coico | imunologia - 6.ª ed

IMUNOLOGIASEXTA EDIÇÃO

Richard CoicoProfessor of Microbiology and Immunology

Temple University School of Medicine

Geoffrey SunshineSenior Scientist, Health Effects Institute,

and Lecturer, Tufts University School of Medicine

Traduzido por

Eiler Fritsch TorosDoutora em Microbiologia e Imunologia pelo Instituto deMicrobiologia da Universidade Federal do Rio de Janeiro

ARTE CAD. ZERO COICO 6/15/10, 2:24 PM3

Coico | Imunologia - 6a edição. Amostras de páginas não sequenciais.

Ícones usados neste livro

neutrófilo mastócito macrófago célula citocidanatural (NK)

eosinófilo basófilo eritrócito

célulaT

célulaT ativada

célulaB

plasmócito anticorpo céluladendrítica

célulaapresentadora deantígeno (APC)

célulamorta

receptorde célula T

receptorde célula T membrana celular

CD45

MHC declasse II

peptídioCD4

peptídio

MHC declasse I

CD8CD28

B7(CD80/CD86)

CD154citocina

CD40receptorde citocina

Tirosina quinaseZAP 70/Syk

Tirosina quinaseda família Src

Tirosina quinasede proteínacitoplasmática Proteína G

vírus

Componentes docomplemento DNA RNA proteína

complexo C1bactéria

anticorporeceptor

de Fccélula complexo de ataque à membrana

proteína peptídiosprocessados

produção de anticorpo



Os autores deste livro e a EDITORA GUANABARA KOOGAN LTDA. empenharam seus melhores esforçospara assegurar que as informações e os procedimentos apresentados no texto estejam em acordo com ospadrões aceitos à época da publicação, e todos os dados foram atualizados pelos autores até a data daentrega dos originais à editora. Entretanto, tendo em conta a evolução das ciências da saúde, asmudanças regulamentares governamentais e o constante fluxo de novas informações sobre terapêuticamedicamentosa e reações adversas a fármacos, recomendamos enfaticamente que os leitores consultemsempre outras fontes fidedignas, de modo a se certificarem de que as informações contidas neste livroestão corretas e de que não houve alterações nas dosagens recomendadas ou na legislaçãoregulamentadora.

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IMMUNOLOGY: A SHORT COURSE, SIXTH EDITIONCopyright © 2009 by John Wiley & Sons, Inc.All Rights Reserved. This translation published under license.

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Editoração Eletrônica: Nova Estrutura

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Coico, RichardImunologia / Richard Coico, Geoffrey Sunshine; tradução Eiler Fritsch Toros. –Rio de Janeiro : Guanabara Koogan, 2010.il.

Tradução de: Immunology: a short course, 6th ed.ApêndiceInclui bibliografiaISBN 978-85-277-1663-5

1. Imunologia. I. Sunshine, Geoffrey. II. Título.

10-1432. CDD: 616.079CDU: 612.017

05.04.10 12.04.10 018401



Material Suplementar

Este livro conta com o seguinte material suplementar:

Ilustrações da obra em formato de apresentação (restrito a docentes)JJ

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LAB e Forense Universitária.

genio21x28.indd 2 16/07/2010 15:32:05


CONTEÚDO RESUMIDO

VISÃO GERAL DO SISTEMA IMUNOLÓGICO, 1

ELEMENTOS DA IMUNIDADE NATURAL EADQUIRIDA, 11

IMUNÓGENOS E ANTÍGENOS, 29

ESTRUTURA E FUNÇÃO DOS ANTICORPOS, 41

INTERAÇÕES ANTÍGENO-ANTICORPO,TESTES IMUNOLÓGICOS E SISTEMASEXPERIMENTAIS, 61

BASE GENÉTICA DA ESTRUTURADO ANTICORPO, 81

BIOLOGIA DO LINFÓCITO B, 93

PAPEL DO COMPLEXO PRINCIPAL DEHISTOCOMPATIBILIDADE NA RESPOSTAIMUNOLÓGICA, 107

BIOLOGIA DO LINFÓCITO T, 125

ATIVAÇÃO E FUNÇÃODAS CÉLULAS T E B, 141

CITOCINAS, 165

TOLERÂNCIA E AUTOIMUNIDADE, 183

COMPLEMENTO, 205

HIPERSENSIBILIDADE: TIPO I, 221

HIPERSENSIBILIDADE: TIPOS II E III, 237

HIPERSENSIBILIDADE: TIPO IV, 247

DISTÚRBIOS POR IMUNODEFICIÊNCIAE NEOPLASIAS DO SISTEMA LINFOIDE, 255

TRANSPLANTE, 285

IMUNOLOGIA DO TUMOR, 299

RESISTÊNCIA E IMUNIZAÇÃO CONTRADOENÇAS INFECCIOSAS, 313

6

5

4

3

2

1

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20

ix



CONTEÚDO

1 VISÃO GERAL DO SISTEMA IMUNOLÓGICO, 1

Introdução, 1

Imunidade Natural e Adquirida, 2

Imunidade Natural, 2

Imunidade Adquirida, 3

Imunização Ativa, Passiva e Adotiva, 3

Teoria da Seleção Clonal, 4

Imunidade Humoral e Celular, 6

Imunidade Mediada por Células, 7

Geração da Diversidade da Resposta Imunológica, 8

Benefícios da Imunologia, 8

Efeitos Lesivos da Resposta Imunológica, 9

O Futuro da Imunologia, 9Inicia-se Aqui um Curso de Pequena Duração, 10

Referências, 10

2 ELEMENTOS DA IMUNIDADE NATURALE ADQUIRIDA, 11Introdução, 11

Imunidade Natural, 11

Barreiras Físicas e Químicas da Imunidade Natural, 11

Destruição Intracelular e Extracelular dosMicrorganismos, 12

Células Envolvidas no Sistema Imunológico Natural, 14

Inflamação, 16

Febre, 17

Substâncias Biologicamente Ativas, 18

Receptores Envolvidos no Sistema Imunológico Natural, 18

Receptores de Reconhecimento de Padrões, 18

Imunidade Adquirida, 19

Células e Órgãos Envolvidos na Imunidade Adquirida, 20

Órgãos Linfáticos, 20

Migração e Recirculação de Linfócitos, 23

Destino do Antígeno Após Penetração, 24

Frequência de Linfócitos Antígeno-específicos“Inocentes”, 25

Inter-relação Entre Imunidade Natural e Adquirida, 25

Resumo, 26

Referências, 26

Questões de Revisão, 26

Respostas às Questões de Revisão, 27

3 IMUNÓGENOS E ANTÍGENOS, 29

Introdução, 29

Exigências para a Imunogenicidade, 29Estranheza, 29Alto Peso Molecular, 30Complexidade Química, 30

Degradabilidade, 30Haptenos, 30Exigências Adicionais para a Imunogenicidade, 31

Respostas Imunológicas Primária e Secundária, 32Antigenicidade e Sítio de Ligação ao Antígeno, 32Epítopos Reconhecidos pelas Células B e T, 33

Principais Classes de Antígenos, 34Ligação de Antígeno a Anticorpos Antígeno-específicos ou

a Receptores de Células T, 35

Reatividade Cruzada, 35Adjuvantes, 36Resumo, 37

Referências, 38Questões de Revisão, 38Respostas às Questões de Revisão, 39

4 ESTRUTURA E FUNÇÃO DOS ANTICORPOS, 41

Introdução, 41Isolamento e Caracterização das Imunoglobulinas, 42Estrutura das Cadeias Leves e Pesadas, 42

Domínios das Imunoglobulinas, 44Região da Dobradiça das Imunoglobulinas, 45Região Variável das Imunoglobulinas, 45Variantes das Imunoglobulinas, 47

xi



Isotipos, 47

Alótipos, 47

Idiotipos, 47

Características Estruturais da IgG, 49

Propriedades Biológicas da IgG, 49

Aglutinação e Formação de Precipitados, 50

Passagem da Ig Através da Placenta e Absorção pelosNeonatos, 51

Opsonização, 51

Citotoxicidade Mediada por Célula Anticorpo-dependente, 52

Ativação do Complemento, 52

Neutralização de Toxinas, 52

Imobilização de Bactérias, 52

Neutralização de Vírus, 52

Características Estruturais da IgM, 53

Propriedades Biológicas da IgM, 53

Fixação do Complemento, 53

Primeira Linha da Defesa Humoral, 53

Aglutinação, 54

Iso-hemaglutininas, 54

Propriedades Estruturais e Biológicas da IgA, 54

Propriedades Biológicas da IgA, 54

Papel nas Infecções Mucosas, 54

Atividade Bactericida, 55

Atividade Antiviral, 55

Propriedades Estruturais e Biológicas da IgD, 55

Propriedades Estruturais e Biológicas da IgE, 55

Importância da IgE nas Infecções Parasitárias e nasReações de Hipersensibilidade, 56

Cinética das Respostas de Anticorpo Após Imunização, 56

Resposta Primária, 56

Resposta Secundária, 56

A Superfamília das Imunoglobulinas, 57

Resumo, 58

Referências, 58



5 INTERAÇÕES ANTÍGENO-ANTICORPO, TESTES

IMUNOLÓGICOS E SISTEMAS EXPERIMENTAIS, 61Introdução, 61

Interações Antígeno-anticorpo, 61

Interações Primárias Entre Anticorpo e Antígeno, 62

Constante de Associação, 63

Afinidade e Avidez, 63

Interações Secundárias Entre Anticorpo e Antígeno, 63

Reação de Aglutinação, 63

Reações de Precipitação, 65

Imunoensaios, 67

Imunoensaio de Ligação Direta, 67

Imunoensaio de Fase Sólida, 68

Imunofluorescência, 70

Imunofluorescência Direta, 70

Imunofluorescência Indireta, 70

Análise de Separação de Célula Ativada por Fluorescência, 70

Imunoabsorção e Imunoadsorção, 71

Ensaios Celulares, 71

Ensaios para Avaliar a Função do Linfócito, 72

Ensaios de Proliferação de Células B e T, 72

Ensaios que Avaliam a Produção de Anticorpo pelasCélulas B, 72

Ensaios de Célula Efetora para Células T e NK, 72

Cultura de Célula, 72

Culturas de Células Primárias e Linhagens de CélulasLinfoides Clonadas, 73

Hibridomas de Célula B e Anticorpos Monoclonais, 73

Hibridomas de Células T, 74

Moléculas e Receptores Produzidos por EngenhariaGenética, 75

Modelos de Animais Experimentais, 75

Linhagens Consanguíneas, 75

Transferência Adotiva, 75

Camundongos SCID, 76

Camundongos Timectomizados e CongenitamenteAtímicos (Nus), 76

Camundongos Transgênicos e Marcação Genética, 76

Camundongos Transgênicos, 76

Camundongos Knockout, 76

Análise da Expressão Genética: Microdispositivos, 77

Resumo, 78

Referências, 79



6 BASE GENÉTICA DA ESTRUTURA DO ANTICORPO, 81

Introdução, 81

Breve Revisão da Estrutura de Genes Não Imunoglobulínicose Expressão Genética, 81

xii CONTEÚDO



CONTEÚDO xiii

Eventos Genéticos na Síntese das Cadeias de Ig, 83Organização e Rearranjo dos Genes da Cadeia Leve, 83Organização e Rearranjo dos Genes da Cadeia Pesada, 84Regulação da Expressão do Gene de Ig, 85

Mudança de Classe ou Isotipo, 86Geração da Diversidade do Anticorpo, 87

Presença de Múltiplos Genes V na Linhagem Germinativa, 87Associação Combinatória de VJ e VDJ, 87Seleção Aleatória das Cadeias H e L, 87Diversidade Juncional, 87Hipermutação Somática, 87Conversão Genética Somática, 88Edição de Receptor, 88Papel da Citidina Desaminase Induzida por Ativação na

Geração da Diversidade do Anticorpo, 88Resumo, 89Referências, 90Questões de Revisão, 90Estudo de Caso, 91Respostas às Questões de Revisão, 91Resposta para o Estudo de Caso, 91

7 BIOLOGIA DO LINFÓCITO B, 93

Introdução, 93Desenvolvimento dos Linfócitos B, 93

Visão Geral, 93Sítios de Diferenciação Inicial da Célula B, 94Estágios Iniciais de Diferenciação da Célula B: Células

Pró-B e Pré-B, 94Células B Imaturas, 96Células B Maduras, 97Tráfego de Linfócitos B: Distribuição Anatômica das

Populações de Células B, 98Locais de Síntese de Anticorpo, 98

Síntese de Anticorpo Timo-dependente no CentroGerminativo, 98

Síntese de Anticorpo na Mucosa, 100Respostas em Anticorpo Timo-independentes em

Diferentes Sítios, 101Proteínas de Membrana da Célula B, 102

Marcadores Estágio-específicos, 102Moléculas de Ligação ao Antígeno: Imunoglobulina de

Membrana, 102Moléculas de Transdução de Sinal Associadas com

Imunoglobulinas de Membrana, 103Moléculas Envolvidas nas Interações das Células B e T, 104

Resumo, 104


8 PAPEL DO COMPLEXO PRINCIPAL DEHISTOCOMPATIBILIDADE NA RESPOSTAIMUNOLÓGICA, 107Introdução, 107Como o MHC Foi Nomeado, 108Diferentes Moléculas do MHC Interagem com Diferentes

Populações de Células T, 108Variabilidade das Moléculas de Classe I e de Classe II do

MHC, 109Estrutura das Moléculas de Classe I do MHC, 110

Seletividade da Ligação do Peptídio às Moléculas deClasse I do MHC, 111

CD8 se Liga à Região Invariável das Moléculas deClasse I do MHC, 111

Estrutura da Molécula de Classe II do MHC, 111Processamento e Apresentação de Antígeno: Como as

Moléculas do MHC se Ligam a Peptídios e CriamLigantes que Interagem com as Células T, 112

Antígenos Exógenos e Formação de Complexos deClasse II-Peptídio, 113

Antígenos Endógenos: Geração de Complexos deClasse I-Peptídio, 114

Expressão Reduzida de Moléculas de Classe I do MHCem Células Infectadas por Vírus e Células Tumorais, 115

Apresentação Cruzada: Antígenos ExógenosApresentados pela Via da Molécula de Classe Ido MHC, 116

Quais Antígenos Iniciam Respostas de Célula T?, 116Ligação de Peptídios Derivados de Moléculas Próprias

às Moléculas do MHC, 117Incapacidade de Responder a um Antígeno, 117

Outros Tipos de Antígenos que Ativam Respostas deCélula T, 118

Lipídios e Glicolipídios Apresentados pelo CD1 às CélulasNKT, 118

Genes da Região HLA, 118Genes Polimórficos de Classe I e II do MHC, 118Nomenclatura das Moléculas Polimórficas do MHC, 119

Regulação da Expressão dos Genes do MHC, 119Expressão Codominante, 119Regulação Coordenada, 119Herança dos Genes do MHC, 120

Outros Genes Dentro do HLA, 120MHC em Outras Espécies, 121



Diversidade das Moléculas do MHC: MHC Associadocom Resistência e Suscetibilidade à Doença, 121

Resumo, 122Referências, 123Questões de Revisão, 123Respostas às Questões de Revisão, 124

9 BIOLOGIA DO LINFÓCITO T, 125

Introdução, 125Receptor Antígeno-específico de Célula T, 125

Moléculas que Interagem com o Antígeno, 125Complexo do Receptor de Célula T, 127Moléculas Correceptoras, 127Outras Moléculas Importantes Expressas na Superfície

da Célula T, 128Genes que Codificam os Receptores da Célula T, 130Geração da Diversidade do Receptor de Célula T, 130Diferenciação da Célula T no Timo, 131

Interações das Células T em Desenvolvimento comCélulas Não Linfoides do Timo, 131

Rearranjos Genéticos Iniciais do Receptor de Célula T:Células T Duplo-negativas e Separação dasCélulas T ��, 132

Células Pré-T, 133Células Duplo-positivas, 134

Seleção Tímica, 134Papel do Produto Gênico AIRE na Seleção Negativa, 135Células Unipositivas, 135Geração do Repertório da Célula T, 135Características das Células T �� Emergindo do Timo, 135Diferenciação Adicional das Células T CD4+ e CD8+ Fora

do Timo, 136Diferenciação de Outras Populações de Células no Timo, 136


10 ATIVAÇÃO E FUNÇÃO DAS CÉLULAS T E B, 141

Introdução, 141Ativação das Células T CD4+, 141

Células Especializadas Apresentam Antígenos às Células TCD4+ Inocentes, 141

Interações Pareadas na Superfície da APC e Células TCD4+, 143

Eventos Intracelulares na Ativação da Célula T CD4+, 144Expansão Clonal, Diferenciação em Células Efetoras e

Migração para Fora do Linfonodo, 147

Outras Vias para Ativar Células T CD4+, 147Superantígenos, 148Proteínas Vegetais e Anticorpos Contra Moléculas de

Superfície da Célula T, 148Função da Célula T, 148

Células T CD4+, 148Subpopulação de Células T CD4+ Definidas pela

Produção de Citocinas e Função Efetora, 148Função da Célula T Auxiliar: Interação das Células T

CD4+ com Células B para Sintetizar Anticorpo, 151

Ativação e Função das Células T CD8+, 153Geração de Células T CD8+ Efetoras, 154Célula T CD8+ Destruindo Células Alvo, 154Restrição pelo MHC e Função Citocida da Célula T CD8+, 156Término da Resposta: Indução de Células de Memória, 156

Função das Células NKT e Células T ��, 157Células NKT, 157Células T ��, 157

Função da Célula B: Síntese de Anticorpos na Ausência daCélula T Auxiliar, 158

Vacinas Conjugadas, 158Vias Intracelulares na Ativação da Célula B, 159Modulação do Sinal do BCR, 160


11 CITOCINAS, 165

Introdução, 165História das Citocinas, 165Propriedades Pleotrópicas e Redundantes das Citocinas, 166Propriedades Gerais das Citocinas, 166

Propriedades Funcionais Comuns, 166Atividades Sistêmicas Comuns, 167Fontes Celulares Comuns e Eventos em Cascata, 168

Categorias Funcionais das Citocinas, 168Citocinas que Facilitam as Respostas Imunológicas

Naturais, 168Citocinas que Regulam as Respostas Imunológicas

Adaptativas, 170

Citocinas que Induzem a Diferenciação de LinhagensDiversas de Células T, 170

Citocinas que Inibem a Diferenciação da Célula TLinhagem Específica, 171

Citocinas que Promovem Respostas Inflamatórias, 172Citocinas que Afetam o Movimento dos Leucócitos, 172

xiv CONTEÚDO



Citocinas que Estimulam a Hematopoiese, 173Receptores de Citocinas, 174

Famílias de Receptores de Citocinas, 174Cadeias Comuns do Receptor de Citocina, 175

Transdução de Sinal Mediado pelo Receptor de Citocina, 176Papel das Citocinas e Receptores de Citocinas nas Doenças, 176

Síndrome do Choque Tóxico, 176Choque Séptico Bacteriano, 177Câncer, 177Autoimunidade e Outras Doenças de Base Imunológica, 177

Exploração Terapêutica de Citocinas e Receptores deCitocinas, 178

Inibidores de Citocinas/Antagonistas, 178Revertendo Deficiências Celulares, 179Tratamento de Imunodeficiências, 179Tratamento de Câncer e Pacientes Transplantados, 179Tratamento de Alergias e Asma, 180


12 TOLERÂNCIA E AUTOIMUNIDADE, 183

Introdução, 183Tolerância Central, 184

Anergia, Edição de Receptor, Deleção e IgnorânciaClonal, 184

Tolerância Periférica, 186Anergia, 186Interações Fas-FasL, 187Células T Supressoras/Reguladoras, 188Tolerância Oral, 189Privilégio Imunológico, 190Autoimunidade e Doença, 190

Suscetibilidade Genética, 191Suscetibilidade Ambiental, 192Fármacos e Desencadeadores Hormonais de

Autoimunidade, 193Doenças Autoimunológicas, 194

Doenças Autoimunológicas nas quais os AnticorposDesempenham um Papel Predominante na Mediaçãodo Dano ao Órgão, 194

Doenças Autoimunológicas nas quais a Célula TDesempenha um Papel Predominante na Lesãodo Órgão, 198

Estratégias Terapêuticas, 201Resumo, 202


13 COMPLEMENTO, 205

Introdução, 205Visão Geral da Ativação do Complemento, 205

Via Clássica, 206Via da Lectina, 207Via Alternativa ou Via Alternada, 207Etapas Compartilhadas por Todas as Vias: Ativação

de C3 e C5, 209Via Terminal, 209

Regulação da Atividade do Complemento, 210Atividades Biológicas do Complemento, 211

Produção de Opsoninas, 212Produção de Anafilatoxinas, 212Lise, 214Outras Importantes Funções do Complemento, 214

Deficiências de Complemento, 216Resumo, 217Referências, 218Questões de Revisão, 218Respostas às Questões de Revisão, 219

14 HIPERSENSIBILIDADE: TIPO I, 221

Introdução, 221Classificação da Hipersensibilidade Segundo

Coombs e Gell, 221

Características Gerais das Reações Alérgicas, 222Fase de Sensibilização, 222Fase de Ativação, 223Fase Efetora, 225Reação de Fase Tardia, 226

Aspectos Clínicos das Reações Alérgicas, 228Rinite Alérgica, 228Alergia Alimentar, 228Dermatite Atópica, 228Asma, 229

Testes Clínicos para Alergias e Intervenção Clínica, 229Detecção, 229Intervenção, 230

Papel Protetor da IgE, 232Resumo, 233Referências, 233Questões de Revisão, 234Respostas às Questões de Revisão, 235

CONTEÚDO xv



15 HIPERSENSIBILIDADE: TIPOS II E III, 237

Introdução, 237Hipersensibilidade do Tipo II, 237

Reações Mediadas por Complemento, 237Citotoxicidade Mediada por Célula Anticorpo-dependente, 237Disfunção Celular Mediada por Anticorpo, 238

Exemplos de Reações de Hipersensibilidade do Tipo II, 239Reações Transfusionais, 239

Reações Induzidas por Fármacos, 239Reações de Incompatibilidade Rh, 239Reações Envolvendo Receptores de Membrana Celular, 240Reações Envolvendo Outros Determinantes da Membrana

Celular, 240Hipersensibilidade do Tipo III, 240

Doença por Imunocomplexo Sistêmica, 241Doença por Imunocomplexo Localizada, 243


16 HIPERSENSIBILIDADE: TIPO IV, 247

Introdução, 247Características Gerais e Fisiopatologia da DTH, 247

Mecanismos Envolvidos na DTH, 248Exemplos de DTH, 249

Sensibilidade de Contato, 249Hipersensibilidade Granulomatosa, 250Hipersensibilidade do Tipo Tuberculina, 251Rejeição a Aloenxerto, 252Exemplos Adicionais de DTH, 252

Tratamento da DTH, 252Resumo, 252Referências, 253Questões de Revisão, 253Respostas às Questões de Revisão, 254

17 DISTÚRBIOS POR IMUNODEFICIÊNCIA E

NEOPLASIAS DO SISTEMA LINFOIDE, 255Introdução, 255Síndromes por Imunodeficiência, 256

Síndromes por Imunodeficiência Primária, 256Doença por Imunodeficiência Secundária, 268

Síndrome da Imunodeficiência Adquirida, 268Descrição Inicial e Epidemiologia, 268Vírus da Imunodeficiência Humana, 269Curso Clínico, 270

Prevenção, Controle, Diagnóstico e Terapia na Infecçãopor HIV, 273

Neoplasmas do Sistema Linfoide, 274Neoplasmas de Célula B, 275Neoplasmas de Célula T, 278Linfoma de Hodgkin, 279Imunoterapia, 279


18 TRANSPLANTE, 285

Introdução, 285Relação Entre Doador e Receptor, 285Mecanismos Imunológicos Responsáveis pela Rejeição ao

Aloenxerto, 287

Categorias de Rejeição ao Alotransplante, 287Rejeição Hiperaguda, 287Rejeição Aguda, 287Rejeição Crônica, 288

Papel das Moléculas do MHC na Rejeição do Aloenxerto, 288Mecanismos de Reconhecimento do Aloantígeno pelas

Células T, 288

Papel das Linhagens de Célula T e Citocinas naRejeição de Aloenxerto, 289

Testes Laboratoriais Utilizados para Tipagem de Tecido, 290Prolongamento da Sobrevivência do Aloenxerto:

Terapia Imunossupresora, 291Agentes Anti-inflamatórios, 291Drogas Citotóxicas, 292Agentes que Interferem na Sinalização e Produção de

Citocina, 292Terapia Imunossupressora por Anticorpo, 293Novas Estratégias e Fronteiras Imunossupressoras, 293

Transplante de Célula-tronco Hematopoiética, 293Doença do Enxerto-versus-Hospedeiro, 294Transplante Xenogeneico, 295O Feto: Um Aloenxerto Tolerado, 295Resumo, 295Referências, 296Questões de Revisão, 296Respostas às Questões de Revisão, 297

19 IMUNOLOGIA DO TUMOR, 299

Introdução, 299Antígenos Tumorais, 299

xvi CONTEÚDO



Categorias de Antígenos Tumorais, 300Produtos Gênicos de Célula Normal, 300Produtos Gênicos de Célula Mutante, 301Antígenos Tumorais Codificados por Oncogenes, 302Fatores Imunológicos que Influenciam a Incidência

de Câncer, 303Mecanismos Efetores da Imunidade Contra Tumor, 303

Resposta de Célula B Contra Tumores, 305Resposta Celular Contra Células Tumorais, 305Citocinas, 306

Limitações da Eficiência das Respostas Imunológicas ContraTumores, 307

Imunodiagnóstico, 307Detecção de Proteínas de Mieloma Produzidas por

Plasmócitos Tumorais, 308

Detecção de �-Fetoproteína, 308Antígeno Carcinoembrionário, 308Detecção do Antígeno Específico da Próstata, 308Antígeno-125 Associado ao Câncer, 308Anticorpo Monoclonal B72.3 Radiomarcado, 308

Imunoprofilaxia Tumoral, 309Imunoterapia, 309Resumo, 311Referências, 311Questões de Revisão, 312Respostas às Questões de Revisão, 312

20 RESISTÊNCIA E IMUNIZAÇÃO CONTRA

DOENÇAS INFECCIOSAS, 313Introdução, 313Defesa do Hospedeiro Contra Várias Classes de Patógenos

Microbianos, 315

Imunidade aos Vírus, 315Imunidade às Bactérias, 316Imunidade aos Parasitas, 317Imunidade aos Fungos, 318

Mecanismos de Evasão de Patógenos às RespostasImunológicas, 318

Bactérias Encapsuladas, 318Toxinas, 319Superantígenos, 319Variação Antigênica, 319Sobrevivência Intracelular, 320Supressão do Sistema Imunológico, 321

Enzimas Extracelulares, 321Expressão de Proteínas Ligantes de Anticorpo, 321

Princípios de Imunização, 321Objetivos da Imunização, 321Imunizações Ativas, 322

Imunizações Recomendadas, 322Utilização de Vacinas em Populações Selecionadas, 322

Mecanismos Básicos de Proteção, 324Importância das Respostas Imunológicas Primárias e

Secundárias, 324Idade e Período de Imunizações, 324

Precauções com Vacinas, 326Sítio de Administração do Antígeno, 326Perigos, 326

Recentes Abordagens para Produção de Vacinas, 327Vacinas Produzidas por DNA Recombinante, 327Polissacarídios Conjugados, 327Vacinas com Peptídios Sintéticos, 327Vacinas Anti-idiotipo, 327Vacinas com Vírus Carreador, 328Vacinas com Bactérias Carreadoras, 328Vacinas de DNA, 328Toxoides, 328

Imunização Passiva, 328Imunização Passiva pela Transferência de Anticorpo

Via Placenta, 329Imunização Passiva Via Colostro, 329Terapia Passiva com Anticorpos e Terapia Sérica, 329Anticorpos Monoclonais e Policlonais, 330Preparação e Propriedades de Imunoglobulina

Sérica Humana, 331Indicações para o Uso de Imunoglobulinas, 331Precauções no Uso da Terapia com Imunoglobulina

Sérica Humana, 332

Fatores de Estimulação de Colônia, 332Resumo, 332Referências, 333Questões de Revisão, 333Respostas às Questões de Revisão, 334

Glossário, 337

Apêndice: Lista Parcial de Antígenos CD, 365

Índice Alfabético, 369

CONTEÚDO xvii



A sexta edição de Imunologia preserva o nosso compromis-so com o ditado menos é maisdesde sua primeira edição, hámais de 20 anos. Da quinta edição em diante, o nosso co-nhecimento sobre como o sistema imunológico se desenvol-ve e funciona, bem como a forma como esses fenômenos fi-siológicos podem falhar ou ser comprometidos e, em con-sequência, causar doença, aumentou significativamente. Paramostrar esse novo conhecimento, na sexta edição cada ca-pítulo foi atualizado, reescrito para incorporar novas desco-bertas ou foram retiradas informações que não mais refle-tem o pensamento vigente.

Os recentes avanços na Imunologia levaram a uma melhorcompreensão do sistema imunológico humano e dos mecanis-mos de doenças infecciosas imunologicamente mediadas. Den-tre estas se incluem doenças infecciosas, tais como malária etuberculose – causas importantes de mortalidade em todo omundo, responsáveis por mais de três milhões de mortes a cadaano –, bem como doenças parasitárias, infecções respiratóriase doenças causadas por patógenos transportados por vetor.Embora o sistema imunológico seja essencial para a sobrevi-vência diante desses patógenos, ele, em algumas circunstâncias,também pode causar doenças. Estas incluem as doenças cau-sadas por imunodeficiência, tais como a imunodeficiência com-binada grave (SCID); asma; doenças alérgicas; dermatite decontato; doenças autoimunes, como lúpus eritematoso sistêmi-co, esclerose múltipla, diabetes melito insulinodependente ediabetes do tipo 1; distúrbios inflamatórios agudos e crônicos,tais como a doença de Crohn; e a rejeição de células, órgãos etecidos transplantados. O sucesso contra essas doenças dependede pesquisa científica, incluindo como o sistema imunológicoe os patógenos interagem, como o sistema imunológico se de-senvolve e é regulado, assim como os mecanismos patológi-cos pelos quais o sistema imunológico causa dano quando fa-lha em executar suas funções fisiológicas.

A sexta edição de Imunologia visa fornecer ao leitor umavisão clara e concisa do nosso conhecimento atual sobre a fisio-logia do sistema imunológico, bem como sobre a fisiopatolo-gia associada a várias doenças imunologicamente mediadas.

Somos imensamente gratos à Dra. Linda Spatz (CUNYMedical School), que contribuiu com o Capítulo 12 (Tole-rância e Autoimunidade). Gostaríamos também de agrade-cer à Dra. Susan Gottesman (SUNY-Downstate), que atua-lizou o Capítulo 17 (Distúrbios por Imunodeficiência e Neo-plasias do Sistema Linfoide). Nossa gratidão é extensiva aDennis Kunkel, que preparou as imagens das células imu-

PREFÁCIO E AGRADECIMENTOS

nológicas usadas para criar a capa da sexta edição em inglês(http://www.denniskunkel.com).

Esta é a primeira edição de Imunologia a ser escrita sem oDr. Eli Benjamini. O Dr. Benjamini escreveu as duas primei-ras edições com o Dr. Sidney Leskowitz, e contribuiu em to-das as outras edições até a quinta. Agradecemos imensamen-te as contribuições do Dr. Benjamini e do Dr. Leskowitz narealização de Imunologia, e esperamos que a nova ediçãoesteja à altura de seus altos padrões.

Richard Coico gostaria de agradecer o carinho e o apoioconstante de sua esposa Lisa durante a produção deste livro.Como fonte de incentivo e inspiração, Lisa só é comparável aosseus dois filhos, Jonathan e Jennifer. Jonathan, um promissorescritor de talento, e Jennifer, uma emergente defensora glo-bal da área de Saúde, cada um deles abençoado com paciência,mente inteligente e questionadora — a mistura ideal de atribu-tos para crianças e estudantes. O Dr. Coico estende sua grati-dão ao primo, Frank Coico, que, de forma altruística, torceu porele e o encorajou durante os seus anos de treinamento. “Issofez toda a diferença.” Agradecimentos especiais são extensi-vos aos seguintes colegas, que generosamente contribuíramcom seus conhecimentos científicos e oferecendo muitas su-gestões úteis para a sexta edição: Dr. Ethan Shevach (NIH), Dr.Warren Strober (NIH) e Dra. Joanne Manns (Temple Univer-sity School of Medicine). Agradecimentos especiais tambémaos colegas de trabalho, incluindo secretárias, assistentes eoutros membros da equipe, que ajudaram na preparação domanuscrito. O Dr. Coico gostaria de agradecer igualmente aoseu falecido mentor, Dr. G. Jeanette Thorbecke, que muito in-fluenciou seu compromisso e paixão pelo campo da Imunologia.

Geoffrey Sunshine gostaria de agradecer aos colegas PeterBrodeur e Arthur Rabson, junto aos quais ensinou imunologiana Tufts University Medical School, pelas muitas discussõesestimulantes e sobre como melhor apresentar informações aosestudantes de Medicina e a outros profissionais da área de Saú-de. Muitos agradecimentos também a Peter Brodeur, por suasinúmeras sugestões úteis durante a preparação da atual edição.Geoffrey ainda gostaria de agradecer à sua esposa, Ilene, pelocontínuo apoio e compreensão durante a fase de redação.

Os autores desejam expressar também seus agradecimen-tos aos membros da equipe da John Wiley & Sons Inc., queajudaram a publicar a sexta edição, especialmente à Editorade Desenvolvimento Karen Trost, ao Editor Sênior ThomasMoore, ao Gerente de Ilustração Dean Gonzalez e ao EditorSênior de Produção Editor II Danielle Lacourciere.



5

INTERAÇÕES ANTÍGENO-ANTICORPO, TESTESIMUNOLÓGICOS E SISTEMAS EXPERIMENTAIS

61

Immunology: A Short Course, Sixth Edition, By Richard Coico and GeoffreySunshineCopyright © 2009 John Wiley & Sons, Inc.

INTRODUÇÃO

Nos capítulos anteriores, por necessidade, abordamos vá-rias técnicas e testes para a melhor compreensão de algunsaspectos fundamentais da imunidade natural e adaptativa.Neste capítulo discutiremos, com detalhes, as técnicas, en-saios e sistemas experimentais in vitro que são utilizadosem pesquisas e laboratórios de diagnóstico. Alguns são es-tritamente baseados em anticorpos (por exemplo, métodossorológicos). Outros empregam métodos de biologia mo-lecular, engenharia genética, técnicas de cultura de células,e modelos animais in vivoque muito contribuíram para o nos-so conhecimento sobre a fisiologia e fisiopatologia do sis-tema imunológico. Desde o sequenciamento do genomahumano no ano 2000 e com os esforços para sequenciargenomas bacterianos, abordagens que utilizam a bioinfor-mática e a biologia computacional (as chamadas análisesin silica) surgiram como métodos promissores para o es-tudo do sistema imunológico. Com a utilização de infor-mações derivadas de base de dados genômico e proteômico,ferramentas computacionais poderosas, e algoritmos, eviden-ciam-se grandes perspectivas para o campo da imunologiae, em particular, para o desenvolvimento de futuras vaci-nas. Embora este tópico esteja além do objetivo deste ca-pítulo, é importante considerar que futuros progressos nocampo da imunologia surgirão da combinação de aborda-gens in vitro, in vivo e in silica.

Começamos este capítulo com uma discussão sobre a di-nâmica física das interações antígeno-anticorpo.

INTERAÇÕES ANTÍGENO-ANTICORPO

As reações entre antígeno e anticorpos séricos (sorologia) ser-vem como base para muitos ensaios imunológicos. Em funçãoda extraordinária especificidade das respostas imunológicas, ainteração entre antígeno e anticorpo in vitro é amplamente utili-zada com fins diagnósticos para a detecção e identificação deantígenos ou anticorpos. Um exemplo da utilização da sorologiapara a identificação e classificação de antígenos é a sorotipagemde vários microrganismos utilizando-se antissoros específicos.

A interação de antígenos com anticorpos pode trazer inúme-ras consequências, incluindo precipitação (se o antígeno for so-lúvel), aglutinação (se o antígeno for particulado), e ativação docomplemento. Todos estes resultados são causados pelas intera-ções entre antígenos multivalentes e anticorpos que apresentam,pelo menos, dois sítios de combinação por molécula. Asconsequências da interação entre antígeno e anticorpo apresen-tadas acima não representam a interação primária entre anticor-pos e um determinado epítopo. Em vez disso, elas dependem defenômenos secundários que resultam das interações entre antí-genos multivalentes e anticorpos. Fenômenos como a formaçãode precipitados, aglutinação e ativação do complemento não ocor-reriam se o anticorpo com dois ou mais sítios de combinaçãoreagisse com um hapteno (isto é, um antígeno monovalente, comum único determinante) ou como resultado da interação entre umfragmento monovalente do anticorpo, tal como um Fab, e umantígeno, mesmo se o antígeno fosse multivalente. As razões paraestas diferenças são mostradas na Fig. 5.1. A ligação cruzadade várias moléculas de antígeno pelo anticorpo é necessária para

cap05 5/30/10, 10:08 PM61


62 CAPÍTULO 5 INTERAÇÕES ANTÍGENO-ANTICORPO, TESTES IMUNOLÓGICOS E SISTEMAS EXPERIMENTAIS

a precipitação, aglutinação, ou ativação do complemento, e épossível apenas se o antígeno for multivalente e o anticorpodivalente [ou um F(ab)’2 intacto] (ver Fig. 5.1). Em contraparti-da, nenhuma ligação cruzada é possível se o antígeno ou o anti-corpo for univalente.

INTERAÇÕES PRIMÁRIAS ENTREANTICORPO E ANTÍGENO

Ligações não covalentes estão envolvidas na interação entreo anticorpo e um epítopo. Consequentemente, as forças de

ligação são relativamente fracas. Elas consistem principal-mente de forças de van der Waals , forças eletrostáticas eforças hidrofóbicas, todas requerendo que as partes que in-teragem estejam em estreita proximidade. O intenso ajustenecessário entre um epítopo e o anticorpo é frequentementecomparado àquele observado entre uma chave e a fechadura.Considerando os baixos níveis de energia envolvidos na inte-ração entre antígeno e anticorpo, os complexos antígeno-an-ticorpo podem ser rapidamente dissociados por pH baixo oualto, por altas concentrações salinas ou por íons caotrópicos,tais como cianatos, que interferem eficientemente nas ligaçõesde hidrogênio das moléculas de água.

Antígeno/Hapteno Anticorpo/Fragmento Complexos formados

Antígeno monovalente, com umtipo de determinante (hapteno)

Anti-A Complexos A-anti-A(sem ligação cruzada)

Antígeno multivalente, comum único tipo de determinante

Anti-A Complexos com ligaçõescruzadas A-anti-A


Complexos Fab A-anti-A(sem ligações cruzadas)


F(ab)‘2 Anti-A Complexos A-anti-A

com ligações cruzadas

Antígeno multivalente, comdiferentes tipos de determinantes

Complexos de ligações cruzadasA-anti-A, B-anti-B, C-anti-C

Anti-A

Anti-B

Anti-C

Figura 5.1 Reações entre anticorpo ou frag-mentos de anticorpo e antígenos ou haptenos:(A) entre anticorpo e hapteno; (B) entre anticor-po e antígeno multivalente com um único deter-minante; (C) entre Fab e um antígeno multivalentecom um único determinante; (D) entre F(ab)’2 eum antígeno multivalente com um único determi-nante; (E) entre anticorpos para os determinan-tes A, B, e C e um antígeno multivalente com de-terminantes A, B e C.

A

B

C

D

E

Fab Anti-A

A

AA

AA

AA

A

AA

A

AA

A

AB

C

cap05 5/30/10, 10:08 PM62


63INTERAÇÕES SECUNDÁRIAS ENTRE ANTICORPO E ANTÍGENO

Constante de Associação

A reação entre um anticorpo (Ac) e um epítopo de um antíge-no (Ag) é exemplificada pela reação entre o anticorpo e umhapteno monovalente. Como a molécula de anticorpo é simé-trica, com dois sítios idênticos de combinação ao antígeno, Fab,uma molécula de anticorpo se liga a duas idênticas moléculasmonovalentes do hapteno e cada Fab se liga de uma maneiraindependente com uma molécula de hapteno. A ligação de umAg monovalente a cada sítio pode ser representada pela equação

onde k1 representa a constante de velocidade de interação (as-sociação) e k�1 representa o reverso (dissociação). A relaçãok1/k�1 é a constante de associação, K, uma medida da afini-dade. Ela pode ser calculada determinando-se a relação entreo complexo anticorpo-antígeno ligado em relação à concen-tração de antígeno e anticorpo não ligados. Assim,

A constante de associação (K) é, na verdade, uma medida da afi-nidade do anticorpo pelo epítopo (ver a seguir). Quando todas asmoléculas de anticorpo que se ligam a um determinado haptenoou epítopo são idênticas (como no caso dos anticorpos mono-clonais),K representa uma constante de associação intrínseca. En-tretanto, considerando que mesmo aqueles anticorpos séricos quese ligam a um único epítopo são heterogêneos, uma constante deassociação média de todos os anticorpos ao epítopo é menciona-da como K0. A interação entre anticorpos e cada epítopo de umantígeno multivalente segue a mesma cinética energética daquelasenvolvidas na interação entre anticorpos e haptenos, uma vez quecada epítopo de um antígeno reage com seu correspondente an-ticorpo da mesma maneira descrita anteriormente.

A constante de associação K pode ser determinada utilizan-do-se o equilíbrio de diálise. Neste procedimento é utilizada umacâmara de diálise; dois compartimentos são separados por umamembrana semipermeável que permite a livre passagem demoléculas de tamanho apropriado de um lado para outro. O anti-corpo é colocado em um lado da membrana semipermeável enão pode atravessá-la por causa de seu tamanho. Uma quanti-dade conhecida de moléculas de hapteno, pequenas, permeá-veis, radiomarcadas, oligossacarídios ou oligopeptídios, com-pondo o epítopo do carboidrato complexo ou proteínas, é adi-cionada no lado onde se encontra o antígeno. No tempo zero, ohapteno ou o epítopo antigênico utilizado (de agora em diantechamado de ligante) se difundirá através da membrana; no equi-líbrio, a concentração do ligante livre será a mesma em ambosos lados. Entretanto, a quantidade total de ligante será maiorno lado contendo anticorpo, visto que alguns dos ligantes seligarão às moléculas de anticorpo. A diferença na concentraçãodo ligante nos dois compartimentos representa a concentraçãodo ligante ligado ao anticorpo (isto é, o complexo [AgAc]). Quan-to maior a afinidade do anticorpo, mais ligante estará ligado.

Considerando que a concentração de anticorpo adicionadoà câmara de diálise até o equilíbrio pode ser predeterminada emantida constante, concentrações variáveis do ligante podemser utilizadas. Esta abordagem facilita a chamada análise deScatchard do anticorpo, de utilidade para estabelecer se umadeterminada preparação de anticorpo é homogênea (por exem-plo, anticorpo monoclonal) ou heterogênea (por exemplo,antissoro policlonal), e na medida da constante de afinidademédia (K0).

Afinidade e Avidez

Como observado antes, a constante de associação intrínseca quecaracteriza a ligação de um anticorpo com um epítopo ou umhapteno é denominada afinidade. Quando o antígeno é consti-tuído por muitos epítopos idênticos repetidos ou quando osantígenos são multivalentes, a associação entre toda a molécu-la do antígeno e os anticorpos depende não apenas da afinida-de entre cada epítopo e seu correspondente anticorpo, mas tam-bém do somatório das afinidades de todos os epítopos envolvi-dos. Assim, a afinidade de ligação de anti-A com A multivalente(mostrado na Fig. 5.1B) pode ter quatro ou cinco ordens demagnitude maior que a ligação entre anti-A e A monovalente(Fig. 5.1A). Isto é devido ao fato de o pareamento de anti-Acom A multivalente ser influenciado pelo número aumentadode sítios com os quais anti-A pode reagir.

Enquanto o termo afinidade indica a constante de associaçãointrínseca entre anticorpo e um ligante monovalente tal como umhapteno, o termo avidez é utilizado para designar toda a energiade ligação entre anticorpos e um antígeno multivalente. Assim,em geral, os anticorpos IgM têm avidez mais alta que os anticor-pos IgG, embora a ligação com o ligante de cada Fab no anticor-po IgM possa ter a mesma afinidade que o Fab na IgG.

INTERAÇÕES SECUNDÁRIAS ENTREANTICORPO E ANTÍGENO

Reação de Aglutinação

Referindo-se outra vez à Fig. 5.1, as reações de anticorpo comum antígeno multivalente que é particulado (isto é, uma partí-cula insolúvel) resultam em ligação cruzada de várias partí-culas de antígenos pelos anticorpos (Figs. 5.1D e E). Esta li-gação cruzada resulta finalmente na agregação ou aglutina-ção de partículas antigênicas pelos anticorpos.

Título. A capacidade de um anticorpo fazer com que osantígenos se aglutinem exige uma proporção ótima do anticor-po em relação ao antígeno. Um método às vezes utilizado paramedir o nível de anticorpo específico no soro para uma partí-cula antigênica é o teste de aglutinação. Testes quantitativosmais sensíveis [por exemplo, o ensaio do imunossorvente liga-do à enzima (ELISA) discutido mais tarde neste capítulo] subs-tituem em grande parte o teste de aglutinação para a quantifi-

Ag � Ac Ac � Agk�1

k1

k�1

k1K � �[Ac � Ag][Ac][Ag]

cap05 5/30/10, 10:09 PM63



cação dos níveis de anticorpo no soro. O título aglutinante deum certo soro é, de fato, apenas uma expressão semiquantitativados anticorpos presentes no soro, não uma medida quantitativada concentração de anticorpos (peso/volume).

O teste é realizado misturando-se diluições seriadas narazão de 2 do soro com uma concentração fixa de antígeno.Altas diluições do soro normalmente não causam a aglutina-ção do antígeno, uma vez que em tais diluições não há anti-corpos suficientes para provocar aglutinação visível conside-rável. A mais alta diluição do soro que ainda causa aglutina-ção além da qual a aglutinação não ocorre é denominada títu-lo. É uma observação comum a de que a aglutinação pode nãoocorrer em altas concentrações de anticorpo, muito emboraocorra em diluições mais altas do soro. Os tubos com altasconcentrações de soro, onde a aglutinação não ocorre, repre-sentam uma prozona. Na prozona, os anticorpos estão presen-tes em excesso. A razão para a ausência da aglutinação naprozona é que cada epítopo em uma única partícula de antí-geno pode se ligar apenas a uma única molécula de anticor-po, impedindo a ligação cruzada entre partículas diferentes.

Devido ao fenômeno da prozona, nos testes onde se pes-quisa a presença de anticorpos aglutinantes para um determi-nado antígeno, é imperativo que o antissoro seja testado emvárias diluições. Testando-se o soro em apenas uma concen-tração podem ocorrer conclusões enganosas se nenhuma aglu-tinação houver, uma vez que esta ausência de aglutinação podeestar refletindo uma prozona ou a falta de anticorpo.

Potencial Zeta. As superfícies de certos antígenos parti-culados podem apresentar uma carga elétrica, tal como a redede carga negativa na superfície dos eritrócitos causada pelapresença do ácido siálico. Quando estas partículas carregadassão suspensas em solução salina, um potencial elétrico deno-minado potencial zeta é criado entre as partículas, impedindoque elas fiquem muito próximas umas das outras. Este fenô-meno traz uma dificuldade na aglutinação de partículas carre-gadas pelos anticorpos, especialmente a aglutinação dos eritró-citos por anticorpos IgG. A distância entre os braços Fab damolécula IgG, mesmo na sua forma mais estendida, é muitocurta para permitir uma ligação eficaz entre dois eritrócitosdevido ao potencial zeta. Assim, embora os anticorpos IgGpossam ser direcionados contra antígenos dos eritrócitos car-regados, a aglutinação pode não ocorrer em consequência da

repulsão pelo potencial zeta. Por outro lado, algumas das áreasFab dos anticorpos IgM pentaméricos estão suficientementedistantes e podem estabelecer uma ponte para os eritrócitosseparados pelo potencial zeta. Esta propriedade dos anticorposIgM, junto com sua pentavalência, é a principal razão de suaeficácia como anticorpos aglutinantes.

Ao longo dos anos tentativas foram feitas com o objetivode melhorar a reação de aglutinação para diminuir o potencialzeta de várias maneiras, mas nenhuma delas foi universalmen-te aplicada ou eficaz. Entretanto, um método engenhoso foicriado na década 1950 por Coombs para superar este proble-ma. Este método, descrito abaixo, facilita a aglutinação de eri-trócitos por anticorpos IgG específicos para os antígenos doseritrócitos, sendo também útil para a detecção de anticorposnão aglutinantes que estão presentes na superfície dos eritró-citos.

Teste de Coombs. O teste de Coombsé um método queutiliza anticorpos criados contra as imunoglobulinas de dife-rentes espécies (anticorpos heterólogos) para detectar a presençade autoanticorpos na superfície dos eritrócitos (Fig. 5.2) e estábaseado em dois importantes fatos: (1) de que as imunoglobu-linas de uma espécie (a humana, por exemplo), são imunogê-nicas quando injetadas em outra espécie (por exemplo, o coe-lho) e induzem a produção de anticorpos contra elas e (2) deque muitas das anti-imunoglobulinas (como a Ig de coelho anti-humana) ligam-se a determinantes antigênicos presentes na por-ção Fc do anticorpo deixando as porções Fab livres para reagircom o antígeno. Por exemplo, se autoanticorpos IgG humanosforem acoplados aos eritrócitos, a adição de Ig de coelho anti-humana formará pontes (ligações cruzadas) entre os eritróci-tos causando aglutinação.

Existem duas versões do teste de Coombs: o teste de Coombsdireto e o teste de Coombs indireto. As duas versões diferemde certa maneira na mecânica, porém ambas são baseadas nomesmo princípio: a utilização de anti-imunoglobulinas heteró-logas para detectar uma reação entre imunoglobulinas e antí-geno. No teste de Coombs direto, as anti-imunoglobulinas sãoadicionadas às partículas (por exemplo, eritrócitos) que se sus-peita tenham anticorpos ligados aos antígenos em sua superfí-cie. Se, por exemplo, um recém-nato é suspeito de ter a doençahemolítica do recém-nascido causada pelos anticorpos IgG anti-Rh maternos ligados aos seus eritrócitos, a adição de imuno-

Antígeno Anticorpo(Ig)

Ausênciade aglutinação

Anti-Ig Aglutinação Figura 5.2 Representaçãodo teste de Coombs.

cap05 5/30/10, 10:09 PM64


65

globulina anti-humana a uma suspensão dos eritrócitos da crian-ça (teste de Coombs direto) causaria a aglutinação dos eritróci-tos. Em alguns casos, o teste de Coombs direto falha devido aopotencial zeta. O teste de Coombs indireto pode então ser utili-zado para determinar se o soro da mãe contém anticorpos anti-Rh. Neste caso, os reagentes anti-imunoglobulinas são adicio-nados apenas após o soro materno ser combinado com eritróci-tos Rh+. Desta forma, o teste de Coombs direto mede o anticor-po ligado, enquanto o teste indireto mede o anticorpo sérico.

Originalmente, o teste de Coombs foi utilizado para detec-tar anticorpos humanos na superfície dos eritrócitos. Atual-mente, através da utilização das anti-imunoglobulinas, ele éaplicado para a detecção de qualquer imunoglobulina queesteja ligada ao antígeno.

Aglutinação Passiva. A reação de aglutinação pode serrealizada com antígenos particulados (como eritrócitos ou bac-térias) e também com antígenos solúveis desde que estes antíge-nos possam ser ligados a partículas insolúveis. Por exemplo, oantígeno solúvel tireoglobulina pode ser conjugado a partículasde látex, de modo que a adição de anticorpos para o antígeno ti-reoglobulina causará a aglutinação das partículas de látex reves-tidas pela tireoglobulina. A adição de antígeno solúvel aos anti-corpos antes da introdução das partículas de látex revestidas portireoglobulina inibe a aglutinação pelo fato de os anticorpos secombinarem primeiro com o antígeno solúvel. Se o antígenosolúvel estiver presente em excesso, os anticorpos não serão ca-pazes de se ligar ao antígeno particulado, um fenômeno conhe-cido como inibição de aglutinação. Este tipo de inibição de aglu-tinação precisa ser diferenciado da inibição de aglutinação entreanticorpos e vírus. Anticorpos para determinados vírus inibem aaglutinação dos eritrócitos pelos vírus. Em tais casos, os anticor-pos são direcionados para a área ou áreas sobre os vírus que seligam aos receptores virais apropriados nos eritrócitos.

Quando um antígeno é um constituinte natural de umapartícula, a reação de aglutinação é chamada de aglutinaçãodireta. Quando a reação de aglutinação ocorre entre anticor-pos e antígenos solúveis presos a uma partícula insolúvel, areação tem o nome de aglutinação passiva.

As reações de aglutinação são amplamente utilizadas emaplicações clínicas. Além dos exemplos já referidos, as prin-cipais aplicações incluem a tipagem de eritrócitos em bancosde sangue, diagnóstico de doença hemolítica imunologicamen-te mediada, tal como anemia auto-hemolítica induzida porfármacos, testes para fator reumatoide (IgM humana anti-IgGhumana), testes confirmatórios de sífilis e o teste do látex paragravidez, que envolve a detecção de gonadotrofina coriônicahumana (HCG) na urina de mulheres grávidas.

Reações de Precipitação

Reação em Soluções. Ao contrário da reação de aglu-tinação que ocorre entre anticorpos e antígeno particulado, a rea-ção de precipitação se dá quando anticorpos e antígeno solú-vel são misturados. Como no caso da aglutinação, a precipita-

ção dos complexos antígeno-anticorpo ocorre pelo fato de asmoléculas bivalentes dos anticorpos se ligarem de maneira cru-zada a moléculas de antígeno multivalentes para formar umarede. Quando ela alcança um certo tamanho, este complexoantígeno-anticorpo perde sua solubilidade e se precipita da so-lução. O fenômeno de precipitação é denominado reação deprecipitação.

A Fig. 5.3 apresenta uma reação de precipitação qualitati-va. Concentrações crescentes de antígeno são adicionadas auma série de tubos contendo concentrações constantes deanticorpos, o que acarreta a formação de quantidades variá-veis de precipitado. O peso do precipitado de cada tubo podeser determinado por inúmeros métodos. Se a quantidade doprecipitado for colocada em gráfico contra a quantidade deantígeno adicionada, obtém-se uma curva de precipitaçãosemelhante àquela mostrada na Fig. 5.3.

A Fig. 5.3 mostra três importantes áreas da curva: (1) zonade excesso de anticorpo (prozona), (2) zona de equivalência,e (3) zona de excesso de antígeno. Na zona de equivalência, aproporção de antígeno e anticorpo é ótima para uma precipi-tação máxima; nas zonas de excesso de anticorpo ou de ex-cesso de antígeno, as proporções dos reagentes não acarretamuma eficiente reação cruzada e formação de precipitado.

Deve ser enfatizado que as zonas da curva de precipitaçãose baseiam na quantidade de complexo antígeno-anticorpoprecipitado. Entretanto, as zonas de excesso de antígeno e deexcesso de anticorpo podem conter complexos antígeno-an-ticorpo solúveis, particularmente a zona de excesso de antí-geno, onde uma quantidade mínima de precipitado é forma-da, mas grandes quantidades de complexos antígeno-anticor-po estão presentes no sobrenadante. Desta maneira, a quanti-dade de precipitado formado depende das proporções dos re-agentes antígeno e anticorpos: a proporção correta da reaçãoresulta na formação de um precipitado máximo; excesso deantígeno (ou anticorpo) resulta em complexos solúveis.

Reações de Precipitação em Géis. As reações de pre-cipitação entre antígenos solúveis e anticorpos podem ocor-rer não apenas em solução mas também em meio semissólidotal como o gel de ágar. Quando antígeno solúvel e anticorpossão colocados em orifícios abertos no gel (Fig. 5.4A), os rea-gentes se difundem no gel e formam gradientes de concentra-ção, com as concentrações mais altas mais próximas dos ori-fícios. Em algum lugar entre os dois orifícios, os reagentesantígeno e anticorpo estarão presentes em proporções ótimaspara a formação de um precipitado visível, como mostradopelas linhas entre os orifícios na Fig. 5.4.

Se o orifício do anticorpo contiver anticorpos 1, 2 e 3 es-pecíficos para os antígenos 1, 2 e 3, respectivamente, e seos antígenos 1, 2 e 3 colocados nos orifícios do antígeno sedifundirem em diferentes velocidades (com velocidade dedifusão de 1 > 2 > 3) serão formadas três diferentes linhasde precipitação. Estas três linhas de precipitação se formamporque os anticorpos anti-1, anti-2 e anti-3, que se difundemcom a mesma velocidade, reagem independentemente com

INTERAÇÕES SECUNDÁRIAS ENTRE ANTICORPO E ANTÍGENO

cap05 5/30/10, 10:09 PM65



os antígenos 1, 2 e 3, respectivamente, para formar três zo-nas de equivalência e, portanto, três linhas de precipitaçãoseparadas (Fig. 5.4B). Diferentes velocidades de difusão deanticorpo e anticorpo e antígeno resultam de diferenças naconcentração, peso molecular ou forma.

Historicamente, este método de dupla difusão, desenvolvidopor Ouchterlony e algumas vezes chamado de método deOuchterlony, tem sido útil para o estabelecimento do parentes-co antigênico entre várias substâncias, como mostrado naFig. 5.5. Na técnica de gel-difusão são observados três padrões

de reação, todos ilustrados na Fig. 5.5: padrão de identidade,padrão de não identidade e padrão de identidade parcial. Os pa-drões de identidade se formam quando os dois antígenos sãoidênticos (Fig. 5.5A). Um padrão no qual as linhas de precipi-tação se cruzam uma com a outra é denominado padrão de nãoidentidade (Fig. 5.5B). Finalmente, um padrão de identidadeparcial se forma quando o antissoro testado reage positivamentecom antígenos que contêm epítopos que reagem de maneiracruzada e alguns que não reagem de maneira cruzada, fazendocom que apareça no gel um esporão de precipitação (Fig. 5.5C).

Zona de excessode anticorpo

Zona de excessode antígeno

Zona deequivalência

Com

ple

xos

antí

gen

o-a

nti

corp

o p

r eci

pit

ados

Ag adicionado Figura 5.3 Representação da reação de precipitação.

Figura 5.4 Difusão em gel por (A) anticorpos eum único antígeno e (B) anticorpos para os antígenos1, 2 e 3 e seus respectivos antígenos.

Ac1

Ac1

Ac2

Figura 5.5 Padrões de dupla difusão em gelmostrando (A) padrão de identidade, (B) padrão denão identidade, e (C) padrão de identidade parcial.

A B

Ac1

Ac Ag Ac Ag

Ag1 Ag1 Ag1 Ag1Ag2 Ag2

A B C

cap05 5/30/10, 10:09 PM66


67

Imunodifusão Radial. O teste de imunodifusão radial,mostrado na Fig. 5.6, representa uma variação do teste dedupla difusão. Os orifícios contêm antígeno em diferentesconcentrações, enquanto os anticorpos são distribuídos uni-formemente no interior do gel de ágar. Assim, a linha de pre-cipitação é substituída por um anel de precipitação ao redordo orifício. A distância que o anel de precipitação percorredo centro do orifício do antígeno será diretamente proporcio-nal à concentração do antígeno no orifício. A relação entre aconcentração do antígeno no orifício e o diâmetro do anel deprecipitação pode ser mostrada em gráfico como é visto naFig. 5.6. Se os orifícios como F e G contêm quantidades des-conhecidas do mesmo antígeno, a concentração do antígenonestes orifícios pode ser determinada comparando-se o diâ-metro do anel de precipitação com o diâmetro do anel forma-do por uma concentração conhecida do antígeno.

Uma importante aplicação da imunodifusão radial é a quan-tificação clínica da concentração de proteínas séricas. Oantissoro para várias proteínas séricas é incorporado no gel; aconcentração de uma determinada proteína em uma amostrade soro é estabelecida comparando-se o diâmetro do anel deprecipitação resultante com aquele obtido usando-se umaconcentração conhecida de proteína.

Imunoeletroforese. A imunoeletroforese envolve a se-paração de uma mistura de proteínas adicionadas a um gel depoliacrilamida, utilizando-se um campo elétrico (eletrofore-se), seguida pela sua detecção com anticorpos que se difun-dem no gel e é muito útil para a análise de uma mistura deantígenos. Por exemplo, na caracterização clínica das proteí-nas séricas humanas, uma pequena gota de soro humano écolocada em um orifício aberto no centro de uma lâmina re-vestida com ágar. O soro é submetido à eletroforese, que se-para os vários componentes, de acordo com sua mobilidade,em um campo elétrico. Após a eletroforese, uma fenda é cor-tada ao longo da lateral das lâminas, enquanto anticorpos paraas proteínas do soro humano são colocados na fenda. Os an-

ticorpos difundem-se no ágar, assim como as proteínas séri-cas separadas. Em uma proporção ótima de antígeno e anti-corpo, cada antígeno e seu anticorpo correspondente formamlinhas de precipitação. O resultado é um padrão similar àque-le observado na Fig. 5.7. A comparação entre os padrões e aintensidade das linhas de um soro normal, com os resultadosobtidos com os soros dos pacientes, pode revelar ausência,superprodução ou outra anormalidade de uma ou mais proteí-nas séricas. De fato, foi através da utilização do teste de imu-noeletroforese que a primeira síndrome de deficiência de an-ticorpo foi identificada em 1952 (agamaglobulinemia de Bru-ton) (ver Capítulo 17).

Western Blots (Immunoblots). Na técnica de Wes-tern ou immunoblotting, o antígeno (ou uma mistura de an-tígenos) é inicialmente separado em um gel. O material sepa-rado é, a seguir, transferido para membranas que ligam pro-teína (por exemplo, nitrocelulose) utilizando um método deelectroblotting. O anticorpo é, a seguir, aplicado à membranade nitrocelulose a qual se liga ao antígeno específico. O anti-corpo pode ser marcado (por exemplo, com radioatividade)ou uma anti-imunoglobulina marcada pode ser utilizada paralocalizar o anticorpo e o antígeno ao qual ele está ligado. Atécnica é muito utilizada em pesquisas e laboratórios clínicospara a detecção e caracterização de antígenos. Um exemploparticularmente útil é o diagnóstico para confirmação de in-fecção pelo HIV através da aplicação do soro do paciente àsmembranas de nitrocelulose contendo antígenos HIV ligados.O encontro de anticorpo específico constitui uma forte evi-dência de infecção pelo vírus (Fig. 5.8).

IMUNOENSAIOS

Imunoensaio de Ligação Direta

O radioimunoensaio (RIA) emprega moléculas isotopicamen-te marcadas e permite a determinação de quantidades mínimasde antígeno, anticorpo ou complexos antígeno-anticorpo. Asconcentrações são determinadas medindo-se a radioatividadeao invés da análise química, aumentando-se a sensibilidade dedetecção por várias ordens de grandeza. Pelo desenvolvimentodeste método analítico altamente sensível, que apresenta apli-cação clínica nos testes de hormônio, bem como em testes de

Diâ

met

ro d

o a

nel

Log da concentração do Ag

Figura 5.6 Difusão radial. A, B, C, D e E representam con-centrações conhecidas de antígenos; F e G representam con-centrações desconhecidas que podem ser determinadas comparan-do-se o diâmetro de seus anéis de precipitação com os diâmetrosdos anéis formados pelo antígeno de concentração conhecida.

Figura 5.7 Padrões imunoeletroforéticos de proteínasséricas.

Albumina Transferrina IgM IgA IgG

IMUNOENSAIOS

A

B

C

DE

F

G

A

B

C

D

E

F G

cap05 5/30/10, 10:09 PM67


69

terminantes antigênicos, um número suficiente deles aindapode reagir com os seus correspondentes anticorpos cuja pre-sença pode ser detectada pelo uso de anti-imunoglobulinas(Fig. 5.11) marcadas com um marcador radioativo ou, maiscomumente, com uma enzima. Se forem usadas anti-imuglobulinas marcadas com uma enzima que pode ser de-tectada pelo aparecimento de uma cor com a adição do subs-trato, o teste é chamado ensaio do imunossorvente ligado àenzima (ELISA).

Depois de revestir a superfície do plástico com antígeno, éimperativo bloquear qualquer superfície plástica não revestidaa fim de evitar que ela absorva outros reagentes, sendo o maisimportante o reagente marcado. Tal bloqueio é conseguido pelorevestimento da superfície plástica com alta concentração deuma proteína não relacionada, como a gelatina, após a aplica-ção do antígeno.

Considerando que os poços plásticos são normalmente reves-tidos com quantidades relativamente grandes de antígeno, quan-to maior for a concentração de anticorpo ligado ao antígeno, maisalta é a quantidade de anti-imunoglobulina marcada que pode serligada a anticorpos. Desta forma, um excesso de anti-imunoglo-bulina marcada é sempre utilizado para assegurar a saturação.

O imunoensaio de fase sólida pode ser usado para avaliaçõesqualitativas ou quantitativas de antígeno. Tais determinações sãorealizadas misturando-se o antissoro com quantidades variáveisconhecidas de antígeno antes de adicioná-las aos poços plásti-cos revestidos de antígeno. Este procedimento preliminar resul-ta na ligação dos anticorpos com o antígeno solúvel, diminuindoa disponibilidade de anticorpos livres. Quanto maior for a con-centração do antígeno solúvel que reage com os anticorpos an-tes da adição do anticorpo aos poços, menor o número de anti-corpos que podem se ligar ao antígeno na placa e menor o nú-

Antígenomarcado (mesma

concentraçãodo acima) e

antígeno nãomarcado

(9 “unidades”)

Antícorpo(mesma

concentraçãodo acima)

Separação deanticorpo ligado

do marcadornão ligado

Marcadorligado

(3 “unidades”)

6 “unidades”de marcadornão ligado (e6 “unidades”de antígenonão marcadonão ligado

Antígenomarcado

(9 “unidades”)

Anticorpo(pouca quantidade)

Separação deanticorpo ligado, domarcador não ligado

Marcadorligado

(6 “unidades”)

3 “unidades”de marcadornão ligado

Figura 5.9 Quantidade de marcação ligadaao anticorpo após incubação com quantidades cons-tantes de anticorpo e antígeno marcado.

Figura 5.10 Radioimunoensaio baseadona competição pelo anticorpo de antígenos mar-cados e não marcados.

Antígeno Proteínade bloqueio

Poço de plástico revestidopelo antígeno

Locais bloqueados não ligadossobre o plástico com proteína

não relacionada

Anticorpo marcadocom enzima

EnzimaSubstrato

Figura 5.11 ELISA repre-sentativo usando poços re-vestidos diretamente comantígeno.

IMUNOENSAIOS

cap05 5/30/10, 10:09 PM69



mero de anti-imunoglobulinas marcadas que podem se ligar aoscomplexos antígeno-anticorpo. A diminuição da quantidade deanticorpo marcado como uma função da concentração de antí-geno usado pode ser mostrada em um gráfico; a quantidade deantígeno em uma solução desconhecida pode então ser determi-nada a partir do gráfico por comparação da diminuição da mar-cação causada pela solução desconhecida ao decréscimo causa-do pelas concentrações conhecidas de antígeno puro.

IMUNOFLUORESCÊNCIA

Um composto fluorescente tem a propriedade de emitir luzde um certo comprimento de onda quando ele é excitado pelaexposição à luz de um comprimento de onda mais curto. Aimunofluorescência localiza um antígeno através da utiliza-ção de anticorpos fluorescentemente marcados. O procedimen-to, originalmente descrito por Coombs, emprega anticorposcovalentemente ligados a grupos fluorescentes que não causamqualquer mudança apreciável na atividade do anticorpo.

Um composto fluorescente que é amplamente utilizado emimunologia é o isotiocianato de fluoresceína (FITC), quefluoresce com uma cor esverdeada, visível quando excitadopor luz ultravioleta (UV). O FITC é facilmente conjugado agrupos amino livres. Outro composto fluorescente amplamen-te utilizado é a ficoeritrina (PE), que fluoresce em vermelho,e também é facilmente conjugado a grupos amino livres. Mi-croscópios de fluorescência equipados com uma fonte de luzultravioleta permitem a visualização de anticorpo fluorescentesobre um espécime microscópico. A imunofluorescência é am-plamente utilizada para localizar antígenos sobre vários teci-dos e microrganismos.

Existem dois procedimentos importantes e relacionadosque empregam anticorpos fluorescentes: imunofluorescênciadireta e imunofluorescência indireta.

Imunofluorescência Direta

A imunofluorescência direta, que é utilizada principalmentepara a detecção de antígeno, envolve a reação do tecido-alvo(ou microrganismo) com anticorpos específicos marcadosfluorescentemente. É amplamente utilizada para propósitosclínicos como identificação de subpopulações linfocíticas econfirmação da presença de deposição de proteína específicaem certos tecidos, como rim e pele em casos de lúpus erite-matoso sistêmico (SLE) (ver Capítulo 12).

Imunofluorescência Indireta

A imunofluorescência indireta envolve a reação do primeiroalvo com anticorpos específicos não marcados e a seguir comanti-imunoglobulina marcada fluorescentemente.

O método de imunofluorescência indireta é mais ampla-mente utilizado que o método direto, porque um único anti-corpo anti-imunoglobulina fluorescente pode ser emprega-

do para localizar anticorpos de muitas especificidades dife-rentes. Além disso, posto que as anti-imunoglobulinas con-têm anticorpos para muitos epítopos da imunoglobulina es-pecífica, a utilização de anti-imunoglobulinas fluorescentesamplia significativamente o sinal fluorescente. Um excelenteexemplo do uso de imunofluorescência indireta é a triagemde soros de pacientes quanto à presença de anticorpos anti-DNA em casos de SLE.

ANÁLISE DE SEPARAÇÃO DE CÉLULAATIVADA POR FLUORESCÊNCIA

Um instrumento muito poderoso que utiliza anticorpo fluo-rescente específico para antígenos de superfície celular é aanálise de separação de célula ativada por fluorescência(FACS – fluorescence-activated cell sorting). Uma suspen-são celular marcada com anticorpo fluorescente específico épassada através de um aparelho que forma uma corrente depequenas gotas, cada uma contendo uma única célula. Estasgotas são passadas entre um feixe de laser de luz ultravioletae um detector que captura a fluorescência emitida pelas célu-las marcadas. O sinal emitido do detector é passado para umeletrodo que carrega a gota, levando a sua deflexão em umcampo eletromagnético (Fig. 5.12). À medida que as gotaspassam através do feixe de laser, elas são contadas e podemser selecionadas conforme emitem um sinal (isto é, se elasestão marcadas ou não marcadas). A intensidade de colora-ção com fluoresceína de cada célula, que reflete a densidadedo antígeno expresso sobre a célula, pode ser detectada poreletrônica sofisticada.

Com este tipo de aparelho é possível agora desenvolver ra-pidamente um perfil citométrico de fluxo de um conjunto delinfócitos tomando-se por base sua expressão diferencial de mo-léculas de superfície celular, a quantidade relativa de moléculaexpressa na superfície celular de cada célula, a distribuição detamanho e números de cada tipo celular. É possível também uti-lizar o aparelho para escolher uma coleção de células coradascom cinco ou mais diferentes marcadores fluorescentes e obteruma amostra muito homogênea de um tipo particular de célu-la. Uma variação desta técnica usa anticorpos fluorescentesconjugados a pérolas magnéticas para separar populações ce-lulares. Células que se ligam ao anticorpo fluorescente podemser separadas, por um magneto, das células não coradas. Am-bos os métodos, FACS e separação por pérola magnética, re-sultaram no isolamento de células muito raras tais como ascélulas-tronco hematopoiéticas.

O método mais comum de fenotipagem e separação de cé-lulas envolve o uso de anticorpos que reagem com proteínasde superfície celular identificadas como antígenos de gruposde diferenciação (CD – clusters of differentiation antigens).A nomenclatura CD se originou de estudos utilizando-se an-ticorpos monoclonais (discutidos mais tarde neste capítulo)para caracterizar as células fenotipicamente. Ficou estabele-cido que os marcadores de superfície celular (antígeno CD)

cap05 5/30/10, 10:09 PM70


71

estão associados com estágios de desenvolvimento distintos.Além disso, estas proteínas têm funções biológicas importan-tes necessárias para a fisiologia da célula normal. Os estágiosde desenvolvimento das células T e B e as subpopulaçõesfuncionais destas células podem agora ser fenotipados toman-do-se por base sua expressão de marcadores CD. Contudo, aexpressão de uma molécula particular na superfície pode nãoser específica para apenas uma célula ou mesmo para umalinhagem celular. Não obstante, a expressão na superfíciecelular pode ser explorada para purificação assim como ca-racterização das células. Para objetivos práticos o acrônimoCD é seguido por um número arbitrário que identifica umaproteína de superfície celular específica. Os números CD sãodesignados pelo Comitê de Nomenclatura da União Interna-cional de Ciências Imunológicas. Uma lista de alguns dosantígenos CD mais importantes expressos pelas células B, vá-rias subpopulações de células T e outras células pode ser en-contrada no Apêndice.

IMUNOABSORÇÃO EIMUNOADSORÇÃO

Devido à ligação específica entre o antígeno e o anticorpo,é possível capturar, ou remover seletivamente, um antígenocontra o qual um anticorpo é dirigido a partir de uma mistu-ra de antígenos em solução. De modo similar, é possível re-mover seletivamente anticorpos antígeno-específicos de umamistura de anticorpo utilizando-se o antígeno específico.

Há dois métodos relacionados de remoção. Em um deles, aabsorção é realizada com ambos os reagentes em solução(imunoabsorção). No outro, é realizada com um reagente li-gado a um suporte insolúvel (imunoadsorção). A imunoadsor-ção é de especial utilidade porque o material adsorvido podeser, a seguir, recuperado do complexo por cuidadosos trata-mentos que dissociem os complexos antígeno-anticorpo, taiscomo abaixando o pH (glicina-HCl ou ácido acético, pH 2-3)ou adicionando íons caotrópicos. Isto possibilita a purifica-ção efetiva de antígenos ou anticorpos de interesse.

ENSAIOS CELULARES

Outros ensaios imunológicos utilizados na avaliação e estu-do de componentes celulares do sistema imunológico sãotambém descritos neste capítulo. Entre estes estão métodosrotineiros utilizados para medir a função linfocitária. Osensaios destinados a medir as respostas de células B ao es-tímulo antigênico ou mitogênico são às vezes utilizados cli-nicamente para verificar a imunocompetência humoral. Emmodelos experimentais estes ensaios auxiliam a compreen-der os mecanismos reguladores e moleculares associadoscom a ativação da célula B. De modo similar, ensaios paramedir a função da célula T são usados tanto clínica comoexperimentalmente para medir respostas efetoras e prolifera-tivas de células T e perfis de células T e citocinas. Ensaios decélulas T têm contribuído significativamente para a com-preensão da diversidade funcional da célula T e para a

Suspensãoda misturade células

Anticorposfluorescentes

Feixe de laserDetector

Placa dedeflexão

Células nãofluorescentes

Célulasfluorescentes

Figura 5.12 Representação esquemá-tica da separação de células ativadas porfluorescência.

ENSAIOS CELULARES

cap05 5/30/10, 10:09 PM71



Plasmócitos malignos (imortais em cultura de célula) quenão produzem imunoglobulinas são usados na produção deanticorpos monoclonais. As células são transformadas por en-genharia genética para serem deficientes da enzima hipoxan-tina guanina fosforribosil transferase (HGPRT) e por isso nãosobreviverão em cultura a menos que esta enzima seja adiciona-da ao meio em que as células estão crescendo. Estas célulassão fundidas (hibridizadas) com uma fonte de células B re-cém-coletadas de um camundongo recentemente imunizadocom antígeno (por exemplo, células do baço) para formarhibridomas de célula B(Fig. 5.13). A fusão é frequentemen-te efetuada pelo uso de polietilenoglicol (PEG), e, a seguir,as células são cultivadas em meio de cultura deficiente deHGPRT. Uma vez que as células B produtoras de anticorpoproduzem HGPRT, as células do hibridoma sobreviverão sema adição de HGPRT ao meio de cultura. Em poucos dias, osplasmócitos HGPRT negativos não fundidos logo morrerão,assim como todas as células B não fundidas. Aquelas célulashíbridas que sintetizam anticorpo específico serão seleciona-das por algum teste para reatividade ao antígeno (como, por

exemplo, o ELISA) e a seguir clonadas a partir de célulasindividualizadas e propagadas em cultura de tecido, cada clonesintetizando anticorpos de uma única especificidade. Estesanticorpos monoclonais altamente específicos são usados emnumerosos procedimentos que variam desde testes de diag-nóstico específicos a agentes biológicos utilizados naimunoterapia do câncer (ver Capítulo 19). Na imunoterapia,vários fármacos, ou toxinas, são conjugados a anticorposmonoclonais que, por sua vez, liberam estas substâncias jun-to das células tumorais contra as quais os anticorpos são es-pecificamente dirigidos.

Hibridomas de Células T

No final da década de 1970 foram também desenvolvidos mé-todos para a produção de hibridomas de células T. O proces-so envolve a fusão de linhagens de células T malignas comlinfócitos T antígeno-específicos não malignos após expan-são das populações de linfócitos T pela imunização com oantígeno. Os hibridomas de células T têm sido muito úteis na

Camundongo imunizado com AgX Células de mieloma de camundongo

HGPRT�

Ig�, incluindocélulas de baço

anti-AgX HGPRT�, Ig�

Morte celular Fusão Morte celular

Células híbridas“imortais”HGPRT�, Ig�

selecionadasno meio HAT

Triagem quanto ao Anti-AgXe células do clone produzindo

Anti-AgX

Clone 1 Clone 2 Clone 3

Anticorpos monoclonais para o antígeno X

Figura 5.13 Representação esquemática da produção de anticorpos monoclonais.

cap05 5/30/10, 10:09 PM74


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análise da relação entre células T de uma única especificida-de e um epítopo correspondente.

Moléculas e Receptores Produzidospor Engenharia Genética

Até os dias de hoje os anticorpos monoclonais têm sido, emsua maioria, produzidos usando células de camundongo, quesão apropriadas para diagnóstico e muitas outras finalida-des. Contudo, sua administração em seres humanos tem acomplicação potencial da formação de anticorpos contra asimunoglobulinas de camundongo. Tentativas de desenvol-ver anticorpos monoclonais humanos in vitro não têm sidobem-sucedidas.

Anticorpos monoclonais humanos estão sendo produzidosseguidamente por engenharia genética utilizando várias abor-dagens. Um método utiliza a tecnologia do DNA recombinan-te para produzir um anticorpo monoclonal humano-murino qui-mérico. Os chamados anticorpos humanizados são constituí-dos pela região constante da imunoglobulina humana e umaregião variável da imunoglobulina de camundongo. Um méto-do similar é usado para produzir anticorpos humanizados queconsistem em uma região constante humana e outra região va-riável contendo uma região hipervariável de camundongo. Ou-tro método utiliza a reação em cadeia da polimerase (PCR) paragerar bibliotecas genéticas de cadeias pesadas e leves a partirde hibridomas de células B ou DNA de plasmócito. Com estatecnologia agora é possível produzir milhões de clones de di-ferentes especificidades, para selecioná-los rapidamente quantoà especificidade desejada, e para gerar as formas de Fab mono-clonais desejadas sem imunização e sem as dificuldades encon-tradas na produção de anticorpos monoclonais.

A engenharia genética de proteínas imunológicas não estálimitada à produção de anticorpos monoclonais. Muitos genesque codificam receptores de membranas expressos sobre célu-las linfoides e não linfoides têm sido clonados e, em algunscasos, produzidos geneticamente para possibilitar a transferên-cia do gene para células que não expressam normalmente estesreceptores. A expressão de certas moléculas coestimuladorasfacilita as interações célula-célula, tais como o contato físicoentre as células T citotóxicas e células-alvo, o que resulta namorte das células-alvo. A expressão de tais moléculas coesti-muladoras (por exemplo B7) sobre células tumorais através datransferência genética aumenta significativamente a capacida-de de as células T reconhecerem e matarem células-alvo. Es-tratégias de vacinação experimental têm demonstrado que aimunização de animais portadores de tumor com suas própriascélulas tumorais, que foram removidas e transfectadas com ogene B7, podem potencializar as células T para reconhecer e des-truir as células tumorais mães (uma forma de imunoterapia). Umaestratégia similar usando células tumorais transfectadas comcertos genes de citocinas tem sido usada, também com algumsucesso, em modelos animais. Estratégias imunoterapêuticasusadas para tratar inúmeras doenças são discutidas em várioscapítulos deste livro (ver Capítulos 17-19).

MODELOS DE ANIMAISEXPERIMENTAIS

Vários modelos animais importantes in vivo têm sido desen-volvidos, com valor experimental e resultados clínicos simila-res àqueles que surgem do uso de sistema in vitro comentadosantes. Estes sistemas in vivo fundamentam-se no uso de linha-gens consanguíneas de camundongos com uma variedade deperfis genéticos, alguns dos quais são produzidos por engenhariagenética. Algumas linhagens consanguíneas apresentam pre-disposição natural para desenvolver uma doença particular (porexemplo, câncer de mama, leucemia, doença autoimunológica,doença por imunodeficiência combinada grave). Por outro lado,vêm sendo desenvolvidos animais geneticamente alterados, paraexpressar um determinado gene estranho clonado (camundon-gos transgênicos) ou interferir na expressão de genes marcados(camundongos knockout). Tais linhagens são úteis no estudoda expressão de um determinado transgene ou na determina-ção das consequências do silenciamento genético. Começamos,então, com a discussão das linhagens consanguíneas de animais.

Linhagens Consanguíneas

Muitas das experiências clássicas no campo da imunologiaforam realizadas usando linhagens consanguíneas de animaiscomo camundongos, ratos e porquinhos-da-índia (guinea pigs).O cruzamento seletivo de ninhadas por mais de 20 geraçõesgeralmente acarreta a produção de uma linhagem consanguínea.Todos os membros da linhagem consanguínea de animais sãogeneticamente idênticos. Por isso, como os gêmeos idênticos,eles são denominados singeneicos. Respostas imunológicas deanimais consanguíneos podem ser estudadas na ausência devariáveis associadas com diferenças genéticas entre animais.Conforme será discutido no Capítulo 18, transplantes de órgãosentre membros de linhagens consanguíneas são sempre acei-tos posto que seus antígenos do MHC são idênticos. De fato, oconhecimento das leis de transplante e a identificação do MHCcomo a principal barreira genética para transplante surgiram depesquisas utilizando linhagens consanguíneas. Experiênciasusando linhagens consanguíneas levaram à identificação dosgenes de classe I e classe II do MHC (ver Capítulo 8). Tam-bém explicaram sua função principal, a apresentação de frag-mentos peptídicos do antígeno na superfície celular, o que lhespermite ser reconhecidos pelas células T antígeno-específicas.Os capítulos subsequentes explicarão a importante função doMHC na (1) geração de respostas imunológicas normais, (2)no desenvolvimento de células T, (3) na suscetibilidade à do-ença e (4) no transplante de órgãos.

Transferência Adotiva

Como vimos no Capítulo 1, a proteção contra muitas doençasé conferida através da imunidade mediada por células, efetua-da pelas células T antígeno-específicas, e não pela imunidademediada por anticorpo (humoral). A distinção entre estes dois

MODELOS DE ANIMAIS EXPERIMENTAIS

cap05 5/30/10, 10:09 PM75



braços da resposta imunológica pode ser demonstrada pronta-mente pela transferência adotiva de células T ou pela adminis-tração passiva de antissoro ou anticorpos purificados. A trans-ferência adotiva de células T é usualmente realizada usandodoadores e receptores geneticamente idênticos (por exemplo,linhagens consanguíneas) e resulta em imunização adotivaduradoura após contato com o antígeno. Por outro lado, a trans-ferência passiva de soro contendo anticorpos, que pode ser re-alizada cruzando as barreiras do MHC, e é eficaz enquanto osanticorpos transferidos permanecem ativos no receptor, é de-nominada imunização passiva (ver Capítulo 1).

Camundongos SCID

A doença por imunodeficiência combinada grave (SCID)é uma enfermidade na qual as células B e T não se desen-volvem, comprometendo o indivíduo em relação aos meca-nismos de defesa linfoides. O Capítulo 17 discute váriascausas da SCID nos seres humanos. Na década de 1980 umalinhagem consanguínea de camundongos desenvolveu es-pontaneamente uma mutação autossômica recessiva queresultou em SCID em camundongos homozigóticos scid/scid. Em função da ausência de células T e B funcionais oscamundongos SCID são capazes de aceitar células e enxer-tos de tecido de outras linhagens de camundongos ou deoutras espécies. Os camundongos SCID podem ser enxerta-dos com células-tronco hematopoiéticas humanas para criarquimeras SCID-humanas. Tais camundongos quiméricosdesenvolvem células B e T funcionais maduras derivadas dascélulas-tronco humanas precursoras infundidas. Este modeloanimal tornou-se um instrumento de pesquisa valioso, umavez que permite aos imunologistas manipular o sistema imu-nológico humano in vivo e investigar o desenvolvimento devárias células linfoides. Além disso, camundongos SCIDhumanos podem ser usados para testar candidatos à vacina,incluindo aquelas possivelmente úteis na proteção de sereshumanos contra infecção pelo HIV.

Camundongos Timectomizadose Congenicamente Atímicos (Nus)

A importância do timo no desenvolvimento das células T ma-duras pode ser demonstrada pelo uso de camundongos timec-tomizados ao nascer, irradiados, e depois reconstituídos commedula óssea singeneica. Tais camundongos não desenvolvemcélulas T maduras. Similarmente, camundongos homozigotospara uma mutação em um gene chamado nu também não de-senvolvem células T maduras, uma vez que a mutação resultaem um fenótipo atímico (e sem pelo, por isso o termo nu). Emambas as situações, o desenvolvimento da célula T pode serrestaurado enxertando-se estes camundongos com tecido epite-lial tímico. Da mesma maneira que os camundongos SCID, es-tes modelos animais têm sido úteis no estudo do desenvolvi-mento da célula T. Eles também têm sido úteis para a propaga-ção in vivo de linhagens de células tumorais e tecido tumoral

recentemente coletado de outras linhagens e de outras espéciesem função da ausência das células T necessárias para a rejei-ção das células estranhas.

CAMUNDONGOS TRANSGÊNICOSE MARCAÇÃO GENÉTICA

Camundongos Transgênicos

Outro sistema animal significativo, muito usado em pesqui-sa imunológica, é o camundongo transgênico. Os camun-dongos transgênicos são produzidos injetando-se um geneclonado (transgene) em “ovos” fertilizados de camundon-go. Os ovos são, a seguir, microinjetados em camundongostornados pseudoprenhes utilizando-se terapia hormonal (Fig.5.14). A taxa de sucesso desta técnica é um tanto baixa comaproximadamente 10 a 30% da descendência expressando otransgene. Considerando que o transgene fica integrado tantonas células somáticas quanto nas germinais, ele é transmiti-do para a descendência como um traço mendeliano. Cons-truindo um transgene com um determinado promotor é pos-sível controlar a expressão do transgene. Por exemplo, al-guns promotores funcionam apenas em certos tecidos (opromotor da insulina funciona apenas no pâncreas); outrosfuncionam em resposta a sinais bioquímicos que podem serdados como um suplemento da dieta (o promotor dametalotionina que funciona em resposta ao zinco pode seradicionado a água potável). Camundongos transgênicos fo-ram utilizados para estudar genes que não são usualmenteexpressos in vivo (por exemplo, os oncogenes), assim comoos efeitos de transgenes que codificam moléculas de imu-noglobulinas particulares, receptores de célula T, molécu-las de classe I ou de classe II do MHC, e inúmeras citoci-nas. Em alguns camundongos transgênicos, todo o lócus deimunoglobulina murino foi substituído por genes de imu-noglobulina humana, que são úteis para gerar anticorpos “hu-manos” no camundongo. Há duas desvantagens no métodotrangênico. Primeiro, o transgene se integra ao acaso no ge-noma. Segundo, não é fisiológico expressar altas quantida-des de transgenes em tecidos errados, de maneira que osinvestigadores devem ter muito cuidado ao interpretar resul-tados obtidos em camundongos transgênicos.

Camundongos Knockout

Algumas vezes, é de interesse determinar como a remoçãode um certo produto genético afeta o sistema imunológico.Usando um método de marcação genética é possível subs-tituir um gene normal por um que tenha sofrido mutação ouse rompido para gerar os chamados camundongos knockout.Diferentemente dos camundongos transgênicos, os camun-dongos knockout expressam transgenes que se integram agenes endógenos específicos através de um processo conhe-cido como recombinação homóloga. Qualquer gene para o

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qual exista um transgene que tenha sofrido mutação ou al-teração pode ser virtualmente afetado deste modo. Os ca-mundongos knockout são gerados usando-se transgenesque tenham sofrido mutação ou alterações que afetam, e emconsequência silenciam, a expressão de uma variedade degenes importantes incluindo aqueles que codificam citoci-nas particulares e moléculas do MHC. Os camundongosknockout também foram usados para identificar a região dosgenes essenciais para a função genética normal. Com a fi-nalidade de identificar a parte do gene que responde, dife-rentes cópias do gene que sofreu mutação são introduzidasde volta no genoma, por transgênese, para constatar-se qualdeles restaura a função normal.

ANÁLISE DA EXPRESSÃO GENÉTICA:MICRODISPOSITIVOS

Os microdispositivos ou chips genéticos são instrumentos po-derosos para examinar o nível da expressão de milhares degenes simultaneamente. O microdispositivo inclui milharesde fragmentos de DNA, cada um com uma sequência carac-terística, ligados em um arranjo ordenado a uma lâmina devidro ou outra superfície. Estes fragmentos de DNA, na for-ma de cDNA (geralmente 500-5.000 pares de bases de com-primento) ou oligonucleotídios (20 a 80 pares de bases decomprimento), podem representar genes de todas as partesdo genoma; alternativamente, microdispositivos especiali-zados podem ser preparados usando DNA de genes que seacredita ser de particular interesse. Para realizar um ensaiode microdispositivo, uma amostra do RNA mensageiro total(mRNA, o produto obtido da transcrição de todos os genes

ativos) de uma célula ou tecido é comumente analisada comoreferência para comparar a expressão genética entre váriasamostras. Por exemplo, diferentes tipos celulares ou tecidopodem ser comparados, células podem ser comparadas emdiferentes estágios de diferenciação ou células tumorais po-dem ser comparadas com suas contrapartes normais. As amos-tras adicionadas ao microdispositivo não são geralmentemRNAs; em vez disso, o mRNA total é transcrito reversamen-te no cDNA, o qual é, a seguir, marcado com um material flu-orescente (um fluorocromo). Fluorocromos coloridos diferen-tes são usados para marcar, de modo distinto, as diferentesfontes de cDNA. A Fig. 5.15 ilustra como os microdispositi-vos são usados para comparar a expressão genética de umapopulação de células linfoides tumorais com uma populaçãode células normais. Um fluorocromo vermelho é usado paramarcar cDNAs da célula tumoral experimental e umfluorocromo verde é usado para preparar cDNAs das contra-partes normais controles. Os cDNAs marcados são colocadossobre o microdispositivo e deixados para hibridizar pelopareamento de bases com os fragmentos de combinação. Asamostras de cDNA derivadas de ambas as amostras são com-binadas de maneira que elas competem pela ligação aomicrodispositivo. O material não hibridizado é eliminado porlavagem, deixando pontos de fluorescência onde o pareamentoocorreu. No fim da reação de hibridização o microdispositivoé varrido a laser para revelar os pontos vermelhos, verdes ouamarelos, indicando níveis mais altos do cDNA da célula tu-moral experimental (vermelhos), níveis mais altos do cDNAcontrole (verdes), ou níveis iguais de DNA nas duas amos-tras (amarelos). Para interpretar os resultados, uma varredurade fluorescência examina cada ponto sobre a lâmina quantoao nível preciso de fluorescência. Os dados são, a seguir, ana-

Ovos fertilizados isoladosde camundongo prenhe

“Transgene” clonadoinjetado no pró-núcleo

PotencializadorPromotor

Sequênciaterminal

Gene

Implante dos ovos injetadosno camundongo pseudoprenhe

Triagem de descendentes quanto à expressãode transgene. Geração de camundongo expressando

transgene para gerar a linhagem transgênica.

Figura 5.14 Procedimento geral paraa produção do camundongo transgênico.

ANÁLISE DA EXPRESSÃO GENÉTICA: MICRODISPOSITIVOS

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lisados por um programa de computador que combina geral-mente a informação da fluorescência com uma base de dadosgenética para determinar os genes que estão superexpressosou subexpressos nas amostras analisadas. A caracterização dopadrão e a quantidade de ligação ao microdispositivo têm

Amostra demRNA da célulalinfoide tumoral

Amostra demRNA da célulalinfoide normal

Transcriçãoreversa para

cDNA e marcaçãocom corantesfluorescentes

Hibridizar emmicrodispositivo

Cada poço contémum oligonucleotídio

Figura 5.15 Ensaio do microdispositivo comparando amostras de mRNA oriundo de células linfoides tumorais e células linfoides normais.

muitos usos potenciais no campo da imunologia, incluindo odiagnóstico clínico de tumores linfoides, desenvolvimento defármacos e descoberta de novos genes. Candidatos a fárma-cos imunossupressores, por exemplo, podem ser analisadospor seus efeitos sobre a expressão de genes de citocinas.

RESUMO

1. A reação entre um anticorpo e um antígeno não en-volve forças covalentes; ela envolve forças fracas deinteração tais como forças eletrostáticas, hidrofóbi-cas e de van der Waals. Consequentemente, para umainteração significativa, o sítio de combinação do an-ticorpo e o antígeno requerem um firme ajuste comoo que acontece entre uma chave e uma fechadura.

2. Apenas a reação entre um antígeno multivalente e umanticorpo, que é pelo menos bivalente, pode acarretarreações antígeno-anticorpo que resultam na ligação cru-zada de moléculas de antígeno pelos anticorpos. Estasreações não ocorrem com haptenos ou Fab monovalente.

3. A interação entre um anticorpo solúvel e um antígenoparticulado insolúvel resulta em aglutinação. A intensi-dade da aglutinação depende das proporções de intera-ção entre antígeno e anticorpo. Em altos níveis de anti-corpo, a aglutinação pode não ocorrer. Isto é denomina-do prozona. O termo título se refere à mais alta diluição

do soro na qual a aglutinação ainda ocorre e acima daqual (em diluições maiores) a aglutinação não ocorre.

4. A reação de precipitação ocorre pela mistura, em pro-porções ideais, de antígeno multivalente solúvel e an-ticorpos que são, pelo menos, bivalentes. A reação deprecipitação pode ocorrer em meio aquoso ou em géis.

5. A reação em géis entre antígeno solúvel e anticorpospode ser utilizada para análise qualitativa e quantita-tiva do antígeno ou anticorpo. Os exemplos incluemas reações de precipitação em géis, imunodifusão ra-dial e imunoeletroforese.

6. O radioimunoensaio (RIA) é um teste muito sensí-vel utilizado para quantificar anticorpo e antígeno.Ele emprega o uso de antígeno ou anticorpo radio-marcado e se baseia na inibição competitiva entre an-tígeno não marcado e antígeno marcado. O antígenoligado ao anticorpo deve ser separado dos antígenos

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marcados não ligados. A separação é geralmente al-cançada pela precipitação com anti-imunoglobulinas.

7. O imunoensaio de fase sólida é um teste que exploraa capacidade de muitas proteínas aderir ao plástico eformar uma monocamada. O antígeno é aplicado aosorifícios plásticos, os anticorpos são adicionados, oorifício é lavado, e quaisquer anticorpos ligados ao an-tígeno são mensuráveis pela utilização de anti-imuno-globulinas radiomarcadas ou ligadas à enzima.

8. O ensaio do imunossorvente ligado à enzima (ELISA) éum imunoensaio de fase sólida no qual uma enzima é li-gada à anti-imunoglobulina. A quantificação é alcança-da pela avaliação colorimétrica após a adição de um subs-trato que muda de cor em resposta à atividade enzimática.

9. Na imunofluorescência, um antígeno é detectado pelautilização de imunoglobulinas marcadas com fluores-cência. Na imunofluorescência direta, o anticorpo parao antígeno em questão é fluorescente. Na imunofluo-rescência indireta, o anticorpo específico para o antí-geno não é marcado; ele é detectado pela adição de anti-

imunoglobulina marcada com fluorescência. Osseparadores de células ativadas por fluorescência (FACS)são instrumentos que podem ser utilizados para quan-tificar e separar células marcadas com fluorescência.

10. Os ensaios utilizados para avaliar a função linfocíticamedem normalmente suas respostas proliferativas oufunções efetoras. As células B, por exemplo, podem serfuncionalmente avaliadas medindo-se sua capacidade deproliferar e produzir anticorpos em resposta a mitóge-nos de células B tal como o LPS. As células T são fre-quentemente avaliadas medindo-se sua capacidade deajudar outras células (no caso das células CD4+) ou des-truir alvos portando antígeno (no caso das células CD8+).Além disso, as células T podem ser avaliadas medindo-se sua capacidade de proliferar e produzir certas cito-cinas em resposta a mitógenos como PHA ou Con A.

11. Os anticorpos monoclonais são reagentes altamenteespecíficos consistindo em populações homogêneasde anticorpos, todos precisamente da mesma especi-ficidade para um epítopo.

REFERÊNCIAS

QUESTÕES DE REVISÃO

Para cada questão, escolha A MELHOR resposta.

1. Qual das seguintes interações é necessária para garan-tir a integridade e estabilidade das moléculas de Ig, masnão está associada com interações entre antígenos e an-ticorpos?A) ligações covalentesB) forças de van der WaalsC) forças hidrofóbicasD) forças eletrostáticasE) um intenso ajuste entre um epítopo e o anticorpo

2. Se uma preparação de anticorpo IgG específica paralisossoma do ovo de galinha (HEL) é tratada com papaínapara gerar fragmentos Fab, qual das seguintes afirmativasrelativas à avidez destes fragmentos é verdadeira?A) eles terão uma menor avidez pelo HEL quando comparados

com a IgG intactaB) eles terão uma maior avidez pelo HEL quando comparados

com a IgG intactaC) eles terão a mesma avidez pelo HEL como pela IgG intactaD) eles terão perdido sua avidez para ligar para o HELE) eles terão a mesma avidez, mas terão menor afinidade pelo HEL


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3. Os ensaios de Western blot utilizados para testar amostrasde soro quanto à presença de anticorpos para agentes infec-ciosos, tal como o HIV, são particularmente úteis comoensaios diagnósticos porque:A) eles são mais sensíveis que o ELISAB) podem ser detectados anticorpos específicos para múltiplos

epítopos antigênicosC) eles fornecem dados quantitativos para análise de amostrasD) eles permitem a análise simultânea de muitas amostrasE) Eles são mais baratos e consomem menos tempo para a rea-

lização quando comparados com o ELISA

4. A principal diferença entre camundogos transgênicos e ca-mundongos knockout é:A) os camundongos transgênicos sempre empregam o uso de

genes clonados derivados de outras espéciesB) os camundongos transgênicos possuem genes estranhos que se

integram em loci marcados através de recombinação homólogaC) os camundongos transgênicos possuem um gene funcional

estranho adicionado ao seu genomaD) os camundongos knockout sempre possuem um fenótipo ca-

racterístico

5. Camundongos SCID possuem um defeito genético queimpede o desenvolvimento funcional de:A) células hematopoiéticasB) células B e TC) células T e NKD) células tronco pluripotentesE) células mieloides

6. Qual das seguintes afirmativas em relação ao hibridomade célula B é verdadeira?A) eles constituem linhagens de células imortalizadas que pro-

duzem anticorpos com mais de uma especificidadeB) eles são derivados das células B que foram inicialmente clonadas

e cresceram em cultura de células por curtos períodosC) eles contêm um núcleoD) eles são derivados da fusão de células B com células plas-

máticas malignas incapazes de secretar imunoglobulinas

7. Um ELISA idealizado para testar a presença de anticor-po sérico para uma nova cepa de bactéria patogênica estásendo desenvolvido. Inicialmente, um anticorpo mono-clonal específico para um único epítopo do microrga-nismo foi usado tanto para sensibilizar os poços da placade ELISA quanto como anticorpo de detecção marcadocom enzima, em um ELISA sanduíche convencional. OELISA falhou na detecção do antígeno a despeito do usode uma larga faixa de concentrações de anticorpo. Quala causa mais provável deste problema?A) a quantidade de antígeno usada no ensaio foi muito grandeB) o anticorpo tem baixa afinidade pelo antígeno.C) o anticorpo monoclonal usado para sensibilizar os poços es-

tava bloqueando o acesso ao epítopo, assim como, quando omesmo anticorpo está marcado com a enzima, ele não podese ligar ao antígeno

D) o anticorpo marcado com a enzima deveria ter sido de umisotipo diferente daquele do anticorpo sensibilizante

E) o anticorpo monoclonal usado era provavelmente instável

RESPOSTAS ÀS QUESTÕES DE REVISÃO

1. A Nenhuma ligação covalente está envolvida na interação entreanticorpo e antígeno. As forças de ligação são relativamente fracas eincluem forças de van der Waals, forças hidrofóbicas e forçaseletrostáticas. Torna-se necessário um ajuste muito intenso entre umepítopo e o anticorpo.

2. A A avidez denota a energia de ligação total entre anticorpos eantígenos multivalentes. Considerando que a valência dos fragmen-tos Fab é 1 quando comparada com a molécula de IgG específicapara HEL, que possui valência 2 (devido à presença de duas regiõesFab), a avidez dos fragmentos será mais baixa. A escolha E é incor-reta, uma vez que a afinidade dos fragmentos Fab será a mesma emcada uma das regiões Fab da molécula de IgG intacta.

3. B Nos ensaios de Western blot, as técnicas de separaçãoeletroforéticas são usadas para “estabelecer” a massa molecular de umdeterminado antígeno ou misturas de antígenos. Considerando que asrespostas de anticorpos a agentes infecciosos geram respostas policlo-nais em virtude da existência de complexos determinantes antigêni-cos expressos por tais agentes, ensaios de Western blot podem confir-mar a presença desses anticorpos que reagem com antígenos de pesosmoleculares conhecidos separados eletroforeticamente.

4. C Genes estranhos clonados a partir da mesma ou outras espéciessão introduzidos em camundongos para gerar uma cepa transgênica. Aintegração é ao acaso e ocorre tanto na célula somática quanto nas ger-minais. A escolha D é incorreta porque algumas vezes o camundongo

knockout não tem um fenótipo característico causado pela substituiçãode um gene funcional por um que não é funcional, provavelmente pelaatividade de mecanismos redundantes ou compensatórios.

5. B Os camundongos SCID possuem uma mutação autossômicarecessiva que causa uma doença na qual as células B e T não se de-senvolvem. Como suas contrapartes humanas, os camundongosSCID estão comprometidos no que diz respeito aos mecanismos dedefesa linfoides. Células-tronco pluripotentes presentes no camun-dongo SCID podem originar outras linhagens hematopoiéticas, in-cluindo células da linhagem mieloide e células NK.

6. D O método usado para gerar hibridomas de célula B empre-ga a fusão de células B (por exemplo, do baço e linfonodo) cole-tadas de camundongos imunizados com uma população selecio-nada de plasmócitos malignos incapazes de secretar imunoglo-bulinas. O processo produz um anticorpo monoclonal secretadopor células que contêm núcleos das células B e plasmócitos quetenham se fundido.

7. C Em um ELISA sanduíche um anticorpo (frequentemente mo-noclonal) usado para cobrir os poços do ELISA se ligará ao epítopopara o qual ele é específico. No exemplo apresentado, o mesmo an-ticorpo monoclonal epítopo-específico é usado como anticorpo dedetecção marcado com enzima. O anticorpo monoclonal de sensi-bilização está bloqueando o acesso ao epítopo, pelo anticorpo mo-noclonal marcado com a enzima, de maneira que ele não se ligará.

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BIOLOGIA DO LINFÓCITO T

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Immunology: A Short Course, Sixth Edition, By Richard Coico and GeoffreySunshineCopyright © 2009 John Wiley & Sons, Inc.

INTRODUÇÃO

Os capítulos iniciais se focaram nas características dos lin-fócitos B e seus receptores para antígenos, a imunoglobuli-na. No Capítulo 8, foi introduzido o papel das respostas imu-nológicas envolvendo os linfócitos T (células T) e discuti-dos os papéis-chave das moléculas do MHC e peptídios nes-tas respostas.

O enfoque deste capítulo são as características das célu-las T. Conforme descrito no capítulo anterior, acredita-se queas células T evoluíram para lidar com a etapa crucial da res-posta contra os patógenos — tais como vírus, bactérias e pa-rasitas — que ocorrem dentro das células do hospedeiro.Como as proteínas são tanto os principais componentes dospatógenos, como também por serem sintetizadas por estes,as células T desempenham uma função importante na res-posta contra quase todos os agentes danosos — e antígenos“inócuos” — aos quais um indivíduo é exposto.

Inicialmente vamos descrever o receptor para antígeno dascélulas T — o TCR — e comparar suas características comaquelas da Ig, para, em seguida, descrever outras moléculasimportantes na superfície da célula T. Posteriormente, iremosexplicar as etapas-chave do desenvolvimento da célula T notimo, o órgão no qual a célula T em desenvolvimento adquireseu TCR, e descrever também o papel decisivo desempenha-do pelas moléculas do MHC durante o desenvolvimento dacélula T no timo.

RECEPTOR ANTÍGENO-ESPECÍFICODE CÉLULA T

Moléculas que Interagem com o Antígeno

Assim como as células B, as células T expressam um recep-tor antígeno-específico que é clonalmente distribuído; cadaclone de célula T expressa um TCR de sequência única. Ogrande repertório de moléculas de TCR, que se calcula ser daordem de 1018 diferentes estruturas possíveis, é formado pelamesma estratégia de rearranjo genético V(D)J descrita paraas moléculas de Ig no Capítulo 6. Os aspectos característicosdo rearranjo genético do TCR serão discutidos com mais de-talhes ainda neste capítulo.

O lado esquerdo da Fig. 9.1 mostra a forma do TCR ex-presso na maioria das células T maduras de seres humanos eem muitas outras espécies. Ele é constituído por duas cadeiaspolipeptídicas, � e �, unidas por ligações dissulfeto. As ca-deias � e � do TCR são glicoproteínas transmembrânicas comextremidades citoplasmáticas curtas; devido a diferenças naexpressão de carboidratos, os pesos moleculares das cadeiasvariam entre 40 e 60 kDa. As cadeias � e � do TCR são cons-tituídas de regiões variáveis (V) e constantes (C), análogas àsregiões V e C das moléculas de Ig (ver Figs. 4.3 e 4.14). Cadaregião V e C do TCR se dobra em um domínio do tipo Ig. Alémdisso, assim como a Ig, as regiões V� e V� do TCR contêmtrês regiões hipervariáveis ou determinantes da complemen-

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127RECEPTOR ANTÍGENO-ESPECÍFICO DE CÉLULA T

forme descreveremos no Capítulo 10, a ativação da célula Tresulta na secreção de citocinas e/ou na morte das células in-fectadas do hospedeiro. Em contrapartida, após o antígeno seligar à Ig de membrana e ativar a célula B, esta se diferenciaem plasmócito que secreta Ig com a mesma especificidadeantigênica expressa pela célula B, que inicialmente se ligouao antígeno (ver Capítulo 7).

Ausência de Mudanças no TCR Durante a Respos-ta ao Antígeno. Conforme discutido nos Capítulos 6 e 7,durante o curso da resposta ao antígeno, as moléculas de Igsofrem hipermutação somática (com associada maturação daafinidade) e troca de isotipo, a ligação de um conjunto degenes que codifica uma determinada região V a diferentesgenes da região C. Estes mecanismos são característicos dascélulas B. O TCR não muda durante a resposta ao antígeno.

Complexo do Receptor de Célula T

A Fig. 9.1 mostra que as cadeias � e � do TCR, que reco-nhecem o antígeno, são expressas também na superfície dascélulas T em associação estreita, não covalente, com a mo-lécula CD3 e com duas cadeias � (zeta) idênticas (CD247com peso molecular de 16 kDa). CD3 e � não se ligam aoantígeno. Elas são moléculas de transdução de sinal ativa-das após a ligação do antígeno às cadeias � e � do TCR esão análogas às moléculas Ig� e Ig�, associadas à Ig docomplexo de receptor antígeno-específico da superfície dacélula B, conforme descrito no Capítulo 7. A combinaçãodas cadeias � e � do TCR mais a CD3 e � é conhecida comosendo o complexo do TCR.

A CD3 compreende os três polipeptídios distintos �, � e �(pesos moleculares de 25, 20 e 20 kDa, respectivamente). Todasestas moléculas contêm uma estrutura em alça dobrada caracte-rística de Ig e são membros da superfamília de Igs. Como a CD3desempenha papel de chaperon no transporte da molécula deTCR recém-sintetizada, através da célula para a superfície celu-

lar, ela sempre está associada ao TCR. A CD3 é invariante (amesma) sobre todas as células T; como ela é expressa exclusiva-mente nas células T, pode ser usada como um marcador paradistinguir as células T de todas as outras células.

Cada cadeia do complexo CD3 também contém uma se-quência contendo tirosina, conhecida como um motivo deativação baseado na tirosinado imunorreceptor — tambémencontrado em Ig� e Ig� — e a cadeia � contém três. Confor-me será descrito em mais detalhes no Capítulo 10, após oantígeno se ligar às cadeias � e � do TCR, os ITAMs da CD3e das cadeias � realizam papel importante nas fases iniciaisde ativação da célula T.

Moléculas Correceptoras

Nas células T maduras, o TCR é expresso na superfície dacélula T em associação com outra molécula transmembrana,conhecida como um correceptor. O correceptor da célula Tnão liga antígeno, mas aumenta a capacidade de o antígenoativar as células T; em outras palavras, a expressão docorreceptor reduz o limiar para a resposta ao antígeno, confor-me será descrito adiante. Desta forma, o correceptor de célulaT é análogo ao correceptor da célula B — os complexos CD19,CD21 e CD81 — conforme descrito no Capítulo 7.

A Fig. 9.3 mostra que o correceptor nas células T madu-ras é o CD4 ou a molécula de duas cadeias CD8, ambos mem-bros da superfamília das Igs. Conforme descreveremos pos-teriormente neste capítulo, somente as células T imaturas emdiferenciação no timo expressam tanto CD4 quanto CD8.CD4 e CD8 são quase exclusivamente expressos nas célu-las T; a expressão do correceptor divide a população de cé-lulas T em duas principais subpopulações conhecidas comocélulas T CD4+ e T CD8+. Em pessoas saudáveis, a relaçãoentre células T CD4+ e T CD8+ na circulação é de aproxi-madamente 2:1, mas em condições que apresentam níveisreduzidos de células T CD4+, como na AIDS, esta relação éreduzida (ver Capítulo 17).

Figura 9.2 Interação do TCR com uma molé-cula do MHC-modelo (de classe I ou II) e com umpeptídio ligado, expressos na superfície da célulado hospedeiro.

Célula dohospedeiro

Molécula do MHC

Peptídio

Regiãohipervariável

Célula T

V� V�TCR

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128 CAPÍTULO 9 BIOLOGIA DO LINFÓCITO T

CD4 e CD8 possuem várias funções importantes:

• As porções extracelulares de CD4 e CD8 se ligam às por-ções invariáveis das moléculas do MHC expressas na su-perfície das células do hospedeiro. A Fig. 9.3A mostraque CD4 se liga seletivamente às células expressando mo-léculas de classe II do MHC; conforme descrito no Ca-pítulo 8 e discutido posteriormente com maiores detalhesneste capítulo e no Capítulo 10, as moléculas de classe IIdo MHC são expressas constitutivamente nas APCs:células dendríticas, macrófagos, células B e células epi-teliais tímicas. Assim, as células T CD4+ interagem comas células do hospedeiro que expressam antígeno ligadoao MHC de classe II.

A Fig. 9.3B mostra que o CD8 se liga seletivamente àscélulas expressando as moléculas de classe I do MHC, quesão expressas na superfície de todas as células nucleadas docorpo. Assim, as células T CD8+ interagem com as célulasexpressando antígeno associado com o MHC de classe I.

• A ligação do CD4 ou CD8 às moléculas do MHC ex-pressas nas APCs ajuda a fortalecer a ligação das célu-las T à APC. Assim, CD4 e CD8 agem como molécu-las de adesão nas interações da célula T com a APC.

• CD4 e CD8 estão envolvidos na transdução de sinalapós a ligação do antígeno ao TCR. Especificamente,as porções intracelulares de CD4 e CD8 estão ligadas aenzimas, conhecidas como proteína tirosina quinase,que são componentes iniciais importantes nas vias deativação da célula T. Este conceito será discutido maisdetalhadamente no Capítulo 10.

• A característica típica da molécula CD4 é que ela se ligaao HIV. Isto permite que o vírus infecte células expres-sando CD4, o que acarreta o desenvolvimento da AIDS(ver Capítulo 17). Nos seres humanos, o CD4 é expres-so em baixos níveis pelos macrófagos e células dendrí-ticas, assim como pelas células T; assim, todos estestipos celulares podem ser infectados pelo HIV.

Outras Moléculas Importantes Expressasna Superfície da Célula T

Nos parágrafos seguintes e na Fig. 9.4 descreveremos asmoléculas além daquelas associadas ao complexo TCR e aos

correceptores de célula T, que desempenham papéis impor-tantes na função da célula T.

Ligantes Coestimulatórios. Para que sejam ativadas,as células T inocentes, aquelas células T que não se encon-traram com o antígeno previamente, precisam mais do que ainteração do sinal primárioentre o peptídio e o MHC, expres-so na APC, e o TCR, expresso pela célula T. Além disso, ascélulas T inocentes precisam de sinais secundários, tambémchamados de interações coestimulatórias, para a completaativação da célula T. Estas interações coestimulatórias aumen-tam o sinal liberado pelo complexo do TCR.

Múltiplos pares de tais moléculas coestimulatórias foramidentificados nas superfícies da célula T e da APC. A interaçãocoestimulatória melhor compreendida ocorre entre CD28 ex-presso na célula T madura e as moléculas da família B7 ex-pressas na APC. Esta interação, que iremos discutir em maio-res detalhes no Capítulo 10, é decisiva para as células T ativa-das por antígenos sintetizarem a citocina IL-2, um fator de cres-cimento de célula T, que é necessário para a proliferação des-tas células. As células T também expressam CD40 ligante(CD40L ou CD154), que interage com o CD40 expresso nosmacrófagos, células B e células dendríticas. Esta interaçãoaumenta a interação coestimulatória B7-CD28. A interação deCD40 e CD40 ligante também desempenha papel decisivo namudança de isotipo nas células B dependentes de células T.

Parece que a interação de alguns pares coestimulatórios têmefeitos distintos da ativação de célula T, incluindo sinaliza-ção negativa. CTLA-4 (CD152), uma molécula intimamenterelacionada com CD28, é expressa nas células T ativadas einterage com moléculas B7 para transmitir uma sinalizaçãonegativa à célula T ativada, que ajuda a terminar a resposta.

Moléculas Envolvidas na Adesão e Endereçamento.CD2, assim como CD4 e CD8, tem propriedades de sinaliza-ção e transdução de sinal. CD2 é expresso quase exclusivamentenas células T e é expresso por quase todas as células T madu-ras. Nos seres humanos, CD2 interage com CD58 (LFA-3)expresso em muitas células diferentes.

As células T também expressam moléculas de superfícieassociadas com o endereçamento, a entrada preferencial dediferentes tipos de linfócitos em diferentes tecidos. Assimcomo o endereçamento da célula B (descrito no Capítulo 7),o endereçamento da célula T é altamente regulado pela ex-

Figura 9.3 Correceptores do TCR e suas interações comas moléculas do MHC expressas nas células do hospedeiro:(A) CD4 com MHC de classe II expressos na APC; (B) CD8 comMHC de classe I expressos em todas as células nucleadas.

MHC de classe II

Correceptor

MHC de classe I

Célula dohospedeiro

Peptídio

Célula T

Correceptor

Peptídio

Célula T

A B

TCR

CD4CD8

TCR

APC

cap09 6/10/10, 11:32 AM128



(Notar que as cadeias �� do TCR são diferentes das cadeias �e � de CD3.) Normalmente, as células �� não têm as molécu-las correceptoras CD4 e CD8 encontradas nas células T expres-sando ��, entretanto, as células �� encontradas no intestinoexpressam CD8. Conforme descreveremos mais adiante nestecapítulo, as linhagens �� e �� divergem cedo durante o desen-volvimento intratímico.

As células T �� são encontradas sobretudo em locais doepitélio mucoso, como pele, intestino e pulmão, entretanto,aparecem em números proporcionalmente mais baixos do queas células T �� na circulação de seres humanos adultos nor-mais. As células T �� estão presentes em todos os mamíferosem diferentes níveis; o sangue periférico dos ruminantes, queincluem o boi e o cervo, pode conter níveis mais altos de cé-lulas T �� do que as ��.

Como as células de TCR �� são encontradas especialmentenas mucosas, admite-se que elas constituam uma primeira linhade defesa contra os patógenos invasores. Estas células respon-dem a patógenos, como as micobactérias, rapidamente produzin-do citocinas, particularmente interferon gama; elas também têmfunções citotóxicas. Assim, as células de TCR �� proporcionama primeira linha de defesa contra patógenos invasores. No en-tanto, os tipos de antígenos com os quais as células T �� intera-gem diferem dos complexos MHC-peptídio reconhecidos pelascélulas T ��; as células T �� respondem a fosfolipídios e a ou-tras moléculas pequenas não proteicas, conhecidas comofosfoantígenos, assim como as proteínas do choque térmico (pro-teínas que se formam em células quando elas são aquecidas ouestressadas por diferentes formas). As células T �� interagem comtais antígenos apresentados pelos CD1 ou pelas moléculas nãopolimórficas de classe I do MHC (discutidas no Capítulo 8).

Conforme descreveremos na próxima seção, o número depossíveis estruturas que podem ser formadas pela recombi-nação dos segmentos gênicos V� e V� é tão alto ou ainda maisalto do que o número que pode ser formado pela recombina-ção dos segmentos gênicos V� e V�. Entretanto, por moti-vos que não são conhecidos, há muito menos variabilidade norepertório das células de TCR �� do que no repertório das ��.As células �� encontradas em diferentes locais do organismoparecem usar distintas, entretanto limitadas, combinações desegmentos gênicos V� e V�.

GENES QUE CODIFICAM OSRECEPTORES DA CÉLULA T

A organização dos lóci dos genes humanos que codificam ascadeias �, �, � e � do TCR é mostrada na Fig. 9.5. Observaras seguintes características:

• As cadeias � e � são construídas a partir dos segmen-tos gênicos V e J, assim como as cadeias leves da Ig,entretanto, as cadeias � e � são construídas a partir dossegmentos gênicos V, D e J, assim como as cadeias pe-sadas da Ig.

• Os segmentos gênicos dos lóci do TCR � e � são intercala-dos no mesmo cromossoma; de fato, os genes que codifi-cam a cadeia � do TCR são flanqueados tanto na extremi-dade 5� quanto na 3� por genes que codificam a cadeia �.Os mecanismos de rearranjo genético nos lóci � e � asse-guram que � e � não sejam expressos na mesma célula T.

• Os lóci do TCR � e � são encontrados cada um em di-ferentes cromossomas.

• Existem muito mais genes V� e V� (aproximadamente 50e 70, respectivamente) do que genes V� e V� (5-10) nascélulas de linhagem germinativa. Além disso, há dois di-ferentes genes C� (C�1 e C�2), entretanto, estes genes eseus produtos são virtualmente idênticos e não têm dife-renças funcionais conhecidas. Assim, eles não devem serconfundidos com isotipos de anticorpo, em que os genesde cadeia pesada constante de Ig e seus produtos diferemconsideravelmente e têm diferentes funções efetoras: asregiões C do TCR não dispõem de função efetora.

GERAÇÃO DA DIVERSIDADE DORECEPTOR DE CÉLULA T

Os mecanismos para formar a diversidade dos TCRs são bas-tante semelhantes aos mecanismos de formação da diversida-de dos BCRs. Os mesmos princípios fundamentais do rearran-jo genético descrito no Capítulo 6 para a Ig se aplicam na sín-tese das regiões V e C de cada cadeia �, �, � e � dos TCRs.

Figura 9.5 Organização dos geneshumanos �, �, � e � codificadores doTCR.

3′ lócus �

3′ lóci � e �

3′ lócus �

J�1C� J�n C�

V�1 V�2 V�n D�1 J�1.1 J�1.n C�1 D�2 J�2.nJ�2.1 C�2

V� (n� 5) J� (n� 3) J� (n� 2)C�1 C�2

J�1 (n� 6) J�2 (n� 6)

D� (n� 3) J� (n� 3)V� (�70) � V�(�10)

J� (n� 60)

V� (n� 50)

5′

5′

5′

cap09 6/10/10, 11:32 AM130


131DIFERENCIAÇÃO DA CÉLULA T NO TIMO

Recombinases e sequências de junção são usadas para ligaruma unidade VJ ou VDJ, gerando a especificidade da regiãovariável de uma determinada cadeia polipeptídica do TCR. Asmesmas enzimas estão envolvidas nos eventos de recombina-ção em ambas as células B e T. Conforme descrito nos Capítu-los 6 e 7, os dois genes conhecidos como genes de ativação darecombinação (RAGs), RAG-1 e RAG-2, desempenham pa-pel importante na ativação dos genes da recombinase tanto nascélulas B iniciais quanto nas células T iniciais. Além disso,assim como as células B (ver Capítulo 6), defeitos na recombi-nação V(D)J, que envolve a quebra e reunião dos segmentosdo DNA, podem causar doenças, especialmente malignidades,na linhagem de célula T (ver também Capítulo 17).

Em resumo, assim como na geração da diversidade de Ig, adiversidade do TCR é gerada por (1) múltiplos genes V na li-nhagem germinativa, (2) combinação aleatória das cadeias e (3)variabilidade de junção e inserção. Entretanto, inicialmente nocapítulo, foi mostrada uma diferença importante entre a geraçãoda diversidade dos TCRs e das moléculas de Ig: após estímuloantigênico a Ig sofre hipermutação somática, mas o TCR não.

O número teórico de diferentes estruturas de TCRs que po-dem ser geradas para os TCRs �� e �� é de aproximadamente1013, enquanto o repertório de células T �� encontradas em umindivíduo é menor e, conforme comentado anteriormente nocapítulo, o número de células T �� é ainda menor. As variabili-dades juncional e de inserção, que são importantes contribuintespara a diversidade do TCR, resultam em um número enorme desequências diferentes para a parte da região hipervariável do TCRconhecida como CDR3. (As sequências CDR1 e CDR2 do TCRnão são geradas pelo rearranjo, mas são codificadas pelos ge-nes V encontrados na linhagem germinativa.) CDR3 é a regiãodo sítio de ligação do TCR �� que faz contato com os amino-ácidos do centro do peptídio ligado a uma molécula do MHC(ver Fig. 9.2). O grande número de diferentes sequências CDR3do TCR assegura que a ligação do TCR à porção peptídica docomplexo peptídio-MHC seja altamente específica.

No Capítulo 6 também descrevemos como os genes de Igexibem a exclusão alélica, que assegura que uma única célula Bproduza um receptor com especificidade para um único antíge-no. Os genes TCR� e TCR� também exibem exclusão alélica.

DIFERENCIAÇÃO DA CÉLULA TNO TIMO

Conforme descrito no Capítulo 2, o timo, localizado acima docoração, é o órgão linfoide primário para o desenvolvimento dascélulas T; é neste local que as células precursoras adquirem oTCR, assim como outras características de células T. (Confor-me discutido no Capítulo 7, a medula óssea é o órgão primáriopara o desenvolvimento de células B nos mamíferos.) Algumascrianças nascem com um timo que não se desenvolveu correta-mente in utero (Síndrome de DiGeorge, ver também Capítulo17); camundongos nos quais o timo não se desenvolveu são cha-mados de camundongos nus porque eles também não possuem

pelos. Em ambos os casos, as células T maduras não se desen-volvem e as respostas destas células são defeituosas.

Síndrome de DiGeorge

A diferenciação da célula T no timo ocorre durante a vidade um indivíduo, mas diminui significativamente após a pu-berdade. O tamanho do timo se reduz com o começo da pu-berdade nos mamíferos (involução tímica), presumivelmen-te devido ao aumento da síntese dos hormônios esteroides. Emalgumas espécies, particularmente no camundongo, a popu-lação de células T maduras é consideravelmente perdida quan-do o timo é removido alguns dias após o nascimento. De fato,estas foram as primeiras observações que estabeleceram opapel crucial do timo nas respostas das células T. Remover otimo tardiamente durante o desenvolvimento do animal temmuito menos impacto na população de células T maduras.

A diferenciação de célula T no timo é um processo comple-xo de várias etapas. Assim como as fases iniciais da diferencia-ção da célula B, a maioria das informações sobre as fases iniciaisda diferenciação da célula T no timo provém de trabalhos emespécies não humanas, tal como o camundongo. Os parágrafosque se seguem e as Figs. 9.6 e 9.7 se concentram nos principaispontos do desenvolvimento da célula T, incluindo as descriçõesdas interações das células T em desenvolvimento com célulasnão linfoides do timo, a sequência dos rearranjos genéticos doTCR, os diferentes padrões de expressão das moléculascorreceptoras CD4 e CD8 e a seleção tímica.

Interações das Células T em Desenvolvimentocom Células não Linfoides do Timo

A Fig. 2.8 mostra a estrutura detalhada do timo e das célulasem seu interior. Os linfócitos T em desenvolvimento no timo(timócitos) estão em contato e interagem com uma rede formadapor células não linfoides do timo, sendo as mais importantes(1) as células epiteliais no córtex e medula (as regiões externae interna do timo, respectivamente) e (2) as células dendríticas,encontradas sobretudo na junção do córtex e da medula. Ascélulas dendríticas do timo são derivadas da medula óssea e sãomembros da mesma família de células que apresentam antíge-nos às células T em outros tecidos e órgãos (ver Capítulo 10).As células epiteliais e dendríticas do timo expressam molécu-las de classe I e II do MHC, uma característica de APC.

As células não linfoides proporcionam importantes interaçõescom a superfície celular, necessárias para a seleção tímica, o queserá descrito rapidamente. As células não linfoides também pro-duzem a citocina IL-7, que provoca proliferação e sobrevivên-cia de células nos estágios iniciais do desenvolvimento do linfó-cito T. O timo é, de fato, um local de intensa proliferação de cé-lulas T em desenvolvimento, entretanto, a grande maioria destascélulas — que se calcula ser em torno de 95% das células pro-

cap09 6/10/10, 11:32 AM131



duzidas diariamente — morre no timo em função de razões queserão descritas em seções subsequentes neste capítulo.

As vias de desenvolvimento da célula T no timo estão ilus-tradas na Fig. 9.6 e nos parágrafos que se seguem.

Rearranjos Genéticos Iniciais do Receptorde Célula T: Células T Duplo-negativas eSeparação das Células T ��

As células precursoras derivadas da medula óssea entram notimo, através da circulação sanguínea, na junção do córtex com

a medula. Conforme descreveremos posteriormente nestecapítulo, estes precursores não estão completamente compro-metidos com a linhagem de células T; outros tipos celularestambém podem se desenvolver a partir destas células precur-soras tímicas muito primitivas. Estes precursores tímicos ini-ciais possuem seus genes de TCR em uma configuração nãorearranjada (linhagem germinativa).

Os genes das cadeias �, � e � do TCR começam a serearranjar quase simultaneamente no córtex do timo; estascélulas não expressam correceptores CD4 nem CD8, e, dessaforma, são conhecidas como células duplo-negativas. A deci-

Timo

Células Tmaduras

Célulaunipositiva

Medula

Célulaepitelialmedular

Célula duplo-positiva

Céluladendrítica

Seleçãotímica

CórtexCélula duplo-positiva ��+CD4+CD8+

Célulaepitelial tímica

Rearranjo do TCR �

pré-T�

Célula T��

Célula pré-T

Rearranjodo TCR �

Rearranjodo TCR � e �

Céluladuplo-negativa

Medulaóssea

Célula linfoideprecursora

Migração para os órgãos linfoides secundários e tecidos

Figura 9.6 Principais estágios no de-senvolvimento das células T �� e �� notimo, mostrando os rearranjos genéticosdo TCR e a expressão do TCR e correcep-tores CD4 e CD8. A linha única na super-fície da célula representa CD3 + �.

�

��+

CD4+ CD8+

��+ CD8+��+ CD4+

cap09 6/10/10, 11:33 AM132


133

são de se tornar uma célula T �� ou �� ocorre no estágioduplo-negativo, mas os sinais que determinam a via escolhi-da não são bem compreendidos. As células duplo-negativas,que produtivamente rearranjam tanto os genes � quanto os �,desligam o rearranjo do gene � e expressam as cadeias � e �do TCR na superfície da célula em associação com CD3 e �.Estas células T expressando TCR �� saem do timo e formamuma população de células T �� periféricas. Células T expres-sando �� como seus TCRs surgem cedo durante o desenvol-vimento do indivíduo, mas são posteriormente superadas emmuito pelo desenvolvimento das células T ��.

Células Pré-T

As células duplo-negativas que produtivamente rearranjamum gene � expressam a cadeia � do TCR na superfície ce-lular em associação com uma molécula invariante conhe-cida como pré-T�. Estas células são chamadas de células

pré-T. A combinação da cadeia � e pré-T� (junto com CD3e �) constitui o receptor de célula pré-T (pré-TCR), análo-go ao receptor de célula pré-B expresso pelas células pré-Bdiscutidas no Capítulo 7.

A sinalização pelo pré-TCR, assim como a sinalizaçãoatravés do receptor pré-B, é um importante ponto no desen-volvimento de células expressando � e � como seus TCRs. Asinalização através do pré-TCR paralisa rearranjos adicionaisdos genes do TCR�, assegurando que ele expresse somenteum tipo de cadeia � (exclusão alélica). Além disso, a expres-são de pré-T� é regulada negativamente, os genes RAG-1 eRAG-2 são reativados e os genes � começam a se rearranjar.Conforme observado anteriormente, os segmentos gênicos doslóci � e � do TCR estão intercalados no mesmo cromossoma;assim, o rearranjo de � localizado num determinado cromos-soma também exclui o lócus �. Os genes � não exibem ex-clusão alélica, dessa forma, o rearranjo dos genes � pode ocor-rer em ambos os cromossomas.

Figura 9.7 Seleção tími-ca positiva e negativa: sele-ção positiva mostrando a in-teração das células duplo-po-sitivas ��TCR+CD4+CD8+ comas células epiteliais corticais;seleção negativa mostrando acélula duplo-positiva intera-gindo com a célula dendríticado timo.

Células duplo-positivas

Célula epitelialtímica

Sem interaçãoInteração = Sobrevivência na SeleçãoPositiva da célula duplo-positivacom TCR específico paraMHC-próprio + peptídio-próprio

Células morrem

Céluladendrítica tímica

Seleção negativa

Interação dealta afinidade

Interação deafinidade intermediária

DELEÇÃO das células Tde reatividade alta pelopróprio

Sobrevivência das células Tunipositivas CD4+ ou CD8+

DIFERENCIAÇÃO DA CÉLULA T NO TIMO

CD4 CD8

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137

1. As células T expressam um receptor de antígeno úni-co clonalmente distribuído, conhecido como receptorde célula T. As mesmas estratégias de recombinaçãoV(D)J e maquinaria de recombinase usadas pelas cé-lulas B para gerar a diversidade de Ig, são tambémusadas para gerar um enorme repertório de células Tcom diferentes TCRs.

2. Na maioria das células T de seres humanos e camun-dongos, o TCR é uma molécula transmembrana deduas cadeias, ��. O TCR compreende regiões V e C,análogas àquelas das moléculas de Ig. A porção ex-tracelular do TCR se assemelha ao fragmento Fab doanticorpo.

3. Um TCR �� interage com o peptídio ligado a uma mo-lécula do MHC na superfície de uma célula do hospe-deiro. As cadeias �� de ligação ao antígeno são ex-pressas na superfície da célula T em um complexomultimolecular (o complexo do TCR) em associaçãocom polipeptídios CD3 e �, que agem como uma uni-dade de transdução de sinal após a ligação do antíge-no com ��.

4. Moléculas correceptoras estão associadas com oTCR ��. Nas células T maduras, o correceptor éCD4 ou CD8, dividindo as células T em duas subpo-pulações principais, tanto ��+ CD4+ quanto ��+

CD8+. As funções destas moléculas correceptorassão (a) ligar a porção invariante de uma moléculado MHC sobre uma célula do hospedeiro (CD4 comMHC de classe II e CD8 com MHC de classe I); (b)firmar a aderência entre a célula T e a célula do hos-pedeiro e (c) participar da transdução de sinal apósativação do TCR.

5. A célula T também expressa moléculas na sua su-perfície com importantes propriedades coestimu-latórias e de adesão. Estas incluem CD28, CTLA-4(CD152), as integrinas LFA-1 (CD11aCD18) e VLA-4(CD49dCD29) e CD2. O padrão de expressão de mo-léculas de adesão e receptores de quimiocinas de-sempenha papel-chave no endereçamento das célulasT em diferentes estágios de diferenciação para dife-rentes tecidos.

6. �� é o TCR de uma população minoritária de célulasT humanas, encontradas predominantemente em sí-tios de epitélio mucoso, como intestino e pele. �� éexpresso na superfície da célula T em associação comCD3 e �. A maioria das células T ��+ não expressaCD4, mas algumas expressam CD8. As funções dascélulas T ��+ não são tão bem compreendidas comoaquelas das células T ��+, mas acredita-se que elas

tenham uma função na primeira linha de defesa con-tra patógenos.

7. O timo é o órgão no qual as células T em desenvolvi-mento adquirem um TCR. O timo é um local de in-tensa proliferação e diferenciação de células T em de-senvolvimento, mas a maioria delas morre ali. Aspoucas células T maduras que emergem dão origem àpopulação de células T maduras encontradas na cir-culação e tecidos fora do timo.

8. O rearranjo genético do TCR começa inicialmente nostimócitos “duplo-negativos” no timo. Células T �� e�� divergem no estágio duplo-negativo. Se as célulasT �� são formadas, elas deixam o timo.

9. Alternativamente, timócitos que expressam uma ca-deia � rearranjada expressam-na sobre a superfície emassociação com uma molécula não rearranjada, pré-T�, na célula pré-T. O próximo estágio no desenvol-vimento das células T ��+ é a célula “duplo-positiva”expressando um TCR �� (em associação com o CD3e �) e ambas as moléculas correceptoras, CD4 e CD8.

10. A célula duplo-positiva sofre seleção tímica mediadapor interações do TCR e CD4 e CD8 sobre a célula Tem desenvolvimento com moléculas do MHC e pep-tídios expressos pelas células tímicas não linfoides. Aseleção positiva sobre células epiteliais do córtex“educa” a célula T em desenvolvimento: como umacélula madura, ela responde ao antígeno somentequando apresentado por uma célula que expressa asmesmas moléculas do MHC com que a célula Tinteragiu durante a diferenciação no timo (restriçãopelo MHC-próprio da resposta de célula T). A sele-ção negativa sobre células dendríticas e células epi-teliais da medula remove células T com reatividadepotencial para moléculas próprias, assegurando a au-totolerância. Assim, as células T TCR ��+ que emer-gem do timo são restritas pelo MHC-próprio e auto-tolerantes.

11. As células T TCR+ ��CD4+ e asT TCR+ ��CD8+ quesobrevivem à seleção negativa, juntas com as célulasT ��+, deixam o timo. Estas células constituem o re-pertório das células T periféricas no sangue, órgãoslinfoides secundários e tecidos que respondem a antí-genos não próprios (estranhos). Após ativação peloantígeno, a célula T se diferencia em uma célulaefetora; algumas células T ativadas se tornam célulasCD4+ ou CD8+ de memória.

12. Além das células T �� e ��, as células NK, célulasNKT e células Treg também se desenvolvem no timo.

RESUMO

RESUMO

cap09 6/10/10, 11:33 AM137



Para cada questão, escolha A MELHOR resposta.

1. Qual das seguintes sentenças relacionadas ao desenvolvi-mento da célula T está correta?A) As células T progenitoras que entram no timo a partir da me-

dula óssea já rearranjaram seus genes do TCR.B) A interação com as células tímicas não linfoides é importante.C) A maturação no timo requer a presença de antígeno estranho.D) As moléculas de classe II do MHC não estão envolvidas na

seleção positiva.E) Células T maduras, completamente diferenciadas, são encon-

tradas no córtex do timo.

2. O desenvolvimento de autotolerância no compartimento dacélula T é importante para a prevenção de autoimunidade.Qual das seguintes condições resulta em autotolerância decélula T?A) Exclusão alélica.B) Hipermutação somática.C) Proliferação de timócitos.D) Seleção positiva.E) Seleção negativa.

3. Qual das seguintes sentenças está correta?A) As cadeias do TCR transduzem um sinal para a célula T.B) Uma célula depletada de sua molécula CD4 seria incapaz de

reconhecer antígeno.C) As células T com as cadeias de TCR completamente

rearranjadas não são encontradas no timo.D) As células T expressando o TCR são encontradas somente

no timo.E) As células T CD4+ CD8+ formam a maioria das células T no timo.

4. Qual das seguintes questões esta incorreta em relação àscélulas T maduras que usam �� como seu receptor antí-geno-específico?A) Elas coexpressam CD8 na superfície da célula.B) Elas podem ser CD4+ ou CD8+.C) Elas interagem com peptídios derivados de antígenos não

próprios.

REFERÊNCIAS


D) Elas podem rearranjar mais uma vez seus genes de TCR paraexpressar �� como seu receptor.

E) Elas circulam pelo sangue e linfa e migram para os órgãoslinfoides secundários.

5. Qual das seguintes sentenças está incorreta em relação aosgenes de TCR e Ig?A) Em ambos os precursores de células B e T, há múltiplos ge-

nes de região V-, D-, J- e C- em uma configuração não rear-ranjada.

B) O rearranjo dos genes tanto de TCR quanto de Ig envolvemenzimas do tipo recombinase que se ligam a regiões especí-ficas do genoma.

C) Tanto Ig quando TCR são capazes de mudar a região C em uso.D) Tanto Ig quanto TCR utilizam associações combinatórias de

genes V, D e J e imprecisão juncional para gerar diversidade.

6. Qual das seguintes sentenças está incorreta em relação aosreceptores antígeno-específicos nas células B e T?A) Eles são moléculas transmembranas clonalmente distribuídos.B) Eles têm grandes domínios citoplasmáticos que interagem

com moléculas intracelulares.C) Eles consistem de polipeptídios com regiões variáveis e cons-

tantes.D) Eles estão associados com moléculas de transdução de sinal

na superfície da célula.E) Eles podem interagir com peptídios derivados de antígenos

não próprios.

7. Qual das seguintes sentenças está correta em relação àscaracterísticas das células T que saem do timo?A) Não expressam CD4 ou CD8, mas expressam um TCR que

têm alta afinidade pelo MHC mais o antígeno-próprio.B) Expressam CD4 e CD8, mas não o TCR, e têm baixa afini-

dade pelo MHC mais o antígeno-próprio.C) Expressam CD4 ou CD8 com um TCR com alta afinidade

pelo MHC mais o antígeno-próprio.D) Expressam CD4 ou CD8 com um TCR de baixa a moderada

afinidade pelo MHC mais antígeno-próprio.E) Expressam CD4, CD8 e um TCR de alta afinidade pelo MHC

mais o antígeno-próprio.

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139

1. B A interação dos timócitos com as células tímicas não linfoides— células epiteliais corticais, células dendríticas e células epiteliaismedulares — é decisiva no desenvolvimento da célula T.

2. E Seleção negativa remove as células T em desenvolvimento comreatividade potencial para moléculas próprias.

3. E As células T CD4+ CD8+ formam a maioria das células no timo.

4. D Os genes das células T que usam �� como seu receptor, nãopodem sofrer outro rearranjo para usar �� como seu receptor; ossegmentos gênicos � do TCR são intercalados com o lócus � edeletados quando o lócus � se rearranja.

5. C A capacidade de mudar a região constante da cadeia pesadaenquanto mantém a mesma especificidade antigênica é uma pro-

priedade característica da Ig. As outras características são comunsao TCRs e à Ig.

6. B O TCR e a Ig dispõem de pequenas regiões citoplasmáti-cas. As moléculas de transdução de sinal associadas com ascadeias de ligação ao antígeno interagem com moléculas intra-celulares.

7. E As células T que usam �� como seus TCRs e emergem comoo estágio final de diferenciação no timo expressam CD4 ou CD8 (as-sim como um TCR) e, como resultado da seleção tímica, têm afini-dade de baixa a intermediária para antígeno próprio associado como MHC-próprio (moléculas do MHC expressas pelas células tímicasnão linfoides do indivíduo).



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