additif chiral en concentration appropriée

Établissement d’équilibres multiples :

Formation de complexes entre sélecteur (R)‐CS et énantiomères (R)‐X et(S)‐X dans la PM (cst d’association)

Distribution des énantiomères (R)‐X et (S)‐X entre PM et PS (cst de

distribution

Distribution des complexes X…

CS entre PM et PS (cst de distribution)



Phase stationnaire chirale

Moyen le plus simple et le plus pratique pour les séparations d’énantiomères.Le sélecteur chiral est lié de préférence par liaison covalente (alternativement par

forte adsorption physique) au support de la PS, habituellement des particules de

silice poreuse.

Pendant la migration de l’échantillon dans la colonne, les énantiomères sont

retenus par association avec le sélecteur de la PS. Des complexes

as r os som res se ormen ans a . eur va eur e es su sammen

différente, leur séparation est possible.Nécessité d’une PS chirale qui interagisse plus fortement avec un des deux

énantiomère.



Mécanismes de la reconnaissance chirale

Modèle à « 3 points » : nécessité d’avoir au moins 3 points d’interaction pour qu’un sélecteur chiral puisse distinguer 2 énantiomères (règle de Dagliesh)

•Complémentarité de taille et de forme entre analyte et sélecteur chiral

•Interactions intermoléculaires non‐covalentes (principalement électrostatiques) :

Interactions ioniques

Ponts hydrogène

on‐ p e, p e‐ p e, …

Interactions π‐π

…

•Si le sélecteur et l’analyte possèdent des régions hydrophobes correspondantes,

liaison par interactions hydrophobes



Exemples de phases stationnaires chirales

• Sélecteurs macromoléculaires d’origine semi‐synthétique (polysaccharides)• Sélecteurs macromoléculaires d’origine synthétique (poly(met)acrylamide)

• Sélecteurs macromoléculaires d’origine naturelle (protéines)

• Sélecteurs oligomériques macrocycliques ou de taille intermédiaire (cyclodextrines)

• Entités ioniques synthétiques de faible poids moléculaire pour échange

ioni ue

• Sélecteurs chélatants pour échange de ligand chiral



= enchaînements cycliques de 5 à 7 molécules de glucose greffées par

l’intermédiaire d’un « bras » de quelques atomes de carbone sur la PS.

De forme cylindrique, elles présentent une cavité hydrophobe tandis que la

paroi externe est hydrophile.

Inclusion sélective de composés qui forment à la surface de la phase

chirale des complexes diastéréoisomères réversibles

α‐cyclodextrine

Fast HPLC



Fast HPLC

Tendance : séparations très rapides, de moins d’une minute pour les échantillons

Une fois optimisées les valeurs de k et de α (optimisation de la capacité et de la

sélectivité), la résolution et le temps d’analyse ne dépendent plus que de N.

Les conditions qui favorisent les séparations rapides incluent l’utilisation de petites

particules, de colonnes plus courtes et de débits plus importants.

’ ’

l’utilisation de •Ultra‐haute pression = UPLC ou UHPLC (> 6000 psi ou 400 bar)

•Température plus élevée = HT‐HPLC

•Particules spéciales

UPLC ‐ UHPLC



vo u on es a es e par cu es

10 min

Late 1960’s

40μm pellicular non‐porous coated

m n‐ ‐

5,000 plates/meterEarly

1970’s10μm Irregular micro‐porous1000‐2500 si 70‐180 bar

10 min

40,000 plates/meter

1980’s to present day

3.5 ‐ 5μm spherical micro‐porous1500‐4000 psi (110‐280 bar)80,000 ‐ 115,000 plates/meter

Exemples de PS utilisées en UHPLC



Exemples de PS utilisées en UHPLC

C18— Trifunctionally Bonded C18— ropr e ary n capp ng— Widest pH range

— Trifunctionally Bonded C8— Proprietary Endcapping—

Shield RP18—

— Embedded polar group

Phen l— Trifunctionally Bonded C6 Phenyl— Proprietary Endcapping

Le challenge de la courbe de Van Deemter



Le challenge de la courbe de Van Deemter

( )u C C u

B AH

M S +++=

Particule = élément central de la

Plus petites particules meilleures séparations sur de plus grandes

plages de vélocités

augmentation de la vitesse et de

Exemples




Séparation en gradient UHPLC d’une digestion à la trypsine d’albumine de serum bovin.



HT ‐ HPLC



Augmentation de la température :

, équivalent à une augmentation de la pression (cf UHPLC)

• Augmentation du coefficient de diffusion du soluté • même efficacité à un débit plus élevé et un temps d’analyse plus court

• efficacité améliorée à temps d’analyse égal

Inconvénients

°

• Possibilité de gradients de t°dans la colonne manque d’uniformité de la t°

• Instabilité des colonnes

• Diminution de la sélectivité

« me eure » emp ra ure = comprom s en re max e αmax

B =



=ugmen a on e a emp ra ure : u

C quand T



.

L’analyse par chromatographie a principalement pour but de repérer la

présence ou de doser un composé présent pour lequel on a choisi un

détecteur bien adapté.

ua s u ec eur :•Sensibilité•Bruit négligeable

•Réponse indépendante des variations des paramètres d’utilisation(pression, température, débit, composition de la phase mobile)

•Non‐destructif •Stable au cours du temps

••Grande vitesse de réponse

Modes de détection les plus courants basés sur les propriétés optiques

des composés : absorption, fluorescence, indice de réfraction

Limites de détection et de uantification



LOD = plus petite concentration d’un analyte détectable (pas nécessairement quantifiable)

LOQ = plus petite concentration d’un analyte quantifiable avec une

précision et une justesse acceptables

Rapport signal sur bruit (S/N)

LOD S/N = 3

LOQ S/N = 10



Detector Relative

sensitivity

Useful with

gradient

T°sensitivity Analytes

Yes Presence of Specific IR bands

Refractive

Index

+ No High Universal

Conductivity ++ No Moderate Charged compounds

UV‐Vis +++ Yes Presence of chromo hores

ELSD +++ Yes Universal

‐

Fluorescence ++++ Yes Fluorophore

++++ es n versa wselective detection possible

Détecteur à indice de réfraction



Un faisceau lumineux (mono‐ ou polychromatique) passe à travers une cellule à

deux compartiments dont l’un est rempli avec la PM seule et l’autre avec la PM

sortant de la colonne. La différence d’indice de réfraction entre les deux li uides

qui apparaît lorsqu’un analyte est mélangé à la PM provoque un déplacement

angulaire du rayon diffracté.

Le RI est utile dans le cas de composés qui ne possèdent pas de chromophores

’, , ,



, , ,

(conductimètre)Généralement utilisé en conjonction avec une autre technique de détection

Applications : Sucres, Alcools, Lipides, Polymères,…

Avantages



•Réponse « universelle »

Détecte tout ce qui se trouve en solution.

Sauf si l’analyte a exactement le même RI que la phase mobile

•Utilisation facile

•Peu de paramètres

•Très robuste

•Peu sensible à l’encrassement et aux “bulles”

Désavantages

•Faible sensibilité

•Absence de sélectivité

• ens e aux c angemen s e , emp ra ure e v scos

•Pas d’utilisation de gradients

Détecteur spectrophotométrique UV‐Visible :



Mesure la perte d’intensité de lumière UV ou Vis. lors du passage dans une solution

Détection basée sur la loi de Lambert‐Beer (A = εlC) : l’absorbance A de la

phase mobile est mesurée en sortie de colonne, à la longueur d’onde λ ou

’ ’ .

‐ , , .



La sensibilité optimale est obtenue en utilisant le détecteur à la longueur d’onde où l’absorbance du composé d’intérêt est la plus grande (λ )

Le détecteur UV/Vis est le plus répandu en HPLC

Bien u’a ant des limitations articulièrement our les com osés ui ne possèdent pas de chromophore UV), il possède la meilleure combinaison

de :

•Linéarité•Gamme dynamique• o us esse•Facilité d’utilisation

’ composés.



• Très robuste• Facilité d’utilisation

• Compatible avec les gradients

• Non‐destructif

• • ~70% des publications HPLC utilisent un UV/Vis.

Désavantages

• Pas universel

• Pas aussi sélectif que d’autres techniques (Fluo, MS, ECD)

• Détection affectée par la composition de la phase mobile



Détecteur à barrette de diodes (PDA ou DAD)



Soit :

‐Changement de longueur d’onde en cours d’analyse

‐ ’ ’ simultanément

‐Enregistrement de l’absorbance sur tout un domaine de longueurs

d’onde

Absorbance en 3D

Enregistre l’absorbance sur tout le spectre UV Vis



Enregistre l absorbance sur tout le spectre UV‐Vis

Permet la création de bibliothèques spectrales



Le PDA acquiert un spectre par unité de temps en fonction de la vitesse

d’acquisition du détecteur

Le spectre acquis au sommet du pic est considéré comme référence

L’algorithme de pureté de pic analyse tous les spectres d’un pic par rapport

au s ectre de référence



• Détection “universelle” UV‐Vis• Bonne Sélectivité

• Gamme dynamique

• Spectres UV‐Vis des pics

Bibliothèques

• Estimation de la pureté d’un pic

Désavantages

• o ns sens e que c ass que

• Complexe

• Plus de bruit qu’un détecteur UV classique

• Composés de même famille possèdent le même spectre

Caractéristiques de quelques chromophores :




Détecteur spectrofluorimétrique

Les composés fluorescents réémettent sous forme de lumière tout ou une



Les composés fluorescents réémettent sous forme de lumière tout ou une

partie du rayonnement de la source lumineuse auquel ils sont soumis.

L’intensité de fluorescence est proportionnelle à la concentration de l’analyte.

Lampe au deuterium ou au xenonλ d’excitation sélectionnée par un filtre ou un monochromateur

Isolement de la λ d’émission ar un second filtre ou monochromateur

λ d’émission dirigée vers le photodétecteur

a ec on par uorescence a eu quan une mo cu e a sor e e a



lumière, atteignant ainsi un niveau d’énergie plus élevé (excitation).’

perdue est émise sous forme de lumière (émission) – La molécule

fluoresce.

Le FL enregistre à la fois les longueurs d’onde d’excitation et d’émission, ce

qui donne lieu à de très grandes sélectivité et sensibilité .

es ongueurs on e son sp c ques c aque compos uorescen .



• Sensibilité 10 à 1000x lus sensible u’un UV

Recherche de « traces »• Sélectivité

• Faible bruit de fond• Technique simple et nondestructive

Désavantages

• Peu de composés fluorescents• Besoin de dérivatiser les analytes• Reproductibilité inter‐labo

• Réponse dépend de T°, pH, viscosité, polarité solvant• Les λEx et λEm peuvent varier

• N cessite p usieurs scans pour trouver es va eurs optima es

Détecteur électrochimique (ampérométrique)

Les composés pouvant être réduits ou oxydés en présence d’un potentiel



électrique peuvent être détectés à de très faibles concentrations par des mesures électrochimi ues sélectives.

Potentiel constant variation du courant

Détecteur conductimétrique



Mesure le changement de conductivité électrique due à la présence d'un soluté dans la phase mobile (de façon absolue ou différentielle).

Avantage: détecteur utilisé pour solutés ioniques.Inconvénient: sensibilité très grande à la température.

Détecteur ELSD (Evaporative Light Scattering Detector)



Evaporation de la PM suivie de la mesure de la lumière diffusée par les particules d’analyte non volatile.

Utile pour tous les solutés ayant une volatilité plus faible que la PM.

L’intensité de la lumière diffusée dépend de la taille des particules

d’analyte.

3 étapes :

• Nébulisation : effluent transformé en aérosol

É



• Évaporation : la partie volatile de l’effluent est éliminée (solvants), les

‐

• Détection : les particules interceptent un rayon de lumière, l’intensité

de lumière diffractée est ro ortionnelle à la uantité de articules détectées

Source : Grace



• Détecte les composés qui n’absorbent pas en UV‐Vis.• eu re u s avec es so van s qu a sor en eaucoup en .• Utilisation de gradients (avantage sur RI).• Possibilité de varier la T°de nébulisation pour optimiser la détection.

• Applications : Sucres, Polymères, Triglycérides

Désavantages

• Pas de tampons/additifs non‐volatils• Techni ue destructive.• Besoin de gaz de nébulisation (habituellement N2).• TOUS les ELSD sont non‐linéaires.• ’ .

Détecteur de masse

O i i i d dé d ill l’UPLC



Optimisation des détecteurs de masse pour travailler avec l’UPLC’

Vitesses de changement de mode d’ionisation minimisés

• ESI +• ESI –

• APCI +

• APCI ‐

Dwell times minimisés

Simple et triple quadrupôle

Temps de vol (TOF, QTOF)

r nc paux ec eurs u s s



.



rug scovery

Préformulation

Pharmacocinétique et métabolisme

Développement process

Développement formulation

…

cromatografia liquidachapitre_6_(hplc)[1]

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