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_____________________________________________________________________________Pensamiento

i

Hay hombres que luchan un día y son buenos,

Hay otros que luchan un año y son mejores,

Hay quienes luchan muchos años y son muy buenos,

Pero hay quienes luchan toda la vida, esos son los

imprescindibles.

Bertolt Brecht

______________________________________________________________________________Dedicatoria

ii

A mi querida madre Livia Mora

A mis hermanos Martha, Giovanni y Estalì

A toda mi familia, y en especial a la memoria de mi tía Elvia Mora Gonzales

Para mis amores chiquitos Alejandra, Denisse, Paula, Alina, Dayana y Alonso

En especial a Sandra.

__________________________________________________________________________Agradecimientos

iii

A Dios por ser mi guía, mi esperanza y fortaleza diaria

A la Secretaria Nacional de Ciencia y Tecnología, por creer y fortalecer el talento humano

de muchos Ecuatorianos

A la Universidad Nacional de Loja, Ecuador

A todo el claustro de docentes de la 11na Edición de la Maestría en Agricultura Sostenible.

En especial a mi tutor Dr. C. Roldán Torres Gutiérrez, por su incondicional apoyo,

dedicación y asesoramiento científico y técnico desde el inicio hasta la finalización del

presente trabajo de investigación.

A todos mis familiares y amigos, que de una u otra forma contribuyeron a la realización

del presente trabajo, en especial para Abel Ramos, René Cupull y Teresita Ordoñez

A todos gracias

________________________________________________________________________________Resumen

Caracterización e identificación de aislados de Rhizobium: comportamiento en genotipos de frijol iv

El presente trabajo se llevó a cabo con el objetivo de caracterizar e identificar bacterias

pertenecientes al género Rhizobium aisladas de 13 zonas de muestreos de las provincias

de Sancti Spiritus, Cienfuegos y Villa Clara, así como determinar el efecto de estos

aislados sobre parámetros morfológicos, fisiológicos y la fijación de nitrógeno de

genotipos de frijol común. El análisis morfológico se basó en determinar las diferencias de

las colonias obtenidas del aislamiento, donde se evaluó la tinción al Gram, tipo de

crecimiento, color, producción de mucus, bordes y elevación. La identificación genética de

los aislados resultantes de la caracterización morfológica se realizó mediante la

secuenciación total de los genes de la región 16S ARNr. El análisis fenotípico de los

aislados se condujo en condiciones controladas, evaluándose los parámetros de

nodulación, morfológicos, fisiológicos y la fijación de nitrógeno de los genotipos ICA Pijao

y BAT-304 de frijol común. Los resultados obtenidos demuestran una gran diversidad

morfológica de cepas nativas de Rhizobium en los suelos de la región central de Cuba,

obteniéndose 65 colonias iniciales, de las cuales 33 presentaron características diferentes

en al menos un parámetro evaluado. De un total de 22 secuencias analizadas en la

identificación genética, se obtuvieron 6 géneros bacterianos, siendo el género Rhizobium

el que mostró variabilidad en las especies, identificándose 4 especies en 8 secuencias

alineadas y entre ellas el primer reporte de R. pisi para Cuba. El análisis fenotípico

evidenció el efecto beneficioso de la especie R. etli y los aislados procedentes de Santa

Clara y Camajuaní-1, así como el aislado R. pisi de Camajuaní-2. La variabilidad

genotípica demostró la estrecha correlación positiva entre estas cepas y el genotipo BAT-

304 en comparación con ICA Pijao.

_________________________________________________________________________________Abstract

Caracterización e identificación de aislados de Rhizobium: comportamiento en genotipos de frijol v

The work was carried out to characterize and identify bacteria belonging to Rhizobium

genus isolated from 13 sampling areas in the provinces of Sancti Spiritus, Cienfuegos and

Villa Clara, and to determine the effect of these isolated on morphological, physiological

and nitrogen fixation of common bean genotypes. The morphological analysis was based

on determining the differences of the colonies obtained from isolation, which evaluated the

Gram stain, growth type, color, mucus production, edge and elevation. The genetic

identification of isolates resulting from the morphological characterization was performed

by gene sequencing of the 16S rRNA region. The phenotypic analysis of isolates

characterized and identified was conducted under controlled conditions, evaluating

nodulation parameters, morphological, physiological and nitrogen fixation of common bean

ICA Pijao and BAT-304 genotypes. The results show a wide morphological diversity of

native strains of Rhizobium in the soils of the central region of Cuba, resulting in 65 initial

colonies, from which 33 showed different characteristics in at least one parameter

evaluated. From a total of 22 sequences analyzed in the genetic identification, six bacterial

genera were obtained, in which the genus Rhizobium showed the variability of species.

From eight sequences aligned, four species were identified, among them the first report of

R. pisi for Cuba. The phenotypic analysis showed the beneficial effect of the species R. etli

and isolated from Santa Clara and Camajuaní-1 and the isolated R. pisi of Camajuaní-2.

Genotypic variability showed strong positive correlation between these strains and

genotype BAT-304 compared with ICA Pijao.

___________________________________________________________________________________Índice

Caracterización e identificación de aislados de Rhizobium: comportamiento en genotipos de frijol vi

Páginas

Pensamiento………………………………………………………………………………… i

Dedicatoria…………………………………………………………………………………... ii

Agradecimientos………………………………………………………………………….... iii

Resumen……………………………………………………………………………………... iv

Abstract…………………………………………………………………………………….... v

Índice…………………………………………………………………………………………. vi

1 INTRODUCCIÓN………………..…………………………………………………..….…. 1

2 HIPÓTESIS………………………..……………………………………………………….. 3

3 OBJETIVOS……………………….………………………………………………………. 3 3.1 Objetivo general……………...……………………….……………………………… 3

3.2 Objetivos específicos………………………………….…………………………….. 3

4 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA……………………………….…………………….……… 4 4.1 Impacto del nitrógeno (N) en los ecosistemas…………………………….…….. 4

4.1.1 Implicaciones de la liberación de N reactivo en los ecosistemas…..…… 5

4.2 La fijación biológica del nitrógeno (FBN)………………………………………… 6

4.2.1 Organismos involucrados en la FBN……………………………………….. 7

4.2.1.1 Cianobacterias………………………………………………………... 8

4.2.1.2 Actinomicetos…………………………………………………………. 8

4.2.1.3 Bacterias no simbióticas…………………………………………….. 9

4.2.1.4 Bacterias simbióticas………………………………………………… 11

4.2.2 Características generales del género Rhizobium...................................... 13

4.3 La simbiosis rizobio-leguminosa……………………………..……………………. 14

4.3.1 Proceso de nodulación rizobio-leguminosa………..…………….…………. 15

4.3.2 Especificidad y promiscuidad en la interacción rizobio-leguminosa, aspectos claves para la selección de rizobios eficientes……………...…………

17

4.4 Aportes de aislamientos de Rhizobium en el desarrollo y productividad del frijol común………………………………………………………………………………...

20

5 MATERIALES Y MÉTODOS.…………….……………………………………………… 23 5.1 Aislamiento e identificación de aislados de Rhizobium.…………………………. 23

___________________________________________________________________________________Índice

Caracterización e identificación de aislados de Rhizobium: comportamiento en genotipos de frijol vii

5.1.1 Toma de muestras por municipios en la región central de Cuba…….….. 23

5.1.2 Preparación de muestras y aislamiento de colonias bacterianas…....….. 23

5.1.3 Caracterización morfológica e identificación genética de los aislados...... 25

5.1.3.1 Caracterización morfológica…………………………………….…... 25

5.1.3.2 Identificación genética…………………………..…………………… 25

5.2 Efecto de aislados de Rhizobium sobre parámetros morfológicos, fisiológicos y fijación de N de genotipos de frijol común………………………………………..…

27

5.2.1 Preparación del inoculó, montaje del experimento e inoculación……………. 27

5.2.2 Condiciones de crecimiento y evaluaciones…………………………………… 29

5.2.3 Análisis estadístico………………………………………………………………... 30

6 RESULTADOS Y DISCUSIÓN..………….……………………………………………… 32 6.1 Caracterización e identificación de aislados de Rhizobium……………………. 32

6.1.1 Análisis del muestreo de plantas en la región central de Cuba..….….….. 32

6.1.2 Caracterización morfológica de los aislados obtenidos…………………... 34

6.1.3 Identificación genética de aislados mediante el análisis de lasecuenciación 16S ADNr…………………………………………………………….

36

6.1.3.1 Diversidad de Rhizobium en la región central de Cuba…..………. 38

6.2 Efecto de la inoculación de asilados de Rhizobium sobre parámetros morfológicos, fisiológicos y la fijación de N en genotipos de frijol en condicionescontroladas………………………………………………………………………………...

40

6.2.1 influencia de la inoculación de aislados sobre parámetros morfológicos en diferentes etapas de crecimiento………………………………………………..

40

6.2.2 Efecto de los aislados sobre los parámetros de nodulación…………….. 42

6.2.3 Determinación de la biomasa en genotipos de frijol común………………………………………………………………………………….

47

6.2.4 Análisis de la fijación de N y correlaciones…………………………………. 50

7 CONCLUSIONES…………………………………………………………………………. 54

8 RECOMENDACIONES..….………………………………………………………………. 56

9 BIBLIOGRAFÍA

________________________________________________________________Introducción

Caracterización e identificación de aislados de Rhizobium: comportamiento en genotipos de frijol 1

1 INTRODUCCIÓN

El suministro de nitrógeno (N) al suelo no es suficiente para compensar su creciente

demanda por las plantas y organismos vivos que habitan en este, haciéndose necesaria la

aplicación de algún fertilizante nitrogenado (Beever et al., 2007). Sin embargo, esta

estrategia puede producir una creciente contaminación ambiental donde se ven afectados

todos los factores actuantes, ya sean bióticos como abióticos (Urzua et al., 2001). El N es

el principal factor nutricional que limita el crecimiento de plantas en los agroecosistemas

mundiales (Graham, 1988). Este elemento es un componente esencial en sustancias

básicas para la vida, tales como ácidos nucleicos y la conformación de proteínas

(Harrison, 2003), por lo que el cultivo de plantas con capacidad para incorporar este

elemento tanto a su metabolismo como para el adecuado comportamiento del ciclo del N

en la biosfera es de vital importancia.

Las plantas pertenecientes a la familia leguminosa (Fabaceae) son unas de las máximas

responsables del equilibrio del N en los ecosistemas (Broughton et al., 2003). Estas son

capaces de realizar el proceso de fijación biológica del N (FBN) mediante la estrecha

relación con bacterias del suelo comúnmente conocidas como rizobios1 (Weir, 2006),

estableciéndose la conocida interacción simbiótica Rhizobium-leguminosa (Weidner et al.,

2003).

Dentro de las plantas leguminosas, el frijol común (Phaseolus vulgaris L.) presenta

singular importancia por aporte de altas cantidades de proteínas, carbohidratos y

minerales (Quintero, 2000). Este cultivo es cosechado en todos los continentes, con

mayor incidencia en América Latina (Broughton et al., 2003). En Cuba este grano tiene

una larga tradición y goza de alta demanda, cultivándose como promedio 150 584 ha (5

645 ha en el sector estatal y 144 939 ha en el sector privado) y obteniendo una

producción anual de 110 800 t, sin embargo sus rendimientos no rebasan los 740 kg ha-1

(Oficina Nacional de Estadísticas, 2009), lo cual representa una cifra muy baja para el

total de grano consumido en el país (20.3 kg año-1) (Gómez, 2006). Según la FAO (FAO

2007), la cantidad estandarizada de importación de este alimento en Cuba asciende a las

135 510 t año-1, colocándonos en el país más importador de frijol seco de toda América

Latina, aún por encima de Brasil (135 430 t). Según Gómez et al., (2006) la cantidad de

1 Comúnmente se conoce como rizobios o rhizobia; sin embargo existen 13 géneros que pertenecen a la familia Rhizobiaceae que agrupan características genéticas similares. Ver acápite 4.2.1.4 del texto.

________________________________________________________________Introducción


divisa destinada a la importación de este alimento para satisfacer la demanda de la

población asciende a más 60 millones USD por año.

El mayor beneficio de la interacción Rhizobium-leguminosa esta estrechamente ligado a la

disminución de la aplicación de fertilizantes nitrogenados y a la salud de las plantas, lo

cual trae como resultado el incremento de los rendimientos agrícolas (Giller, 2001). Estos

sistemas simbióticos aportan la mayor fuente de N a los agroecosistemas, incorporando

como promedio un 80% de los requerimientos de N mediante la fijación simbiótica del N

(FSN) (Graham y Vance, 2000). Sin embargo, los cultivos de leguminosas son muy

variables en cuanto a su eficiencia para fijar dinitrógeno (N2) atmosférico, especialmente

el cultivo del frijol común, el cual se considera por varios autores como ineficiente en este

proceso, alcanzando niveles del 40% del N derivado de la atmósfera (Burdman et al.,

1996; Peña-Cabriales y Zapata, 1999; Urquiaga y Zapata, 2000; Remans et al., 2007,

Torres-Gutiérrez, 2008).

Es ampliamente conocido que el frijol común es una leguminosa promiscua en cuanto a la

inoculación por cepas de Rhizobium (Bromfield y Barran, 1990), siendo infectada por

varias especies de este género en una misma planta (Michiels et al., 1998; Torres-

Gutiérrez, 2008). Cepas de Rhizobium aisladas de nódulos de P. vulgaris mediante

métodos moleculares (16S rRNA) han mostrado una considerable diversidad genética, sin

embargo, las investigaciones relacionadas con las evaluaciones de estas cepas frente a

los parámetros fenotípicos de las plantas aun son muy escasos (Martínez-Romero, 2003;

Torres-Gutiérrez et al. 2009). Estos resultados sugieren que las evaluaciones de la

diversidad de géneros y especies de rizobios nativos en los suelos permite una mejor

selección de cepas para la realización de inoculantes y aplicación a esta leguminosa,

resultando en una eficiente nodulación, fijación de N e incremento de los rendimientos

agrícolas en condiciones de campo, contribuyendo a su vez a lograr un proceso

productivo económico, ecológico y agronómicamente sostenible en este cultivo

estratégico.

Teniendo en cuenta la imperiosa necesidad de la obtención de cepas de Rhizobium

eficientes para el cultivo del frijol, nos trazamos la siguiente hipótesis y objetivos en

nuestra investigación:

__________________________________________________________Hipótesis y Objetivos


2 HIPÓTESIS

La caracterización e identificación de bacterias pertenecientes al género Rhizobium

aisladas de diferentes localidades de la región central de Cuba, así como el análisis del

efecto de estas sobre parámetros morfológicos, fisiológicos y la fijación de N de genotipos

de frijol común, contribuirá a la selección de mejores inoculantes por agroecosistemas

para la producción del cultivo en el país.

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo general

Caracterizar e identificar bacterias del género Rhizobium aisladas de la región central de

Cuba y determinar el efecto de las mismas sobre parámetros morfológicos, fisiológicos y

la fijación de N en genotipos de frijol común.

3.2 Objetivos específicos

1. Aislar y caracterizar morfológicamente cepas nativas de Rhizobium procedentes

de diferentes agroecosistemas de la región central de Cuba.

2. Identificar genéticamente los aislados obtenidos mediante técnicas moleculares.

3. Evaluar el efecto de las cepas aisladas sobre parámetros morfológicos, fisiológicos

y la fijación de N de genotipos de frijol común en condiciones controladas.

_________________________________________________________Revisión Bibliográfica


4 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

4.1 Impacto del nitrógeno (N) en los ecosistemas

A partir de la década del 40, millones de toneladas de N sintético eran suministradas a las

producciones agrícolas anualmente con el fin de aumentar sus rendimientos potenciales.

La alta demanda de alimentos fue un factor determinante de tal incremento en la

producción y aplicación de fertilizantes nitrogenados. La “revolución verde” se convirtió en

el punto sublime de la difusión de los mencionados fertilizantes, trayendo consigo el gasto

incalculable de fuentes de energía natural para su producción y los nefastos problemas

que han ocasionado en la ecología y el equilibrio biológico (Biological Nitrogen Fixation,

2001). Desde 1972, con la fundación de la IFOAM (Internacional Federation of Organic

Agriculture Movements) se estableció que la agricultura orgánica debía aumentar la fertilidad

de los suelos, su actividad microbiana e incrementar el reciclaje de los nutrientes. En la

década de los 90, los biofertilizantes se convirtieron en un punto común de investigación

teniendo en cuenta los serios problemas ambientales causados con la aplicación irracional

de los fertilizantes químicos (IFOAM, 2001), lo cual se ha mantenido hasta la actual

década.

La aplicación de fertilizantes que contienen N y otros nutrientes para las cosechas es

esencial para equilibrar las entradas y salidas y por tanto para mantener o mejorar la

fertilidad del suelo, para incrementar la productividad agrícola y a su vez, para evitar que

los ecosistemas naturales y los hábitats vírgenes se conviertan en tierras de cultivo

(Beever et al., 2007). Sin embargo, esto ha traído como consecuencia el gran uso del

fertilizante químico nitrogenado para reponer el N del suelo y para obtener los

rendimientos deseados, una práctica que conlleva a altos costos y que produce efectos

severos al medio ambiente (Gustafson y Kreys, 2006). Los grandes incrementos de las

producciones de cereales en los países desarrollados entre 1959 y 1990 están

directamente relacionados con el aumento de la aplicación del fertilizante nitrogenado.

Unido a los altos niveles de aplicación de estos fertilizantes están la expulsión de óxidos

de nitrógeno (N2O) a la atmósfera, el deterioro de recursos no renovables, un desequilibrio

en el ciclo global del N y la disolución del nitrato en las aguas subterráneas (Torres-

Gutiérrez, 2008).

El uso de N sintético en los últimos 40 años ha aumentado de 3.5 a 80 millones de

toneladas, tanto en países desarrollados como en vías de desarrollo, incrementándose



sus costos de producción a más de 20 billones de USD anualmente (Biological Nitrogen

Fixation, 2001). En este periodo, el ciclo global del N se ha visto afectado por el

incremento irracional de la fijación de N mediante procesos industriales, es decir,

mediante la aplicación de fertilizantes nitrogenados; pero su impacto ambiental aun está

por calcularse (Biological Nitrogen Fixation, 2001; Montañés et al., 2004). La contribución

de la fijación de N al ciclo global de este elemento no ha cambiado en los últimos años,

teniendo un balance aproximado con el proceso de desnitrificación, el cual convierte el N

combinado en N2 atmosférico. En la actualidad la fijación no ocurre eficientemente debido

a que es inhibida por la presencia de N mineral en el medio (Vitouseck y Matson, 1993,

citado en Biological Nitrogen Fixation, 2001; Montañés et al., 2004).

4.1.1 Implicaciones de la liberación de N reactivo en los ecosistemas

La falta de N reactivo en agro-ecosistemas lleva al descenso de la fertilidad de los suelos,

bajos rendimientos y escaso contenido proteínico en las cosechas, reducción de la

materia orgánica de los suelos, erosión y en casos extremos, la desertificación (Barbier y

Bergeron, 2001). Sin embargo, existen nefastos problemas que pueden originarse con el

exceso o la aplicación irracional de productos químicos nitrogenados.

El exceso de NO3- en los suelos comúnmente suele lixiviarse a los suministros de agua

subterránea y agua potable, contaminando las fuentes fluviales. Aunque el llamado

síndrome de niños cianóticos (enfermedad comúnmente conocida como “niños azules”,

causante de la metahemoglobinaemia), ha sido atribuido recientemente a la

contaminación bacteriana y no al exceso de NO3- en las aguas como originalmente se

suponía (L'hirondel y L'hirondel, 2002), es ampliamente conocido que el exceso de NO3-

en vegetales y alimentos causado por la irrigación con aguas contaminadas con NO3- está

estrechamente relacionado con la aparición de cánceres intestinales y gástricos (Leifert y

Dorado, 2000).

Beever et al. (2007) han reportado que los nitratos en aguas superficiales aumentan la

carga de N lo cual puede jugar un rol fundamental en la eutroficación. Este proceso

contribuye a la degradación de los recursos ecológicos creando grandes concentraciones

de algas y organismos en las aguas superficiales y su contaminación.

En la atmósfera el oxido de N (NO2) de manera particular puede exacerbar varias

enfermedades en los seres humanos, tales como asma y enfermedades cardiovasculares.

En este medio, el incremento de las concentraciones de óxido nitroso (N2O) contribuye



sustancialmente al calentamiento global y consecuentemente a la salud humana (Graham

y Vance, 2003; Norse, 2003; Crutzen et al., 2007). El N2O es un potente gas invernadero,

contando con un potencial global de calentamiento (PGC) promedio de 100 años, siendo

296 veces mayor que igual masa de CO2 (Prather et al., 2001). Como fuente de óxidos

nítricos (ej: NO, NO2, N2O) también juega un rol importante en la las transformaciones

químicas del ozono, actuando como un catalizador en la destrucción de este elemento en

la atmósfera (Crutzen, 1970), lo cual deriva en el incremento de las radiaciones

ultravioletas. Existen evidencias que alta exposición a este tipo de radiaciones incrementa

la incidencia de cánceres de piel, cataratas y soriasis (De Gruijl, 1999).

Todos los ecosistemas emiten N2O y más de 50% de las emisiones globales son

considerados como "natural" (tierras bajo vegetación natural, océanos, etc.). La agricultura

justifica el 86% de las emisiones globales antropogénicas de N2O (USEPA, 2006). De las

emisiones N2O agrícolas, 44% está relacionado a la administración y la aplicación de

abono animal, y 14% es asociado directamente con el uso de fertilizantes minerales

(Mosier et al., 2004). Sin embargo, está claro que aumentando la aplicación de

fertilizantes nitrogenados aumentará las emisiones N2O por los procesos naturales de

desnitrificación natural procesado (Merino et al., 2001, Crutzen et al., 2007).

Las proyecciones recientes indican que la demanda global de fertilizantes nitrogenados en

el 2050 podrían estar entre 107 y 171 t de N (Beever et al., 2007). De acuerdo con los

cuatro escenarios reportados por la Evaluación del Ecosistema del Milenio (2005) así

como otros investigadores, corroboran que el consumo global del fertilizante nitrogenado

en el 2050 se prevé que esté entre 110 y 140 t de N (Bumb y Baanante, 1996; FAO, 2000;

Wood et al., 2004; Galloway et al., 2004; Heffer y Prud'homme, 2006). Estos incrementos

sin precedentes en la producción agrícola para satisfacer los niveles de insumos calóricos

y proteicos para el abastecimiento a la gran población mundial propicia la búsqueda de

nuevos métodos de producción agronómicamente y ecológicamente sustentables para

proteger el entorno que soportarán tal explosión demográfica (Biological Nitrogen Fixation,

2001).

4.2 La fijación biológica del nitrógeno (FBN)

El N es un elemento necesario en la composición de proteínas, ácidos nucleicos y otros

componentes celulares, siendo así una molécula esencial para el crecimiento de todos los

organismos. En la atmósfera el N ocupa aproximadamente el 80%, existiendo en la forma



N≡N; sin embargo, el N2, debido al triple enlace entre los dos átomos de nitrógeno, que

hace a la molécula casi inerte, no puede ser aprovechado por la mayoría de las formas

vivientes, sino sólo por un pequeño grupo de microorganismos altamente especializados,

que incluyen algas, bacterias y actinomicetos; para ser utilizado en el crecimiento, este

debe ser primero reducido y luego “fijado” (combinado) en la forma de iones amonio

(NH4+) o nitrato (NO3

-). El proceso a través del cual esos microorganismos reducen el

nitrógeno hasta una forma utilizable es conocido como Fijación Biológica del Nitrógeno

(FBN), este paso puede ser llevado a cabo por los microorganismos en vida libre o en

simbiosis con plantas (Allan y Graham, 2002).

La FBN es una fuente eficiente de N (Peoples et al., 1995). Las entradas anuales de N en

la tierra a partir de la FBN como se plantea por (Burns y Hardy, 1975) y (Paul, 1988)

oscilan entre 139 y 175 millones de toneladas de nitrógeno con interacciones asociativas

planta-bacteria y con el pasto permanente, lo cual representa un 30 % (45 millones de

toneladas de N) y con las asociaciones simbióticas (Rhizobium-plantas leguminosas) en

terreno arable representa entre un 25 y un 30 % (entre 35 y 45 millones de toneladas de

N). Aunque la exactitud de estas cifras puede ser cuestionada (Beever et al., 2007).

Los organismos que pueden fijar N, es decir, convertir el gas N2 estable en la atmosfera

en una forma útil biológicamente, pertenecen todos ellos a un grupo biológico conocido

como procariotas. Todos los organismos que reducen el N2 a NH4+ lo hacen con la ayuda

de una enzima compleja, la nitrogenasa (Zahran, 1999). Un amplio espectro de

microorganismos podría tener la capacidad de fijar N. Sin embargo, solamente una

proporción pequeña de las especies conocidas pueden hacerlo; cerca de 87 especies en

2 géneros de archaea, 38 géneros de bacterias y 20 géneros de cianobacterias han sido

identificadas como diazótrofos u organismos que pueden fijar el N2 atmosférico (Dixon y

Wheeler, 1986; Zahran y Afkar, 1995). La FBN resulta ser, entonces, una tecnología

limpia de producción y una forma concreta de proteger el medio ambiente.

4.2.1 Organismos involucrados en la FBN

Entre los microorganismos capaces de realizar la conversión del N2 en sus células se

encuentran grupos de cianobacterias, actinomicetos y bacterias, todos estos en diferentes

asociaciones simbióticas (Rhizobium-leguminosa, Azolla-Anabaena, Frankia-actinorizas) y

de vida libre (bacterias, bacterias-filosfera, bacterias-rizosfera), siendo estas últimas las



más extendidas (Roesch et al., 2006), sin embargo las asociaciones simbióticas,

especialmente Rhizobium-leguminosa ha sido la más estudiada (Vance, 2001).

4.2.1.1 Cianobacterias

Dentro de las cianobacterias capaces de realizar el proceso de FSN representativas se

encuentran los géneros Anabaena y Nostoc (Zahran, 1999). Presentan una gran

diversidad morfológica, desde unicelulares hasta multicelulares filamentosas y con o sin la

presencia de heterocistos. (Stanier y Cohen-Bazire, 1977), las describen como

fotoautotróficas, fijadoras de CO2 a través del Ciclo de Calvin y carentes de 2-

oxoglutarato deshidrogenasa. En las cianobacterias, el amonio es incorporado en

esqueletos carbonados (2-oxoglutarato) a través del ciclo de la glutamina sintetasa-

glutamato sintasa para la biosíntesis de glutamato y compuestos nitrogenados derivados

(Herrero et al., 2001). Los heterocistes son células especializadas, distribuidas a lo largo o

al final del filamento (cianobacterias multicelulares filamentosas), los cuales tienen

conexiones intercelulares con las células vegetativas adyacentes, de tal manera que

existe un continuo movimiento de los productos de la fijación de N desde los heterocistos

hacia las células vegetativas y de los productos fotosintéticos desde las células

vegetativas hacia los heterocistos (Todar, 2004).

Figura 4.1. Cianobacterias fijadoras de N. A, B: Anabaena spp.; C, D: Nostoc spp. Tomado de imágenes de Google (http://www.google.com.cu./imagenes)

4.2.1.2 Actinomicetos

Los actinomicetos son bacterias filamentosas Gram positivas, comunes en el suelo,

especialmente en suelos de elevado pH y poca humedad. Se les considera como

organismos intermedios entre los hongos y las bacterias, formadores de micelios

(Lechevalier y Lechevalier, 1979; Huss, 1990). Frankia es un género del grupo de los

actinomicetos, cuya especie F. alni, se ha reportado como fijadora de N tanto en vida libre

A B C D

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reportan la presencia de carbohidratos y aminoácidos en exudados radicales y señalan

que la composición y cantidad de exudados varía con la especie del microorganismo

presente y las condiciones abióticas, especialmente agua y temperatura. La relación que

se establece entre las bacterias y las plantas puede ser favorable, perjudicial o neutra.

Dentro de las relaciones favorables se encuentra la asociación con bacterias fijadoras de

N; entre estas, especies de Azospirillum, Azotobacter y Burkholderia, Paenibacillus, entre

otras (Estrada et al., 2001). Las bacterias fijadoras de N pueden ser categorizadas dentro

del grupo de las rizobacterias promotoras del crecimiento (PGPR, por sus siglas en

inglés), al ejercer un efecto benéfico sobre el crecimiento de las plantas (Okon y

Vaderleyden, 1997). Por muchos años se consideró que el efecto benéfico de las

bacterias fijadoras de nitrógeno sólo provenía de la utilización por las plantas del amonio

excretado; así existen numerosas publicaciones que prueban tal efecto (Mirza et al., 2001;

Becker et al., 2002); sin embargo, se ha encontrado que estas bacterias también

producen fitohormonas (auxinas, giberelinas y citoquininas) que afectan favorablemente el

desarrollo de las plantas, particularmente de la raíz (Persello-Cartieaux et al., 2003). Más

recientemente se ha reportado que las bacterias fijadoras de N incrementan la capacidad

radical de absorción de nitrato, indirectamente como una consecuencia de la estimulación

del desarrollo radical y directamente por estimulación del sistema transportador del

compuesto (Mantelin y Touraine, 2004).

Figura 4.5. Bacterias rizosfericas fijadoras de N. A: Azospirillum brasilense, B: Azotobacter chroococcum, C: Burkhorderia spp., D: Paenibacillus polymyxa. Tomado de imágenes de Google (http://www.google.com.cu/imagenes)

4.2.1.4 Bacterias simbióticas

Hasta la actualidad las únicas bacterias capaces de realizar el proceso de FSN son

aquellas comúnmente conocidas como rizobios. Sin embargo, estas incluyen 6 géneros

bacterianos los que se asocian con diferentes plantas pertenecientes a la familia

A B C D



Fabaceae (Weir, 2006), además de taxas independientes. Weir (2009) reporta que esta

interacción incluye los bien conocidos grupos de alfa-proteobacterias de la familia

Rhizobiaceae conteniendo los géneros Azorhizobium, Bradyrhizobium, Ensifer

(Sinorhizobium), Mesorhizobium y Rhizobium; junto con los taxas: Methylobacterium (Sy

et al., 2001) y Devosia (Rivas et al., 2002), Herbaspirillum (Valverde et al., 2003),

Ochrobactrum (Zurdo-Piñeiro et al., 2007), Phyllobacterium (Valverde et al., 2005),

Shinella (Lin et al., 2008) y miembros del grupo de beta-proteobacteria tales como:

Burkholderia (Moulin et al., 2001), Cupriavidus (Ralstonia) (Chen et al., 2001)

La taxonomía de los rizobios se ha desarrollado rápidamente y durante los últimos 20

años se han descrito muchas especies y géneros nuevos. La aplicación de los métodos

de biología molecular en la taxonomía ha ayudado a descubrir nuevas especies de estos

géneros. La taxonomía actual de estas bacterias se basa en un enfoque polifásico que

incluye caracterizaciones de morfología, bioquímica, fisiología, genética y filogenia, entre

otras (Gillis et al., 2001). El uso del enfoque polifásico ha conferido a la taxonomía una

base más natural y más confiable. Se estima que los rizobios no conocidos en el mundo

representan un recurso biológico porque las leguminosas son uno de los grupos de

plantas más grande y diverso y éstas se encuentran distribuidas en distintos ecosistemas.

Sólo se han investigado los microsimbiontes de un pequeño número de ellas.

Seguramente nuevos rizobios se conocerán cuando se caractericen más aislados (Wang

y Martínez-Romero, 2004).

Cada especie bacteriana consta de un grupo de cepas que comparten características que

las distinguen como grupo de otras especies bacterianas. El uso de técnicas de biología

molecular ha provisto de una descripción más precisa para las especies. El análisis de

secuencias de los genes 16S rRNA se ha usado como uno de los principales criterios para

la descripción de los géneros y las especies de rizobios (Vanparys et al., 2007). Se

considera que las cepas cuyas secuencias del gen de 16S rRNA son similares en un 97%

o más, probablemente pertenecen a la misma especie. Si bien se puede distinguir a los

diferentes géneros de rizobios a partir del parecido de las secuencias de genes de 16S

rRNA, no existe un porcentaje definido para marcar las fronteras entre géneros (Wang y

Martínez-Romero, 2004). Por otra parte, cuando las secuencias de 16S rRNA son muy

parecidas, este criterio no permite distinguir especies cercanamente relacionadas y esto

ocurre debido a que el gen 16S rRNA está muy conservado entre todos los organismos

vivos. Hasta la fecha, se han descrito más de 40 especies entre los géneros bacterianos

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integrase en el cromosoma. En unas especies como R. leguminosarum y R. etli se

encontraron cepas no simbióticas en suelo o en el laboratorio al eliminar los genes

simbióticos. También las cepas no simbióticas de los rizobios o de Agrobacterium pueden

formar nódulos fijadores de nitrógeno al adquirir plásmidos o genes simbióticos a partir de

los rizobios simbióticos. Estos casos indican la capacidad de cambio entre las bacterias

simbióticas y las no simbióticas al adquirir o perder genes. Se ha secuenciado

completamente el plásmido simbiótico de la cepa tipo de R. etli, CFN42, y también todo el

genoma. Debido a que las especies de Agrobacterium, Rhizobium y Allorhizobium se

entremezclan, además de que no se distinguen por características fenotípicas, se ha

propuesto combinar los tres géneros en uno solo como Rhizobium (Young et al., 2001), lo

cual ha sido causa de controversia (Farrand et al., 2003, citado por Wang y Martínez-

Romero, 2004)

4.3 La simbiosis rizobio-leguminosa

Un examen de la historia de la FBN demuestra el marcado interés centrado generalmente

en el sistema simbiótico Rhizobium-leguminosa, debido al impacto cuantitativo en el ciclo

del N. Un inmenso potencial para la contribución de la fijación de N en los ecosistemas

existe en plantas leguminosas (Brockwell y Thies, 1995; Peoples y Ladha, 1995; Tate,

1995). Aproximadamente 650 géneros y acerca de 20.000 especie de legumbres habitan

en el planeta (Sprent, 1985), sólo una porción de ellas (cerca del 20%) han sido

examinadas en cuanto a la capacidad de nodulación (Sprent y Sprent, 1990; citado por

Torres-Gutiérrez, 2008), mostrando tener la habilidad para fijar N2. Estimaciones de la

simbiosis Rhizobium-leguminosa muestran que algo más que 100 especies de legumbres

agrícolamente importantes contribuyen casi a la mitad de las cantidades anuales de FBN

en los ecosistemas terrestres (Tate, 1995). Las cifras de las entradas por esta interacción

ascienden a 70 millones de toneladas de N año-1, variando entre diferentes genotipos y

condiciones ambientales donde se desarrollan los cultivos (Giller, 2001).

La FBN, particularmente mediante la interacción Rhizobium-leguminosa, juega un rol

crucial en el incremento de la sostenibilidad de los agro-ecosistemas y los rendimientos

agrícolas de las legumbres de grano, contando con un mínimo de insumos de fuentes no

renovables (Vance, 2001). Esta interacción esta caracterizada típicamente por la

formación de nódulos en las raíces o tallos de las plantas leguminosas que son inducidos

y subsecuentemente invadidos por microsimbiontes específicos (Weidner et al., 2003).



4.3.1 Proceso de nodulación rizobio-leguminosa

Las plantas leguminosas secretan compuestos específicos que actúan como sustancias

atrayentes de los rizobios. Entre estos compuestos se encuentran flavonoides y en

respuesta a ellos los rizobios activan una serie de genes implicados en la nodulación

(Cárdenas, 2000). El primer paso en la formación de los nódulos es la adherencia de la

bacteria a la planta. En la superficie del rizobio se localiza una proteína específica la

ricadesina, proteína que se une al calcio y puede actuar captando complejos de calcio en

la superficie de los pelos radicales. Otras sustancias, como las lectinas, que son proteínas

que contienen carbohidratos, también cumplen una función en la adherencia planta-

bacteria. Luego de la unión, los pelos radicales se enroscan debido a la acción de

sustancias específicas secretadas por la bacteria, que se conocen como factores Nod

(Nápoles, 2008). Algunos pelos radicales se enroscan hasta 360° formando una

estructura denominada el "cayado de pastor". La bacteria penetra entonces en el pelo

radical e induce la formación del hilo o canal de infección (López-Lara, 2003).

Las bacterias son liberadas desde el canal de infección al citoplasma de las células

vegetales por un mecanismo similar al de endocitosis. Los rizobios quedan separados del

citoplasma por una membrana derivada de la planta, a la cual se le denomina membrana

peribacteroidal (MPB). En seguida hay una división continua y sincronizada de los rizobios

rodeados de MPBs. Al cesar la división las bacterias se transforman en unas formaciones

ramificadas, hinchadas y deformes, llamadas bacteroides. Estos quedan rodeados,

individualmente o en pequeños grupos por la MPB. A estos grupos de bacteroides se les

conoce como simbiosomas (López-Lara, 2003). Cuando los rizobios se encuentran dentro

de la célula vegetal sufren diversos cambios morfológicos esenciales para la nueva

función que han adquirido. Estos cambios incluyen, entre otros, un aumento en el tamaño

de las células y una diferenciación de la bacteria a un estado de bacteroide, en el cual

ocurre la fijación del nitrógeno atmosférico. Durante un proceso eficiente de fijación de N,

la expresión de las nodulinas tardías se incrementa, jugando un papel muy importante en

la fisiología del nódulo; tal es el caso de la leghemoglobina, cuya función es la de

mantener bajas las tensiones parciales de oxígeno, lo que crea un ambiente microaerofilo

que permite a su vez la actividad de la enzima nitrogenasa del bacteroide y la fijación

biológica del nitrógeno atmosférico. (Quinto y Cárdenas, 2007).



Figura 4.7. Esquema de formación de nódulos por Rhizobium en raíces de leguminosas.

Según Bauer (2001), la apariencia de la planta, el número, tamaño, peso y color interno

de los nódulos, así como el contenido de N en distintas partes de la planta, constituyen

características utilizadas para medir la respuesta a la simbiosis. De acuerdo con estas

características, la nodulación puede clasificarse como efectiva o inefectiva. Sin embargo,

estos dos términos no son suficientemente descriptivos como para distinguir todas las

respuestas posibles de las plantas a la nodulación.

Dada la gran diversidad de plantas leguminosas, existen diferentes modos de infección,

formas y modo de desarrollo de los nódulos. De modo general, los nódulos se clasifican

en: nódulos indeterminados y determinados los primeros presentan un meristemo

persistente, que puede producir nódulos ramificados o coraloides, puesto que

constantemente se añaden nuevas células a la parte distal del nódulo; de tal manera que

todos los estados de desarrollo están así representados, debido a que ocurre una

gradiente de formación desde la parte distal, a la proximal en el punto de unión a la raíz

(Mayz-Figueroa, 2004). Este tipo de nódulo se observa en la gran mayoría de

leguminosas que se desarrollan en climas subtropicales o templados, tales como

Medicago, Trifolium, Vicia, Lotus entre otros géneros. Los nódulos determinados son

aquellos en los que la actividad meristemática cesa temprano en su formación y su

aspecto final resulta del alargamiento de las células, este tipo de desarrollo origina

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Nódulo

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Pelos radicales

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nódulos esféricos o globosos, que pueden organizarse alrededor de la raíz para formar los

denominados nódulos en collar (Hirsch, 1992; Mayz, 1997). La formación de estos

nódulos se observan en géneros de leguminosas tropicales, tales como Glycine,

Phaseolus, Arachis y otros.

4.3.2 Especificidad y promiscuidad en la interacción rizobio-leguminosa, aspectos claves para la selección de rizobios eficientes

Hasta la fecha, sólo existe información limitada sobre diversidad microbiana y la dinámica

de la población en suelos agrícolas (Smit et al., 2001; Weir, 2009). El estudio de la

diversidad microbiana en suelos agrícolas, además de proporcionar valiosa información

ecológica para definir las preferencias de los hospederos y el predominio de las cepas,

contribuye al conocimientos sobre las relaciones genética y estructural de las bacterias en

los suelos, el entendimiento en la dinámica del intercambio de material genético, así como

es una potente fuente de selección de cepas eficientes en los procesos agrícolas

beneficiosos tal como la FSN (Dunbar et al., 2000).

La formación de una simbiosis efectiva es un proceso altamente específico, sin embargo,

el grado de especificidad varía tremendamente entre los diferentes rizobios (Kneip et al.,

2007). Así algunas cepas tienen un rango de hospedador muy reducido como por ejemplo

R. leguminosarum biovar trifolii que sólo fija N en especies de Trifolium (trébol) o

Sinorhizobium meliloti, que nodula especies de los géneros Medicago, Melilotus y

Trigonella. Otras por el contrario, muestran un amplio rango de hospedador, este es el

caso de Rhizobium sp. NGR234 que nodula 112 géneros incluyendo la no-leguminosa

Parasponia (Pueppke y Broughton, 1999). Las leguminosas también pueden ser

específicas por un simbionte en particular, como ejemplo de estas se encuentran: Galega

officinalis y G. orientalis, noduladas solamente por Rhizobium galegae, (Lindström, 1989)

Vicia faba por R. leguminosarum bv. viciae (Ritsema, 1996) y Medicago sp., por

Sinorhizobium meliloti.

En contraste a otras leguminosas de grano, tal como soya (Glycine max L.), el frijol común

es altamente promiscuo, tanto para simbiontes de crecimiento lento como para aquellos

de crecimiento rápido. Sin embargo, una eficiente simbiosis en la fijación de N en frijol

común, solo se obtiene con rizobios de crecimiento rápido (Michiels et al., 1998; Bala y

Giller, 2001). La promiscuidad del frijol común interfiere en el manejo de las interacciones

simbióticas eficientes en condiciones de campo debido a la competición con las cepas



nativas, las cuales generalmente son menos eficientes en la fijación de N, pero más

competitivas en la rizosfera del frijol (Torres-Gutiérrez, 2008). Como se ha hecho alusión,

esta es una de las principales razones que hacen a este cultivo una planta ineficiente en

el proceso de fijación de N comparada con otras leguminosas de grano.

En los últimos años, la taxonomía de microorganismos y específicamente la clasificación

de Rhizobium nodulantes de frijol común ha sido revisada progresivamente. Una gran

diversidad de Rhizobium han sido descubiertos en diferentes partes del mundo. P.

vulgaris se ha reportado a ser originario de América (Gepts, 1990); sin embargo, esta

planta es conocida por ser un anfitrión simbiótico en varias localidades, cuyos socios

simbióticos se encuentran diversa y ampliamente extendidos. Un amplio rango de

especies de Rhizobium han sido reportadas para nodular efectivamente P. vulgaris,

reconociéndose esta como una planta promiscua, así como otras plantas leguminosas,

tales como: Macroptilum (Bromfield y Barran, 1990) y especies de Vigna (Pueppke y

Broughton, 1999).

La distribución de Rhizobium capaces de nodular P. vulgaris varía entre diferentes

condiciones geo-ecológicas (ver tabla 4.1, pág.-19), aunque Rhizobium tropici y

Rhizobium etli son los simbiontes más distribuidos a nivel global. R. tropici ha sido

reportado a ser más dominante en la nodulación del frijol en suelos de diversas regiones

tropicales, incluidas las regiones América del Sur y Central (Martínez-Romero et al.,

1991), Brasil (Hungria et al., 2000), en África del Este y del Sur (Anyango et al., 1995);

mientras R. etli es más dominante en Europa (Herrera-Cervera et al., 1999), África Central

y Oeste (Diouf et al., 2000) e Indonesia (Tjahjoleksono, 1993). R. giardinii y R. gallicum

son menos diversos y han sido reportados en asociación con frijol común en Francia

(Laguerre et al., 1993) y España (Herrera-Cervera et al., 1999).

En muchos agroecosistemas los microsimbiontes no han sido caracterizados, por ejemplo

en Cuba los estudios sobre la identificación genética, así como fenotípica son muy

escasos, por ello el conocimiento de la dominancia de cepas existentes de Rhizobium en

diferentes condiciones agro-ecológicas son prácticamente nulos (Hernández et al., 1996;

Loiret, et al., 2004; Torres-Gutiérrez et al., 2009).

Para mejorar la nodulación y fijación de N en las leguminosas, la introducción de

inoculantes bacterianos a los campos agrícolas ha sido una práctica común durante 100

años. Cuando cepas de Rhizobium específicos no se encuentran presentes en los suelos,

la inoculación fácilmente aumenta el crecimiento vegetal y rendimiento (Singleton y



Tavares, 1986; Vlassak y Vanderleyden, 1997). Por otra parte, cuando existen cepas

nativas, a menudo estas compiten con las cepas del inoculante ocupando una pequeña

proporción en los nódulos como se ha observado en algunas áreas de América Latina

(Aguilar et al., 2001; Burgos et al., 1999; Graham, 1981; Ramos y Boddey, 1987).

Tabla 4.1 Especies de Rhizobium aisladas de nódulos de frijol común

Especies de Rhizobium Sitios de aislamientoa

R. etli (Segovia et al., 1993) México, Colombia, Ecuador-Perú, Argentina, Brasil, Senegal, Gambia, Tunisia, España, Austria, USA, Cubab

R. tropici (Martínez-Romero et al., 1991) Brasil (tipo A, B y otros), Colombia (tipo B), Francia (tipo A), Marruecos, Kenya, Senegal y Gambia (tipo B), Cuba (tipo A)b

R. leguminosarum bv. phaseoli (Jordan, 1984) Inglaterra, Francia, España, Colombia, Brasil, Tunisia

R. gallicum (Amarger et al., 1997) Francia, Austria, México (bv. gallicum solamente), Tunisia, España

R. giardinii (Amarger et al., 1997) Francia, España, Brasil

a Se resaltan los centros de origen. b Torres-Gutiérrez (2008). Fuente: Martínez-Romero (2003) modificada.

La lucha contra las cepas nativas para incrementar la FSN es uno de los puntos comunes

de estudios en la interacción rizobio-leguminosa. Genotipos de frijol común con alta

capacidad de fijar N pueden combinarse con cepas de Rhizobium con capacidad superior

para fijar N y competir con las cepas nativas del suelo. Una estrategia enfocada por

varios autores y reseñada por Martínez-Romero, (2003) se centra en el mejoramiento de

la fijación de N mediante cepas nativas bien adaptadas a los ecosistemas y al estudio de

la biodiversidad de rhizobia.

Aunque una gran cantidad de conocimientos se han acumulado relativos a la diversidad

genética de frijol y sus simbiontes, la base del éxito de la inoculación y la eficiente fijación

de N en este cultivo siguen siendo difícil y en muchos casos ilusivo en condiciones de

campo. Algunos de los problemas en la nodulación del frijol común y la FSN detectados

durante 20 años atrás (Graham, 1981) aun existen hoy día (Martínez-Romero, 2003).

Programas para mejorar la FBN, así como FSN pueden beneficiarse de los estudios de la

biodiversidad de Rhizobium, genética de los simbiontes, factores ambientales y las



relaciones microbianas establecidas en la rizosfera (Martínez-Romero, 2003; Cooper,

2007; Muresu et al., 2008).

4.4 Aportes de aislamientos de Rhizobium en el desarrollo y productividad del frijol común

Se conocen alrededor de 55 especies de Phaseolus (Maréchal et al., 1978; citado por

Martínez-Romero, 2003), pero solamente cinco de ellas son domesticadas: frijol común

(Phaseolus vulgaris), habas (P. lunatus), judía escarlata (P. coccineus), tepari (P.

acutifolius), y P. polyanthus. Entre las especies de Phaseolus el frijol común es el más

extensamente cultivado (Martínez-Romero, 2003). El frijol es el alimento básico que

aporta más del 70 % de la proteína en la dieta de los pobres en América Latina y África

Oriental. Los nutricionistas caracterizan al frijol como un alimento casi perfecto debido a

su alto contenido proteico y apropiadas cantidades de fibra, carbohidratos complejos y

otras necesidades nutricionales incluyendo ácido fólico, hierro, cobre, potasio y zinc. Los

frijoles complementan otros alimentos como el maíz y el arroz que son fuentes primarias

de carbohidratos (Torres-Gutiérrez, 2008). Dado estas características, no es sorprendente

que el frijol común sea la legumbre mas importante en el mundo para el consumo humano

directo (Broughton et al., 2003).

Los frijoles son cultivos muy diversos, se encuentran en terrenos tanto a nivel del mar

como sobre el nivel del mar (3000 m), se cultivan en monocultivo, en asociaciones o en

rotaciones. Su hábitat de crecimiento va desde variedades de arbustos que maduran en

tres meses hasta trepadores que demoran ocho meses para ser cosechadas. (Torres-

Gutiérrez, 2008). A través de su gran biodiversidad, la variación genética natural para las

características de importancia agronómica es amplia para este cultivo. Tanto la

domesticación como la mejora de la planta redujeron la diversidad genética entre las

variedades cultivadas debido al cambio genético aleatorio y la selección para genes

específicos (Singh, 2001; Rossi et al., 2007), por lo que especialmente las especies

Phaseolus silvestres son una fuente excelente para los rasgos de resistencia y tolerancia

al estrés biótico y abiótico, rendimiento bajo diversas condiciones agronómicas e

interacciones simbióticas con rizobio y PGPR.

Rosas (1986) y Piha y Munns (1987) han demostrado que, entre un 25 y un 75% del N

requerido por la planta de frijol, proviene de la interacción eficiente con Rhizobium

específico. Las cantidades de N2 fijado suministran entre 25-125 kg N ha-1, dependiendo

del cultivar, pero generalmente las tasas de fijación son relativamente bajas.



Alves et al. (1995) evaluó durante 3 años la influencia del incremento de la norma de

fertilización nitrogenada sobre la composición cuantitativa de la microflora risosférica del

frijol durante el ciclo vegetativo y el rendimiento del cultivo con y sin inoculación de

Rhizobium, en un suelo pardo medianamente lavado. Se estableció que de las normas

nitrogenadas investigadas, los mayores rendimientos en grano se obtuvieron con 60 kg

ha-1 e inoculación de las semillas con Rhizobium.

Rodríguez y Ferrera (1984), citados por (Ferrera et al., 1990), realizaron una selección de

cepas de Rhizobium en cuatro variedades de frijol de diferente hábito de crecimiento. Las

variedades mostraron respuesta desigual a la inoculación con las diferentes cepas de

Rhizobium: el 37,5% de las cepas se comporto como efectivo en más de una variedad; el

26% fueron efectivas en dos variedades; el 10% se comporto como efectivo en fijación de

N en tres variedades y el 63% resulto ser efectiva en las cuatro variedades. Concluyendo

que existe interespecificidad entre cepa y variedad de frijol, interacción que es necesaria

considerar en un programa de selección de cepas de Rhizobium y/o genotipos de frijol. El

estudio muestra que algunas cepas pueden nodular y fijar N en forma eficiente en más de

una variedad.

En la sierra Peruana la deficiencia de N en los suelos, es una de las causas principales de

los bajos rendimientos en cultivos de maíz y frijol. Una alternativa de bajo costo para

reducir este problema, es el N fijado por la leguminosa. Con este propósito el proyecto de

frijol del Centro de Investigaciones en Agricultura Tropical (CIAT) para la zona andina,

realizó trabajos principales en selección de cepas efectivas de Rhizobium con amplio

rango de adaptación y con capacidad de competir con las cepas nativas. El trabajo hizo

énfasis a la evaluación de cepas (siete nativas y siete del CIAT) en campos de

agricultores. Después de cuatro campañas agrícolas, en 1991 se seleccionaron cuatro

cepas con las características deseadas. En los ensayo de campo, se lograron incrementar

un 22% en la producción de frijol y del 42% en la producción de maíz (Pineda, 1992).

Brunet et al. (1999) observaron que un suelo pardo grisáceo procedente de área frijolera

presenta gran infección de Rhizobium, lo que indica la presencia de cepas nativas

adaptadas a las condiciones de este suelo. Estos autores encontraron que todas las

cepas de Rhizobium probadas en condiciones controladas presentaron buena infección en

la variedad de frijol utilizada, demostrado por el peso seco de los nódulos que se

incrementó con la edad de la planta, lo que indica la efectividad de las cepas estudiadas

en estas condiciones. La cepa menos efectiva de las estudiadas fue aquella donde se



utilizó como soporte la zeolita, pues aunque el peso seco de los nódulos fue mayor, el

contenido de N y proteína bruta del mismo fue menor, indicando menor eficiencia en la

fijación del N. Esto pudiera estar influenciado por la viabilidad de las bacterias eficientes

en este soporte debido a una mayor sequedad del área de la rizosfera producto del propio

material.

(Mhamdi et al., 2002) describieron la variabilidad de cepas de Rhizobium con la capacidad

de nodular el frijol común en diferentes ambientes en Túnez y recientemente (Tajini et al.,

2008) demostraron la efectiva combinación Rhizobium etli y R. tropici CIAT899 en los

genotipos del frijol común. Los resultados demostraron que fue evidente que las cepas de

rizobia nativas eran más eficientes que la cepa CIAT899, sin embargo observaron un claro

efecto de las cepas por genotipo en el estudio.

En Cuba, durante los últimos 20 años se han aislado y evaluado cepas de Rhizobium, en

diferentes condiciones (Hernández, 1997). Según (Hernández et al., 1994), después de un

trabajo de colección de cepas nativas de Rhizobium, de evaluaciones en condiciones de

laboratorio e invernadero, de ensayos de evaluación y validación de la mejores cepas en

campos de agricultores en las tres regiones más productoras de frijol, se llego a la

producción de inoculantes. En las provincias de Matanzas y Holguín, se tuvieron las

mejores respuestas a la inoculación. Estos autores reportan que en 1988 se utilizaron tres

toneladas de inoculante en frijol común, cantidad que aumentó en 1992-93 a 60

toneladas, lo cual permitió ahorrar 2,7 millones de USD al país, debido a la reducción de

16000 t de urea para la producción de frijol. En este sentido Morales-Alvarez y Torres-

Gutiérrez, (2009) obtuvieron resultados similares en la determinación del efecto de cepas

de Rhizobium aisladas en suelos de la región central de Cuba frente a los parámetros de

crecimiento y rendimiento de dos variedades de frijol común, donde se obtuvo que todas

las cepas aisladas fueron capaces de nodular e incrementar los parámetros de

crecimiento en comparación con el tratamiento testigo y mediante la inoculación de R.

tropici se incremento el rendimiento con resultados superiores a la fertilización con N

mineral.

__________________________________________________________Materiales y Métodos


5 MATERIALES Y MÉTODOS

El presente trabajo se realizó en dos etapas experimentales para dar respuesta a los

objetivos de la investigación. Durante el primer periodo (2008-2009), se realizaron

ensayos en condiciones de laboratorio en la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la

Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas (Cuba), la Universidad Católica de

Leuven y la Universidad de Gent (Bélgica). En estas instituciones se realizaron los

experimentos necesarios para el aislamiento, identificación y caracterización de los

aislados bacterianos procedentes del cultivo de frijol común. El segundo periodo (2009-

2010) se enfocó en la determinación del efecto de los aislados diazotróficos sobre

parámetros morfológicos, fisiológicos y la fijación de N de los genotipos de frijol común

BAT-304 e ICA Pijao en condiciones controladas.

5.1 Aislamiento e identificación de aislados de Rhizobium

5.1.1 Toma de muestras en localidades de la región central de Cuba

En un total de 13 zonas de muestreos distribuidos por diferentes municipios de las

provincias de Villa Clara, Cienfuegos y Sancti Spiritus, se tomaron muestras de plantas de

frijol con presencia de nódulos en las raíces para la realización del aislamiento de las

cepas de Rhizobium nativas en estos suelos. En todos los casos se tomaron muestras del

suelo para la caracterización del grupo pedológico al cual pertenecen. En todas las zonas

se constató que el cultivo del frijol no hubiera sido biofertilizado con inoculo a base de

cepas de Rhizobium.

Todas las muestras fueron llevadas al laboratorio de Microbiología de la Facultad de

Ciencias Agropecuarias antes de las 24 horas de tomadas para evitar la desecación de

los nódulos de las plantas y de este modo obtener bacterias viables. En todos los casos

se comprobó la actividad de los nódulos mediante la escisión de los mismos con el

objetivo de observar la pigmentación de la leghemoglobina, lo cual indica la viabilidad de

los bacteroides dentro del nódulo y por consiguiente la vitalidad de estos para el posterior

aislamiento.

5.1.2 Preparación de las muestras y asilamiento de colonias bacterianas

Las muestras se procesaron mediante el método de siembra en placas Petri y

agotamiento por estrías (Torres-Gutiérrez, 2008. Ver figura 5.1) el cual consistió en el



lavado intenso de las raíces de las plantas noduladas con agua común para eliminar

restos de suelo y material contaminante en la corteza de la raíz. Todos los nódulos de las

plantas de frijol tomados en la misma zona de muestreo se separaron cuidadosamente

con el objetivo de que la corteza de la raíz permaneciera en su extremo apical para

proceder posteriormente al lavado intenso con agua destilada estéril durante 10 minutos.

Se tomaron aproximadamente 15 a 20 nódulos (2 g) para realizar la esterilización de los

mismos mediante la inmersión 1 minuto en etanol (90%), seguido de 3 minutos en

hipoclorito de sodio (NaCl 3%) y finalmente 2 minutos en bicloruro de mercurio (HgCl2

0.1%). Después de la esterilización se procedió al lavado intenso de los nódulos (hasta 10

veces) con agua destilada estéril con el propósito de eliminar todo resto de sustancia

toxica a las bacterias. Luego del lavado se realizó el exudado de los nódulos estériles en 1

ml de agua destilada estéril en placa Petri.

Las suspensión obtenida del exudado en cada muestra se sembró por estrías en placas

Petri conteniendo medio agar nutriente (AN) e incubadas a 30ºC durante 7 días. Al

finalizar el periodo de incubación, todas las colonias crecidas se purificaron mediante la

siembra repetida en medio yeast-manitol-agar (YMA) y confirmada la pureza de los

aislados de Rhizobium mediante el suplemento al medio de 0.025 g L-1 de Rojo Congo o

Bromotimol Azul (Somasegaran y Hoben, 1994).

Figura 5.1. Esquema de aislamiento de las cepas de Rhizobium. 1. Lavado intenso de los nódulos en agua común. 2. Lavado de los nódulos con agua destilada estéril (10 min.). 3. Desinfección de los nódulos mediante inmersión en etanol (90%) 1 min, NaCl (3%) 3 min. y HgCl2, (0.1%) 2 min. 4. Lavado intenso de los nódulos en agua destilada estéril. 5. Realización del exudado (trituración de los nódulos en 1 ml de agua destilada estéril). 6. Realización del aislamiento en cuadrantes mediante el método de agostamiento por estrías.



5.1.3. Caracterización morfológica e identificación genética de los aislados

5.1.3.1 Caracterización morfológica

Todas las colonias crecidas procedentes del aislamiento se analizaron como material de

origen para la caracterización morfológica. Estas colonias se reinocularon en medio Fred

modificado para que existiera disponibilidad de nutrientes, se incubaron a 30 ºC durante

24 horas y luego se mantuvieron a 4 ºC para detener su crecimiento. La caracterización

morfológica se realizó mediante la diferencia de las colonias respecto a: tinción al Gram,

tipo de crecimiento, color, producción de mucus, bordes y elevación. Los cultivos puros de

estos aislados posteriormente se le añadió 50% de glicerol y se mantuvieron a -20ºC para

la identificación genética.

5.1.3. 2 Identificación genética

Los estudios de identificación genética se realizaron de conjunto entre la Universidad

Católica de Leuven (KUL) y la Universidad de Gent (U-Gent), Bélgica. Para ello se realizó

el pase de las cepas a medio fresco en el Centro de Genética de Microorganismos de

Plantas y Microorganismos de la KUL y se realizaron los protocolos previstos para la

identificación en el Laboratorio de Microbiología de la U-Gent.

La identificación genética se realizó mediante las técnicas de biología molecular 16S

ADNr, específicamente el aislamiento de los genes de la región 16S ARNr, la cual es una

región muy conservada del genoma de los microorganismos. Esta técnica se basa en el

aislamiento del ADN de las colonias, amplificación de los genes de la región 16S ARNr y

purificación del producto de amplificación, reacción de secuenciación y la secuenciación

de estos genes.

Aislamiento del ADN de las colonias aisladas

El aislamiento del ADN de las colonias aisladas se extrajo mediante el método de lisis

alcalina (Vanparys et al., 2007). El procedimiento consistió en la suspensión de 1 o 2

colonias en 20 µl de buffer de lisis (2.5 µl 10% SDS; 5 µl 1 M NaOH y 92.5 µl agua MilliQ)

y centrifugado 5 minutos a 13 000 rpm. El sobrenadante de cada aislado se transfirió a un

nuevo tubo eppendorf el cual se situó a 95 ºC durante 15 minutos. Subsecuentemente,

180 µl de agua MilliQ se añadió y al tubo y este se centrifugo nuevamente durante 5

minutos a 13 000 rpm. El nuevo sobrenadante se transfirió a otro tubo eppendorf y



desechado, mientras el ADN extraído se conservó y se mantuvo a -20 ºC hasta su

procesamiento.

Amplificación de los genes de la región 16S ARNr

Los genes de la región 16S ARNr se amplificaron con los cebadores (primers)

conservados: 5’CTGGCTCAGGAC/TGAACGCTG3’ (ARI C/T) y

5’AAGGAGGTGATCCAGCCGCA3’ (pH), los cuales amplifican prácticamente toda la región

(1500 pares de bases) correspondiente a los genes 16S ARNr (Logan et al., 2000). Todas

las reacciones de amplificación (50 µl) contenía: 34.5 µl agua estéril, 5 µl dNTPs (2 mM

de cada uno); 5 µl 10X-buffer de PCR (del ingles Polimerase Chain Reaction-Reacción en

Cadena de la Polimerasa) [100 mM Tris–HCl (pH 8.3), 500 mM KCl,15mM MgCl2,

0.01%(w/v) gelatina]; 1 µl de cada cebador (50 ng µl-1); 1 µl Taq DNA polimerasa (1 U µl-

1); 348 µl agua MilliQ y 2.5 µl de muestra de AND extraído.

Los siguientes secuencia de ciclos de temperatura se usaron para la amplificación en la

maquina de PCR: 5 minutos a 95 ºC para desnaturalizar el ADN, 3 ciclos de amplificación

(45 segundos a 94 ºC, 2 minutos a 55 ºC y 1 minuto a 72 ºC), 30 ciclos de amplificación

(20 segundos a 94 ºC, 1 minutos a 55 ºC y 1 minuto a 72 ºC) y 5 minutosa 72 ºC para la

extensión final de los cebadores. Todos los productos del PCR se analizaron en

electroforesis en gel de agarosa al 1% (1 g de agarosa, 100 ml de buffer TAE-1X) a 80 V

durante 45 minutos.

El producto de la amplificación de los genes 16S ARNr se purificó usando el kit de

purificación QIAquick (Qiagen, USA), acorde con las instrucciones del fabricante y

analizado posteriormente mediante electroforesis en gel de agarosa 1%.

Reacción de secuenciación y secuenciación de los genes 16S ARNr

Para cada reacción de secuenciación se realizó la mezcla de 1 µl del producto del PCR

purificado, 0.5 µl de Big DyeTM Termination Ready Reaction Mix (Applied biosystem, USA),

3.75 µl de agua MilliQ y 3 µl (20 ng µl-1) de uno de los 8 cebadores usados para la

secuenciación total (cebador delantero, posición 339-358,

5’CTCCTACGGGAGGCAGCAGT3’; 519–536, 5’CAGCAGCCGCGGTAATAC3’; 908-926,

5’AACTCAAAGGAATTGACGG3’; 1093-1112, 5’AGTCCCGCAACGAGCGCAAC3’; cebador

reverso, posición 358-339, 5’ACTGCTGCCTCCCGTAGGAG3’; 536-519,

5’GTATTACCGCGGCTGCTG3’; 1112-1093, 5’GTTGCGCTCGTTGCGGGACT3’ and 1241-



1222, 5’GCTACACACGTGCTACAATG3’). El programa térmico consistió de 30 ciclos (15

segundos a 96 °C, 1 segundo a 35 °C y 4 minutos a 60 °C).

El análisis de la secuencia se realizó usando el secuenciador de ADN Applied Biosystem

3100, siguiendo el protocolo del fabricante (Perkin-Elmer). El montaje de las secuencias

se realizó con el programa BioNumerics ver. 4.5 (Applied Maths, Sint-Martens-Latem,

Bélgica). El alineamiento de las secuencias, así como la cercanía de las mismas se

realizó mediante el programa FASTA (Pearson, 1994) y la homología de las secuencias

con las secuencias depositadas en la base de datos de nucleotidos internacional

European Molecular Biology Laboratory (EMBL-nucleotide).

5.2 Efecto de aislados de Rhizobium sobre parámetros morfológicos, fisiológicos y fijación de N de genotipos de frijol común

El segundo periodo de experimentación se realizó en la Facultad de Ciencias

Agropecuarias y el Instituto de Biotecnología de las Plantas (IBP) de la Universidad

Central “Marta Abreu” de Las Villas, para determinar el efecto de diferentes aislados de

Rhizobium sobre parámetros morfológicos, fisiológicos y la fijación de N en dos genotipos

contrastantes de frijol común, BAT-304 e ICA Pijao en condiciones controladas.

Tabla 5.1 Genotipos de frijol común utilizados en el ensayo y sus principales

características

Genotipos de frijol común

Características relevantes Proveedor de las semillas

Ciclo (días)

Tipo de crecimiento*

Color grano

Masa vainas (g)

Rdto. bajos insumos (t ha-1)

ICA Pijao 82 II Negro 7.82 0.65 AgroFAR VC

BAT-304 75 III Negro 9.68 0.70 AgroFAR VC

* tipo de crecimiento indeterminado sin habilidad de trepar (Voysest, 2000)

5.2.1 Preparación del inoculó, montaje del experimento e inoculación

Cepas bacterianas

Las cepas bacterianas utilizadas en el ensayo fueron aquellas caracterizadas

morfológicamente e identificadas genéticamente, sin embargo, solo se inocularon aquellas

que fueron capaces de formar nódulos en las raíces de frijol común (var. BAT-477)



mediante un ensayo preliminar de re-inoculación. La tabla 5.2 muestra las cepas utilizadas

en el experimento en condiciones controladas, así como el la zona de muestro donde se

aislaron estas bacterias.

Tabla 5.2 Cepas bacterianas utilizadas en el ensayo en condiciones controladas

Identificador Identificación genética

Zona de aislamiento

R-40979 Rhizobium pisi Cifuentes (Unidad Proletaria)

R-40980 Rhizobium pisi Cienfuegos (Lajas)

R-40981 Rhizobium etli Santa Clara (Carretera de Maleza)

R-40982 Rhizobium pisi Sagua la Grande (Jesús Menéndez)

R-40983 Rhizobium pisi Camajuaní (campesino Camajuaní)

R-43451 Rhizobium etli Camajuaní (campesino Camajuaní)

CNPAF-512 Rhizobium etli Cepa tipo (wild type)

Preparación del inoculo, montaje del experimento e inoculación

El crecimiento de las cepas se realizó en el Laboratorio de Microbiología de la Facultad de

Ciencias Agropecuarias. Todas las cepas utilizadas se sembraron en medio Fred sólido

(Manitol 10g; MgSO47H2O 0.2g; NaCl 0.1g; CaCO3 0,5g; K2HPO4 0.5g; Extracto de

levadura 0.5g; Agar 15g; esto para 1L) durante 72 h e incubadas a 30 ºC. Para la

preparación del pre-inóculo se dispuso de 10 ml de medio Fred modificado y se ajustó el

pH a 7 añadiendo HCl. En este medio se sembraron las cepas previamente crecidas. Los

tubos se incubaron a 30 ºC durante 24 h en incubadora zaranda (Gerhardt, THO-500,

Alemania) para contar con título mínimo de 108 unidades formadoras de colonias por ml

(ufc ml-1). Al cabo del tiempo establecido se inoculó el cultivo de cada cepa en 500 ml de

medio Fred modificado para obtenerse el inóculo final, el cual se incubó a 30 ºC durante

24 h en incubadora zaranda.

Luego del tiempo necesario para el crecimiento de las bacterias se realizó el conteo de las

células viables en cada una de los aislados. Todas las cepas contaron con títulos de 109 o

1010 ufc ml-1 para la realización de la inoculación de las semillas.

En la fase de adaptación del IBP se realizó el ensayo, para el cual se dispuso de un

diseño experimental totalmente aleatorizado con 10 réplicas por cada cepa objeto de



análisis, además de un tratamiento control con la inoculación de la cepa tipo CNPAF-512

y un control sin inoculación de bacterias. Se depositaron 2 bandeja de poliespuma de 96

hoyos, de ellos solo se utilizaron para cada variedad un total de 80 hoyos, en los cuales

se añadieron 200 gramos de zeolita inactiva como sustrato para el crecimiento de las

plantas. En cada hoyo se sembraron las semillas de las variedades ICA Pijao y BAT-304,

las que se inocularon con 5 ml de inóculo de cada cepa en el momento de la siembra. A

las semillas del tratamiento control sin inoculación se les añadió 5 ml de agua.

5.2.2 Condiciones de crecimiento y evaluaciones

Las bandejas de poliespuma sembradas e inoculadas se colocaron en la cámara 5 de la

casa de cultivo 1 del IBP, donde existía adecuada iluminación y se mantuvo el riego

manual diario para evitar la desecación de la zeolita.

Durante todo el periodo de experimentación no se detectó presencia de plagas o

enfermedades en las plantas de ambas variedades analizadas. Tampoco se fertilizó ni se

aplicó producto químico alguno. Todos los hoyos donde crecieron las plantas se

encontraban libre de malezas, por lo cual no se tuvo que realizar ningún tipo de labor

cultural.

Evaluaciones

A partir de los 7 días de la siembra del experimento se evaluó la altura (cm) y el número

de hojas de las plantas. Estas últimas evaluaciones se continuaron a los 15 y 21 días

respectivamente.

A los 21 días después de la siembra (DDS) se analizaron los parámetros morfológicos y

fisiológicos de la nodulación: número de nódulos totales (NN) y peso fresco y seco de los

nódulos (PFN, PSN en gramos) (FAO, 1995); además del contenido de biomasa de la raíz

y el follaje: peso fresco y seco de la raíz (PFR, PSR) y el peso fresco y seco del follaje

(PFF, PSF en gramos). Para los análisis se cosecharon todas las plantas, por lo que se

dispuso de 10 muestras por cada tratamiento. El análisis de la biomasa se realizó en

balanza (Explorer Pro, EP64, Suiza)

Luego del análisis del contenido de materia seca mediante el secado de la parte aérea de

las plantas, se precedió determinar la fijación de N para cada tratamiento tomando 2

réplicas como muestra. Este parámetro se realizó mediante el porcentaje de N total (% N

total) y el porcentaje de proteína bruta (% PB). Para esta determinación se utilizó el



método Kjeldahl, (citado por Herrera et al., 1980), el cual se basa en la transformación del

N contenido en la muestra en sulfato de amonio (Na2SO4) mediante la digestión con acido

sulfúrico H2SO4 en presencia de selenio (Se) como catalizador (Se 5g /1 L de H2SO4). El

ion amonio (NH4+) obtenido se transforma en medio básico (NaOH) al 32%) en amonio

(NH4) que se destila y valora con una solución de acido patrón (HCl 0.1 % N).

El cálculo del % N total se efectúa por la siguiente formula:

14,0*%PM

VBVmN −=

Donde:

%N= porcentaje de N total de la muestra

Vm= volumen de la muestra

VB= volumen del blanco (H2SO4 sin muestra)

PM= peso de la muestra

Para el cálculo del contenido de proteína bruta (P.B) se siguió la siguiente formula:

25,6*%NPB =

Donde:

PB= proteína bruta

%N= porcentaje de N total

5.2.3 Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó utilizándose el paquete STATGRAPHIC® Plus ver. 5.0

para el sistema operativo Windows. Cada análisis se realizó teniendo en cuenta la

normalidad de los datos a procesar.

Para determinar las diferencias estadísticas entre los tratamientos, las variedades o la

interacción de estos factores en los parámetros de nodulación (NN, PFN, PSN) y la

biomasa de las plantas (PFR, PSR, PFF, PSF), se realizó un análisis de varianza

multifactorial (Multifactor ANOVA), donde se determinó el grado de independencia de los

tratamientos y las variedades, los cuales no tuvieron diferencias significativas en la

interacción (p<0.05) para estas variables evaluadas. De este modo se realizó el análisis

de varianza simple (One-Way ANOVA) y la prueba paramétrica Bonferroni con nivel de

significación p<0.05 para los tratamientos. En todos los casos evaluados se realizó la



verificación de varianza para conocer la homogeneidad de estas y por consiguiente

seleccionar la prueba paramétrica o no paramétrica idónea a utilizar.

Para las evaluaciones de la fijación de N no se realizó análisis estadístico ya que se

analizo el porcentaje de N total y no las proporciones de fijación de N.

Para las diferencias entre variedades por tratamientos se realizó el análisis de

comparación de dos muestras (Two-Samples Comparison) por columnas con nivel de

significación p<0.05.

Para correlacionar los parámetros de nodulación y la biomasa de las plantas se realizó un

análisis de regresión lineal mediante coeficiente de correlación de Pearson (Pearson

Linear Correlation) teniendo niveles de significación 0.01<p>0.05.

_________________________________________________________Resultados y Discusión


6 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

6.1 Caracterización e identificación de aislados de Rhizobium

6.1.1 Análisis del muestreo de plantas en la región central de Cuba

Un amplio muestreo se llevó a cabo en la investigación para obtener la mayor

representatividad de localidades y tipos de suelos de la región central de país. El

muestreo se realizó en 13 localidades abarcando 7 municipios de la provincia de Villa

Clara, 1 municipio de la provincia de Cienfuegos y 1 municipio de la provincia de Sancti

Spiritus (figura 6.1).

Figura 6.1 Zonas de muestreos para la realización de los aislamientos de cepas de Rhizobium de plantas de frijol noduladas.

Estos muestreos se realizaron con el objetivo de determinar la diversidad de cepas

nativas de Rhizobium predominantes en los suelos de esta región del país, así como la

obtención de aislados adaptados a las diferentes regiones agroclimáticas. En la tabla 6.1

se observan las zonas de muestreos y el tipo de suelo predominante en cada caso, lo cual

evidencia la amplia gama de grupos pedológicos de esta región.

Debido a que en Cuba la nomenclatura de los suelos propuesta por la (FAO-UNESCO,

1990) no es ampliamente conocida por la comunidad científica (Hernández et al., 2004),

se muestra en la tabla 6.1 la correlación de los tipos y subtipos genéticos de suelos

predominantes en las zonas de muestreo. Como se observa en la tabla, en la gran

mayoría de las zonas de muestreos predominó el Cambisol Eutrico Húmico.

Zonas de muestreos



Tabla 6.1 Zonas de muestreos y clasificación de los suelos predominantes

Municipio y localidad

Correlaciones

Clasificación genética de los suelos de Cuba

FAO-UNESCO (1990)*

Santa Clara (Estación Experimental, UCLV)

Pardo mullido Cambisol Eútrico, Húmico

Santa Clara (Carretera de Maleza) Pardo mullido Cambisol Eútrico, Húmico

Santa Clara (Callejón de los Patos, UCLV)

Pardo mullido Cambisol Eútrico, Húmico

Cifuentes (Unidad Proletaria) Ferralítico rojo típico Ferrasol Ródico

Manicaragua (campesino Manicaragua)

Pardo grisáceos Cambisol Cuarcítico, Humedo

Jibacoa (La Felicidad) Pardo grisáceos Cambisol Cuarcítico, Humedo

Sagua la Grande (Jesús Menéndez)

Gley Vértico típico Gelysol Vértico

Placetas (campesino Placetas) Pardo mullido Cambisol Eútrico, Húmico

Santo Domingo (Manacas) Ferralítico Cuarcítico Amarillo Rojizo Lixiviado

Acrisol Crómico Plíntico

Santo Domingo (INIVIT) Pardo mullido Cambisol Eútrico, Húmico

Camajuaní (campesino Camajuaní) Pardo mullido Cambisol Eútrico, Húmico

Cienfuegos (Lajas) Pardo mullido Cambisol Eútrico, Húmico

Sancti Spiritus (Cabaiguán) Pardo mullido Cambisol Eútrico, Húmico

*correlación internacional según FAO-UNESCO, 1990 (Hernández et al., 2004)

El análisis realizado respecto a los grupos pedológicos en las zonas de muestreos reviste

gran importancia en relación a la microflora autóctona de estas condiciones, ya que

además de conocer la presencia o no de bacterias benéficas en estos, existe una

estrecha relación entre las características químicas y físicas de los suelos y la diversidad

de microorganismos presentes en las condiciones edafoclimáticas determinadas (Varma y

Oelmöler, 2007). Estos resultados demuestran lo reportado por Martínez-Rimero, (2003)

al señalar que el género Rhizobium puede adaptarse a diferentes condiciones



agroclimáticas en climas tropicales, encontrándose en una diversa cantidad de tipos de

suelos.

6.1.2 Caracterización morfológica de los aislados obtenidos

Un total de 65 colonias de bacterias se obtuvieron luego del procesamiento de las

muestras y la realización de la metodología propuesta por Torres-Gutiérrez (2008) para el

aislamiento de bacterias pertenecientes al género Rhizobium de nódulos de frijol.

Todas las colonias obtenidas formaron parte de la caracterización morfológica, la cual se

basó en la diferencia en cuanto a: tinción de Gram, tipo de crecimiento, color, producción

de mucus, bordes y elevación de las colonias. La tabla 6.2 muestra los resultados

obtenidos en las diferencias morfológicas de los aislados, donde se observa que del total

de aislados solo 31 presentaron características diferentes en al menos un parámetro,

aunque todos respondieron a rasgos distintivos del género Rhizobium (Segovia et al.,

1993).

Tabla 6.2 Caracterización morfológicas de las bacterias aisladas

Identificador Parámetros morfológicos

Crec.a Colorb Mucusc Bordesd Elevac.e Gramf Morfolog.

Santa Clara-Maleza 4 ++ 3 ++ ++ + - CB

Santa Clara-Maleza 6 ++ 3 ++ + + - CB

Santa Clara-UCLV 1 ++ 3 ++ + + - CB

Santa Clara-UCLV 4 +++ 3 +++ ++ + - CB

Santa Clara-UCLV 5 ++ 3 ++ ++ + - CB

Manicaragua 1 ++ 3 ++ + + - CB

Manicaragua 3 +++ 3 +++ + + - CB

Manicaragua 4 ++ 3 ++ + + - BC

Placetas 4 +++ 3 +++ + + - BC

Placetas 5 ++ 3 ++ + + - CB

Cifuentes UBPC 1 ++ 3 + ++ + - BC

Cifuentes UBPC 5 ++ 3 + + + - CB

Jibacoa 2 +++ 3 ++ + + - CB

Jibacoa 5 +++ 3 +++ ++ + - BC

Cienfuegos 2 ++ 3 ++ + + - CB



Tabla 6.2 Caracterización morfológicas de las bacterias aislada (continuación)

a/ crecimiento: (-) nulo, (+) ligero, (++) moderado; (+++) abundante; b/ color: (1) transparente (2) traslucido, (3) opaco, (3*) blanco opaco, (3**) amarillo opaco; c/ mucus: (-) nulo, (+) ligero, (++) moderado, (+++) abundante; d/ bordes: (+) regular, (++) irregular e/ elevación: (+) liso, (++) elevado. Morfología/ BC (bacilo corto), CB (coco-bacilo).

En la tabla se muestran las zonas de muestreo y la cantidad de aislados diferentes

obtenidos en dichas zonas, así como las características morfológicas de cada uno de

estos. Se destaca que en todos los muestreos realizados se obtuvieron más de un aislado

diferente, lo cual demuestra la diversidad morfológica de las bacterias. De un total de 33

aislados 66.7% (22) tuvieron morfología de coco-bacilo, mientras que el resto fueron

bacilos cortos. Ambas morfologías pueden encontrarse en la agrupación del género

Rhizobium (Mayea et al., 1998; Varma y Oelmöler, 2007). En todos los casos se

observaron bacterias Gram negativas y coloración opaca, así como el crecimiento de

moderado a abundante, siendo característico de este género. Tanto la elevación como los

bordes son parámetros muy dependientes del medio de cultivo, no obstante con la

Identificador Parámetros morfológicos

Crec.a Colorb Mucusc Bordesd Elevac.e Gramf Morfolog.

Cienfuegos 3 ++ 3 ++ + + - BC

Cienfuegos 4 + 3 + + + - BC

Sagua la Grande 1 ++ 3 ++ ++ + - CB

Sagua la Grande 3 +++ 3 +++ ++ + - BC

Sagua la Grande 5 ++ 3 ++ ++ + - CB

Manacas 2 ++ 3 ++ + + - BC

Manacas 4 ++ 3 ++ + + - CB

INIVIT 2 +++ 3 +++ ++ + - CB

INIVIT 3 ++ 3 ++ + + - BC

INIVIT 5 +++ 3 +++ + + - BC

Sancti Spiritus 2 +++ 3 +++ + + - BC

Sancti Spiritus 3 ++ 3 ++ + + - BC

Santa Clara-Los Patos 1 ++ 3 ++ + + - BC

Santa Clara-Los Patos 5 ++ 3 ++ + + - BC

Camajuaní 1 ++ 3 ++ + + - CB

Camajuaní 2 ++ 3 ++ + + - BC



utilización de medio Fred modificado todas las colonias crecieron con elevación y el 66.7

% presentaron bordes regulares.

6.1.3 Identificación genética de aislados mediante el análisis de la secuenciación 16S ADNr

La técnica de aislamiento y secuenciación de los genes de la región 16S ARNr se aplicó

para la identificación genética de las bacterias previamente aisladas y caracterizadas.

Esta técnica de biología molecular es extremadamente dependiente de la pureza de las

cepas a identificar, de lo contrario la frecuencia de la secuenciación es errónea y se debe

repetir todo el proceso (Heyrman y Swings, 2001). Por tal motivo todas las colonias

aisladas se re-purificaron obteniéndose un total de 22 aislados los cuales se procesaron

siguiendo los protocolos del análisis de secuenciación 16S ADNr.

En la tabla 6.3 se muestran los resultados obtenidos de la secuenciación de los aislados,

donde se observa que solamente los aislados obtenidos de Sancti Spiritus (Cabaiguán) no

fueron secuenciados debido a la impureza de las bacterias. En el resto de las zonas de

muestreos se secuenció al menos 1 aislado. En un total de 22 secuencias alineadas se

identificaron 6 géneros bacterianos, resultado inesperado teniendo en cuenta el estricto

procedimiento de desinfección de los nódulos realizado, lo que evidencia que aun así,

permanecieron rizobacterias provenientes del suelo en la corteza o en interior de los

nódulos. Los resultados demuestran una estrecha homología de las secuencias obtenidas

con aquellas alineadas en la base de datos EMBL, lo cual refuerza la hipótesis de la

identificación a nivel de género y especie. Según Stackebrandt y Goebel (1994), dos

cepas que muestran homología en sus secuencias del 97.5% o menos, presentan menos

del 60 o 70% de similitud del ADN y por esta razón no pertenecen a la misma especie.

Como varios de los aislados identificados pertenecen a bacterias gran negativas que se

han reportado como rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPR por sus

siglas en inglés), tales como: Enterobacter, Pseudomonas, Stenotrophomonas y

Rhizobium (Bai, et al., 2003; Burdman et al., 2000; Dobbelaere, 2002), las cuales pudieran

ser de gran utilidad para la biofertilización de los cultivos con cepas autóctonas de estas

rizobacterias, además de servir como co-inóculos para la aplicación a leguminosas como

el frijol común e incrementar los parámetros de crecimiento, nodulación y fijación de N.

____________________________________________________________________________________________Resultados y Discusión


Tabla 6.3 Identificación genética de aislados basado en las secuenciación 16S ADNr

Identificador Zona de aislamiento Similitud de la secuencias 16S ADNr

Referencia FASTA más cercana %

R-43435 Cienfuegos (Lajas) Arthrobacter parietis 96.7 Heyrman et al. (2005)

R-43441 Santa Clara (Estación Exper., UCLV) Chryseobacterium sp. 100 Vandamme et al. (1994)

R-43452 Jibacoa (La Felicidad) Chryseobacterium sp. 100 Vandamme et al. (1994)

R-43438 Santa Clara (Estación Exper., UCLV) Enterobacter cloacae subsp. dissolvens 100 Xu (1994)

R-43449 Santa Clara (Estación Exper., UCLV) Enterobacter cloacae subsp. dissolvens 99.9 Xu (1994)

R-43446 Placetas (campesino Placetas) Enterobacter cloacae subsp. dissolvens 100 Xu (1994)

R-43448 Santa Clara (callejón de los Patos, UCLV) Rhizobium sp. 100 Young et al. (2001)

R40981 Santa Clara (carretera Maleza) Rhizobium etli 99.9 Segovia et al. (1993)

R-43451 Camajuaní (campesino Camajuaní) 1 Rhizobium etli 99.9 Segovia et al. (1993)

R-43450-T2 Manicaragua (campesino Manicaragua) Rhizobium radiobacter 100 Young et al. (2001)

R40980 Cienfuegos (Lajas) Rhizobium pisi 99.9 Ramirez-Bahena et al. (2008)

R40979 Cifuentes UBPC "Unidad Proletaria" Rhizobium pisi 99.9 Ramirez-Bahena et al. (2008)

R-43444 Camajuaní (campesino Camajuaní) 2 Rhizobium pisi 99.9 Ramirez-Bahena et al. (2008)

R40982 Sagua la Grande (Jesús Menéndez) Rhizobium pisi 99.9 Ramirez-Bahena et al. (2008)

R-43440 Cienfuegos (Lajas) Stenotrophomonas rhizophila 99.7 Wolf et al. (2002)

R-43447 Cienfuegos (Lajas) Stenotrophomonas rhizophila 99.7 Wolf et al. (2002)

R-43442-T2 Manicaragua (campesino Manicaragua) Stenotrophomonas rhizophila 100 Wolf et al. (2002)

R-43445-T1 Jibacoa (La Felicidad) Stenotrophomonas rhizophila 99.7 Wolf et al. (2002)

R-43436 Santo Domingo (Manacas) Pseudomonas monteilii 99.9 Elomari et al. (1997)

R-43442-T1 Manicaragua (campesino Manicaragua) Pseudomonas monteilii 99.2 Elomari et al. (1997)

R-43450-T1 Manicaragua (campesino Manicaragua) Pseudomonas monteilii 99.2 Elomari et al. (1997)

R-43453 Placetas (municipio Placetas) Pseudomonas monteilii 99.2 Elomari et al. (1997)



Varios son los estudios en los cuales estas rizobacterias han mostrado el incremento de

los parámetros de crecimiento y rendimiento de las plantas. Según Andrade et al. (1998)

el incremento de la nodulación en Pisum esta relacionado a la inoculación de P.

fluorescens, mediante la cual se incrementa el exudado de flavonoides por la planta

hospedera. En ese sentido Remans et al. (2007), reportan que la inoculación de

Rhizobium etli CNPAF-512 simple y co-inoculado con Pseudomonas putida UW4 en

variedades contrastantes de frijol común en invernadero mostró un incremento

significativo respecto al número de nódulos, masa seca y fijación de N en comparación

con el tratamiento testigo y la aplicación de fertilizantes minerales. Wolf et al. (2002) han

reportado la incidencia de Stenotrophomonas rhizophila como una rizobacteria promotora

del crecimiento, ya que además de reducir las concentraciones de compuestos

cenobióticos en suelos contaminados (Binks et al., 1995), ha sido reportada como

biocontrol a agentes fúngicos en los suelos. Recientemente se ha reportado la utilización

de Enterobacter como promotora del crecimiento vegetal, tanto por la producción de

sustancias de crecimiento (auxinas y giberelinas) como por la capacidad de fijación de N

de estas bacterias.

6.1.3.1 Diversidad de Rhizobium en la región central de Cuba

Aunque se identificaron varios géneros bacterianos en las muestras de nódulos de frijol, la

variabilidad de las especies solo se manifiesta en los aislados pertenecientes al género

Rhizobium. De 8 secuencias reveladas en este género se identifican 4 especies,

demostrando la biodiversidad de este género en la región central del país y en especial en

la provincia de Villa Clara.

Se destacan los resultados obtenidos en los aislamientos procedentes de los muestreos

realizados en Santa Clara (carretera de maleza y callejón de los Patos) y Camajuaní (área

de campesino). En el primer caso aunque el suelo en ambas localidades fue de la misma

clasificación y las condiciones agroclimáticas fueron muy similares, se identificaron 2

especies diferentes: Rhizobium sp. y R. etli respectivamente. Los resultados obtenidos en

Camajuaní demuestran un aspecto aun más complejo y ampliamente discutido por la

comunidad científica internacional, lo que refiere a la diferencia de especies de Rhizobium

provenientes de la misma muestra para el aislamiento. En este muestreo se identificaron

las especies R. etli y R. pisi procedentes de las misma planta colectada, por lo que se

infiere que ambas especies se encontraban co-habitando en el mismo hospedante y por



consiguiente puede especularse sobre la formación de nódulos indistintamente por una

especie u otra en la misma planta.

Estos resultados son el primer reporte para condiciones cubanas de la presencia de R.

pisi, así como la incidencia de más de un simbionte co-habiatndo en los nódulos de la

misma leguminosa. Los mismos pueden dar respuesta a la baja eficiencia en la

nodulación y fijación de N reportada por varios autores en condiciones de campo

(Hernández et al., 2000; Torres-Gutiérrez, 2004; Torres-Gutiérrez 2008), debido que al

existir varias especies de Rhizobium en el mismo nicho de colonización, pueden llevarse a

cabo diferentes procesos de reconocimiento de las señales moleculares que excreta la

bacteria (genes Nod-) por la planta y de este modo realizarse un proceso inespecífico, lo

cual trae como consecuencia la competencia de las especies por la formación de nódulos,

viéndose afectada la fijación de N y la eficiencia de este proceso (Mulder et al., 2005).

El frijol común es una legumbre promiscua en la formación de nódulos por diferentes

especies de rizobios (Broughton et al., 2003). Según Hungría et al. (2000) y Diouf et al.

(2000) en Brasil, Senegal y Gambia pueden encontrarse cepas de R. tropici y R. etli

ocupando nódulos de frijol común. Martínez-Romero et al. (1991) reportan que el frijol

fuera de países de su sitio de origen puede ser infectado por diferentes especies de

Rhizobium.

Aunque es ampliamente conocida la promiscuidad de esta planta, parece existir cierta

preferencia a diferentes especies de Rhizobium (Pacovsky et al., 1984). Se ha

considerado que la baja efectividad de la simbiosis Rhizobium-frijol se debe a la falta de

interacción específica planta-bacteria (Bernal y Graham, 2001). La siembra de frijoles

ecuatorianos y mexicanos se ha usado como trampas para la selección de R. etli en los

suelos, ya que estos pertenecen a los sitios de origen, tanto Andino como

Mesoamericano. La eficiencia de la nodulación y la fijación de N fue mayor cuando se

utilizaron ambos simbiontes de la misma región (Bernal y Graham, 2001). Mientras los

cultivares Andinos son capaces de formar un gran número de nódulos con cepas de R.

tropici (Nodari et al., 1993), cultivares Mesoamericanos con alta capacidad para fijar N

nodulan escasamente con cepas de R. tropici y en estos casos R. tropici bloquea la

nodulación de R. etli cuando ambas cepas están inoculadas de conjunto (Martínez-

Romero et al., 1998).

Este hecho pone en evidencia la necesidad de obtener cepas nativas de los suelos en

diferentes regiones edafoclimáticas, no solo por la importancia que puede revestir este



cultivo, sino además teniendo en cuenta que Cuba se encuentra fuera de los sitios de

origen de esta leguminosa.

Aunque se ha accedido a una amplia gama de conocimientos respecto a la diversidad

genética de los rizobios mediante la implementación de las técnicas moleculares, los

estudios fenotípicos sobre la interacción Rhizobium-leguminosa aun son escasos para

respaldar la aplicabilidad de esta importante fuente de suministro de N a los ecosistemas.

6.2 Efecto de la inoculación de aislados de Rhizobium sobre parámetros morfológicos, fisiológicos y la fijación de N de genotipos de frijol en condiciones controladas.

6.2.1 Influencia de la inoculación de aislados sobre parámetros morfológicos en diferentes etapas de crecimiento

El análisis fenotípico de la inoculación de cepas nativas del género Rhizobium se realizó

en condiciones controladas en los genotipos contrastantes de frijol común BAT-304 e ICA

Pijao. Estas variedades son de amplia diseminación en la región central del país, tanto por

el sector estatal como por los productores privados (MINAGRI, 2010).

Las tablas 6.4 y 6.5 muestran las evaluaciones de la altura y el número de hojas de las

plantas a los 7, 15 y 21 días después de sembrado (DDS) el experimento.

Tabla 6.4 Incidencia de aislados de Rhizobium sobre parámetros morfológicos de la variedad BAT-304 en diferentes etapas de crecimiento.

Tratamientos

7 DDS 15 DDS 21 DDS Altura (cm)

Nº Hojas

Altura (cm)

Nº Hojas

Altura (cm)

Nº Hojas

R. pisi - Cifuentes 3.53 ±0.30* 2 ±0.00 5.00 ±0.39 3.0 ±0.61 5.22 ±0.39 5 ab ±0.24

R. pisi - Cienfuegos 3.72 ±0.26 2 ±0.00 5.33 ±0.33 3.5 ±0.53 5.56 ±0.34 4.2 b ±0.21

R. etli - Santa Clara-Maleza 3.80 ±0.26 2 ±0.00 5.46 ±0.33 3.5 ±0.53 5.65 ±0.34 5.4 a ±0.21

R. pisi Sagua la Grande 3.75 ±0.24 2 ±0.00 5.37 ±0.31 3.0 ±0.50 5.59 ±0.32 5 ab ±0.19

R. etli Camajuaní-1 3.53 ±0.23 2 ±0.00 5.10 ±0.30 2.9 ±0.47 5.29 ±0.30 5 ab ±0.18

R. etli CNPAF-512 4.01 ±0.24 2 ±0.00 5.60 ±0.31 3.7 ±0.50 5.80 ±0.32 5 ab ±0.19

R. pisi Camajuaní-2 3.97 ±0.23 2 ±0.00 5.63 ±0.30 2.9 ±0.47 5.79 ±0.30 5 ab ±0.18

Control 3.35 ±0.26 2 ±0.00 4.59 ±0.33 2.7 ±0.53 4.76 ±0.34 5 ab ±0.21

Letras desiguales en la columnas difieren para p<0.05 por Bonferroni. (*) error estándar.



Tabla 6.5 Incidencia de aislados de Rhizobium sobre parámetros morfológicos de la variedad ICA Pijao en diferentes etapas de crecimiento.

Tratamientos

7 DDS 15 DDS 21 DDS Altura (cm)

Nº Hojas

Altura (cm)

Nº Hojas

Altura (cm)

Nº Hojas

R. pisi-Cifuentes 2.93 ±0.24* 2 ±0.00 4.28 ±0.30 3.20 ±0.45 4.41 ±0.30 4.70 ±0.21

R. pisi-Cienfuegos 3.07 ±0.25 2 ±0.00 4.32 ±0.31 2.67 ±0.48 4.48 ±0.31 4.33 ±0.22

R. etli-Santa Clara-Maleza 3.01 ±0.24 2 ±0.00 4.08 ±0.30 2.90 ±0.45 4.24 ±0.30 5.00 ±0.21

R. pisi-Sagua 3.08 ±0.27 2 ±0.00 4.25 ±0.33 3.88 ±0.51 4.39 ±0.33 5.00 ±0.24

R. pisi-Camajuaní-1 3.04 ±0.27 2 ±0.00 4.19 ±0.33 3.13 ±0.51 4.33 ±0.33 5.00 ±0.24

R. etli-CNPAF-512 4.30 ±0.24 2 ±0.00 4.49 ±0.30 2.60 ±0.45 4.65 ±0.30 4.70 ±0.21

R. pisi-Camajuaní-2 3.25 ±0.27 2 ±0.00 4.56 ±0.33 2.75 ±0.51 4.73 ±0.33 5.00 ±0.24

Control 2.87 ±0.25 2 ±0.00 4.24 ±0.31 3.00 ±0.48 4.46 ±0.31 5.00 ±0.22


En ambos genotipos no existieron diferencias significativas a los 7 y 15 DDS, sin embargo

a los 21 DDS se observó diferencias estadísticas entre los tratamientos respecto al

número de hojas para BAT-304, no siendo así para ICA Pijao. En BAT-304 la inoculación

con la cepa aislada de Santa Clara-Maleza (R. etli) tuvo los mejores resultados

significativos (p<0.05), siendo el único aislado que tuvo diferencias con la cepa

procedente de Cienfuegos-Lajas (R. pisi).

En la tabla 6.6 se observan los valores medios de la altura y el número de hojas de ambos

genotipos evaluados en las diferentes etapas de crecimiento. En este análisis no se

observaron diferencias estadísticas en cuanto al número de hojas por planta en ninguno

de los momentos de evaluación, sin embargo, la altura de las plantas se vio afectada

significativamente para BAT-304 respecto a ICA Pijao en los estadios evaluados.

Tabla 6.6 Diferencia de los genotipos BAT-304 e ICA Pijao respecto a los parámetros morfológicos

Variedades 7 DDS 15 DDS 21 DDS

Altura (cm)

Nº Hojas

Altura (cm)

Nº Hojas Altura (cm)

Nº Hojas

BAT-304 3.70 a ±0.09*

2

0.00 5.26 a

±0.11 3.15 a

±0.18 5.45 a

±0.12 4.95 a

±0.08

ICA Pijao 3.06 b

±0.08 2

0.00 4.30 b

±0.12 3.01 a

±0.17 4.45 b

±0.11 4.84 a

±0.07




Los resultados obtenidos al comparar las variedades se deben a que el genotipo BAT-304

desde el inicio de las evaluaciones fue siempre superior en altura y número de hojas que

para ICA Pijao, es de suponer entonces que esta variedad tuvo una mejor adaptación a

las condiciones controladas, en cuanto a temperatura, humedad relativa y luminosidad.

Estos resultados concuerdan con lo reportado por (Torres-Gutiérrez, 2004), el cual al

analizar la inoculación de Rhizobium y la combinación con rizobacterias en la variedad

ICA Pijao de frijol común, no observó diferencias estadísticas respecto a la altura por

planta en ninguno de los estadios de los tratamientos evaluados; no obstante, los valores

del tratamiento testigo fueron menores al compararlos con la inoculación de rizobacterias

y la fertilización mineral.

La diferencia entre los genotipos respecto a las variables evaluadas, específicamente la

altura de las plantas, puede relacionarse con la predisposición de la variabilidad

genotípica de cada variedad, lo cual es un factor invariable independiente de la

inoculación o no de rizobacterias (Remans et al., 2007). Sin embargo, es ampliamente

conocido el efecto beneficioso de la inoculación de PGPR sobre los cultivos de

leguminosas y en específico la inoculación de cepas de Rhizobium (Burdman et al., 2000).

6.2.2 Efecto de los aislados sobre los parámetros de nodulación

En las figuras 6.2, 6.3, 6.4 y 6.5 se muestran los resultados de los parámetros de

nodulación, referente al número de nódulos totales y el peso fresco y seco de nódulos (g)

por cada genotipo analizado y la comparación entre los genotipos en las diferentes

variables evaluadas. Dichos análisis se realizaron a partir de los 21 días después de la

siembra del experimento.

Todas las cepas aisladas fueron capaces de nodular las raíces de BAT-304 e ICA Pijao

indicando la compatibilidad en la interacción micro y macrosimbionte. En la figura 6.2 se

observan como mejores tratamientos en el genotipo ICA Pijao (figura 6.2-A) la inoculación

de los aislados procedentes de Santa Clara y Sagua respectivamente (R. etli y R. pisi), los

cuales defirieron significativamente con los tratamientos de menores valores en la

modulación, los que correspondieron a la inoculación con R. pisi aislado de Camajuaní-2 y

el tratamiento control. El resto de los tratamientos no tuvieron diferencias significativas con

estos últimos tratamientos.



Para el genotipo BAT-304 (figura 6.2-B) se observaron mayor número de cepas que

lograron estimular la nodulación que para ICA Pijao. En este genotipo la inoculación con

las cepas aisladas de Santa Clara-Maleza (R. etli), Cienfuegos (R. pisi), Camajuaní-1

(R.etli) y la cepa tipo CNPAF- 512 (R. etli) fueron los tratamientos de mejores resultados

estadísticos, al diferir significativamente con el tratamiento sin inoculación de bacterias

(control). Se destaca en este genotipo que la diferencia de nódulos entre los tratamientos

R. etli-Santa Clara-Maleza y el control asciende a 61.7%, lo que evidencia la superioridad

de la cepa en este genotipo.

A B Figura 6.2 Número de nódulos totales por genotipos. A: número de nódulos para ICA Pijao. B: número de nódulos para BAT-304. Tratamientos: R. pisi-Cifuentes, R. pisi- Cienfuegos, R. etli-Santa Clara-Maleza, R. pisi-Sagua, R. etli-Camajuaní-1, R. etli-cepa tipo CNPAF512, R. pisi-Camajuaní-2, Control. Letras desiguales en las columnas difieren para p<0.05 por Bonferroni Sorprendentemente en las plantas pertenecientes al tratamiento control se observaron

nódulos en las raíces, este fenómeno pudo estar originado a que la zeolita utilizada no se

esterilizó, por lo que pudo estar contaminada con bacterias pertenecientes al género

Rhizobium, desencadenándose de este modo el proceso simbiótico al sembrar esta

leguminosa. En ambos genotipos estas cepas procedentes de la zeolita formaron una

adecuada cantidad de nódulos, sin embargo, fueron los tratamientos de menores valores

estadísticos en ambos genotipos.

En los resultados mostrados en nuestra investigación se destaca la elevada formación de

nódulos en ambos genotipos, aunque se obtiene la mayor afectación en BAT-304

comparado con ICA-Pijao. En la figura 6.3 se muestra la comparación entre los genotipos



evaluados respecto al número de nódulos totales. Mediante la inoculación con R. etli

procedente de Cifuentes se observa como ICA Pijao presenta mayor cantidad de nódulos

que BAT-304, sin embargo, no existieron diferencias significativas entre ambos genotipos.

Resultados similares se evidencian en el tratamiento control. En el resto de las

evaluaciones se muestra como el genotipo BAT-304 supera a ICA Pijao en la formación

de nódulos, sin embargo, solamente se aprecian diferencias estadísticas en los

tratamientos de los aislados procedentes de camajuaní-1 (R.etli) y Camajuaní-2 (R.pisi),

además de la cepa tipo CNPAF-512 (R. etli).

Figura 6.3 Variabilidad genotípica respecto a la formación de nódulos totales. Tratamientos: R. pisi-Cifuentes, R. pisi- Cienfuegos, R. etli-Santa Clara-Maleza, R. pisi-Sagua, R. etli-Camajuaní-1, R. etli-cepa tipo CNPAF512, R. pisi-Camajuaní-2, Control. Letras desiguales en las columnas difieren para p<0.05.

Es evidente el efecto estimulatorio de las especies R. etli en el incremento de la

nodulación, en especial para la variedad BAT-304, ya que con la inoculación de aislados

de esta especie se obtuvieron los mejores resultados independientemente de la

procedencia de la cepa inoculada, lo cual demuestra que existe una predisposición

positiva para la formación de nódulos en esta especie en comparación con R. pisi. No

obstante, en la diferencia de genotipos se destaca que los aislados de Camajuaní 1-2 (R.

etli y R. pisi) obtuvieron los mismos valores estadísticos. Estos resultados corroboran lo

reportado por Martínez-Romero et al., (1998) al señalar que las cepas de R. etli son

abundantes en los suelos de las regiones mesoamericanas, así como de formar una gran

cantidad de nódulos en estas condiciones en dependencia de las condiciones

edafoclimáticas favorables y sin presencia de cepas nativas del género Rhizobium.



Como se ha mencionado, una mayor cantidad de nódulos en la planta le posibilita a esta

una mayor asimilación de N2 atmosférico. La habilidad de las cepas para formar nódulos

no necesariamente indica la eficiencia en la FBN. Para cada combinación leguminosa-

rizobios el nivel óptimo de nodulación es diferente. No obstante, los parámetros de

abundancia, tamaño, distribución y coloración interna de los nódulos son importantes

indicadores de su efectiva habilidad para fijar nitrógeno atmosférico (Silvester et al., 1987).

De esta manera, no todas las cepas de Rhizobium son efectivas en la fijación de

nitrógeno, a pesar de que la infectividad sea alta (Mumns, 1987, Torres-Gutiérrez, 2008).

En la figura 6.4 se muestran los resultados para el peso fresco y seco de los nódulos

(PFN y PSN) tanto para ICA Pijao como BAT-304. Este último parámetro de gran

importancia ya que sirve como indicador para estimar las tasas de fijación de N2

atmosférico en el cultivo de leguminosas en condiciones de bajos insumos (Urquiaga y

Zapata, 2000).

A B

Figura 6.4 Análisis del peso fresco y seco de los nódulos por genotipos. A: peso fresco y seco (g) para ICA Pijao. B: peso fresco y seco (g) para BAT-304. Tratamientos: R. pisi-Cifuentes, R. pisi- Cienfuegos, R. etli-Santa Clara-Maleza, R. pisi-Sagua, R. etli-Camajuaní-1, R. etli-cepa tipo CNPAF512, R. pisi-Camajuaní-2, Control. Letras desiguales en las columnas difieren para p<0.05 por Bonferroni

Para el genotipo ICA Pijao (figura 6.4-A) no se observan grandes diferencias entre los

tratamientos, obteniéndose el de mejores resultados para el peso fresco de los nódulos

aquel donde se aplicó la cepa aislada de Cifuentes (R. pisi), mientras que para el peso

seco de los nódulos la inoculación del aislado procedente de Sagua tuvo los mejores

valores significativos. En ambas variables evaluadas la inoculación con la cepa R. pisi de



Camajuaní-2 y el control obtuvieron los valores más bajos estadísticamente,

comportándose de la misma forma que para la nodulación total. Para BAT-304 (figura

6.4-B) los valores también se comportaron muy relativos a los analizados en el número

de nódulos totales. El peso fresco de nodulos estuvo estimulado con la inoculación de las

cepas R. pisi-Cienfuegos y R. etli Camajuaní-1 y se observa que ambas difieren

estadísticamente con el tratamiento control, el cual obtuvo el menor valor estadístico. La

biomasa seca nodular en este genotipo demostró una correlación positiva con la

nodulación, ya que el único aislado que tuvo diferencias significativas con el control fue el

procedente de Camajuaní-1 (R. etli). Aunque los aislados R. etli-Santa Clara-Maleza y R.

etli CNPAF-512 no tuvieron diferencias con el tratamiento control, se observa una

tendencia al incremento de la biomasa seca nodular de 56.7 y 55% respectivamente con

ese tratamiento.

La diferencia entre los genotipos en cuanto a la biomasa nodular se aprecia en la figura

6.5, donde se observa mayor variabilidad entre las condiciones evaluadas.

Figura 6.5 Variabilidad genotípica respecto a la biomasa nodular. Tratamientos: R. pisi-Cifuentes, R. pisi- Cienfuegos, R. etli-Santa Clara-Maleza, R. pisi-Sagua, R. etli-Camajuaní-1, R. etli-cepa tipo CNPAF512, R. pisi-Camajuaní-2, Control. Letras desiguales en las columnas difieren para p<0.05.

Al igual que para la nodulación, los tratamientos de inoculación con R. etli-Cifuentes y el

control, el genotipo ICA Pijao tuvo un mayor efecto, aunque sin diferencias significativas.

Del mismo modo en los tratamientos R. etli-Santa Clara-Maleza, R. pisi-Sagua y R. etli

CNPAF-512, el genotipo ICA Pijao tuvo incrementos en el peso seco de los nódulos, sin



embargo de todos estos R. pisi-Sagua fue el único con diferencias significativas. De todos

los tratamientos la mayor diferencia entre los genotipos se obtuvo mediante la inoculación

de R. etli Camajuaní-1 el cual tuvo una marcada diferencia significativa para BAT-304

respecto a ICA Pijao.

Mora, (1995) reporta que con la utilización de cepas nativas de Rhizobium para la variable

peso seco de nódulos la mayor respuesta se obtiene con la inoculación de Rhizobium CR-

455, CR-487, CR-BSA y CR-492, estas cepas aisladas mostraron diferencias significativas

con respecto a otros tratamientos. El testigo absoluto presentó el menor peso seco de

nódulos, la formación de nódulos en este tratamiento así como en el testigo +N, se debió,

posiblemente, a que en el suelo se encontraban rizobios viables capaces de infectar las

raíces, a pesar de que fue tratado con calor para disminuir al mínimo la población de

cepas nativas. Esto corrobora a los resultados obtenidos en nuestra investigación donde

el control también presentó nodulación en los dos genotipos estudiados, pero en ambos

casos la nodulación y el peso de los nódulos es en todos los casos más bajos que en

cualquiera de los tratamientos evaluados. En investigaciones similares (Torres-Gutiérrez,

2008) reporta que el tratamiento control también se vio afectado por nodulación en las

raíces de frijol tanto en la variedad ICA Pijao como BAT-304, además dicho tratamiento no

mostró diferencia estadística con los otros métodos evaluados.

Estos resultados obtenidos con estas cepas promisorias, con especial énfasis en aquellas

asiladas de Camajuaní-1 (R.etli), Santa Clara-Maleza (R. etli) y Cienfuegos (R. pisi),

además de la cepa tipo CNPAF-512 (R.etli), puede estar asociado a la estimulación de

una temprana nodulación, mediado por una señalización mutua entre las raíces de la

planta (flavonoides) y las bacterias (síntesis de “polisacáridos”) factores Nod. Las señales

de la leguminosa activan la producción de factores Nod rizobial, lo cual a su vez le dan

una señal a la planta (Mulder et al., 2005). La variación en la cantidad y las estructuras de

factores Nod producida por una especie rizobial es un factor clave que determina el rango

de su hospedero (Perret et al., 2000).

6.2.3 Determinación de la biomasa en genotipos de frijol común

La figura 6.6 muestra los parámetros de la biomasa estudiados tanto para ICA Pijao y

BAT-304. En cada cuadro de la figura se observa el peso fresco o seco del follaje y la raíz

para ICA Pijao (A, C) y BAT-304 (B, D).



A B

C D

Figura 6.6 Análisis de parámetros fisiológicos en los genotipos estudiados. A: peso fresco del follaje y la raíz ICA Pijao, B: peso fresco del follaje y la raíz BAT-304, C: peso seco del follaje y la raíz ICA Pijao, D: peso seco del follaje y la raíz BAT-304. Tratamientos: R. pisi-Cifuentes, R. pisi-Cienfuegos, R. etli-Santa Clara-Maleza, R. pisi-Sagua, R. etli-Camajuaní-1, R. etli-cepa tipo CNPAF512, R. pisi-Camajuaní-2, Control. Letras desiguales en las columnas difieren para p<0.05 por Bonferroni

El análisis del peso fresco en ambos genotipos estudiados demuestra como existe

diferencias significativas en los tratamientos para esta variable evaluada, tanto para el

follaje como para la raíz. En ICA Pijao (figura 6.6-A) se aprecia que con excepción de la

inoculación de R. pisi-Camajuaní-2, ninguna de las rizobacterias inoculadas difirieron

estadísticamente entre ellas para el peso fresco del follaje. Los menores valores

estadístico se obtuvieron con el tratamiento control y la cepa aislada de Camajuaní-2,



aunque la cepa tipo CNPAF no tuvo diferencias con estos dos tratamientos. En el peso

fresco de la raíz la inoculación con R. etli-Santa Clara-Maleza fue el mejor tratamiento al

obtener diferencias estadísticas con la inoculación de los aislados de Cienfuegos,

Camajuaní-2, la cepa tipo CNPAF-512 y el tratamiento control. Los resultados para BAT-

304 (figura 6.6-B) respecto a estas variables evaluadas se comportan con mayor

variabilidad por cada uno de los tratamientos. En peso fresco del follaje la inoculación con

la cepa tipo CNPAF fue el mejor tratamiento, teniendo diferencias significativas con R.

pisi-Cienfuegos y el control sin inoculación, mientras que para el peso fresco de la raíz

vuelve a sobresalir el tratamiento donde se inoculó la cepa R. etli-Camajuaní-1, la cual

difirió estadísticamente con todos los demás tratamientos analizados. Para el peso seco

del follaje como de la raíz para ambos genotipos (figura 6.6-C, D) no existieron diferencias

significativas entre las condiciones analizadas, sin embargo se observa la tendencia al

incremento en estas variables en los tratamientos: R. etli-Santa Clara-Maleza, R. etli-

Camajuaní-1, R. etli-CNPAF-512 y R. pisi-Cifuentes.

De forma general se observa que existe mayor variabilidad para los parámetros

fisiológicos de la raíz que para el follaje en ambos genotipos. Estas variables se ven más

afectadas positivamente mediante la inoculación con aquellas bacterias que ejercen un

marcado efecto sobre los parámetros de nodulación, lo cual puede estar relacionado con

los mecanismos directos que realizan las sustancias excretadas por estas bacterias sobre

el sistema radical y de modo indirecto sobre el follaje de las plantas, además del

incremento de las tasas de N fijado al follaje como resultado de la eficiencia de la

interacción.

Según Dobbelaere et al., (2003) estas bacterias son capaces de excretar al medio donde

se desarrollan abundantes cantidades de sustancias que son conocidas como

estimuladoras del crecimiento vegetal, tales como auxinas, las cuales intervienen en la

arquitectura radical y de este modo se facilita la invasión, colonización y la nodulación en

interacciones eficientes. Recientemente Remans et al. (2008), reportaron diferentes QTLs

(quantitative trait loccus) que ejercen un marcado efecto sobre la producción de auxinas

en frijol común inoculado con la cepa R. etli CNPAF-512. Estos reportes se encuentran

estrechamente relacionados con la estimulación de la producción de auxinas y la

nodulación en frijol común (Remans et al., 2008, Torres-Gutierrez, 2008).

Arcocha et al., (1994) en estudios realizados sobre la inoculación de cepas de Rhizobium

contra fertilización química en frijol ejotero, demostraron que al evaluar 7 cepas



experimentales de biofertilizantes Mexicanos y una comercial (Nitrobiol), obtuvieron una

respuesta positiva con el uso de este biofertilizante. Las variables medidas fueron:

rendimiento de frijoles, peso de nódulos, número de nódulos, peso del follaje y peso de la

raíz. Los rendimientos obtenidos con la cepa más sobresaliente (FM 110 + P) fueron

similares a los obtenidos con el tratamiento de fertilizante químico (60-40-00). Sin

embargo las utilidades fueron ligeramente mayores con las cepas de Rhizobium.

Resultados similares se reportan por Torres-Gutiérrez y Francisco (1999) al evaluar los

parámetros fisiológicos en el cultivo del frijol, donde no observan diferencias significativas

en cuanto al peso fresco y seco del follaje en los tratamientos de inoculación combinada y

la inoculación con Rhizobium en solitario.

6.2.4 Análisis de la fijación de N y correlaciones

La fijación de N se determinó mediante el método Kjeldahl, el cual evalúa el % de N total

en la planta. Esta variable es de significativa importancia al estudiar el efecto de diferentes

cepas de Rhizobium sobre cultivos de leguminosas. En este sentido se aprecian los

resultados obtenidos en los tratamientos evaluados en ambas variedades en la figura 6.7.

A B

Figura 6.7 Fijación de N por tratamiento en los genotipos evaluados. A: % de N para ICA Pijao, B: % de N para BAT-304. Tratamientos: R. pisi-Cifuentes, R. pisi-Cienfuegos, R. etli-Santa Clara-Maleza, R. pisi-Sagua, R. etli-Camajuaní-1, R. etli-cepa tipo CNPAF512, R. pisi-Camajuaní-2, Control. Letras desiguales en las columnas difieren para p<0.05 por Duncana.

Con relación a ICA Pijao como se muestra en la figura 6.7-A, los mejores resultados se

obtienen con el aislado procedente de R. pisi-Sagua, este último conjuntamente con la



inoculación del aislado de R. pisi Cienfuegos tuvieron un incremento de 30.3 y 26.7%

respectivamente respecto al tratamiento control en cuanto a la tasa de fijación de N y por

ende el contenido de proteína bruta (P.B).

En el genotipo BAT-304 (figura 6.7-B), se observa como el tratamiento R. pisi Camajuaní-

2, R. etli-Santa Clara-Maleza y R. etli-Camajuaní-1 obtuvieron los mejores resultados en

los niveles de fijación de N, teniendo un incremento de 41.8, 37.6 y 35.1%

respectivamente frente al control. Los resultados obtenidos en estos últimos tratamientos

demuestran una estrecha relación entre todos los parámetros evaluados, los cuales para

ambos genotipos estimularon desde el análisis morfológico, hasta la nodulación,

parámetros fisiológicos y la fijación de N, en especial para BAT-304. Al comparar los

resultados mostrados en las figuras 6.4 y 6.7 se corroboran estos reportes, ya que se

observa como las mejores cepas en la nodulación y masa seca nodular correlacionan con

las mejores cepas en la fijación de N. Además de la relación que se puede establecer

entre ambas figuras, en la tabla 6.7 se muestran las correlaciones estadísticas realizadas

mediante el coeficiente de correlación de Pearson.

Las diferencias en la eficiencia de la FSN entre cepas de Rhizobium son consecuencia al

menos de dos causas: i) estabilidad en el material genético involucrado en la fijación, el

cual está sometido a frecuentes pérdidas por reordenamiento del mismo (Martínez et al.,

1988) y ii) relación entre la capacidad para formar masa seca nodular, fijar N y transferir

este a la parte aérea de las plantas (Dobereigner, 1988). Teniendo en cuenta estos

aspectos se puede atribuir que la cepa R. pisi Camajuaní-2 para el genotipo BAT-304 es

un caso típico de estabilidad en los genes nif involucrados en la fijación de N, aunque

formó relativamente menos masa seca nodular (figura 6.4) que la cepa aislada de

Camajuaní-1, fue capaz de fijar y transformar adecuadas tasas de N.

En trabajos similares realizados por (Gómez et al., 1998), se reportan que entre cinco

genotipos de frijol común cultivados en solución nutritiva e inoculados con tres cepas de

Rhizobium diferentes, el genotipo Carioca y la cepa CF1 fueron los mayores productores

de masa seca nodular independientemente de con quien establecieron la simbiosis; por el

contrario el genotipo G 14665 y la cepas CIAT 899 fueron los mayores fijadores de N, el

primero por aceptable combinación entre masa seca nodular y eficiencia en la fijación y la

cepa CF1 por mostrarse 2,4 veces más eficiente en el proceso (mg nitrógeno fijado/g

masa seca nodular) que el resto, mostrando que los valores de masa seca nodular no son

concluyentes cuando se seleccionan genotipos y cepas con alta capacidad para fijar N.



En la tabla 5 se muestra los valores obtenidos mediante análisis de correlación de

Pearson p<0,05 entre las diferentes variables evaluadas tanto para los parámetros de

fijación y parámetros fisiológicos bajo condiciones controladas esto con respecto para

cada variedad estudiada.

Tabla 6.7 Correlación para parámetros de nodulación y parámetros fisiológicos en los genotipos evaluados BAT-304 Correlaciones NN PFN PSN PFR PSR PFF PSF

NN Pearson Corr. 0,5424 0,5201 0,4896 0,2034 0,4628 0,3415 Valor- P 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0001 0,0044PFN Pearson Corr. 0,5424 0,5645 0,6303 0,2450 0,3241 0,2789 Valor- P 0,0000 0,0000 0,0000 0,0440 0,0070 0,0213PSN Pearson Corr. 0,5201 0,5645 0,4150 0,1984 0,4158 0,3419 Valor- P 0,0000 0,0000 0,0004 0,1048 0,0004 0,0043PFR Pearson Corr. 0,4896 0,6303 0,4150 0,3706 0,4861 0,1997 Valor- P 0,0000 0,0000 0,0004 0,0019 0,0000 0,1025PSR Pearson Corr. 0,2034 0,2450 0,1984 0,3706 0,5212 0,1773 Valor- P 0,0000 0,0440 0,1048 0,0019 0,0000 0,1480PFF Pearson Corr. 0,4628 0,3241 0,4158 0,4861 0,5212 0,5820 Valor- P 0,0001 0,0070 0,0004 0,0000 0,0000 0,0000PSF Pearson Corr. 0,3415 0,2789 0,3419 0,1997 0,1773 0,5820 Valor- P 0,0044 0,0213 0,0043 0,1025 0,1480 0,0000 ICA Pijao Correlaciones NN PFN PSN PFR PSR PFF PSF

NN Pearson Corr. 0,6802 0,4983 0,2378 -0,0158 0,4213 0,1909 Valor- P 0,0000 0,0000 0,0442 0,8951 0,0002 0,1082PFN Pearson Corr. 0,6802 0,7748 0,3138 0,1647 0,4302 0,0823 Valor- P 0,0000 0,0000 0,0073 0,1669 0,0002 0,4917PSN Pearson Corr. 0,4983 0,7748 0,1675 0,1097 0,2033 0,1118 Valor- P 0,0000 0,0000 0,1597 0,3590 0,0867 0,3500PFR Pearson Corr. 0,2378 0,3138 0,1675 0,6342 0,5016 0,2810 Valor- P 0,0442 0,0073 0,1597 0,0000 0,0000 0,0168PSR Pearson Corr. -0,0158 0,1647 0,1097 0,6342 0,3079 0,2204 Valor- P 0,8951 0,1669 0,3590 0,0000 0,0085 0,0629PFF Pearson Corr. 0,4213 0,4302 0,2033 0,5016 0,3079 0,4776 Valor- P 0,0002 0,0002 0,0867 0,0000 0,0085 0,0000PSF Pearson Corr. 0,1909 0,0823 0,1118 0,2810 0,2204 0,4776 Valor- P 0,1082 0,4917 0,3500 0,0168 0,0629 0,0000

NN: Número de nódulos, PFN: peso fresco de nódulos, PSN: peso de nódulos, PFR: peso fresco de la raíz, PSR: peso seco de la raíz, PFF: peso fresco del follaje, PSF: peso seco del follaje.



Para BAT-304 se observa correlaciones significativas entre todas las variables evaluadas,

siendo las más importantes en nuestro estudio el número de nódulos totales, peso seco

de nódulos, y peso seco del follaje quienes correlacionan positivamente entre si, entre

NN y el peso seco de los mismos 52% y entre el número de nódulos totales y PSF un

34%. Inverso a esto sucede para ICA Pijao donde no todas las variables evaluadas

tienden a correlacionar positivamente entre si, tal es el caso entre peso seco de la raíz

con el numero de nódulos, donde la misma es negativa. Los valores mas significativos

para esta variedad se presentan entre PSN-PFN con un 77%, seguido por PFN-NN con

68%, y PSR-PFR con un 63%, el resto de los valores siendo menos significativos. A pesar

que esto valores son significativos para estas variables, los valores en los parámetros de

fijación son menos significativos al compararlos con BAT-304 donde los mismos se

presentan mejor en esta variedad que los reportados en ICA Pijao, esto nos da la pauta

que al existir un mayor número de nódulos totales existirá mayor materia nodular y por

consiguiente el incremento de la fijación de N2, dando como resultado el aumento en la

materia seca de la parte aérea y radicular de las plantas, esto al corroborar la correlación

positiva entre el peso seco de los nódulos y el peso seco del follaje, así como el peso

fresco de raíz y peso fresco de nódulos, lo que no sucede para ICA Pijao. Frente a esto

podemos concluir diciendo que la inoculación de aislados de Rhizobium afecto

positivamente en el crecimiento, desarrollo y fijación de N2 en las dos variedades de frijol,

pero sobre todo en BAT-304.

________________________________________________________________Conclusiones


7 CONCLUSIONES

Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en nuestro trabajo podemos arribar a las

siguientes conclusiones.

• La caracterización morfológica de los aislados obtenidos demostró una alta

diversidad de cepas que pertenecen morfológicamente al género Rhizobium en la

zona central de Cuba.

• Mediante la implementación de las técnicas moleculares se identifican géneros

bacterianos comúnmente conocidos como PGPR, dentro de los cuales se encuentran:

Enterobacter, Pseudomonas y Stenotrophomonas, sugiriendo que estas bacterias son

altamente persistentes en la corteza o el interior de los nódulos en las raíces de

plantas de frijol común.

• Se identifica una alta variabilidad en las especies de Rhizobium en la zona central del

Cuba, determinándose 4 especies de este género en 8 secuencias alineadas, dentro

de las cuales se encuentran R. etli, R. pisi, R. radiobacter y R. sp. Estos resultados

brindan una valiosa herramienta para los estudios de biodiversidad microbiana y

determinar las mejores especies de Rhizobium para la realización de inoculantes en

diferentes localidades de la región central del país.

• Se reporta por primera vez en Cuba la presencia de R. pisi en nódulos de frijol

común, así como el cohabita de especies de Rhizobium (R. etli- Camajuaní-1 y R.

pisi-Camajuaní-2) procedentes de nódulos de la misma planta leguminosa en el

muestreo realizado en el municipio de Camajuaní, lo cual pudiera explicar la escasa

respuesta a la nodulación y fijación de N observada en ensayos realizados en

condiciones de campo.

• Las cepas aisladas no afectan los parámetros morfológicos de altura y número de

hojas a los 7 y 15 días después de sembrado el experimento para ninguno de los

genotipos evaluados, sin embargo, a los 21 días el aislado R. etli-Santa Clara-Maleza,

logró incrementar el número de hojas para BAT-304, no siendo así para ICA Pijao.

• Todas las cepas aisladas son capaces de formar nódulos en las raíces de los

genotipos ICA Pijao y BAT-304. En los parámetros de nodulación se destacan las

cepas R. etli-Santa Clara-Maleza y R. pisi-Sagua para ICA Pijao, mientras que para

________________________________________________________________Conclusiones


BAT-304 los mejores aislados fueron R. etli-Santa Clara-Maleza, R. etli-Camajuaní-1,

R. etli-CNPAF-512 y R. pisi-Cienfuegos.

• Los parámetros fisiológicos se ven afectados con la inoculación de diazótrofos en el

peso fresco de la raíz y el follaje, no siendo así en el peso seco de estas variables. El

peso fresco del follaje tuvo un comportamiento más estable para ambos genotipos en

comparación con el peso fresco de la raíz, el cual tuvo mayor variación, siendo los

aislados procedentes de Santa Clara-Maleza (R. etli) y Camajuaní-1 (R. etli) los de

mejores resultados para ICA Pijao y BAT-304 respectivamente.

• La variabilidad genotípica en todos los parámetros evaluados se vio afectada

positivamente para BAT-304, no siendo así para ICA Pijao. Los mejores resultados

globales se establecen por combinaciones cepas-genotipo (R.pisi-Sagua-ICA Pijao,

R. pisi-Cifuentes-ICA Pijao, R. etli-Santa Clara-Maleza-BAT-304, R. etli-Camajuaní-1-

BAT-304 y R. pisi-Camajuaní-2-BAT-304), por lo que puede inferirse que para el

genotipo ICA Pijao los aislados identificados como R. pisi tuvieron los mejores

resultados estadísticos, mientras que para BAT-304 fueron aquellos identificados

como R. etli.

_____________________________________________________________Recomendaciones


8 RECOMENDACIONES

Se recomienda:

• Continuar los aislamientos y la identificación genética de cepas nativas del género

Rhizobium en diferentes regiones del país.

• Realizar investigaciones básicas para determinar el efecto de las sustancias

estimuladoras del crecimiento vegetal, específicamente auxinas, producidas por

aislados cubanos sobre los parámetros de nodulación y la fijación de N de genotipos

comerciales y locales de frijol común.

• Recomendar a entidades del Ministerio de la Agricultura, así como a productores

privados la utilización de las mejores combinaciones cepas-genotipos por localidades:

R. pisi-ICA Pijao – para Sagua la Grande.

R. pisi-ICA Pijao – para Cifuentes.

R. etli-BAT-304 – para Santa Clara.

R. etli-BAT-304 – para Camajuaní.

R. pisi-BAT-304 – para Camajuaní.

_________________________________________________________________Bibliografía

Caracterización e identificación de aislados de Rhizobium: comportamiento en genotipos de frijol

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