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HCG IRMA

Coat-A-Count® HCG IRMA

2 Coat-A-Count HCG IRMA (PIIKCG-9, 2010-11-01)

English

Intended Use: Coat-A-Count HCG IRMA is an immunoradiometric assay designed for the quantitative and qualitative measurement of human chorionic gonadotropin (HCG) in serum and plasma. It is intended strictly for in vitro diagnostic use by professional laboratory personnel as an aid in the detection of pregnancy. Catalog Numbers: IKCG1 (100 tubes)

The 100-tube kit contains less than 20 microcuries (740 kilobecquerels) of

radioactive 125I polyclonal anti-HCG.

Summary and Explanation of the Test Human chorionic gonadotropin (HCG) is a two-chain glycoprotein hormone (MW ≈ 37,000) normally found in blood and urine only during pregnancy. It is secreted by placental tissue, beginning with the primitive trophoblast, almost from the time of implantation, and serves to support the corpus luteum during the early weeks of pregnancy. HCG or HCG-like material is also produced by a wide variety of trophoblastic and nontrophoblastic neoplasia.4,9,10,16 Its measurement, by assay systems of suitable sensitivity and specificity, has proved of great value in the detection and management of pregnancy. According to the literature, HCG normally reaches levels of approximately 2,000 mIU/mL one month after conception.2,3,10,11 A peak of 50,000 or even 100,000 mIU/mL is attained in the third month, after which a gradual decline sets in. Following delivery, the HCG level normally undergoes rapid descent, reaching nonpregnant concentrations (usually less than 5 mIU/mL) some two weeks later.10 Ectopic pregnancies and pregnancies terminating in spontaneous abortion tend to have lower than normal values, while somewhat higher values are often seen in multiple pregnancies. The qualitative procedure represents a simplification of the quantitative procedure, in that a single reference point

is used instead of a full calibration curve. It allows for determining whether a serum sample has an HCG concentration above or below 25 mIU/mL, within the precision of the assay. Concentrations above this cutoff may be considered positive for pregnancy providing other causes of high HCG levels have been ruled out, viz. trophoblastic and nontrophoblastic neoplasia.4,9,10,16 Concentrations below this cutoff are to be expected for samples from individuals who are not pregnant, as well as those in such an early stage of pregnancy that the HCG concentration has not yet reached the decision level set for the procedure. Assaying another sample collected two or more days later should settle the matter, since in early pregnancy the HCG level can be expected to double in approximately this time.11 It may also be of interest to reassay the original specimen by the quantitative procedure in order to pinpoint its HCG concentration more exactly.

Principle of the Procedure Coat-A-Count HCG IRMA is a solid-phase immunoradiometric assay. The assay utilizes a 125I-labeled anti-HCG polyclonal antibody in liquid phase, and a monoclonal anti-HCG antibody immobilized to the wall of a polystyrene tube.

In the procedure: HCG is captured between the polyclonal tracer and monoclonal antibodies coated to the tube. Unbound polyclonal tracer is removed by decanting and washing the tube. The tube is counted in a gamma counter for one minute. The concentration of HCG in the patient sample is directly proportional to the number of counts per minute. HCG concentration is determined by comparing the number of counts with those obtained from the set of calibrators provided. Reagents to Pipet: 2 Total Incubation Time: 1 Hour (on a rack shaker)

Coat-A-Count HCG IRMA (PIIKCG-9, 2010-11-01) 3

Total Counts at Iodination: approximately 300,000 cpm

Warnings and Precautions For in vitro diagnostic use. Reagents: Store at 2–8°C in a refrigerator designated for incoming radioactive materials. Dispose of in accordance with applicable laws. Do not use reagents beyond their expiration dates. Some components supplied in this kit may contain human source material and/or other potentially hazardous ingredients which necessitate certain precautions. Follow universal precautions, and handle all components as if capable of transmitting infectious agents. Source materials derived from human blood were tested and found nonreactive for syphilis; for antibodies to HIV 1 and 2; for hepatitis B surface antigen; and for antibodies to hepatitis C. Sodium azide, at concentrations less than 0.1 g/dL, has been added as a preservative. On disposal, flush with large volumes of water to prevent the buildup of potentially explosive metal azides in lead and copper plumbing. Water: Use distilled or deionized water.

Radioactivity A copy of any radioisotope license certificate (Specific or General) issued to a US customer must be on file with Siemens Healthcare Diagnostics before kits or components containing radioactive material can be shipped. These radioactive materials may be acquired by any customer with the appropriate Specific license. Under a General license these radioactive materials may be acquired only by physicians, veterinarians in the practice of veterinary medicine, clinical laboratories and hospitals — and strictly for in vitro clinical or laboratory tests not involving external or internal administration of the radioactive material or its radiation to human beings or other animals. Its acquisition, receipt, storage, use, transfer and disposal are all subject to the regulations and a (General or Specific) license of the U.S. Nuclear Regulatory Commission or a State with which the NRC has entered into an

agreement for the exercise of regulatory control. Handle radioactive materials according to the requirements of your General or Specific license. To minimize exposure to radiation, the user should adhere to guidelines set forth in the National Bureau of Standards publication on the Safe Handling of Radioactive Materials (Handbook No. 92, issued March 9, 1964) and in subsequent publications issued by State and Federal authorities. Wipe up spills promptly and decontaminate affected surfaces. Avoid generation of aerosols. Dispose of solid radioactive waste according to license requirements. General licensees (holders of NRC Form 483) may dispose of solid radioactive waste as nonradioactive waste, after removing labeling. Specific licensees (NRC Form 313) should refer to Title 10, Code of Federal Regulations, Part 20. Licensees in Agreement States should refer to the appropriate regulations of their own state. General licensees may dispose of liquid radioactive waste of the type contained in this product through a laboratory sink drain. Licensees must remove or deface labels from empty containers of radioactive materials before disposal of solid waste. Specific licensees may dispose of small quantities of liquid radioactive waste of the type used in this product through a laboratory sink drain. Refer to the appropriate regulations applicable to your laboratory.

Materials Supplied – Initial Preparation

HCG Ab-Coated Tubes (ICG1) Polystyrene tubes coated with anti-HCG murine monoclonal antibodies and packaged in zip-lock bags. Store refrigerated and protected from moisture, carefully resealing the bags after opening. Stable at 2–8°C until the expiration date marked on the bag. IKCG1: 100 tubes.

125I HCG Ab (ICG2) Iodinated anti-HCG polyclonal antibody in liquid form, ready to use. Each vial contains 5.5 mL. Stable at 2–8°C for 30 days after opening, or until the expiration date marked on the label. IKCG1: 2 vials.


HCG Calibrators (CGI3–9) Seven vials, labeled A through G, of HCG calibrators in a HCG-free human-serum matrix, with preservative. The calibrators are supplied lyophilized. At least 30 minutes before use, reconstitute the zero calibrator A with 10 mL distilled or deionized water, the calibrator C with 5 mL, and the remaining calibrators B and D through G with 2 mL each. (See the table below.) Use volumetric pipets and mix by gentle swirling or inversion. Stable at 2–8°C for 30 days after reconstitution or –20°C for 6 months (aliquotted). IKCG1: 1 set.

Calibrator Vial Reconstitution Volume

Calibrator A 10.0 mL

Calibrator B 2.0 mL

Calibrator C 5.0 mL

Calibrators D – G 2.0 mL

The calibrators are standardized against (but not prepared from) the World Health Organization's Third International Standard for HCG Immunoassay, number 75/537. In terms of this standard, the calibrators represent 0, 5, 25, 50, 100, 250 and 500 milli-International Units of HCG per milliliter (mIU/mL, 3rd IS 75/537). The calibrator values in terms of the World Health Organization's Second International Standard for HCG, number 61/6, are identical. Intermediate calibration points may be obtained by mixing calibrators in suitable proportions. Note that the Coat-A-Count HCG IRMA calibrators are not interchangeable with those supplied in Double Antibody HCG kit. The 25 mIU/mL calibrator (Calibrator C) serves as the positive reference in the qualitative procedure. Other calibrators supplied with this kit can be used as controls in this context.

HCG Assay Buffer (CGAB) 11 mL of buffered diluent. Stable at 2–8°C for 30 days after opening, or until the expiration date marked on the label. IKCG1: 1 vial.

Buffered Wash Solution Concentrate (2TSBW) Concentrated buffered saline solution, with surfactants and sodium azide as a preservative. Using a transfer container,

dilute the contents of each vial with 600 mL distilled water, for a total volume of 660 mL. Store refrigerated: stable at 2–8°C for 6 months after preparation. IKCG1: 1 vial × 60 mL.

Materials Required But Not Provided Gamma counter — compatible with standard 12x75 mm tubes Rack shaker — set at approximately 200 strokes per minute.

Reagent Preparation Pipets: 2.0 mL, 5.0 mL and 10.0 mL Distilled or deionized water Graduated cylinder — for dispensing 600 mL Plastic storage container with lid — for preparation and storage of Buffered Wash Solution

Immunoassay Micropipet: 100 µL. Dispenser — for delivering 2.0 mL of Buffered Wash Solution. Foam decanting rack — available from Siemens Healthcare Diagnostics (catalog number: FDR). 3-cycle log-log graph paper A tri-level, human serum-based immunoassay control, containing HCG as one of 25 assayed constituents, is available from Siemens Healthcare Diagnostics (catalog number: CON6).

Specimen Collection The patient need not be fasting, and no special preparations are necessary. Collect blood by venipuncture19 into plain, heparinized, or EDTA vacutainer tubes, noting the time of collection. The use of an ultracentrifuge is recommended to clear lipemic samples. Hemolyzed samples may indicate mistreatment of a specimen before receipt by the laboratory; hence the results should be interpreted with caution. Blood collection tubes from different manufacturers may yield differing values, depending on materials and additives, including gel or physical barriers, clot activators and/or anticoagulants. Coat-A-


Count HCG IRMA has not been tested with all possible variations of tube types. Consult the section on Alternate Sample Types for details on tubes that have been tested. Volume Required: 100 µL of serum or plasma per tube. Storage: 2–8°C for 7 days, or for up to 2 months at –20°C. Before assay, allow the samples to come to room temperature (15–28°C) and mix by gentle swirling or inversion. Aliquot, if necessary, to avoid repeated thawing and freezing. Do not attempt to thaw frozen specimens by heating them in a water bath.

Dilutions: The quantitative procedure has a range of up to 500 mIU/mL, but patient levels up to 100,000 mIU/mL or more may be encountered in the course of normal pregnancy. Normal pregnancy samples, even those reaching first trimester peak values, will yield counts per minute greater than the counts of the highest calibrator, if assayed without dilution. Samples expected to have high levels, including those from molar pregnancies,4,9,10,16 must be suitably diluted with the zero calibrator before assay. To avoid delays caused by having to reassay samples "off the curve," some laboratories may wish to make a practice of setting up a series of 1-in-10 dilutions on every sample. Assaying samples undiluted, at 1-in-10 and 1-in-100 will in most cases bring the sample concentrations within assay range; an additional 1-in-1,000 dilution can be prepared for samples expected to be in excess of 100,000 mIU/mL.

Pipetting: Care must be taken in preparing dilutions and in pipetting samples to avoid errors due to carryover. It is important to use a disposable-tip micropipet, changing the tip between samples, to avoid carryover contamination. Positive displacement pipets and automatic pipettor-diluters should be used only if the possibility of carryover has been evaluated and found to be insignificant. Pipet all samples and reagents directly to the bottom. All samples, including the calibrators and controls, should be assayed in duplicate. Inspect the results for agreement within tube pairs. Pairs of control tubes may be spaced throughout the run to help verify the absence of significant drift.

Quantitative Procedure All components must be at room temperature (15–28°C) before use. 1 Label fourteen HCG Ab-Coated Tubes

A (nonspecific binding) and B through G ("maximum binding") in duplicate. Label additional HCG Ab-Coated Tubes, also in duplicate, for controls and patient samples. Optionally, label two plain (uncoated) 12×75 mm polystyrene tubes T (total counts) in duplicate, and set them aside until step 6.

Calibrator HCG mIU/mL 3rd IS 75/537

HCG mIU/mL 2nd IS 61/6

T* — —

A (NSB) 0 0

B 5 5

C 25 25

D 50 50

E 100 100

F 250 250

G ("MB") 500 500

* Optional

2 Pipet 100 µL of each calibrator, control and patient sample into the tubes prepared. Pipet directly to the bottom. Patient samples expected to contain HCG levels greater than 500 mIU/mL should be suitably diluted with the zero calibrator before assay. Use a


disposable-tip micropipet, changing the tip between samples to avoid errors due to carryover. Positive-displacement pipets and automatic pipettor-diluters should be used only if the possibility of carryover has been evaluated and found to be insignificant.

3 Add 100 µL of HCG Assay Buffer to every tube. Pipet directly to the bottom. A repeating dispenser is recommended for this step, and for the addition of tracer at step 6.

4 Shake for 30 minutes on a rack shaker. For the Qualitative Procedure, 15 minutes is sufficient.

5 Decant and drain thoroughly. Add 2.0 mL of Buffered Wash Solution to each tube. Wait 1 to 2 minutes, then decant and drain thoroughly. Removing all visible moisture will greatly enhance precision. After the wash, decant the contents of all tubes using a foam decanting rack. Then strike the tubes sharply on absorbant paper to shake off all residual droplets.

6 Add 100 µL of 125I HCG Ab to every tube. No more than 10 minutes should elapse during the dispensing of the tracer. Set the (optional) T tubes aside for counting at step 9; they require no further processing.

7 Shake for 30 minutes on a rack shaker. For the Qualitative Procedure, 15 minutes is sufficient.

8 Decant and drain thoroughly. Add 2.0 mL of Buffered Wash Solution to each tube. Wait 1 to 2 minutes, then decant and drain thoroughly. Again add 2.0 mL Buffered Wash Solution, wait 1 to 2 minutes, and decant thoroughly. Removing all visible moisture will greatly enhance precision. After the second wash, decant the contents of all tubes (except the T tubes) using a foam decanting rack, and allow them to drain for 2 or 3 minutes. Then strike

the tubes sharply on absorbant paper to shake off all residual droplets.

9 Count for 1 minute in a gamma counter. In multi-head gamma counters, the (optional) Total Counts tubes should be separated from the remaining assay tubes by at least one space, to minimize the possibility of spillover.

Qualitative Procedure The Qualitative Procedure represents a simplification of the Quantitative Procedure in that a single reference point is used instead of a full calibration curve. It allows for determining whether a serum or plasma sample has an HCG concentration above or below 25 mIU/mL, within precision of the assay. Samples expected to have high HCG levels should be assayed under appropriate dilutions by the full Quantitative Procedure described above. 1 Label two HCG Ab-Coated Tubes C,

for the 25 mIU/mL positive reference. Label additional HCG Ab-Coated Tubes, also in duplicate, for controls and patient samples. Optionally, label two plain (uncoated) 12×75 mm polystyrene tubes T (total counts).

Calibrator HCG mIU/mL 3rd IS 75/537

HCG mIU/mL 2nd IS 61/6

T* — —

C (Reference) 25 25

* Optional

Now continue as in the Quantitative Procedure described above (steps 2 through 9). The incubation time at steps 4 and 7 can be reduced to 15 minutes.

Calculations and Quality Control

Quantitative Procedure To calculate HCG concentrations from a log-log representation of the calibration curve, first correct the counts per minute (CPM) of each pair of tubes by subtracting the average CPM of the nonspecific binding tubes (calibrator A): Net Counts = (Average CPM) minus (Average NSB CPM)


Then determine percent binding (relative to that of the highest calibrator) – here called "%B/MB" – of each pair of tubes as a percent of "maximum binding," with the NSB-corrected counts of the highest calibrator taken as 100%: Percent Bound = (Net Counts / Net MB Counts) × 100

Using 3-cycle log-log graph paper, plot Percent Bound versus Concentration for each of the nonzero calibrators, and draw a curve approximating the path of these points. (Connect the calibration points with arcs or straight line segments. Do not attempt to fit a single straight line to the data.) HCG concentrations for controls and unknowns within range of the nonzero calibrators may then be estimated from the calibration curve by interpolation. An additional plot of Percent Bound versus Concentration for the three or four lowest calibrators on linear-linear graph paper may be used for interpolation near zero dose. Comments: Although other approaches are acceptable, data reduction by the method just described has certain advantages from the standpoint of quality control. In particular, it yields a calibration curve that is relatively linear in both log-log and linear-linear representations, and relatively stable from assay to assay. It also yields valuable QC parameters, namely, Percent Bound (%B/MB) values for the nonzero calibrators. A still more informative graph, conveying a sense of within-assay reproducibility as a function of concentration, can be obtained by plotting the Percent Bound values of individual calibrator tubes directly, i.e. without first averaging the CPM of replicates. Alternatives: Although Percent Bound can be calculated directly from Average CPM, correction for nonspecific binding usually produces a calibration curve that is more nearly linear throughout its range. A calibration curve can also be constructed by plotting CPM or Average CPM directly against Concentration on either log-log or linear-linear graph paper. (Semi-log graph paper should not be used.) This approach has the virtue of simplicity, but is less desirable from the standpoint of quality control.

Computerized Data Reduction: "Point-to-point" methods, including linear and cubic spline fits, are suitable; but since they provide little assistance in monitoring the integrity of an assay, it is important to prepare the recommended log-log plot of the calibration curve, either manually or by computer, as a quality control step. Data reduction techniques based on the logistic model may also be applicable. Within this family, curve fitting routines based on the 4- or 5-parameter logistic are the most suitable candidates. However, some algorithms currently in use may not converge successfully, even when the logistic model is true to the data. If a logistic method is adopted, it is essential to verify its appropriateness for each day's assay by monitoring the backcalculation of the calibrators, and other parameters. In addition, a plot of the calibration curve in a log-log representation is highly recommended, as this is more informative than the conventional semi-log plot. Sample Handling: The instructions for handling and storing patient samples and components should be carefully observed. Dilute patient samples expected to contain HCG concentrations greater than the highest calibrator (500 mIU/mL) with the zero calibrator before assay. All samples, including the calibrators and controls, should be assayed at least in duplicate. It is important to use a disposable-tip micropipet, changing the tip between samples, to avoid carryover contamination. Positive-displacement pipets and automatic pipettor-diluters should be used only if the possibility of carryover has been evaluated and found to be insignificant. Pairs of control tubes may be spaced throughout the assay to help verify the absence of significant drift. Inspect the results for agreement within tube pairs. Gamma Counter: To minimize the possibility of spillover in multi-well gamma counters, the optional total counts tubes (T) should be separated by one or more spaces from the other assay tubes. Alternatively, add only 25 µL of the tracer to each of the T tubes at step 6, and multiply the observed counts per minute in these tubes by 4. Controls: Controls or patient serum or plasma pools with at least two HCG concentration levels (low and high) should


routinely be assayed as unknowns, and the results charted from day to day as described in Westgard JO, et al. A multi-rule chart for quality control. Clin Chem 1981; 27:493-501. Repeat samples are a valuable additional tool for monitoring interassay precision. QC Parameters: We recommend keeping track of these performance measures: T = Total Counts (as counts per minute)

%NSB = 100 × (Average NSB Counts / Total Counts)

%MB = 100 × (Net MB Counts / Total Counts)

And the Percent Bound ("%B/MB") values of all but the highest of the nonzero calibrators, for example: %C/MB = 100 × (Net Calibrator "C" Counts / Net MB Counts)

Record Keeping: It is good laboratory practice to record for each assay the lot numbers of the components used, as well as the dates when they were first reconstituted or opened. Further Reading: See Dudley RA, et al. Guidelines for immunoassay data reduction. Clin Chem 1985;31:1264-71. Example Run, Quantitative Procedure: For illustration only, not for calculating results from another run. (See "Example Run, Quantitative Procedure" table.)

Qualitative Procedure If the (average) counts per minute for the patient sample tubes are lower than the (average) counts per minute of the C calibrator, then the sample contains less than 25 mIU/mL HCG, within the precision of the assay. If the patient sample counts are higher than those of the C calibrator, then the sample contains more than 25 mIU/mL HCG, within the precision of the assay. Relation to Pregnancy: Concentrations above the 25 mIU/mL cutoff may be considered positive for pregnancy providing other causes of high HCG levels have been ruled out, e.g. trophoblastic and nontrophoblastic neoplasia, recent pregnancy or spontaneous abortion, and so on.4,9,10,16 Concentrations below the 25 mIU/mL cutoff are to be expected for samples from healthy males and nonpregnant females. (See Expected Values below.) Concentrations below

25 mIU/mL are also to be expected for samples from women in such an early stage of pregnancy that the HCG concentration has not yet risen to the decision level set for the qualitative procedure. Assaying another sample collected two or more days later should settle the matter, since in early pregnancy the HCG level can be expected to double in approximately this time.11 Quality Control: Inspect the counts per minute of all samples for agreement within tube pairs. Controls, or patient (serum or plasma) pools, with HCG concentrations above and below that of the 25 mIU/mL reference (calibrator C) should routinely be assayed as unknowns. Other calibrators supplied with the kit – specifically, the 5 and 50 mIU/mL calibrators (B, D) – can be processed as additional controls. We recommend keeping track of the counts per minute of the reference (calibrator C) and the controls as a percent of total counts, e.g. %C/T = 100 × (Average Counts of Calibrator "C" / Average Total Counts)

A regular practice of determining intraassay means and CVs, based on counts, for several replicates each of a low control, a high control and calibrator C could further assist in monitoring the day-to-day integrity of the assay. Example Run: For illustration only, not for calculating results from another run. (See "Example Run, Qualitative Procedure" table.)

Expected Values Serum samples from 47 healthy males and 38 non-pregnant females were analyzed by the Coat-A-Count HCG IRMA procedure with the following results: 95% of the male values were less than 1.0 mIU/mL 90% of the female values were less than 3 mIU/mL 100% of all values (male and female) were 5 mIU/mL or less The results are consistent with an upper limit of normal of about 5 mIU/mL in the absence of pregnancy. However, laboratories should consider these results as guidelines only.


In another study, 286 serum samples from women of known gestational age were assayed by the Coat-A-Count HCG IRMA procedure. The gestational age was classified by weeks after the first day of the last menstrual period (LMP). Results are as follows:

Median Absolute Range 95% Range

4 weeks After LMP (n=5)

291 196 – 3,537

5 Weeks After LMP (n=12)

4,117 1,026 – 30,964

6 Weeks After LMP (n=23)

18,897 4,250 – 81,172

7 – 8 Weeks After LMP (n=40)

54,266 6,002 – 114,430


48,841 18,344 – 98,807

11 – 14 weeks After LMP (n=52)

50,841 21,874 – 120,766

15 – 22 weeks After LMP (n=67)

16,418 4,106 – 57,393


11,872 2,468 – 36,142

Serial samples from women in the first 2 to 5 weeks of pregnancy showed doubling times for HCG concentrations ranging from 1.5 to 3 days, with a mean doubling time of 2.2 days. Consider these limits as guidelines only. Each laboratory should establish its own reference ranges.

Performance Data The following sections contain data representative of the Coat-A-Count HCG IRMA kit's performance. In the sections below, HCG results are expressed as milli-International Units of HCG per milliliter (mIU/mL). Calibration Range: Up to 500 mIU/mL (3rd IS 75/537 and 2nd IS 61/6). Standardization: The assay has a calibration range of 5 to 500 mIU/mL in the quantitative procedure. The 25 mIU/mL calibrator serves as the positive reference in the qualitative procedure. The assay is standardized in terms of the World Health

Organization's Third International Standard for HCG (3rd IS 75/537), and also in terms of the Second International Standard for HCG (2nd IS 61/6). Analytical Sensitivity: 0.3 mIU/mL. High-dose Hook Effect: None up to 1,000,000 mIU/mL. Intraassay Precision (Within-Run): Statistics were calculated for samples from the results of 20 pairs of tubes in a single assay. (See "Intraassay Precision" table.) Interassay Precision (Run-to-Run): Statistics were calculated for samples from the results of pairs of tubes in 20 different assays. (See "Interassay Precision" table.) End-of-Run Effect: None up to approximately 350 tubes. (See "End-of-Run Effect" table.) Linearity: Samples were assayed under various dilutions. (See "Linearity" table for representative data.) Recovery: Samples spiked 1 to 19 with three HCG solutions (200, 1,000, and 5,000 mIU/mL) were assayed. (See "Recovery" table for representative data.) Specificity: The antibody used in the Coat-A-Count HCG IRMA procedure is highly specific for intact HCG, with low crossreactivity to other glycoprotein hormones present in patient samples. A patient specimen containing 23.3 mIU/mL HCG was spiked with different amounts of FSH, LH and TSH. The sample was assayed both spiked and unspiked by the Coat-A-Count HCG IRMA procedure. (See "Specificity 1" table.) The alpha and beta subunits of HCG were also studied. HCG β-subunit (WHO 75/551), was spiked into the Coat-A-Count HCG IRMA zero calibrator. (See "Specificity 2" table.)

HCG α-subunit (WHO 75/569), was spiked into the Coat-A-Count HCG IRMA zero calibrator. (See "Specificity 3" table.) Bilirubin: Presence of bilirubin in concentrations up to 200 mg/L has no effect on results, within the precision of the assay. Hemolysis: Presence of packed red blood cells in concentrations up to 30 µL/mL has


no effect on results, within the precision of the assay. Alternate Sample Type: To assess the effect of alternate sample types, blood was collected from 20 volunteers into plain, heparinized, EDTA and Becton Dickinson SST® vacutainer tubes. All samples were assayed by the Coat-A-Count HCG IRMA procedure, with the following results. (EDTA) = 1.00 (Serum) – 0.5 mIU/mL r = 0.996

(Heparin) = 1.04 (Serum) + 0.3 mIU/mL r = 0.994

(SST) = 0.98 (Plain tubes) + 1.65 mIU/mL r = 0.993

Means: 101 mIU/mL (Serum) 106 mIU/mL (Heparin) 101 mIU/mL (EDTA) 101 mIU/mL (SST)

Method Comparison: The Coat-A-Count HCG IRMA procedure was compared to another immunoradiometric assay for HCG (Kit A) and also to an HCG radioimmunoassay (Kit B) on 48 patient samples. The samples had HCG levels ranging from 5 to 500 mIU/mL. Linear regression analysis yielded the following statistics. (CAC IRMA) = 1.19 (Kit A) + 0.9 mIU/mL r = 0.998

Means: 217 mIU/mL (Coat-A-Count IRMA) 182 mIU/mL (Kit A)

(CAC IRMA) = 1.25 (Kit B) – 24.4 mIU/mL r = 0.983

Means: 217 mIU/mL (Coat-A-Count IRMA) 193 mIU/mL (Kit B)

References 1) Bangham DR, Storring PL. Standardisation of human chorionic gonadotropin, HCG subunits, and pregnancy tests. Lancet 1982;1:390. 2) Batzer F. Hormonal evaluation of early pregnancy. Fertil Steril 1980;34:1-12. 3) Braunstein GD, et al. First-trimester chorionic gonadotropin measurements as an aid in the diagnosis of early pregnancy disorders. Amer J Obstet Gynecol 1978;131:25-32. 4) Clayton L, et al. Endocrine aspects of trophoblastic neoplasia. J Repro Med 1981;26:192-99. 5) Corson SL, Horwitz CA, Lau HL, Soderstrom R. Early diagnosis of pregnancy: a symposium. J Repro Med 1981;26:149-78. 6) DeCherney AH, Minkin MJ, Spangler S. Contemporary management of

ectopic pregnancy. J Repro Med 1981;26:519-23. 7) Goldstein DP, Berkowitz RS, Kosasa TS. Measurement of human chorionic gonadotropin. Maj Prob Obstet Gynecol 1982;14:64-97. 8) Hager H, Van Weemen BK. Standardisation of human chorionic gonadotropin, HCG Subunits, and pregnancy tests. Lancet 1982;1:629. 9) Kohorn EI. Hydatidiform mole and gestational trophoblastic disease in southern Connecticut. Obstet Gynecol 1982;59:78-84. Erratum: the first diagram belongs with the caption to Figure 3, and vice versa. 10) Kosasa TS. Measurement of human chorionic gonadotropin. J Repro Med 1981;26:201-06. 11) Lenton E, Neal L, Sulaiman R. Plasma concentrations of human gonadotropin from the time of implantation until the second week of pregnancy. Fertil Steril 1982;37:773-78. 12) Lindstedt G, Janson PO, Thorburn J. Sensitivity of serum chorionic gondotropin assay for ectopic pregnancy. Lancet 1981;1:781-82. 13) McCready J, Braunstein GD, et al. Modification of the choriogonadotrophin beta-subunit radioimmunoassay for determination of urinary choriogonadotropin. Clin Chem 1978;24:1958-61. 14) Ranta T, et al. Verbesserte Diagnostik Schwangerschafts-assoziierter gyn;8akologischer Notfallsituationen durch einen schnell β-HCG Test. Geburtshilfe und Frauenheilkunde 1981;41:91-92. 15) Storring PL, Gaines-Das R, Bangham DR. International Reference Preparation of Human Chorionic Gonadotrophin for Immunoassay: potency estimates in various bioassay and protein binding assay systems. J Endocrinol 1980;84:295-310. 16) Vaitukaitis J. Human chorionic gonadotropin--a hormone secreted for many reasons. N Engl J Med 1979;301:324-26. 17) Danzer H, Braunstein GD, et al. Maternal serum human chorionic gonadotropin concentrations and fetal sex predictions. Fertil Steril 1980;34:336-40. 18) Hussa RO. The clinical marker HCG. New York: Praeger Publishers, 1987. 19) National Committee for Clinical Laboratory Standards. Procedures for the collection of diagnostic blood specimens by venipuncture; approved standard. 4th ed. NCCLS Document H3-A4, Wayne, PA: NCCLS, 1998.

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Tables and Graphs

Example Run, Quantitative Procedure

Tube1 Duplicate

CPM2 Average

CPM3 Net

CPM4Percent Bound5

HCG mIU/mL6

T7 288,573 287,469 288,021

A (NSB)8

428 414 421 0 — 0

B 1,571 1,506 1,539 1,118 1.5% 5.0

C 5,775 6,030 5,903 5,482 7.2% 25

D 11,308 11,888 11,598 11,177 15% 50

E 22,672 22,192 22,432 22,011 29% 100

F 46,283 46,738 46,511 46,090 61% 250

G ("MB")9

75,120 76,966 76,043 75,622 100% 500

Unknowns10

X1 1,644 1,713 1,679 1,258 1.7% 5.6

X2 29,609 28,608 29,109 28,688 38% 142

X3 67,777 67,656 67,717 67,296 89% 430

Quality Control Parameters:11 T7 = 288,021 cpm %NSB8 = 0.15% %MB9 = 27%

Example Run, Qualitative Procedure

Tube1 Duplicate

CPM2 Average

CPM3 HCG

Concentration4

C* 4,353 4,304 4,329 25 mIU/mL

X1 1,229 1,185 1,207 < 25 mIU/mL

X2 49,601 49,368 49,485 > 25 mIU/mL

* Reference5

Intraassay Precision (mIU/mL)

Mean1 SD2 CV3

1 7.3 0.42 5.8%

2 31 0.9 2.9%

3 66 1.7 2.6%

Interassay Precision (mIU/mL)

Mean1 SD2 CV3

1 7.4 0.52 7.0%

2 31 2.0 6.5%

3 65 3.0 4.6%

End-of-Run Effect (mIU/mL)

Tubes1 25–30

Tubes 117–122

Tubes 205–210

Tubes 293–298

Tubes 353–358

1 5.0 5.2 4.9 5.0 4.8

2 45 44 42 44 44

3 157 161 154 155 155

Linearity (mIU/mL) Dilution1 Observed2 Expected3 %O/E4

1 16 in 165 137 — —

8 in 16 65 68.5 95%

4 in 16 35 34.3 102%

2 in 16 18 17.1 105%

1 in 16 9.1 8.6 106%

2 16 in 16 338 — —

8 in 16 171 169 101%

4 in 16 80 85 94%

2 in 16 42 42 100%

1 in 16 23 21 110%

Recovery (mIU/mL)

Solution1 Observed2 Expected3 %O/E4

1 — 56 — —

A 59 63 94%

B 105 103 102%

C 296 303 98%

2 — 120 — —

A 123 124 99%

B 167 164 102%

C 358 364 98%


Specificity 1

Compound1 Added2 Apparent mIU/mL3

FSH (mIU/mL) — 23.3

100 23.3

500 23.6

1,000 23.7

10,000 23.2

LH (mIU/mL) — 23.3

100 23.7

500 23.3

1,000 23.8

10,000 22.4

TSH (µIU/mL) — 23.3

100 23.7

500 23.4

1,000 23.2

10,000 24.7

Specificity 2

Apparent HCG Concentration1 β-HCG WHO

75/551 ng/mL

HCG mIU/mL

HCG ng/mL*

β-HCG ng/mL†

Percent Cross-

reactivity2

2,800 87 9.4 5.7 0.20%

1,400 63 6.8 4.1 0.29%

700 42 4.5 2.7 0.39%

350 28 3.0 1.8 0.51%

175 16 1.7 1.0 0.57%

88 9.0 1.0 0.6 0.68%

44 5.0 0.5 0.3 0.68%

* mIU HCG/mL × 0.10769 → ng HCG/mL † ng HCG/mL × 0.605 → ng β-HCG/mL

Specificity 3

Apparent HCG Concentration1 α-HCG WHO

75/569 ng/mL

HCG mIU/mL

HCG ng/mL*

α-HCG ng/mL†

Percent Cross

reactivity2

7,000 305 33 13 0.19%

3,500 162 17 6.7 0.19%

1,750 82 8.8 3.5 0.20%

875 42 4.5 1.8 0.21%

438 24 2.6 1.0 0.23%

219 12 1.3 0.5 0.23%

109 6.0 0.6 0.2 0.18%

55 3.3 0.4 0.2 0.36%

* mIU HCG/mL × 0.10769 → ng HCG/mL † ng HCG/mL × 0.395 → ng α-HCG/mL

Deutsch. Example Run, Quantitative Procedure: 1Röhrchen, 2Duplikat CPM, 3Mittelwert CPM, 4Netto CPM, 5Prozent Bindung, 6Ca. HCG, mIU/mL, 7Total, 8%NSB, 9%MB, 10Unbekannt, 11Qualitätskontrollparameter. Example Run, Qualitative Procedure: 1Röhrchen, 2Duplikat CPM, 3Mittelwert CPM, 4HCG Konzentration. Intraassay Precision: 1Mittelwert, 2SD (Standardabweichung), 3CV (Variationskoeffizient). Interassay Precision: 1Mittelwert, 2SD (Standardabweichung), 3CV (Variationskoeffizient). Linearity: 1Verdünnung, 2Beobachtet (B), 3Erwartet (E), 4% B/E, 516 in 16. Recovery: 1Lösung, 2Beobachtet (B), 3Erwartet (E), 4% B/E. Specificity 1: 1Verbindung, 2zugesetzte Menge, 3Gemessene Konzentration. Specificity 2, 3: 1Gemessene Konzentration, 2% Kreuzreaktivität. End-of-Run Effect: 1Röhrchen.


Español. Example Run, Quantitative Procedure: 1Tubo, 2Duplicado CPM, 3Media CPM, 4 CPM Netas, 5Porcentaje de unión, 6HCG, aprox., mIU/mL, 7Total, 8%NSB, 9%MB, 10Desconocido, 11Parámetros del control de calidad. Example Run, Qualitative Procedure: 1Tubo, 2Duplicado CPM, 3Media CPM, 4Concentración de HCG. Intraassay Precision: 1Media, 2DS, 3CV. Interassay Precision: 1Media, 2DS, 3CV. Linearity: 1 Dilución, 2Observado (O), 3Esperado (E), 4%O/E, 516 en 16. Recovery: 1Solución, 2Observado (O), 3Esperado (E), 4%O/E. Specificity 1: 1Compuesto, 2Cantidad añadida, 3Concentración aparente. Specificity 2, 3: 1Concentración aparente, 2% Reacción cruzada. End-of-Run Effect: 1Tubos.

Français. Example Run, Quantitative Procedure: 1Tube, 2Double CPM, 3 CPM moyen, CPM corrigé, 5Pourcentage lié, 6Approx. HCG, mIU/mL, 7Total, 8%NSB, 9%MB, 10Inconnus, 11Paramètres Contrôle de Qualité. Example Run, Qualitative Procedure: 1Tube, 2Double CPM, 3 CPM moyen,4Concentration en hCG. Intraassay Precision: 1Moyenne, 2SD, 3CV. Interassay Precision: 1Moyenne, 2SD, 3CV. Linearity: 1Dilution, 2Observé (O), 3Attendu (A), 4%O/A, 516 dans 16. Recovery: 1Solution, 2Observé (O), 3Attendu (A), 4%O/A. Specificity 1: 1Composé, 2ajouté, 3Concentration apparente. Specificity 2, 3: 1Concentration apparente, 2Réaction croisée%. End-of-Run Effect: 1Tubes.

Italiano. Example Run, Quantitative Procedure: 1Provetta, 2CPM in duplicato, 3CPM Medio, 4CPM Netti, 5Percentuale di Legato, 6Appross. HCG, mIU/mL, 7Totale, 8%NSB, 9%MB, 10Campioni Non Noti, 11Parametri per il Controllo di Qualità. Example Run, Qualitative Procedure: 1Provetta, 2CPM in duplicato, 3CPM Medio, 4 Concentrazione di HCG. Intraassay Precision: 1Media, 2SD (Deviazione Standard), 3CV (Coefficiente di Variazione). Interassay Precision: 1Media, 2SD (Deviazione Standard), 3CV (Coefficiente di Variazione). Linearity: 1Diluizione, 2Osservato (O), 3Atteso (A), 4%O/A, 516 in 16. Recovery: 1Soluzione, 2Osservato (O), 3Atteso (A), 4%O/A. Specificity 1: 1Composto, 2quantità aggiunta, 3Concentrazione apparente. Specificity 2, 3: 1Concentrazione apparente, 2Percentuale di Crossreattività. End-of-Run Effect: 1Provette.

Português. Example Run, Quantitative Procedure: 1Tubo, 2Duplicado CPM, 3Média de CPM, 4Net CPM, 5Percentagem de Ligação, 6Aprox. HCG, mIU/mL, 7Total, 8%NSB, 9%MB, 10Amostras desconhecidas, 11Parâmetros do controlo de qualidade. Example Run, Qualitative Procedure: 1Tubo, 2Duplicado CPM, 3Média de CPM, 4 Concentração de HCG. Intraassay Precision: 1Média, 2Desvio padrão, 3Coeficiente de variação. Interassay Precision: 1Média, 2Desvio padrão, 3Coeficiente de variação. Linearity: 1Diluição, 2Observado (O), 3Esperado (E), 4%O/E, 516 em 16. Recovery:

1Solução, 2Observado (O), 3Esperado (E), 4%O/E. Specificity 1: 1Composto, 2Quantidade adicionada, 3Apparent Concentration. Specificity 2, 3: 1Apparent Concentration, 2Percentagem de reacção cruzada. End-of-Run Effect: 1Tubos.

Deutsch

Coat-A-Count HCG IRMA Anwendung: Der Coat-A-Count HCG IRMA ist ein immunradiometrischer Assay zur quantitativen und qualitativen Bestimmung des humanen Choriongonadotropin (HCG) im Serum und Plasma. Der Assay ist ausschließlich in der In-Vitro Diagnostik durch professionelles Laboratoriumspersonal im Zusammenhang mit der Erkennung von Schwangerschaften einzusetzen. Artikelnummern: IKCG1 (100 Tests)

Die Packung mit 100 Röhrchen enthält weniger als 20 Microcurie (740 Kilobequerel) an

125I-polyklonalen Anti-HCG.

Klinische Relevanz Humanes Choriongonadotropin (HCG) ist ein zweikettiges Glykoprotein (MG: ca. 37 000). Messbare Spiegel im Blut und Urin werden normalerweise nur während der Schwangerschaft gefunden. Es wird vom Plazentagewebe (Trophoblast) produziert, sobald sich die befruchtete Eizelle in der Gebärmutter eingenistet hat. Das HCG stabilisiert den Corpus Luteum während der frühen Phase der Schwangerschaft. HCG oder dem HCG ähnliche Stoffe werden zusätzlich in einer großen Variation bei trophoblastischen und nicht-trophoblastischen Neoplasien produziert.4,9,10,16 Die HCG-Messung, durch ein entsprechend sensitives und spezifisches Assaysystem, hat ihren großen Wert bei der Erkennung und Begleitung der Schwangerschaft unter Beweis gestellt. In der Fachliteratur wird für die zu erwartenden Werte im ersten Monat nach der Befruchtung, eine Konzentration von ca. 2.000 mIU/ml angegeben.2,3,10,11 Die Höchstwerte von 50 000 – 100 000 mIU/ml werden im


dritten Monat erreicht. Danach sinken die Konzentrationen sukzessive ab. Nach der Entbindung erfolgt eine schnelle Abnahme der HCG-Konzentration, die nach 2 Wochen Hormonwerte (< 5 mIU/ml) nicht schwangerer Frauen erreicht.10 Ektope Schwangerschaften sowie Schwanger-schaften, die in Spontanaborten enden, zeigen normalerweise erniedrigte HCG-Konzentrationen, Mehrlings-schwangerschaften dagegen oftmals erhöhte HCG-Spiegel. Das qualitative Verfahren ist eine Vereinfachung des quantitativen Verfahrens, da ein Referenzpunkt anstatt einer vollständigen Standardkurve benutzt wird. Es erlaubt die Entscheidung, ob eine Serumprobe eine HCG Konzentration ober- oder unterhalb von 25 mIU/ml hat – innerhalb der Präzision des Assays. Konzentrationen oberhalb dieses Grenzwertes sollten als positiver Schwangerschaftsnachweis betrachtet werden, wenn andere Gründe für hohe HCG Spiegel, wie trophoblastische und nicht-trophoblastische Neoplasien, ausgeschlossen sind.4,9,10,16 Konzentrationen unterhalb dieses Grenzwertes werden in Proben nichtschwangerer Frauen und ebenso in den Frühphasen der Schwangerschaft erwartet, bei denen die HCG Konzentration noch nicht die festgelegte Entscheidungsgrenze des Verfahrens erreicht hat. Die Bestimmung einer weiteren Probe, zwei oder mehrere Tage später entnommen, sollte den Sachverhalt klären, da erwartet werden kann, dass sich innerhalb dieser Zeit der HCG Spiegel gegenüber dem aus der Frühphase der Schwangerschaft verdoppelt hat. 11 Es kann auch von Interesse sein, die originale Probe quantitativ nachzumessen, um die genaue HCG Konzentration festzustellen.

Methodik Der Coat-A-Count HCG IRMA ist ein Festphasen immunradiometrischer Assay. Der Assay benutzt einen 125I-markierten polyklonalen anti-HCG Antikörper in flüssiger Phase und einen monoklonalen anti-HCG Antikörper, immobilisiert auf der Wand eines Röhrchens.

Testablauf: HCG wird zwischen dem polyklonalen Tracer und den monoklonalen Antikörpern der Beschichtung der Röhrchen gebunden. Ungebundener polyklonaler Tracer wird durch Dekantieren und Waschen der Röhrchen entfernt. Das Röhrchen wird eine Minute im Gammacounter gemessen. Die Konzentration von HCG in der Patientenprobe ist direkt proportional zur Zählrate pro Minute. Die HCG Konzentration wird durch den Vergleich der Zählrate pro Minute mit denen der mitgelieferten Standards unterschiedlicher Konzentrationen ermittelt. Zu pipettierende Reagenzien: 2 Testdauer: 1 Stunde (auf einem Schüttler) Totalaktivität zum Zeitpunkt der Markierung: ca. 300 000 cpm

Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen Zur In-vitro-Diagnostik. Reagenzien: Die Packung mit den Reagenzien sollte bei 2–8°C in einem Kühlschrank gelagert werden, der für radioaktives Material ausgewiesen ist. Die Entsorgung muss nach den jeweils gültigen Gesetzen erfolgen. Die Reagenzien dürfen nur bis zum Verfallsdatum verwendet werden. Einige Komponenten des Kits können Material humanen Ursprungs und/oder in anderer Weise gefährliche Inhaltsstoffe enthalten, die es unbedingt notwendig machen die folgenden Vorsichtsmaßnahmen einzuhalten. Die generell geltenden Vorsichtsmaßnahmen sind einzuhalten und alle Komponenten als potenziell infektiös zu behandeln. Alle aus menschlichem Blut gewonnenen Materialien wurden auf Syphilis, Antikörper gegen HIV-1 und HIV-2, Hepatitis-B-Oberflächenantigen und Hepatitis-C-Antikörper untersucht und negativ befundet. Bestimmten Komponenten wurde Natriumazid (<0,1 g/dl) hinzugefügt. Um die Bildung von explosiven Metallaziden in


Blei- und Kupferrohren zu vermeiden, sollten die Reagenzien nur zusammen mit großen Wassermengen in die Kanalisation gespült werden. Wasser: Destilliertes bzw. deionisiertes Wasser benutzen.

Radioaktivität Der Umgang mit radioaktivem Material ist in Deutschland genehmigungspflichtig. Deshalb muss der Siemens Healthcare Diagnostics eine Kopie der aktuellen gültigen Umgangsgenehmigung des Kunden vorliegen, bevor radioaktive Reagenzien versendet werden dürfen. Die Strahlenschutzverordnung ist zu beachten. Das radioaktive Material ist gemäß der jeweiligen Umgangsgenehmigung zu handhaben. Die Strahlenexposition ist zu minimieren. Spritzer sind sofort aufzuwischen und die betroffene Oberfläche zu dekontami-nieren. Aerosolbildung ist zu vermeiden. Flüssiger und fester radioaktiver Abfall sind unter Beachtung der gültigen Richtlinien zu entsorgen.

Bestandteile der Testpackung: Vorbereitung

HCG Antikörper-beschichtete Röhrchen (ICG1) Polystyrol Röhrchen beschichtet mit monoklonalen anti-HCG Antikörper von der Maus, verpackt in wiederverschließbaren Plastikbeuteln. Kühl lagern, vor Feuchtigkeit schützen und nach dem Öffnen wieder sorgfältig verschließen. Lagerung bei 2–8°C bis zum Verfallsdatum. IKCG1: 100 Röhrchen.

125I HCG Antikörper (ICG2) Jodierte polyklonale anti-HCG Antikörper in flüssiger Form, gebrauchsfertig. Jede Flasche enthält 5,5 ml. Bei 2–8°C für 30 Tage nach dem Öffnen oder bis zum Verfallsdatum auf der Flasche haltbar. IKCG1: 2 Flaschen.

HCG Standards (CGI3–9) 7 Flaschen, A – G, mit HCG Standards in einer HCG-freien humanen Serummatrix, mit Konservierungsmitteln. Die Standards werden lyophilisiert geliefert. Mindestens

30 Minuten vor Testbeginn den Nullstandard A mit 10 ml destilliertem oder deionisiertem Wasser, den Standard C mit 5 ml und die restlichen Standards B und D – G mit je 2 ml rekonstituieren. (Siehe untenstehende Tabelle.) Volumetrische Pipetten verwenden und durch vorsichtiges Wirbeln oder Umdrehen mischen. Bei 2–8°C für 30 Tage nach der Rekonstitution oder bei –20°C für 6 Monate (portioniert) haltbar. IKCG1: 1 Set.

Standardflaschen Rekonstitutionsvolumen

Standard A 10,0 ml

Standard B 2,0 ml

Standard C 5,0 ml

Standard D – G 2,0 ml

Die Standards sind kalibriert (aber nicht daraus hergestellt) am “World Health Organization's Third International Standard for HCG Immunoassay”, Nummer 75/537. Im Sinne dieser Referenz repräsentieren die Standards 0, 5, 25, 50, 100, 250 und 500 mIU/ml (3rd IS 75/537). Die Standardwerte im Bezug auf den “World Health Organization's Second International Standard for HCG”, Nummer 61/6 sind identisch. Weitere Standardkurvenpunkte können durch mischen der Standards hergestellt werden. Es ist zu beachten, dass die Coat-A-Count HCG IRMA Standards nicht durch die im Doppelantikörper HCG Testbesteck mitgelieferten austauschbar sind. Der 25 mIU/ml Standard (Standard C) wird als Positive Referenz im qualitativen Verfahren verwendet. Andere, in diesem Testbesteck mitgelieferte Standards, können in diesem Zusammenhang als Kontrollen eingesetzt werden.

HCG Assay Puffer (CGAB) 11 ml gepufferter Diluent. Bei 2–8°C für 30 Tage nach dem Öffnen oder bis zum Verfallsdatum auf dem Etikett haltbar. IKCG1: 1 Flasche.

Gepufferte Waschlösung, Konzentrat (2TSBW) Konzentrierte, gepufferte Salzlösung, mit Detergenz und Natriumazid als Konservierungsmittel. Unter Zuhilfenahme eines Transferbehälters jede Flasche


Konzentrat mit 600 ml destilliertem Wasser lösen, das Endvolumen beträgt 660 ml. Gekühlt lagern: Bei 2–8°C für 6 Monate nach der Herstellung haltbar. IKCG1: 1 Flasche × 60 ml.

Erforderliche Laborgeräte und Hilfsmittel Gammacounter – kompatibel mit 12x75 mm Röhrchen Schüttler – ca. 200 Zyklen pro Minute einstellen.

Reagenzienvorbereitung Pipetten: 2,0 ml, 5,0 ml und 10,0 ml Destilliertes oder deionisiertes Wasser Messzylinder - zum Abmessen von 600 ml Plastikbehälter mit Verschluss – zur Herstellung und Lagerung der gepufferten Waschlösung

Immunoassay Mikropipette: 100 µl. Dispenser – Für die Zugabe von 2,0 ml der gepufferten Waschlösung. Dekantierständer – erhältlich bei Siemens Healthcare Diagnostics (Artikelnummer: FDR). Logarithmisches Papier, 3 Dekaden Immunoassay-Kontrollen (mehrere Parameter, 3 Konzentrationen) (Artikelnummer: CON6).

Probengewinnung Es ist keine besondere Vorbereitung der Patienten nötig. Blutentnahme durch Venenpunktion19 in unbeschichtete, Heparin- oder EDTA Röhrchen, Abnahmezeitpunkt notieren. Der Einsatz einer Ultrazentrifuge wird zur Klärung von lipämischen Proben empfohlen. Bei hämolysierten Proben besteht die Möglichkeit einer unsachgemäßen Handhabung vor Eintreffen im Labor, daher sind die Ergebnisse mit Vorsicht zu interpretieren. Blutentnahmeröhrchen von verschiedenen Herstellern können differierende Werte verursachen. Dies hängt von den verwendeten Materialien und Additiven (Gel oder physische Trennbarrieren, Gerinnungsaktivatoren und /oder

Antikoagulantien) ab. Coat-A-Count HCG IRMA sind nicht mit allen möglichen Röhrchenvariationen ausgetestet worden. Details der getesteten Röhrchenarten sind dem Kapitel "Alternative Probenarten" zu entnehmen. Erforderliche Menge: 100 µl Serum oder Plasma pro Röhrchen. Lagerung: Bei 2–8°C für 7 Tage oder bis zu 2 Monate bei –20°C. Die Proben vor Testbeginn auf Raumtemperatur (15–28°C) bringen und vorsichtig durchmischen. Um wiederholtes Einfrieren und Auftauen zu vermeiden bei Bedarf portionieren. Gefrorene Proben dürfen nicht durch Erhitzen im Wasserbad aufgetaut werden.

Verdünnungen: Das quantitative Verfahren hat einen Bereich bis 500 mIU/ml, aber es können im Verlauf einer normalen Schwangerschaft auch Spiegel bis 100 000 mIU/ml oder mehr gefunden werden. Proben normaler Schwangerschaften, besonders die mit Höchstwerten des ersten Trimesters, können bei einer Bestimmung ohne Verdünnung CPMs erzielen, die höher als der höchste Standard sind. Alle Proben mit erwartet hohen Konzentrationen, einschließlich bei Blasenmole4,9,10,16, müssen vor der Messung mit 0-Standard verdünnt werden. Um Verzögerungen durch Wiederholungsmessungen bei Proben außerhalb der Standardkurve zu vermeiden, kann auf Wunsch von jeder Probe eine 1:10 Verdünnung hergestellt werden. Die Bestimmung der Proben als unverdünnt, 1:10 und 1:100 wird die Probenkonzentration in den meisten Fällen in den Messbereich des Assay bringen; eine zusätzliche 1:1 000 Verdünnung kann für Proben erstellt werden, bei denen ein Überschreiten von 100 000 mIU/ml erwartet wird.

Pipettieren: Um Fehler durch Verschleppung zu vermeiden, wird empfohlen Einmal-Pipettenspitzen zu verwenden und die Spitze von Probe zu Probe zu wechseln. Verdrängungspipetten, sowie automatische Pipettor-Dilutoren sollten nur verwendet werden, wenn eine mögliche


Verschleppung untersucht und für vernachlässigbar befunden wurde. Direkt auf den Boden des Röhrchens pipettieren. Alle Proben, inklusive Standards und Kontrollen, sollten in Doppelbestimmung gemessen werden. Die Einzelergebnisse der Doppelbestimmungen sollten auf Übereinstimmung geprüft werden. Kontrollpaare sollten an verschiedenen Stellen des Testansatzes platziert werden, um eine eventuelle Drift zu erkennen.

Quantitatives Verfahren Alle Testkomponenten vor Testbeginn auf Raumtemperatur (15–28°C) bringen. 1 Jeweils 2 HCG-Antikörper-

beschichtete Röhrchen mit A (unspezifische Bindung, 0-Standard) und von B bis G (Maximalbindung) beschriften. Jeweils 2 weitere Antikörper-beschichtete Röhrchen für Kontrollen und Patientenproben beschriften. Optional: 2 unbeschichtete 12x75 mm Polystyrol-Röhrchen mit T (Totalaktivität) beschriften und bis Schritt 6 zur Seite stellen.

Standard HCG mIU/ml 3rd IS 75/537

HCG mIU/ml 2nd IS 61/6

T* — —

A (NSB) 0 0

B 5 5

C 25 25

D 50 50

E 100 100

F 250 250

G ("MB") 500 500

* Optional

2 Jeweils 100 µl der Standards, Kontrollen und Patientenproben in die vorbereiteten Röhrchen pipettieren. Direkt auf den Boden des Röhrchens pipettieren. Patientenproben mit Konzentrationen oberhalb von 500 mIU/ml sollten vor der Messung mit 0-Standard verdünnt werden. Um Fehler durch Verschleppung zu vermeiden, wird empfohlen Einmal-Pipettenspitzen zu verwenden und die Spitze von Probe zu Probe zu wechseln.

Verdrängungspipetten, sowie automatische Pipettor-Dilutoren sollten nur verwendet werden, wenn eine mögliche Verschleppung untersucht und für vernachlässigbar befunden wurde.

3 100 µl HCG Assay Puffer in jedes Röhrchen hinzufügen. Direkt auf den Boden des Röhrchens pipettieren. Für diesen Schritt und für die Zugabe des Tracer bei Schritt 6 wird die Verwendung eines Dispensers empfohlen.

4 30 Minuten auf einem Schüttler inkubieren. Für das qualitative Verfahren, sind 15 Minuten ausreichend.

5 Vollständig dekantieren und abfließen lassen. 2 ml gepufferte Waschlösung in jedes Röhrchen geben, 1 – 2 Minuten stehen lassen, dann erneut vollständig dekantieren und abfließen lassen. Vollständiges Entfernen der Flüssigkeit verbessert die Präzision deutlich. Nach dem Waschen, mit Hilfe eines Dekantierständers alle Röhrchen dekantieren. Anschließend werden die Röhrchen kräftig auf Fließpapier ausgeklopft, um alle restlichen Tröpfchen zu entfernen.

6 100 µl 125I HCG Antikörper in jedes Röhrchen hinzufügen. Das Verteilen des Tracers sollte nicht länger als 10 Minuten dauern. Die T-Röhrchen bis zur Messung (siehe Schritt 9) beiseite stellen; sie bedürfen keiner weiteren Behandlung.

7 30 Minuten auf einem Schüttler inkubieren. Für das Qualitative Verfahren, sind 15 Minuten ausreichend.

8 Vollständig dekantieren und abfließen lassen. 2 ml gepufferte Waschlösung in jedes Röhrchen geben, 1–2 Minuten stehen lassen, dann erneut vollständig dekantieren und abfließen lassen. Nochmals 2 ml gepufferte Waschlösung in jedes Röhrchen geben, 1–2 Minuten stehen lassen, dann erneut vollständig dekantieren. Vollständiges Entfernen der Flüssigkeit verbessert die Präzision


deutlich. Nach dem 2. Waschgang, mit Hilfe eines Dekantierständers alle Röhrchen (außer die T-Röhrchen) dekantieren und 2–3 Minuten umge-dreht stehen lassen. Anschließend werden die Röhrchen kräftig auf Fließpapier ausgeklopft, um alle restlichen Tröpfchen zu entfernen.

9 Für 1 Minute im Gamma Counter messen. In Mehrkanal-Gamma-Countern sollten die T-Röhrchen mindestens 1 Position Abstand von den übrigen Teströhrchen haben, um ein “Spillover” zu vermeiden.

Qualitatives Verfahren Das Qualitative Verfahren ist eine Vereinfachung des Quantitativen Verfahrens, da ein Referenzpunkt anstatt einer vollständigen Standardkurve benutzt wird. Es erlaubt die Entscheidung, ob eine Serumprobe eine HCG Konzentration ober- oder unterhalb von 25 mIU/ml – innerhalb der Präzision des Assays - hat. Proben mit erwartet hohen HCG Spiegeln sollten entsprechend den oben für das quantitative Verfahren beschriebenen Verdünnungen bestimmt werden 1 2 HCG Antikörper beschichtete

Röhrchen C, für die 25 mIU/ml positive Referenz beschriften. Jeweils 2 weitere HCG Antikörper-beschichtete Röhrchen für Kontrollen und Patientenproben beschriften. Optional: 2 unbeschichtete 12x75 mm Polystyrol-Röhrchen mit T (Totalaktivität) beschriften.

Standard HCG mIU/ml 3rd IS 75/537


T* — —

C (Standard) 25 25

* Optional

Jetzt mit dem Quantitativen Verfahren, wie oben beschrieben fortfahren (Schritte 2 bis 9). Bei den Schritten 4 und 7 kann die Inkubationszeit auf 15 Minuten reduziert werden.

Berechnung der Ergebnisse und Qualitätskontrolle

Quantitatives Verfahren Um die HCG Konzentrationen aus der Log-Log Darstellung der Standardkurve abzulesen werden zunächst der Mittelwert jedes Röhrchenpaars, bereinigt um den Mittelwert der NSB (Standard A) Counts pro Minute (cpm) berechnet: Netto Counts = (Mittelwert CPM) minus (Mittelwert NSB CPM)

Anschließend wird die Bindung jedes Röhrchenpaares als Prozent der Maximalbindung (MB, Bmax) bestimmt (%B/MB). Hierzu werden die mittleren CPM des G-Standards, korrigiert um die mittlere NSB, als 100% gesetzt: Prozentbindung = (Netto Counts / Netto MB Counts) × 100

Die Prozentbindungen der Standards werden gegen die Konzentration auf Logarithmenpapier mit 3 Dekaden aufgetragen und durch eine Kurve mit bestmöglicher Annäherung an diese Punkte verbunden. (Die einzelnen Standardpunkte sollten jeweils mit einem Bogen oder einer geraden Linie aber nicht durch eine gerade Linie durch alle Punkte verbunden werden.) HCG Konzentrationen innerhalb des Konzentrations-Bereichs der Standards können an der Kurve durch Interpolation abgelesen werden. Die Prozentbindungen der drei oder vier niedrigsten Standards können zusätzlich auf linearem Papier gegen die Konzentration aufgetragen werden, um durch Interpolation Ergebnisse in der Nähe von 0 genauer zu ermitteln. Hinweis: Obwohl auch andere Verfahren akzeptabel sind, hat die beschriebene Berechnung der Daten Vorteile im Sinne der Qualitätskontrolle. Man erhält eine Standardkurve, die sowohl in der Log-Log, als auch in der Lin-Lin Darstellung weitgehend linear verläuft und sich von Ansatz zu Ansatz nur wenig verändert. Man erhält so auch wichtige Parameter für die Qualitätskontrolle wie die Prozentbindungen der Standards mit Konzentrationen ungleich 0 (%B/Bmax oder "%B/MB"). Mehr Informationen über die Intra-Assay-Präzision als Funktion der Konzentration vermittelt die direkte


Darstellung der Prozentbindung jedes einzelnen Standard-Röhrchens und nicht des Mittelwertes. Alternative Berechnung: Obwohl die Berechnung der Prozentbindung auch direkt aus dem Mittelwert der CPM erfolgen kann, führt die Korrektur um die NSB normalerweise eher zu einer über den gesamten Messbereich linear verlaufenden Kurve. Eine Standardkurve kann auch durch das direkte Auftragen der CPM, bzw. mittleren CPM gegen die Konzentration auf Log-Log oder Lin-Lin Papier erstellt werden. (Halblogarithmisches Papier sollte nicht verwendet werden.) Dieses Verfahren ist zwar einfacher, aber weniger hilfreich für die Qualitätskontrolle. Computergestützte Berechnung: "Punkt-zu-Punkt" Methoden, insbesondere lineare und kubische-spline Berechnungen können für den Coat-A-Count HCG IRMA angewendet werden. Auch wenn die Berechnung durch ein Computer-Programm erfolgt, ist die grafische Log-Log Darstellung der Standardkurve (manuell oder automatisch) als ein weiterer Schritt der Qualitätskontrolle empfehlenswert. Für die Berechnung der Daten sind auch sog. logistische Verfahren anwendbar. Aus dieser Gruppe sind die 4- oder 5-Parameter Logistik am besten geeignet. Es ist zu berücksichtigen, dass sich manche der üblichen Algorithmen nicht erfolgreich annähern, selbst wenn logistische Modelle die Daten richtig erfassen. Wird ein logistisches Verfahren angenommen, ist es in jedem Fall erforderlich, die Korrektheit des täglichen Ansatzes mit Hilfe der Rückberechnung der Standards und anderer Parameter zu beurteilen. Zusätzlich wird die grafische Darstellung in Log-Log-Form empfohlen, da diese mehr Informationen bietet als die konventionelle halblogarithmische Darstellung. Proben-Handhabung: Die Anweisungen zur Handhabung und Lagerung von Proben und Komponenten müssen beachtet werden. Patientenproben mit erwarteten Konzentrationen über dem höchsten Standard (500 mIU/ml) müssen vor dem Einsatz in den Test mit 0-Standard verdünnt werden. Alle Proben, inklusive der Standards und Kontrollen, sollten in Doppelbestimmungen gemessen

werden. Um Verschleppung zu vermeiden, ist es wichtig Pipetten mit Einwegspitzen zu verwenden und diese zwischen den Proben zu wechseln. Verdrängungs-pipetten, sowie automatische Pipettor-Dilutoren sollten nur verwendet werden, wenn eine mögliche Verschleppung untersucht und für vernachlässigbar be-funden wurde. Kontrollpaare sollten an verschiedenen Stellen des Testansatzes platziert werden, um eine eventuelle Drift zu erkennen. Die Einzelergebnisse der Doppelbestimmungen sollten auf Übereinstimmung überprüft werden. Gamma Counter: In Mehrkanal-Gamma-Countern sollten die T-Röhrchen mindestens 1 Position Abstand von den übrigen Teströhrchen haben, um ein “Spillover” zu vermeiden. Alternativ können auch nur 25 µl in die Röhrchen mit der Totalaktivität im Schritt 6 pipettiert und anschließend die CPM mit dem Faktor 4 multipliziert werden. Kontrollen: Kontrollen oder Patienten Serum oder Plasmapools mit mindestens 2 HCG Konzentrationen (niedrig und hoch) sollten routinemäßig als unbekannte Proben eingesetzt und von Tag zu Tag protokolliert werden. Wiederholungsmessungen von Proben sind ein wertvolles Hilfsmittel in der Beurteilung der Interassay Präzision. Qualitätskontroll-Parameter: Es wird empfohlen die folgenden Parameter zu protokollieren: T = Totalaktivität (als Counts pro Minute)

%NSB = 100 × (Mittelwert NSB Counts / Total Counts)

%MB = 100 × (Netto Counts / Total Counts)

und die Prozentbindungen (%B/Bmax oder "%B/MB") aller Standards mit Ausnahme des höchsten Standards, zum Beispiel: %C/MB = 100 × (Netto Counts Standard "C" / Netto Counts MB)

Dokumentation: Es ist gute Laborpraxis die Chargennummern, sowie das Datum der ersten Öffnung bzw. Rekonstitution der verwendeten Komponenten zu protokollieren. Literatur: Siehe auch: Dudley RA, et al. Guidelines for immunoassay data reduction. Clin Chem 1985;31:1264-71. Auswertebeispiel, Quantitatives Verfahren: Dieses Beispiel dient nur zur


Veranschaulichung und ist nicht dazu geeignet Werte aus einem anderen Testansatz damit zu ermitteln. (Siehe Tabelle "Example Run, Quantitative Procedure").

Qualitatives Verfahren Wenn die (durchschnittlichen) Counts pro Minute für die Patientenprobenröhrchen niedriger sind als die (durchschnittlichen) Counts pro Minute für den Standard C, dann enthält die Probe weniger als 25 mIU/ml HCG, innerhalb der Präzision des Assays. Wenn die Counts der Patientenprobe höher sind, als die des Standard C, dann enthält die Probe mehr als 25 mIU/ml HCG, innerhalb der Präzision des Assays.

Im Bezug auf die Schwangerschaft: Konzentrationen oberhalb des 25 mIU/ml Grenzwertes sollten als positiver Schwangerschaftsnachweis betrachtet werden, wenn andere Gründe für hohe HCG Spiegel, wie trophoblastische, nicht-trophoblastische Neoplasien, kürzliche Schwangerschaft, Spontanabort usw. ausgeschlossen sind.4,9,10,16 Konzentrationen unterhalb dieses Grenzwertes werden bei gesunden Männern und nichtschwangeren Frauen erwartet (Siehe unten “Expected Values”.) Konzentrationen unterhalb 25 mIU/ml können auch in Proben nichtschwangerer Frauen und ebenso in den Frühphasen der Schwangerschaft erwartet werden, bei denen die HCG Konzentration noch nicht die festgelegte Entscheidungsgrenze des Verfahrens erreicht hat. Die Bestimmung einer weiteren Probe, zwei oder mehrere Tage später entnommen, sollte den Sachverhalt klären, da erwartet werden kann, dass sich innerhalb dieser Zeit der HCG Spiegel gegenüber dem der Frühphase der Schwangerschaft verdoppelt hat. 11 Qualtitätskontrolle: Die Counts pro Minute aller Proben sollten auf Übereinstimmung geprüft werden. Kontrollen oder Patienten (Serum oder Plasma) Pools, mit HCG Konzentrationen über und unter des 25 mIU/ml Standards (Standard C) sollten als unbekannte Proben getestet werden. Andere im Testbesteck mitgelieferte Standards, die 5 und 50 mIU/ml Standards (B, D) – können als zusätzliche Kontrollen verwendet

werden. Siemens Healthcare Diagnostics empfiehlt die Erstellung einer Übersicht der CPM des Standards (Standard C) und der Kontrollen als % der Totalaktivität, z.B.: %C/T = 100 × (durchschnittliche Counts des Standards "C" / durchschnittliche Counts Totalaktivität)

Eine regelmäßige Erfassung der Intraassay-Mittelwerte und -Variationskoeffizienten, basierend auf den Counts, kann bei mehreren Wiederholungen jeweils einer niedrigen Kontrolle, einer hohen Kontrolle und des Standard C bei der täglichen Überwachung der Assay-Integrität eine Hilfe sein. Auswertebeispiel: Dieses Beispiel dient nur zur Veranschaulichung und ist nicht dazu geeignet Werte aus einem anderen Testansatz damit zu ermitteln. (Siehe Tabelle "Example Run, Qualitative Procedure".)

Referenzwerte Serumproben von 47 gesunden Männern und 38 nicht-schwangeren Frauen wurden mit dem Coat-A-Count HCG IRMA Verfahren mit den folgenden Ergebnissen analysiert: 95% der männlichen Werte lagen unterhalb von 1,0 mIU/ml 90% der weiblichen Werte lagen unterhalb von 3 mIU/ml 100% aller Werte (Männer und Frauen) lagen bei 5 mIU/ml oder niedriger. Die Ergebnisse haben ein konstantes oberes Limit von normalen 5 mIU/ml bei nicht bestehender Schwangerschaft. Die genannten Ergebnisse sind nur als Richtwerte zu interpretieren. In einer anderen Studie, wurden 286 Serumproben von Frauen mit bekannter Dauer der Schwangerschaft mit dem Coat-A-Count HCG IRMA Verfahren getestet. Die Dauer der Schwangerschaft wurde als Wochen nach dem ersten Tag der letzten Menstruation (LMP) eingestuft. Folgende Ergebnisse wurden ermittelt:

Median Absolut Bereich 95% Bereich

4 Wochen nach LMP (n=5)

291 196 – 3 537


Median Absolut Bereich 95% Bereich


4 117 1 026 – 30 964


18 897 4 250 – 81 172

7 – 8 Wochen nach LMP (n=40)

54 266 6 002 – 114 430


48 841 18 344 – 98 807


50 841 21 874 – 120 766


16 418 4 106 – 57 393


11 872 2 468 – 36 142

Serielle Proben von Frauen in den ersten 2 – 5 Wochen der Schwangerschaft zeigten Verdopplungszeiten der HCG Konzentrationen in Bereichen von 1,5 – 3 Tagen, mit einer mittleren Verdopplungszeit von 2,2 Tagen. Diese Referenzwerte sind lediglich als Richtlinien aufzufassen. Jedes Labor sollte seine eigenen Referenzbereiche etablieren.

Leistungsdaten Die folgenden Abschnitte enthalten repräsentative Daten für das Coat-A-Count HCG IRMA Testbesteck. In den Abschnitten unten sind die HCG Ergebnisse in mIU/ml angegeben. Messbereich: Bis 500 mIU/ml (3rd IS 75/537 und 2nd IS 61/6). Standardisierung: Der Assay hat im quantitativen Verfahren einen Standardbereich von 5 – 500 mIU/ml. Der 25 mIU/ml Standard dient als positive Referenz im qualitativen Verfahren. Der Assay wurde am “World Health Organization's Third International Standard for HCG (3rd IS 75/537)” und am “Second International Standard for HCG” (2nd IS 61/6) genormt. Analytische Sensitivität: 0,3 mIU/ml, High-Dose-Hook-Effect: keiner bis 1 000 000 mIU/ml.

Intraassay-Präzision: Statistische Berechnung der Ergebnisse von Proben, die in 20 Röhrchenpaaren in einem Ansatz gemessen wurden. (Siehe Tabelle „Intraassay-Precision“.) Interassay-Präzision: Statistische Berechnung der Ergebnisse von Proben, die in 20 Röhrchenpaaren in verschiedenen Ansätzen gemessen wurden. (Siehe Tabelle „Interassay-Precision“.) "End of Run" Effekt: Tritt bis ca. 350 Röhrchen nicht auf. (siehe Tabelle "End-of-Run Effect"). Linearität: Proben wurden in verschiedenen Verdünnungen getestet. (Repräsentative Daten entnehmen Sie bitte der Tabelle „Linearität“.) Wiederfindung: Proben wurden 1:19 mit HCG Lösungen (200, 1 000 und 5 000 mIU/ml) versetzt und gemessen. (Repräsentative Daten entnehmen Sie bitte der Tabelle „Recovery“.) Spezifität: Der im Coat-A-Count HCG IRMA verwendete Antikörper ist hochspezifisch für intaktes HCG, mit niedriger Kreuzreaktivität zu anderen Glykoprotein-Hormonen in der Patientenprobe. Eine Patientenprobe mit 23,3 mIU/ml HCG wurde mit verschiedenen Mengen an FSH, LH und TSH versetzt. Die Probe wurde versetzt und unversetzt mit dem Coat-A-Count HCG IRMA Verfahren bestimmt. (Siehe Tabelle "Specificity 1".) Die HCG alpha und beta Untereinheiten wurden ebenfalls untersucht. HCG β-Untereinheiten (WHO 75/551) wurden mit dem Coat-A-Count HCG IRMA 0-Standard versetzt. (Siehe Tabelle "Specificity 2".)

HCG α-Untereinheiten (WHO 75/569) wurden mit dem Coat-A-Count HCG IRMA 0-Standard versetzt. (Siehe Tabelle "Specificity 3".) Bilirubin: Bilirubin hat in Konzentrationen bis zu 200 mg/l keinen Einfluss auf die Ergebnisse, der größer als die Impräzision des Assays selbst ist. Hämolyse: Erythrozyten haben in Konzentrationen bis zu 30 µl/ml keinen Einfluss auf die Messung, der größer als die Impräzision des Assays selbst ist. Alternativer Probentyp: Um die Auswirkungen von verschiedenen


Probenarten zu untersuchen, wurde Blut von 20 Freiwilligen in Röhrchen ohne Additiva, in Heparin-, EDTA- und Becton Dickinson SST® Vacutainer-Rörchen gesammelt. Alle Proben wurden mit dem Coat-A-Count HCG IRMA Assay mit den nachfolgend aufgeführten Ergebnissen bestimmt. (EDTA) = 1,00 (Serum) – 0,5 mIU/ml r = 0,996

(Heparin) = 1,04 (Serum) + 0,3 mIU/ml r = 0,994

(SST) = 0,98 (einfachen Röhrchen) + 1,65 mIU/ml r = 0,993

Mittelwerte: 101 mIU/ml (Serum) 106 mIU/ml (Heparin) 101 mIU/ml (EDTA) 101 mIU/ml (SST)

Methodenvergleich: Das Coat-A-Count HCG IRMA Verfahren wurde mit einem anderen immunradiometrischen Assays für HCG (Kit A) und einem HCG Radioimmunoassay (Kit B) an 48 Patientenproben verglichen. Die Proben hatten HCG Spiegel von 5 – 500 mIU/ml. Berechnung der linearen Regression: (CAC IRMA) = 1,19 (Kit A) + 0,9 mIU/ml r = 0,998

Mittelwerte: 217 mIU/ml (Coat-A-Count IRMA) 182 mIU/ml (Kit A)

(CAC IRMA) = 1,25 (Kit B) – 24,4 mIU/ml r = 0,983

Mittelwerte: 217 mIU/ml (Coat-A-Count IRMA) 193 mIU/ml (Kit B)

Anwendungsberatung Bei Rückfragen wenden Sie sich bitte an Ihre Niederlassung. www.siemens.com/diagnostics

Das Qualitätsmanagement-System der Siemens Healthcare Diagnostics Inc. ist zertifiziert nach DIN EN ISO 13485:2003.

Español

Coat-A-Count HCG IRMA Utilidad del análisis: Coat-A-Count HCG IRMA es un análisis radioinmunométrico diseñado para la determinación

cuantitativa y cualitativa de la gonadotropina coriónica humana (HCG) en suero y plasma. Su uso es estrictamente para diagnóstico in vitro, por personal profesional de laboratorio, como una ayuda en la detección del embarazo. Referencia: IKCG1 (100 tubos)

El kit de 100 tubos contiene menos de 20 microcurios (740 kilobequerelios) de anti-HCG

policlonal marcada con 125I radiactivo.

Resumen y Explicación del Test La gonadotropina coriónica humana (HCG) es una hormona glicoproteica de dos cadenas (peso molecular ≈37 000), que normalmente se encuentra en la sangre y la orina sólo durante el embarazo. Es secretada por el tejido placentario, comenzando con el trofoblasto primitivo, casi desde el momento de la implantación, y sirve para mantener al cuerpo lúteo durante las primeras semanas del embarazo. La HCG o el material tipo HCG también es producido por una amplia variedad de neoplasias trofoblásticas y no-trofoblásticas.4,9,10,16 Su determinación, por sistemas de análisis de sensibilidad y especificidad adecuados, ha demostrado ser de gran valor en la detección y el manejo del embarazo. De acuerdo con la literatura, la HCG normalmente alcanza niveles de aproximadamente 2 000 mIU/ml un mes después de la concepción.2,3,10,11 Para el tercer mes, se alcanza un pico de 50 000 o incluso de 100 000 mIU/ml, después del cual hay una disminución gradual. Normalmente después del parto, el nivel de HCG baja rápidamente, alcanzando las concentraciones de no embarazo unas dos semanas después (generalmente menores de 5 mIU/ml).10 Los embarazos ectópicos y los embarazos que finalizan en aborto espontáneo tienden a tener niveles de HCG circulante más bajos de lo normal, mientras que se observan niveles algo más elevados en los embarazos múltiples. El procedimiento cualitativo representa una simplificación del procedimiento cuantitativo, en cuanto a que sólo se utiliza un punto de referencia en vez de una curva de calibración. Este permite


determinar si una muestra de suero tiene una concentración de HCG superior o inferior a 25 mIU/ml, dentro de la precisión del ensayo. Las concentraciones superiores a este límite pueden considerarse positivas para el embarazo, siempre que se hayan descartado otras causas de los niveles altos de HCG, esto es, neoplasia trofoblástica y no trofoblástica.4,9,10,16 En las muestras de mujeres no embarazadas, así como en las de embarazos en las primeras etapas en las que la concentración de HCG todavía no han alcanzado el nivel de decisión establecido para el procedimiento, es de esperarse concentraciones inferiores al límite. El análisis de otra muestra recogida dos o más días después deberá decidir la cuestión, ya que en los primeros estadíos del embarazo se puede esperar que el nivel de HCG se duplique en este tiempo aproximadamente.11 También puede ser de interés volver a analizar la muestra original por el procedimiento cuantitativo para determinar su concentración de HCG con más exactitud.

Principio del análisis Coat-A-Count HCG IRMA es un ensayo radioinmunométrico en fase sólida. El ensayo utiliza anticuerpos policlonales anti-HCG marcados con 125I en fase líquida y anticuerpos monoclonales anti-HCG inmovilizados en la pared de un tubo de poliestireno.

En el procedimiento: La HCG es capturada entre el trazador policlonal y los anticuerpos monoclonales que recubren el tubo. El trazador policlonal no unido se remueve por decantación y lavado del tubo. El tubo se cuenta en un contador gama durante 1 minuto. La concentración de HCG en la muestra del paciente es directamente proporcional al número de cuentas por minuto. La concentración de HCG se determina comparando el número de cuentas con las obtenidas con el juego de calibradores suministrados. Reactivos a pipetear: 2 Tiempo total de incubación: 1 hora (en un agitador de gradillas) Cuentas totales en la iodización: aproximadamente 300 000 cpm

Advertencias y precauciones Para uso diagnóstico in vitro. Reactivos: Almacenar a 2–8°C en una cámara preparada para almacenar material radiactivo. Desechar de acuerdo a la legislación en vigor. No usar los reactivos después de su fecha de caducidad. Algunos componentes suministrados en el kit pueden contener material de origen humano y/o otros componentes potencialmente peligrosos que necesiten ciertas precauciones. Siga las precauciones universales y manipule todos los componentes como si fueran capaces de transmitir agentes infecciosos. Los materiales derivados de sangre humana han sido analizados y son negativos para sífilis; para anticuerpos frente al VIH 1 y 2; para el antígeno de superficie de hepatitis B y para los anticuerpos de hepatitis C. Se ha usado Azida sódica, en concentraciones menores de 0,1 g/dl, como conservante. Para su eliminación, lavar con grandes cantidades de agua para evitar la constitución de residuos de azidas metálicas, potencialmente explosivas, en las cañerías de cobre y plomo. Agua: Usar agua destilada o desionizada.

Radiactividad Una copia de cualquier certificado de licencia de radioisótopos (específico o general) emitido a la aduana de los EE.UU. se registrará en los ficheros de Siemens Healthcare Diagnostics antes de que se puedan enviar kits o componentes conteniendo material radiactivo. Estos materiales radiactivos pueden adquirirse por cualquier cliente con la licencia específica apropiada. Con una licencia general, estos materiales radiactivos pueden adquirirse solo por médicos, veterinarios en la práctica de la medicina veterinaria, laboratorios clínicos y hospitales — y estrictamente para la clínica in vitro o tests de laboratorio que no conlleven la administración interna o externa de material radiactivo o su radiación a humanos u otros animales. Su adquisición, recepción, almacenaje, uso, trasferencia y desecho están regulados y se expenderá una licencia (general o


específica) de la Comisión Nuclear de EE.UU. o de un Estado con el NRC para su consiguiente control. Manejar los materiales radiactivos de acuerdo a los requerimientos de su licencia general o específica. Para minimizar la exposición a la radiación, el usuario debe adherirse al cuarto conjunto de guías publicadas por el National Bureau of Standards con el nombre Safe Handling of Radioactive Materials (Handbook No. 92, issued March 9, 1964) y en las consiguientes publicaciones de las autoridades Federales o Estatales. Limpiar y decontaminar rápidamente las superficies afectadas. Evitar la generación de aerosoles. Eliminar los residuos sólidos radiactivos de acuerdo con los requerimientos de su licencia. Licencias generales (NRC Form 483) pueden eliminar sus residuos sólidos radiactivos como residuos no radiactivos, después de retirar las etiquetas. Licencias específicas (NRC Form 313) se deben referir al Título 10, Código de Regulaciones Federales, Parte 20. Las licencias en Estados Asociados deben referirse a las normativas de su correspondiente Estado. Licencias generales pueden eliminar sus residuos líquidos radiactivos contenidos en este tipo de productos como cualquier otro material líquido, quitando las etiquetas de los contenedores y procesándolos como residuos sólidos. Licencias específicas pueden eliminar pequeñas cantidades de residuos líquidos radiactivos contenidos en este tipo de productos como cualquier otro material líquido. Refiérase a la normativa aplicable a su laboratorio.

Materiales Suministrados: Preparación Inicial

Tubos recubiertos de anticuerpo frente a la HCG (ICG1) Tubos de poliestireno recubiertos con un anticuerpo monoclonal murino anti-HCG y embalados en bolsas de cierre hermético. Almacenar refrigerados y protegidos de la condensación, cerrando cuidadosamente las bolsas después de su uso. Estable a 2–8°C hasta la fecha de caducidad impresa en la bolsa. IKCG1: 100 tubos.

125I HCG Ab (ICG2) Anticuerpo policlonal anti-HCG yodado en forma líquida, listo para usar. Cada frasco contiene 5,5 ml. Estable a 2–8°C durante 30 días después de su apertura, o hasta la fecha de caducidad marcada en la etiqueta. IKCG1: 2 vials.

Calibradores HCG (CGI3–9) Siete viales de calibradores de HCG, marcados A – G, en una matriz de suero humano libre de HCG, con conservante. Los calibradores se suministran liofilizados. 30 minutos, como mínimo, antes de su uso: reconstituir el calibrador cero A con 10 ml de agua destilada o desionizada, el calibrador C con 5 ml, y los calibradores restantes, B y D a G, con 2 ml cada uno. (Ver la tabla que se da a continuación). Usar pipetas volumétricas y mezclar con movimientos circulares o inversión suave. Estable a 2–8°C durante 30 días después de la reconstitución, o hasta 6 meses (alicuotados) a –20°C. IKCG1: 1 juego.

Vial de Calibrador Volumen de

Reconstitución

Calibrador A 10,0 ml

Calibrador B 2,0 ml

Calibrador C 5,0 ml

Calibradores D – G 2,0 ml

Los calibradores están estandarizados contra (pero no preparados de) el Tercer Estándar Internacional para Inmunoensayo de HCG de la Organización Mundial de la Salud, número 75/537. En términos de este estándar, los calibradores representan 0, 5, 25, 50, 100, 250 y 500 mili-Unidades Internacionales de HCG por mililitro (mIU/ml, 3rd IS 75/537). Los valores de los calibradores en términos del Segundo Estándar Internacional para HCG de la Organización Mundial de la Salud, número 61/6, son idénticos. Los puntos de calibración intermedios se pueden obtener mezclando los calibradores en las proporciones adecuadas. Note que los calibradores del kit Coat-A-Count HCG IRMA no son intercambiables con aquellos suministrados en el kit Doble Anticuerpo HCG. El calibrador de 25 mIU/ml (Calibrador C) sirve como la


referencia positiva en el procedimiento cualitativo. En este contexto, los otros calibradores suministrados con este kit se pueden usar como controles.

Solución Amortiguadora de Ensayo para HCG (CGAB) 11 ml de diluyente amortiguado. Estable a 2–8°C durante 30 días después de su apertura, o hasta la fecha de caducidad marcada en la etiqueta. IKCG1: 1 vial.

Concentrado de Solución Amortiguadora de Lavado (2TSBW) Solución salina amortiguadora, con surfactantes, y azida sódica, con conservante. Utilizando un depósito de transferencia, diluir el contenido de cada frasco con 600 ml de agua destilada, para preparar un volumen total de 660 ml. Almacenar refrigerado. Estable a 2-8°C durante 6 meses después de la preparación. IKCG1: 1 vial × 60 ml.

Materiales Requeridos pero no suministrados Contador Gamma — compatible con tubos estándar de 12 x 75 mm. Agitador — configurado para dar aproximadamente 200 sacudidas por minuto.

Preparación del Reactivo Pipetas: 2,0 ml, 5,0 ml y 10,0 ml Agua destilada o desionizada Probeta graduada — para dispensar 600 ml Depósito para almacenamiento de plástico con tapa — para la preparación y almacenaje de la Solución Amortiguadora de Lavado

Inmunoensayo Micropipeta: 100 µl Dispensador – para dispensar 2,0 ml de Solución Amortiguadora de Lavado. Gradilla de espuma — disponible en Siemens Healthcare Diagnostics (Referencia: FDR). Papel para gráfica log-log de 3 ciclos Un control de inmunoensayo de tres niveles con base de suero humano,

conteniendo HCG más de otros 25 analitos que puede obtenerse en Siemens Healthcare Diagnostics (Referencia: CON6).

Recogida de la muestra El paciente no necesita estar en ayunas así como tampoco cualquier otro tipo de preparación. Recoger la sangre por venipunción19 en tubos vacutainer sin anticoagulante, heparinizados o con EDTA, y anotar la hora en que se toma la muestra. Se recomienda el uso de una ultracentrífuga para aclarar las muestras lipémicas. Las muestras hemolizadas podrían indicar una mala manipulación de la muestra antes de ser recibida por el laboratorio; en este caso, los resultados deben interpretarse con precaución. Los tubos para recoger sangre de distintos fabricantes pueden producir valores diferentes, dependiendo del material del tubo y de los aditivos, incluyendo barreras de gel o barreras físicas, activadores de la coagulación y/o anticoagulantes. El HCG Coat-A-Count IRMA no ha sido analizado con todos los distintos tipos de tubos. Para obtener detalles sobre los tipos tubos que se han analizado, consulte la sección de Volumen requerido: 100 µl suero o plasma por tubo. Conservación: 2–8°C durante 7 días, o hasta 2 meses a –20°C. Antes del ensayo, llevar todas las muestras a temperatura ambiente (15–28°C) y mezclar por inversión. Alicuotar, si es necesario, para evitar la repetición de congelación y descongelación. No intentar la descongelación de muestras congeladas calentándolas en un baño de agua.

Diluciones: El procedimiento cuantitativo tiene un rango de hasta 500 mIU/ml, pero en el curso del embarazo normal se pueden encontrar niveles en las pacientes de 100 000 mIU/ml o más. Las muestras de embarazadas normales, incluso aquellas que estén alcanzando los valores picos del primer trimestre, producirán un valor de cuentas por minuto mayor que el


del calibrador más alto si se analizan sin diluir. Las muestras que se espera que contengan niveles más altos, incluyendo aquellas de embarazos molares,4,9,10,16 se deben diluir adecuadamente con el calibrador cero antes del análisis. Para evitar las demoras ocasionadas al tener que reevaluar las muestras a partir de la curva, es posible que algunos laboratorios deseen poner en práctica la preparación de una serie de diluciones 1 en 10 de cada muestra. El análisis de muestras no diluidas, 1 en 10 y 1 en 100, en la mayoría de los casos pondrá las concentraciones de las muestras dentro del rango del ensayo; se puede preparar una dilución adicional 1 en 1 000 para las muestras que se espera que excedan 100 000 mIU/ml.

Pipeteado: Se debe tener cuidado al preparar las diluciones y pipetear las muestras para evitar errores por arrastre. Es importante usar una micropipeta con punta desechable, cambiando la punta entre muestras para evitar la contaminación por arrastre. Sólo se deberán usar pipetas de desplazamiento positivo y equipos de dilución automática si se ha evaluado la posibilidad de arrastre y se ha determinado que este sería insignificante. Pipetear todas las muestras y los reactivos directamente en el fondo. Todas las muestras deberán analizarse por duplicado, incluyendo los calibradores y los controles. Inspeccionar la concordancia de los resultados entre los pares de tubos. Se pueden espaciar pares de tubos controles a lo largo de la tanda para ayudar a verificar que no haya una desviación significativa.

Procedimiento cuantitativo Todos los componentes deben llevarse a temperatura ambiente (15–28°C) antes de su uso. 1 Marcar por duplicado catorce tubos

recubiertos de anticuerpo frente a la HCG: A (unión no específica) y B a G (máxima unión). Marcar tubos adicionales recubiertos de anticuerpo, también por duplicado, para los controles y las muestras de pacientes.

Opcionalmente, marcar con T (cuentas totales) dos tubos de poliestireno limpios (sin recubrir) de 12 x 75 mm, por duplicado, y dejarlos a un lado hasta el paso 6.

Calibrador HCG mIU/ml 3rd IS 75/537


T* — —

A (NSB) 0 0

B 5 5

C 25 25

D 50 50

E 100 100

F 250 250

G ("MB") 500 500

* Opcional

2 Pipetear 100 µl de cada calibrador, controles y muestras de suero de pacientes en los tubos preparados al efecto. Pipetear directamente en el fondo del tubo. Las muestras de los pacientes que se espera que contengan niveles de HCG mayores de 500 mIU/ml deberán ser diluidas adecuadamente con el calibrador cero antes del análisis. Usar una micropipeta con punta desechable, cambiando la punta entre muestras para evitar errores por arrastre. Se deberán usar pipetas de desplazamiento positivo y pipetores-dilutores únicamente si se ha evaluado la posibilidad de acarreo y se determinado que este sería insignificante.

3 Agregar 100 µl de Solución Amortiguadora de Ensayo HCG a cada tubo. Pipetear directamente en el fondo del tubo. Para este paso y para añadir el trazador en el paso 6, se recomienda usar un dispensador de repetición.

4 Agitar durante 30 minutos sobre un agitador de gradillas. Para el Procedimiento Cualitativo, 15 minutos son suficientes.

5 Decantar y dejar escurrir completamente. Añadir 2,0 ml de la Solución Amortiguadora de Lavado a


cada tubo. Esperar 1 a 2 minutos, luego decantar y dejar escurrir completamente. Eliminar toda la humedad visible para mejorar la precisión. Después del lavado, decantar los contenidos de todos los tubos usando una gradilla de decantación de espuma. Golpear los tubos contra papel absorbente para eliminar las gotas residuales.

6 Agregar 100 µl de HCG Ab I125 a cada tubo. No se debe tardar más de 10 minutos durante la dispensación del trazador. Dejar los tubos T a un lado para su contaje (paso 9); no requieren más procesamiento posterior.

7 Agitar durante 30 minutos sobre un agitador de gradillas. Para el Procedimiento Cualitativo, 15 minutos son suficientes.

8 Decantar y dejar escurrir completamente. Añadir 2,0 ml de la Solución Amortiguadora de Lavado a cada tubo. Esperar 1 a 2 minutos, luego decantar y dejar escurrir completamente. Nuevamente, añadir 2,0 ml de la Solución Amortiguadora de Lavado, esperar 1 a 2 minutos y decantar. Eliminar toda la humedad visible para mejorar la precisión. Después del segundo lavado, decantar los contenidos de todos lo tubos (excepto los tubos T) usando una gradilla de decantación de espuma, y permitir que escurran durante 2 o 3 minutos. Golpear los tubos contra papel absorbente para eliminar las gotas residuales.

9 Contar durante 1 minuto en un contador gamma. En los contadores gamma multicabezas, los tubos de Cuentas Totales (opcional) deberán separarse del resto de los tubos de ensayo por cuando menos un espacio, para minimizar la posibilidad de derrames dentro de otro tubo.

Procedimiento Cualitativo El procedimiento cualitativo representa una simplificación del procedimiento cuantitativo, en cuanto a que sólo se

utiliza un punto de referencia en vez de una curva de calibración. Este permite determinar si una muestra de suero o plasma tiene una concentración de HCG superior o inferior a 25 mIU/ml, dentro de la precisión del ensayo. Las muestras que se espera que contengan niveles de HCG altos, se deberán analizar con las diluciones apropiadas descritas anteriormente en el Procedimiento Cuantitativo. 1 Marcar dos Tubos recubiertos con

anticuerpos anti-HCG como C, para la referencia positiva de 25 mIU/ml. Marcar otros tubos recubiertos con anticuerpo anti-HCG, también por duplicado, para los controles y las muestras del paciente. Opcionalmente, marcar dos tubos de poliestireno (no recubiertos) de 12 x 75 mm como T (cuentas totales).

Calibrador HCG mIU/ml 3rd IS 75/537


T* — —

C (Referencia) 25 25

* Opcional

Ahora, continuar como en el Procedimiento Cuantitativo descrito anteriormente (pasos 2 a 9). El tiempo de incubación en los pasos 4 y 7 se puede reducir a 15 minutos.

Cálculos y Control de Calidad

Procedimiento Cuantitativo Para calcular los resultados a partir de una representación log-log de la curva de calibración, primero corregir las cuentas por minuto (CPM) de cada par de tubos restando las CPM promedio de los tubos de unión no específicos (calibrador A). Cuentas netas = (Media CPM) menos (Media NSB CPM)

Luego determinar el porcentaje de unión (relativo al del calibrador más alto) - aquí llamado “%B/MB” - de cada par de tubos como por ciento de “unión máxima,” con las cuentas NSB corregidas del calibrador mas alto tomadas como 100%: Porcentaje de Unión = (Cuentas netas / Cuentas MB netas) × 100


Utilizando papel de gráficas log-log de 3 ciclos, trazar el Porcentaje de Unión versus la Concentración para cada uno de los calibradores no cero y trazar una curva que se aproxime a la trayectoria de estos puntos. (Conectar los puntos de calibración con arcos o segmentos de líneas rectas. No intentar acomodar una sola línea recta a los datos.) Las concentraciones para controles y desconocidos dentro del rango de calibradores no cero puede entonces ser calculada de la curva de calibración por interpolación. Se puede usar un trazo adicional de Porcentaje Unido versus Concentración para los calibradores mas bajos en papel de gráfica lineal-lineal para una interpolación cercana a la dosis cero. Comentarios: Aunque otros enfoques son aceptables, la reducción de datos por el método recién descrito tiene ciertas ventajas desde el punto de vista de control de calidad. En particular, proporciona una curva de calibración que es relativamente lineal en representaciones tanto log-log como lineal-lineal y relativamente estable de ensayo a ensayo. También proporciona valiosos parámetros de Control de Calidad, es decir, valores de Porcentaje de Unión (%B/MB) para los calibradores no cero. Se puede obtener una gráfica todavía más informativa, dando un sentido de reproducibilidad dentro del ensayo como una función de la concentración, haciendo un trazo de valores de Porcentaje de Unión de los tubos calibradores directamente, esto es, sin primero promediar las CPM de duplicados. Alternativas: Aunque el Porcentaje de Unión se puede calcular directamente de las CPM Promedio, la corrección para la unión no específica generalmente produce una curva de calibración que es mas lineal a lo largo de su rango. Una curva de calibración también puede construirse trazando las CPM o CPM Promedio directamente contra la Concentración en papel de gráfica log-log o lineal-lineal. (No debe emplearse papel de gráfica semilogarítmico.) Este enfoque tiene la virtud de la simplicidad, pero es menos deseable desde el punto de vista del control de calidad. Reducción de Datos por Ordenador: Los métodos “punto a punto”, incluyendo

lineal y spline cúbico, no son adecuados; pero ya que proporcionan poca ayuda en el monitoreo de la integridad de un ensayo, es importante preparar el trazo log-log recomendado de la curva de calibración, ya sea manualmente o por ordenador, como un paso de control de calidad. Las técnicas de reducción de datos basadas en el modelo logístico también pueden ser aplicables. Dentro de esta familia, las rutinas de curva basada en el parámetro logístico de 4 o 5 son los candidatos más apropiados. Sin embargo, algunos algoritmos actualmente en uso no pueden convergir con éxito, aun cuando el modelo logístico es fiel a los datos. Si se adopta un método logístico, es esencial verificar su propiedad para el ensayo de cada día monitoreando el retrocálculo de los calibradores y otros parámetros. Adicionalmente, se recomienda un trazo de la curva del calibrador en una representación log-log, ya que esto es más informativo que el trazo semilogarítmico convencional. Manipulación de la Muestra: Las instrucciones para manipular y almacenar las muestras de los pacientes y los componentes deberán observarse cuidadosamente. Antes del análisis, diluir las muestras de los pacientes que se espera que contengan concentraciones de HCG mayores que la del calibrador más alto (500 mIU/ml) con el calibrador cero. Todas las muestras, incluyendo los calibradores y los controles, deberán someterse a ensayo cuando menos por duplicado. Es importante utilizar una micropipeta con punta desechable, cambiando la punta entre muestras para evitar la contaminación por arrastre. Se deberán usar pipetas de desplazamiento positivo y pipetores-dilutores automáticos sólo si se ha evaluado la posibilidad de arrastre y se ha determinado que sería insignificante. Se pueden espaciar pares de tubos de control a lo largo del ensayo para ayudar a verificar la ausencia de arrastre significativo. Inspeccionar los resultados para comprobar el acuerdo entre pares de tubos. Contador Gamma: Para minimizar la posibilidad de derrames en los contadores gamma de múltiples pozos, los tubos de conteos totales (T) opcionales deberán estar separados de los otros tubos del ensayo por uno o más espacios.


Alternativamente, agregar sólo 25 µl del trazador a cada uno de los tubos T en el paso 6 y multiplicar las cuentas por minuto observadas en estos tubos por 4. Controles: Los controles o pools de sueros con al menos dos niveles de concentración de HCG (bajo y alto) deberán ensayarse rutinariamente como desconocidos y los resultados se deberán trazar de día en día como se describe en Westgard JO, et al. A multi-rule chart for quality control. Clin Chem 1981; 27:493-501. Las muestras de repetición son una valiosa herramienta adicional para el seguimiento de la precisión inter-ensayo. Parámetros de Control de Calidad: Recomendamos controlar estos parámetros de rendimiento: T = Cuentas totales (como cuentas por minuto)

%NSB = 100 × (Media cuentas NSB / cuentas totales)

%MB = 100 × (Cuentas netas / Cuentas totales)

Y los valores de Unión Porcentual (“%B/MB”) de todos menos los calibradores no cero mas altos, por ejemplo: %C/MB = 100 × (Cuentas netas del calibrador "C" / Cuentas netas MB)

Mantenimiento de Registros: Se considera buena práctica de laboratorio el registrar para cada ensayo los números de lote y las fechas de reconstitución de los componentes utilizados, así como los resultados de control y los parámetros de Control de Calidad. Lectura Adicional: Ver Dudley RA, et al. Guideline for immunoassay data reduction. Clin Chem 1985;31:1264-71. Ejemplo, Procedimiento Cuantitativo: Sólo como ilustración, no se puede utilizar para calcular resultados. (Ver la tabla "Example Run, Quantitative Procedure".)

Procedimiento Cualitativo Si el número de cuentas por minuto (promedio) de los tubos de la muestra del paciente es menor que el número de cuentas por minuto (promedio) del calibrador C, entonces la muestra contiene menos de 25 mIU/ml de HCG, dentro de la precisión del ensayo. Si el número de cuentas de la muestra del paciente es mayor que el del calibrador C,

entonces la muestra contiene más de 25 mIU/ml de HCG, dentro de la precisión del ensayo.

Relación con el embarazo: Las concentraciones superiores al límite de 25 mIU/ml puede considerarse positivas para el embarazo, siempre que se hayan descartado otras causas de los altos niveles de HCG, como por ejemplo, neoplasia trofoblástica y no-trofoblástica o aborto espontáneo, etc.4,9,10,16 Para las muestras de hombres sanos y mujeres no embarazadas se espera encontrar concentraciones inferiores al límite de 25 mIU/ml. (Ver más adelante la sección “Valores Esperados”). También son esperables concentraciones inferiores a 25 mIU/ml en las muestras de mujeres que están en una etapa temprana del embarazo, en la que la concentración de HCG aún no ha aumentado al nivel de decisión establecido para el procedimiento cualitativo El análisis de otra muestra recogida dos o más días después debería resolver la cuestión, ya que en las etapas tempranas del embarazo es de esperarse que el nivel de HCG se duplique en este tiempo aproximadamente.11 Control de Calidad Controlar que las cuentas por minuto de todas las muestras coincidan entre los pares de tubos. Los controles o los pools de sueros o plasma de los pacientes que tengan concentraciones superiores e inferiores al valor de referencia de 25 mIU/ml (calibrador C) deberán analizarse rutinariamente como desconocidos. Los otros calibradores que se suministran con el kit –específicamente, los calibradores de 5 y 50 mIU/ml (B, D)- pueden procesarse como controles adicionales. Recomendamos llevar un registro de las cuentas por minuto de la referencia (calibrador C) y los controles como un porcentaje de cuentas totales, por ejemplo: %C/CT = 100 × (Cuentas promedio del calibrador "C" / Cuentas totales promedio)

La determinación regular de las medias y los CV intraensayo en base a las cuentas, para varios duplicados de un control bajo, un control alto y el calibrador C, podría ser una ayuda adicional para monitorear diariamente la integridad del ensayo.


Ejemplo: Sólo como ilustración, no se puede utilizar para calcular resultados. (Ver la tabla "Example Run, Qualitative Procedure".)

Valores esperados Se analizaron muestras de suero de 47 hombres sanos y 38 mujeres no embarazadas mediante el procedimiento Coat-A-Count HCG IRMA, obteniéndose los siguientes resultados: El 95% de los valores masculinos fueron menores de 1,0 mIU/ml. El 90% de los valores femeninos fueron menores de 3 mIU/ml. El 100% de los valores (masculinos y femeninos) fue 5 mIU/ml o menor. Los resultados son coherentes con el límite superior del valor normal de aproximadamente 5 mIU/ml en ausencia de embarazo. Sin embargo, los laboratorios deberán considerar estos resultados sólo como una guía. En otro estudio, se analizaron 286 muestras de suero de mujeres de edad gestacional conocida mediante el procedimiento Coat-A-Count HCG IRMA. La edad gestacional se clasificó en semanas después del primer día del último periodo menstrual (LMP) Los resultados son los siguientes:

Mediana Rango absoluto Rango 95%

4 semanas después de LMP (n=5)

291 196 – 3 537


4 117 1 026 – 30 964


18 897 4 250 – 81 172

7 – 8 semanas después de LMP (n=40)

54 266 6 002 – 114 430

9 -10 semanas después de LMP (n=27)

48 841 18 344 – 98 807


50 841 21 874 – 120 766


16 418 4 106 – 57 393


11 872 2 468 – 36 142

Las muestras seriadas de mujeres en las primeras 2 a 5 semanas del embarazo mostraron tiempos de duplicación para las concentraciones de HCG de 1,5 a 3 días, con un tiempo de duplicación promedio de 2,2 días. Estos límites han de considerarse sólo como una guía. Cada laboratorio deberá establecer sus propios intervalos de referencia.

Características analíticas Las secciones siguientes contienen datos representativos del rendimiento del kit Coat-A-Count HCG IRMA, y los resultados de HCG se expresan como mili-Unidades Internacionales de HCG por mililitro (mIU/ml). Intervalo de calibración: Hasta 500 mIU/ml (3rd IS 75/537 y 2nd IS 61/6). Normalización: El ensayo tiene un rango de calibración de 5 a 500 mIU/ml en el procedimiento cuantitativo. El calibrador de 25 mIU/ml sirve como la referencia positiva en el procedimiento cualitativo. El ensayo está normalizado en términos del Tercer Estándar Internacional para HCG de la Organización Mundial de la Salud (3rd IS 75/537), y también en términos del Segundo Estándar Internacional para HCG (2nd IS 61/6). Sensibilidad analítica: 0,3 mIU/ml, Efecto de gancho a altas dosis: Ninguno hasta 1 000 000 mIU/ml. Precisión intraensayo (dentro de una tanda): Se calcularon las estadísticas para cada una de siete muestras de los resultados de 20 pares de tubos en un solo ensayo. (Ver la tabla "Intraassay Precision"). Precisión entre ensayos (de una tanda a otra): Se calcularon las estadísticas para cada una de siete muestras de los resultados de pares de tubos en 20 ensayos diferentes. (Ver la tabla "Interassay Precision"). Efecto deriva: Ninguno hasta aproximadamente 350 tubos. (Ver tabla "End-of-Run Effect"). Linealidad: Las muestras fueron analizadas con varias diluciones. (Véase la tabla "Linearity" para resultados representativos).


Recuperación: Se han analizado las muestras cargadas 1 a 19 con tres soluciones de HCG (200, 1 000, y 5 000 mIU/ml). (Ver la tabla "Recovery" para resultados representativos). Especificidad: El anticuerpo utilizado en el procedimiento Coat-A-Count HCG IRMA es altamente específico para la HCG intacta, con una reactividad cruzada baja para otras hormonas glicoproteicas presentes en las muestras de los pacientes. Se cargó una muestra de paciente que contenía 23,3 mIU/ml de HCG con distintas cantidades de FSH, LH y TSH. La muestra se analizó, cargada y no cargada, mediante el procedimiento Coat-A-Count HCG IRMA. (Ver la tabla “Specificity 1”). También se estudiaron las subunidades alfa y beta de la HCG. La subunidad β de HCG (WHO 75/551), se cargó en el calibrador cero del procedimiento Coat-A-Count HCG IRMA. (Ver la tabla “Specificity 2”).

La subunidad α de HCG (WHO 75/569), se cargó en el calibrador cero del procedimiento Coat-A-Count HCG IRMA. (Ver la tabla “Specificity 3”). Bilirrubina: La presencia de bilirrubina, en concentraciones de hasta 200 mg/l, no tiene ningún efecto sobre los resultados en términos de precisión. Hemólisis: La presencia de eritrocitos hasta concentraciones de 30 µl/ml no tiene efecto en los resultados, en lo concerniente a la precisión del ensayo. Tipo de Muestra Alternativa: para evaluar el efecto de los diferentes tipos de muestras alternativos, se recogió sangre de 20 voluntarios en tubos normales, tubos con Heparina, tubos con EDTA y tubos vacutainer SST® de Becton Dickinson. Todas las muestras fueron analizadas con el procedimiento Coat-A-Count HCG IRMA, con los siguientes resultados. (EDTA) = 1,00 (Suero) – 0,5 mIU/ml r = 0,996

(Heparina) = 1,04 (Suero) + 0,3 mIU/ml r = 0,994

(SST) = 0,98 (tubos simples) + 1,65 mIU/ml r = 0,993

Medias: 101 mIU/ml (Suero) 106 mIU/ml (Heparina)

101 mIU/ml (EDTA) 101 mIU/ml (SST)

Comparación de los métodos: Se comparó el procedimiento Coat-A-Count HCG IRMA con otro análisis radioinmunométrico para HCG (Kit A) y también con un radioinmunoanálisis para HCG (Kit B) en muestras de 48 pacientes. Las muestras tenían niveles de HCG de 5 a 500 mIU/ml. Un análisis de regresión lineal produjo los valores estadísticos siguientes. (CAC IRMA) = 1,19 (Kit A) + 0,9 mIU/ml r = 0,998

Medias: 217 mIU/ml (Coat-A-Count IRMA) 182 mIU/ml (Kit A)

(CAC IRMA) = 1,25 (Kit B) – 24,4 mIU/ml r = 0,983

Medias: 217 mIU/ml (Coat-A-Count IRMA) 193 mIU/ml (Kit B)

Asistencia técnica Póngase en contacto con el distribuidor nacional. www.siemens.com/diagnostics

El Sistema de Calidad de Siemens Healthcare Diagnostics Inc. está certificado por la ISO 13485:2003.

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Coat-A-Count hCG IRMA Domaine d'utilisation: Coat-A-Count hCG IRMA est un dosage radio-immunométrique conçu pour la mesure quantitative et qualitative de la gonadotrophine chorionique humaine (hCG) dans le sérum et le plasma. Il est conçu pour une utilisation strictement diagnostique in vitro en laboratoire par des professionnels comme une aide à la détection de la grossesse. Référence catalogue : IKCG1 (100 tubes)

Le coffret de 100 tubes contient moins de 20 microcuries (740 kilobecquerels) d'anticorps

polyclonal anti-hCG marqué à l'iode 125.


Introduction L'hormone chorio-gonadotrophique humaine (hCG) est une hormone glycoprotéique composée de deux sous-unités (poids moléculaire env. 37 000) retrouvée normalement uniquement pendant la grossesse dans le sang et les urines. Elle est sécrétée par les cellules trophoblastiques du tissu placentaire, pratiquement au début de la nidation, et permet le maintien du corps jaune durant les premières semaines de grossesse. L'hCG, ou une substance semblable à l'hCG, est également sécrétée par un grand nombre de néoplasies trophoblastiques et non trophoblastiques.4,9,10,16 Sa mesure par des systèmes de dosage suffisamment sensibles et spécifiques s'avère très utile pour la détection et la gestion de la grossesse. Selon les recherches actuelles, le taux d'hCG atteint normalement 2 000 mUI/ml environ un mois après la conception.2,3,10,11 Il atteint un maximum de 50 000 à 100 000 mUI/ml lors du troisième mois, puis diminue progressivement. Après l'accouchement, le taux d'hCG diminue rapidement, jusqu'à des concentrations observées chez des femmes non-enceintes (habituellement moins de 5 mUI/ml) en environ deux semaines.10 Dans le cas de grossesses ectopiques ou de grossesses amenant à un avortement spontané, les taux d'hCG circulante sont plus faibles que dans une grossesse normale, alors que des taux plus élevés sont observés dans le cas de grossesses multiples. La procédure qualitative est une simplification de la procédure quantitative : un seul point de référence est utilisé au lieu d'une courbe de calibration complète. Elle permet de déterminer si la concentration d'hCG contenue dans un échantillon de sérum est inférieure ou supérieure à 25 mUI/ml, dans les limites de précision du dosage. Une concentration supérieure à ce seuil peut être considérée comme un indicateur positif de grossesse à condition que d'autres facteurs pouvant causer des taux élevés d'hCG aient été exclus, à savoir la néoplasie trophoblastique et non trophoblastique.4,9,10,16 Une concentration inférieure à ce seuil est attendue dans des échantillons de femmes non enceintes ou

enceintes depuis si peu de temps que le taux d'hCG n'a pas encore atteint le niveau de décision établi pour cette procédure. Le dosage d'un autre échantillon recueilli au moins deux jours plus tard devrait régler la question car le taux d'hCG en début de grossesse peut doubler en 48 heures environ.11 Il peut également être intéressant de redoser le premier spécimen à l'aide de la procédure quantitative afin de mesurer plus précisément sa concentration en hCG.

Principe du test Coat-A-Count hCG IRMA est un dosage radio-immunométrique à phase solide. Ce dosage utilise un anticorps polyclonal anti-hCG marqué à l'iode 125 à phase liquide et un anticorps monoclonal anti-hCG immobilisé sur la paroi d'un tube en polystyrène.

Lors de la procédure : L'hCG est capturée entre le traceur polyclonal et les anticorps monoclonaux recouvrant le tube. Le traceur non lié est retiré par décantage et lavage du tube. Le tube est compté dans un compteur gamma pendant une minute. La concentration en hCG de l'échantillon de patient est proportionnelle au nombre de comptes par minute. La concentration en hCG est déterminée par comparaison du nombre de comptes et des comptes obtenus à l'aide des calibreurs fournis. Réactifs à distribuer: 2 Temps d'incubation totale : 1 heure (sur agitateur) Activité totale en début de marquage : environ 300 000 cpm

Précautions d'emploi Réservé à un usage diagnostique in vitro. Réactifs : Conserver à +2–8°C dans un réfrigérateur autorisé à recevoir du matériel radioactif. Éliminer les déchets conformément aux lois en vigueur. Ne pas utiliser les réactifs au delà de leur date d'expiration. Certains composants fournis avec ce coffret peuvent contenir des agents humains et/ou d'autres éléments


potentiellement infectieux qui nécessitent certaines précautions. Respecter les précautions d'emploi et manipuler tous les composants du coffret comme des produits potentiellement infectieux. Les réactifs dérivés de produits humains et utilisés dans ce coffret ont subi un test sérologique pour la Syphilis et des tests de dépistage pour les anticorps anti-VIH1 et 2, anti-HCV et pour l'antigène de surface de l'hépatite B, qui se sont tous avérés négatifs. De l'azide de sodium à des concentrations inférieures à 0,1 g/dl a été ajouté comme conservateur ; lors de l'élimination, l'évacuer avec de grandes quantités d'eau pour éviter une accumulation d'azides métalliques explosifs dans les canalisations. Eau : utiliser de l'eau distillée ou désionisée.

Radioactivité Ce coffret de réactif est reservé à l'usage in vitro (Autorisation DGSNR). Règles de base de protection contre les rayonnements ionisants et précautions d'emploi. Ce produit radioactif ne peut être reçu, acheté, détenu ou utilisé que par des personnes autorisées à cette fin et dans des laboratoires dotés de cette autorisation. Cette solution ne peut en aucun cas être administrée à l'homme ou aux animaux. Respecter impérativement les dates de péremption indiquées sur l'emballage extérieur et sur les étiquettes des différents réactifs du coffret. Tous les réactifs, dont les tubes revêtus d'anticorps, doivent être conservés à + 4/+ 8° C dans leur conditionnement d'origine avant d'être utilisés. L'achat, la possession, l'utilisation et l'échange de matières radioactives sont soumis aux réglementations en vigueur dans le pays de l'utilisateur. Les règles de base de protection contre les rayonnements ionisants doivent être respectées selon des procédures en vigueur. Ne pas pipeter des solutions radioactives avec la bouche. Eviter le contact direct avec la peau ou les muqueuses de tout produit radioactif en utilisant des blouses et gants de protection. Toute manipulation de matières radioactives se fera dans un local ad hoc éloigné de tout passage. Les

produits radioactifs seront stockés dans leur conditionnement d'origine dans un local approprié. Un cahier de réception et de stockage de produits radioactifs sera tenu à jour. Le matériel de laboratoire et la verrerie qui ont été contaminés doivent être éliminés au fur et à mesure afin d'éviter une contamination croisée de plusieurs isotopes. Chaque contamination ou perte de substance radioactive devra être réglée selon les procédures établies. Toute mise aux déchets de matière radioactive se fera en accord avec les réglementations en vigueur. Ne pas manger, ni boire, ni fumer, ni appliquer des cosmétiques dans les laboratoires où des produits radioactifs sont utilisés. Les réactifs radioactifs ne peuvent être vendus qu'à des personnes habilitées à manipuler des substances radioactives.

Matériel Fourni : Préparation Initiale

Tubes revêtus d'anticorps anti-hCG (ICG1) Tubes en polystyrène revêtus d'anticorps monoclonal murin anti-hCG, conditionnés dans des sachets hermétiques à glissière. Les conserver réfrigérés et protégés de l'humidité, bien refermer les sachets après utilisation. Stable à +2–8°C jusqu'à la date d'expiration notée sur le sachet. IKCG1: 100 tubes.

Anticorps anti hCG marqué à l'iode I125 (ICG2) Flacons de traceur constitué par un anticorps polyclonal de chèvre anti-hCG marqué à l'iode I125. Prêt à l'emploi, chaque flacon contient 5,5 ml. Stable au moins un mois à 2–8°C après ouverture ou jusqu'à la date inscrite sur le flacon. IKCG1: 2 flacons.

HCG Calibrators (CGI3–9) Sept flacons étiquetés de A à G de calibreurs de l'hCG dans une matrice de sérum humain ne contenant pas d'hCG, avec conservateur. Les calibreurs sont fournis sous forme lyophilisée. 30 minutes au minimum avant l'emploi : reconstituer le standard zéro (A) avec 10 ml d'eau distillée ou désionisée, le standard C avec 5 ml et chaque autre standard (B, D à G) avec 2 ml. (Voir le tableau ci-dessous.) Utiliser des pipettes volumétriques et mélanger doucement par rotations ou


retournement. Utiliser des pipettes volumétriques et mélanger par renversement ou par agitation délicate. Stable à +2/ +8 °C pendant 30 jours après reconstitution, ou 6 mois (aliquoté) à –20 °C. IKCG1: 1 jeu.

Flacon de calibreur Volume de

reconstitution

Calibreur A 10,0 ml

Calibreur B 2,0 ml

Calibreur C 5,0 ml

Calibreurs D – G 2,0 ml

Les calibreurs sont standardisés selon la Troisième Norme de l'Organisation Mondiale de la Santé pour dosages radio-immunométriques de l'hCG numéro 75/537, mais ne sont pas préparés à partir de cette norme. Selon cette norme, les calibreurs représentent 0, 5, 25, 50, 100, 250 et 500 milli-unités internationales d'hCG par millilitre (mUI/ml, 3ème NI 75/537). Les valeurs des calibreurs selon la Deuxième Norme de l'Organisation Mondiale de la Santé pour l'hCG numéro 61/6 sont identiques. Des points de calibration intermédiaires peuvent être obtenus en mélangeant des proportions appropriées de calibreurs. Veuillez noter que les calibreurs du Coat-A-Count hCG IRMA et ceux fournis dans le coffret hCG à double anticorps ne sont pas interchangeables. Le calibreur à 25 mUI/ml (Calibreur C) sert de référence positive lors de la procédure qualitative. Les autres calibreurs fournis dans ce coffret peuvent être utilisés comme contrôles dans ce contexte.

Tampon de dosage de l'hCG (CGAB) 11 ml de diluant avec tampon. Stable au moins un mois à 2–8°C après ouverture ou jusqu'à la date inscrite sur le flacon. IKCG1: 1 flacon.

Solution Concentrée pour tampon de lavage (2TSBW) D'une solution tampon saline concentrée, avec des surfactants et de l'azide de sodium comme conservateur. Transférer dans un autre récipient avec 600 ml d'eau pour un volume total de 660 ml de tampon de lavage. Stable à + 2/+8°C au moins 6

mois après préparation. IKCG1: 1 flacon × 60 ml.

Matériel requis mais non fourni Compteur Gamma – permettant l'utilisation de tubes standard 12x75 mm Un agitateur portoir réglé à environ 200 rotations par minute.

Pour la préparation des réactifs : Pipettes de 2 ml, 5 ml et 10 ml Eau distillée ou désionisée Éprouvette graduée de 600 ml Flacon de conservation en plastique avec couvercle – pour la préparation et le stockage de la solution de tampon de lavage.

Pour le dosage radioimmunologique : Micropipette de 100 µl Distributeur — pour distribuer 2,0 ml de solution de tampon de lavage. Un portoir de décantation – disponible chez Siemens Healthcare Diagnostics (Référence catalogue : FDR). Papier graphe Log-log 3-cycles Un contrôle immunodosage, à base de sérum humain, à trois niveaux de concentration, contenant de la hCG (parmi plus de 25 constituants dosables), est disponible chez Siemens Healthcare Diagnostics (Référence catalogue : CON6).

Recueil des échantillons Le patient n'a pas besoin d'être à jeun et aucune préparation spéciale n'est requise. Effectuer une prise de sang par ponction veineuse19 dans des tubes sous vide secs, héparinés ou EDTA et prendre note de l'heure. Il est recommandé de clarifier les échantillons hyperlipémiques par ultracentrifugation. Des échantillons hémolysés peuvent être révélateurs d'une préparation inadéquate du prélèvement avant son envoi au laboratoire ; il faudra donc interpréter les résultats avec prudence. Des tubes pour prélèvements sanguins provenant de fabricants différents peuvent donner des résultats différents, selon les matériaux et additifs utilisés, y compris


gels ou barrières physiques, activateurs de la coagulation et/ou anticoagulants. Le coffret HCG Coat-A-Count IRMA n'a pas été testé sur tous les types de tubes possibles. Veuillez consulter le chapitre intitulé Autres Types d'Échantillons pour plus de renseignements sur les tubes qui ont été évalués. Volume nécessaire : 100 µl de sérum ou plasma par tube. Conservation: 7 jours à 2–8°C ou 2 mois à –20°C.

Avant le dosage, laisser les échantillons revenir à température ambiante (15–28°C), mélanger doucement par rotations ou retournement. Aliquoter, si nécessaire, afin d'éviter de répéter les cycles congélation / décongélation. Ne pas tenter de décongeler les spécimens congelés à l'aide d'un bain marie.

Dilutions : la procédure quantitative peut déterminer des concentrations jusqu'à 500 mUI/ml, mais les concentrations des échantillons de patient peuvent atteindre 100 000 mUI/ml ou plus au cours d'une grossesse normale. Les comptes par minute d'échantillons de grossesse normale, même ceux dont la concentration atteint le maximum pour le premier trimestre, sont supérieurs à ceux du calibreur le plus élevé si les échantillons sont dosés sans être dilués. Les échantillons à concentration attendue élevée, notamment en cas de grossesse môlaire,4,9,10,16 doivent être suffisamment dilués à l'aide du calibreur zéro avant le dosage. Afin d'éviter les contretemps dus au redosage d'échantillons en dehors de la courbe de calibration, certains laboratoires peuvent établir une série de dilutions 1-pour-10 de chaque échantillon. Dans la plupart des cas, le dosage d'échantillons non dilués, dilués 1-pour-10 et dilués 1-pour-100 ramène les concentrations des échantillons dans les limites du dosage. Une dilution supplémentaire 1-pour-1 000 peut être préparée pour des échantillons dont la concentration attendue dépasse 100 000 mUI/ml.

Pipetage : il est important de préparer les dilutions et de pipeter les échantillons avec soin afin d'éviter les erreurs de contamination. Il est important d'employer

une micropipette à embout jetable et de changer l'embout d'un échantillon à un autre afin d'éviter la contamination croisée. Des pipettes à déplacement positif et des dilueurs-pipeteurs automatiques ne doivent être utilisés que s'il a été prouvé que le risque de contamination croisée est négligeable. Pipeter tous les échantillons et les réactifs directement au fond du tube. Tous les échantillons, y compris les calibreurs et les contrôles, doivent être dosés en double. Vérifier que les tubes de chaque paire donnent des résultats identiques. Des paires de tubes de contrôle peuvent être mesurées entre dosages pendant toute la procédure afin d'assurer l'absence de dérive notable.

Procédure quantitative Tous les composants doivent être à température ambiante avant leur utilisation (15–28°C). 1 Etiqueter 14 tubes coatés d'anticorps

anti-TSH en double, A (liaison non spécifique) et de B à G (liaison maximale LM). Etiqueter les tubes coatés d'anticorps supplémentaires, également en double, pour les échantillons de patients et les contrôles. Facultativement, étiqueter 2 tubes (non coatés) 12 x 75 mm en polypropylène pour l'activité totale, et les mettre de côté jusqu'à l'étape 6.

Calibreur HCG mUI/ml 3rd IS 75/537

HCG mUI/ml 2nd IS 61/6

T* — —

A (NSB) 0 0

B 5 5

C 25 25

D 50 50

E 100 100

F 250 250

G ("MB") 500 500

* Facultatif

2 Pipeter 100 µl de chaque standard, contrôle et échantillon sérique de patient dans les tubes préparés. Pipeter directement au fond du tube. Les échantillons de patient dont la concentration attendue en hCG


dépasse 500 mUI/ml doivent être suffisamment dilués avec le calibreur zéro avant le dosage. Il est bon d'utiliser des embouts de micropipettes jetables, de changer d'embout entre les échantillons de manière à éviter toute contamination. Les pipettes à « capillaire » et les pipeteurs-dilueurs automatiques ne doivent être utilisés que si le risque de contamination a été évalué et jugé insignifiant.

3 Ajouter 100 µL de tampon à dosage HCG à chaque tube. Pipeter directement au fond du tube. Une multipipette est recommandée. Les tubes T peuvent être mis de côté jusqu'au comptage (étape 6); ils n'ont besoin d'aucun autre traitement.

4 Agiter pendant 30 minutes sur agitateur. 15 minutes suffisent pour la procédure qualitative.

5 Décanter et vider complètement. Ajouter 2,0 ml du tampon de lavage. Attendre 1 à 2 minutes, puis décanter minutieusement. Eliminer toute trace d'humidité pour améliorer la précision du dosage. Après le lavage, décanter le contenu de chaque tube à l'aide d'un râtelier de décantation en mousse. Puis appliquer les fortement sur du papier absorbant afin d'éliminer les gouttelettes résiduelles.

6 Ajouter 100 µl d'anticorps anti-hCG marqué à l'iode 125 dans chaque tube. Le temps d'addition du traceur ne doit pas dépasser 10 minutes. Les tubes T peuvent être mis de côté jusqu'au comptage (étape 9); ils n'ont pas d'autre traitement.

7 Agiter pendant 30 minutes sur agitateur. 15 minutes suffisent pour la procédure qualitative.

8 Décanter complètement. Ajouter 2,0 ml du tampon de lavage. Attendre 1 à 2 minutes, puis décanter minutieusement. De nouveau ajouter 2,0 ml du tampon de lavage. Attendre

1 à 2 minutes, et Décanter complétement. Eliminer toute trace d'humidité pour améliorer la précision du dosage. Après le second lavage, décanter le contenu de chaque tube (sauf les tubes T) à l'aide d'un râtelier de décantation en mousse et laisser les tubes se vider pendant 2 à 3 minutes. Puis appliquer les fortement sur du papier absorbant afin d'éliminer les gouttelettes résiduelles.

9 Compter 1 minute dans un compteur gamma. Dans un compteur multipuits, éloigner les tubes T d'au moins un espace pour prévenir tout risque de contamination.

Procédure qualitative La procédure qualitative est une simplification de la procédure quantitative : un seul point de référence est utilisé au lieu d'une courbe de calibration complète. Elle permet de déterminer si la concentration d'hCG contenue dans un échantillon de sérum ou de plasma est inférieure ou supérieure à 25 mUI/ml, dans les limites de précision du dosage. Des échantillons dont la concentration attendue en hCG est élevée doivent être dosés après dilution suffisante à l'aide de la procédure quantitative décrite ci-dessus. 1 Étiqueter deux tubes à anticorps anti

hCG « C », pour la référence positive à 25 mUI/ml. Étiqueter d'autres tubes à anticorps anti-hCG en double également pour les contrôles et les échantillons de patient. Facultativement, étiqueter deux tubes T secs (sans anticorps) en polystyrène de 12x75 mm (comptes totaux).

Calibreur HCG mUI/ml 3rd IS 75/537

HCG mUI/ml 2nd IS 61/6

T* — —

C (Référence) 25 25

* Facultatif

Continuer comme indiqué pour la procédure quantitative décrite ci-dessus (étapes 2 à 9). La durée d'incubation aux


étapes 4 et 7 peut être réduite jusqu'à 15 minutes.

Calculs des résultats et Contrôle de Qualité

Procédure quantitative Pour calculer les concentrations de HCG à partir d'une courbe standard représentée en log-log, il faut, dans un premier temps, corriger les coups par minute (cpm) de chaque paire de tubes en soustrayant la moyenne des cpm des tubes à liaison non spécifique (standard A): CPM corrigés = (Moyenne cpm) moins (Moyenne cpm LNS)

Puis déterminer pour chaque doublet la capacité de liaison en pourcentage (%B/B3000, ici nommée "%B/LM") de liaison maximale (LM), corrigée des cpm dus au LNS des tubes H tubes considérés à 100%: % liaison = (cpm corrigés / cpm corrigés LM) × 100

Utiliser le papier log-log 3 cycles pour la construction de la courbe, en portant sur l'axe des ordonnées les pourcentages de liaison, et sur l'axe des abscisses les valeurs des standards différents de zéro. Tracer la courbe qui passe approximativement par ces points. Relier les points par des arcs ou des segments de droite. Ne pas chercher à réaliser une seule droite à partir des résultats. Les concentrations des contrôles et des inconnus dans le domaine de mesure du standard zéro peuvent être lues à partir de la droite par interpolation. Il est possible de tracer un autre graphe à partir des 3 premiers standards pour apprécier les valeurs proches de zéro. Commentaires: Bien que d'autres approches de calcul soit aussi acceptables, la réduction des données avec la méthode indiquée ci-dessus a certains avantages du point de vue du contrôle de qualité. En particulier, elle donne une courbe d'étalonnage qui est relativement linéaire avec les représentations log-log et linéaire-linéaire, et est relativement stable d'un dosage à l'autre. Elle donne également des paramètres déterminants pour le contrôle de qualité, plus précisément, les valeurs de % de liaison (%B/B3000 ou "%B/LM)

pour les standards différents de zéro. Un graphique encore plus utile, donnant une idée de la reproductibilité intra-essai, peut être obtenu en représentant directement le pourcentage de liaison de chaque standard, par exemple sans faire un calcul de valeur moyenne à partir des cpm des doublets. Alternatives: Le pourcentage de liaison peut être aussi calculé directement à partir de la moyenne des cpm, la correction par la liaison non spécifique produit habituellement une courbe de calibration qui est pratiquement linéaire sur tout le domaine. Une courbe de calibration peut être aussi créée en portant directement sur l'ordonnée les cpm ou la moyenne des cpm et en abscisse la concentration sur du papier log-log ou linéaire-linéaire (le papier semi-log ne doit pas être utilisé). Cette méthode à l'avantage de sa simplicité mais elle est moins recommandée pour ce qui concerne le Contrôle de Qualité. Traitement informatique des données: Les méthodes "Point-par-point", incluant les fonctions de lissage linéaire, peuvent être utilisées ; bien qu'elles ne permettent qu'une faible assistance pour le suivi de la qualité des tests, il est important de tracer en log-log, selon les recommandations, la courbe d'étalonnage, soit manuellement soit informatiquement, en considérant que c'est une étape du Contrôle de Qualité. Le traitement des données utilisant des fonctions polynomiales de 4ème ou 5ème degré est aussi possible et est adapté. Garder à l'esprit, cependant, que certains algorithmes actuellement utilisés peuvent ne pas être adaptés. Si une de ces méthodes semble adaptée, il est essentiel de vérifier qu'elle reste appropriée dans le temps, par recalcul des concentration de standards et d'autres paramètres. De plus, un tracé log-log de la courbe de calibration est fortement recommandé car il est plus informatif que le tracé habituel en semi-log. Traitement des échantillons: Les recommandations données concernant l'utilisation et la conservation des sérums doivent être respectées. Diluer les échantillons de patient dont la concentration attendue en hCG est supérieure au calibreur le plus élevé (500 mUI/ml) à l'aide du calibreur zéro avant le dosage. Tous les échantillons,


standards et contrôles inclus, doivent être dosés en double. Il est important d'utiliser des micropipettes à embouts jetables, de changer d'embout entre les échantillons de manière à éviter toute contamination. Les pipettes de transfert et les pipeteurs diluteurs automatiques ne doivent être utilisés que si le risque de transmission de contamination a été évalué et considéré comme insignifiante. Les doublets de tubes de contrôles doivent être espacés au long de la série de dosage afin de vérifier l'absence de dérive significative. Vérifier la concordance des résultats entre les doublets de tubes. Compteur Gamma : Pour minimiser l'éventualité d'une contamination dans le compteur gamma multipuits, il convient de séparer les tubes d'activité totale T des autres tubes par au moins un espace. En alternative, il est possible d'ajouter uniquement 25 µl (au lieu de 100 µl) et de multiplier par 4 le nombre de cpm obtenus comme activité totale. Contrôles: Les contrôles ou des pools de sérum avec au moins deux niveaux de concentration de hCG (bas et élevé) doivent être dosés en routine comme inconnus, et les résultats notés jour après jour comme décrit par exemple dans Westgard JO, et al. A multi-rule chart for quality control. Clin Chem 1981;27:493-501. Un redosage d'échantillon peut être précieux pour suivre la précision inter essai. Paramètres du Contrôle de Qualité: Nous recommandons de garder une trace de ces résultats de performances: T = Activité totale (cpm)

%LNS = 100 × (Moyenne des cpm du LNS / cpm Totaux)

%LM = 100 × (cpm corrigés LM / cpm totaux)

Et toutes les valeurs de pourcentage de liaison (%B/B3000 ou "%B/LM") sauf la plus élevée des standards différents de zéro, par exemple: %C/LM = 100 × (cpm standard C corrigé / cpm LM corrigé)

Conservation des données: Il est bon d'enregistrer pour chaque dosage les numéros de lots et la date de reconstitution et/ou ouverture des composants utilisés.

Autre référence: Se rapporter à Dudley RA, et al. Guidelines for immunoassay data reduction. Clin Chem 1985;31:1264-71. Exemple de série, Procédure quantitative : A titre d'exemple uniquement, et non pour calculer des résultats provenant d'une autre série. (Voir le tableau « Example Run ».)

Procédure qualitative Si les comptes par minute moyens des tubes d'échantillons de patient sont inférieurs aux comptes par minute moyens du calibreur C, l'échantillon contient moins de 25 mUI/ml d'hCG, dans les limites de précision du dosage. Si les comptes de l'échantillon de patient sont supérieurs à ceux du calibreur C, l'échantillon contient plus de 25 mUI/ml d'hCG, dans les limites de précision du dosage. Rapport à la grossesse : une concentration supérieure au seuil de 25 mUI/ml peut être considérée comme un indicateur positif de grossesse à condition que d'autres facteurs pouvant causer des taux élevés d'hCG aient été exclus, comme par exemple la néoplasie trophoblastique ou non trophoblastique, une grossesse récente ou un avortement spontané, etc.4,9,10,16 Une concentration inférieure au seuil de 25 mUI/ml est attendue pour les hommes en bonne santé et les femmes non enceintes. (Voir Valeurs Attendues ci-dessous.) Une concentration inférieure à 25 mUI/ml est attendue dans des échantillons de femmes enceintes depuis si peu de temps que le taux d'hCG n'a pas encore atteint de niveau de décision établi pour la procédure qualitative. Le dosage d'un autre échantillon recueilli au moins deux jours plus tard devrait régler la question car le taux d'hCG en début de grossesse peut doubler en 48 heures environ.11 Contrôle de qualité : vérifier que les tubes d'échantillon de chaque paire ont des comptes par minute identiques. Les groupes de contrôle ou de patient (sérum ou plasma) à concentration en hCG inférieure ou supérieure à celle de la référence à 25 mUI/ml (calibreur C) doivent être dosés régulièrement comme inconnus. D'autres calibreurs fournis dans le coffret (les calibreurs B et D à 5 et


50 mUI/ml) peuvent être traités comme contrôles supplémentaires. Il est bon de suivre les comptes par minute de la référence (calibreur C) et des contrôles sous forme de pourcentage des comptes totaux, c'est-à-dire %C/T = 100 × (Comptes moyens du calibreur C / Comptes totaux moyens)

Il est utile de déterminer les moyennes et CV entre dosages basés sur les comptes pour plusieurs réplications d'un contrôle bas, d'un contrôle haut et du calibreur C afin de suivre l'intégrité du dosage d'un jour à l'autre. Exemple de série : A titre d'exemple uniquement, et non pour calculer des résultats provenant d'une autre série. (Voir le tableau « Example Run, Qualitative Procedure ».)

Valeurs de référence Des échantillons de sérum de 47 hommes en bonne santé et de 38 femmes non enceintes ont été analysés à l'aide de la procédure Coat-A-Count hCG IRMA et ont donné les résultats suivants : 95% des valeurs pour les hommes étaient inférieures à 1,0 mUI/ml 90% des valeurs pour les femmes étaient inférieures à 3 mUI/ml 100% de toutes les valeurs (hommes et femmes) étaient inférieures ou égales à 5 mUI/ml Ces résultats sont en accord avec une limite supérieure normale d'environ 5 mUI/ml en l'absence de grossesse. Cependant, les laboratoires ne doivent se servir de ces résultats qu'à titre indicatif. Lors d'une autre étude, 286 échantillons de sérum de femmes à un stade de grossesse connu ont été dosés à l'aide de la procédure Coat-A-Count hCG IRMA. Le stade de la grossesse était classé selon le nombre de semaines après le premier jour de la dernière menstruation (LMP). Les résultats sont les suivants :

Moyenne Intervalle absolu Intervalle de 95%

4 semaines après LMP (n=5)

291 196 – 3 537


4 117 1 026 – 30 964


Moyenne Intervalle absolu Intervalle de 95%

18 897 4 250 – 81 172

7 – 8 semaines après LMP (n=40)

54 266 6 002 – 114 430


48 841 18 344 – 98 807


50 841 21 874 – 120 766


16 418 4 106 – 57 393


11 872 2 468 – 36 142

Des échantillons en série de femmes enceintes depuis 2 à 5 semaines indiquent que la concentration en hCG double sous 1,5 à 3 jours (2,2 jours en moyenne). Utiliser ces valeurs à titre indicatif uniquement. Chaque laboratoire devra établir ses propres valeurs de référence.

Performances du test Consulter les tableaux et graphiques pour obtenir les données représentatives des performances de ce test. Les résultats de la hCG sont exprimés en mUI/ml. Intervalle de linéarité : jusqu'à 500 mUI/ml (3rd IS 75/537 et 2nd IS 61/6). Standardisation : ce dosage a un intervalle de calibration de 5 à 500 mUI/ml pour la procédure quantitative. Le calibreur à 25 mUI/ml sert de référence positive pour la procédure qualitative. Le dosage est standardisé selon la Troisième Norme Internationale de l'Organisation Mondiale de la Santé (3rd IS 75/357) ainsi que selon la Deuxième Norme de l'Organisation Mondiale de la Santé pour l'hCG (2nd IS 61/6). Sensibilité analytique : 0,3 mUI/ml, Accoutumance aux doses élevées : aucune jusqu'à 1 000 000 mUI/ml. Précision intra-dosage (au sein d'une même série) : Les résultats ont été calculés pour chacun échantillons à partir des résultats de 20 tubes en double dans une même série. (Voir le tableau “Intraassay Precision”)


Précision inter-dosage (entre plusieurs séries) : Les résultats ont été calculés pour chacun échantillons à partir des résultats de 20 tubes en double. (Voir le tableau “Interassay Precision”.) Effet de la position des tubes : Aucun jusqu'à 350 tubes. (Voir le tableau « End-of-Run Effect ».) Test de dilution : Des échantillons ont été dosés à différentes concentrations. (Voir le tableau « Linearity » pour des données représentatives.) Test de récupération : Des échantillons dosés ont été chargés dans une proportion de 1 à 19 avec trois solutions hCG (200, 1 000, et 5 000 mUI/ml). (Voir le tableau « Recovery » pour des données représentatives.) Spécificité : l'anticorps utilisé pour la procédure Coat-A-Count hCG IRMA est hautement spécifique pour l'hCG intacte, et a une réactivité croisée très faible avec les autres hormones glycoprotéines présentes dans les échantillons de patient. Un spécimen de patient contenant 23,3 mUI/ml d'hCG a été chargé avec différentes quantités de FSH, de LH et de TSH. L'échantillon chargé et non chargé a été dosé à l'aide de la procédure Coat-A-Count hCG IRMA. (Voir le tableau « Specificity 1 ».) Les sous-unités alpha et bêta de l'hCG ont également été étudiées. La sous-unité hCG β (OMS 75/551) a été chargée dans le calibreur zéro de la procédure Coat-A-Count hCG IRMA. (Voir le tableau « Specificity 2 ».)

La sous-unité hCG α (OMS 75/569) a été chargée dans le calibreur zéro de la procédure Coat-A-Count hCG IRMA. (Voir le tableau « Specificity 3 ».) Bilirubine : La présence de bilirubine ne présente aucun effet sur les résultats ni sur la précision du dosage si la concentration ne dépasse pas 200 mg/l. Hémolyse : La présence d'agrégat d'hématies jusqu'à une concentration de 30 µl/ml, n'a aucun effet sur les résultats quant à la précision du dosage. Autres types d'échantillons: pour estimer l'effet de l'utilisation de différents type d'échantillons, 20 volontaires ont été prélevés sur tubes secs, héparinés, EDTA et sur tubes vacutainer SST® Becton

Dickinson. Tous les échantillons ont été dosés avec le protocole Coat-A-Count hCG IRMA et ont donné les résultats suivants. (EDTA) = 1,00 (Sérum) – 0,5 mUI/ml r = 0,996

(Hépariné) = 1,04 (Sérum) + 0,3 mUI/ml r = 0,994

(SST) = 0,98 (tubes ordinaires) + 1,65 mUI/ml r = 0,993

Moyennes : 101 mUI/ml (Sérum) 106 mUI/ml (Hépariné) 101 mUI/ml (EDTA) 101 mUI/ml (SST)

Comparaison de méthodes: la procédure Coat-A-Count hCG IRMA a été comparée à un autre dosage radio-immunométrique de l'hCG (coffret A) ainsi qu'à un dosage radio-immunométrique de l'hCG (coffret B) sur 48 échantillons de patient dont la concentration en hCG allait de 5 à 500 mUI/ml. Une régression linéraire a donné les statistiques suivantes : (CAC IRMA) = 1,19 (Kit A) + 0,9 mUI/ml r = 0,998

Moyennes : 217 mUI/ml (Coat-A-Count IRMA) 182 mUI/ml (Kit A)

(CAC IRMA) = 1,25 (Kit B) – 24,4 mUI/ml r = 0,983

Moyennes : 217 mUI/ml (Coat-A-Count IRMA) 193 mUI/ml (Kit B)

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Le Système Qualité de Siemens Healthcare Diagnostics Inc. est certifié ISO 13485:2003.

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Coat-A-Count HCG IRMA Uso: Il Dosaggio Coat-A-Count HCG IRMA è un dosaggio immunoradiometrico per la determinazione quantitativa e qualitativa della gonadotropina corionica umana (HCG) nel siero e nel plasma. A solo uso diagnostico in vitro da parte di


personale di laboratorio quale ausilio nella determinazione della gravidanza. Codice: IKCG1 (100 provette)

Il kit da 100 determinazioni contiene meno di 20 microcurie (740 kilobecquerel) di un

anticorpo policlonale anti-HCG marcato con I125.

Riassunto e Spiegazione del Test La gonadotropina corionica umana (HCG) è un ormone glicoproteico a catena doppia (Peso molecolare ≈ 37 000) che si riscontra normalmente nel sangue e nell'urina solo durante la gravidanza. Viene secreta dal tessuto placentare, ad iniziare dal trofoblasto primitivo, al momento dell'impianto e serve da supporto al corpo luteo durante le prime settimane di gravidanza. L'HCG o il materiale HCG-simile viene anche prodotto da una serie di neoplasie trofoblastiche e non trofoblastiche.4,9,10,16 La sua determinazione, attraverso dosaggi di sensibilità e specificità adeguate, si è rivelata di grande aiuto nella rilevazione e gestione della gravidanza. Secondo I dati presenti in letteratura, l'HCG normalmente raggiunge livelli di circa 2 000 mIU/mL un mese dopo il concepimento. 2,3,10,11 Un picco di 50 000 o anche 100 000 mIU/mL viene raggiunto nel terzo mese di gravidanza, dopo di che declina gradualmente. A seguito del parto, il livello di HCG subisce normalmente una rapida discesa, raggiungendo concentrazioni pre gravidanza (normalmente meno di 5 mIU/mL) circa due settimane dopo.10 Gravidanze ectopiche e che terminano in aborto spontaneo tendono ad avere livelli di HCG più bassi del normale, mentre valori più elevati sono spesso sinonimo di gravidanze multiple. La procedura qualitativa rappresenta una semplificazione della procedura quantitativa, poiché viene utilizzato un unico punto di riferimento invece che una curva di calibrazione completa. Consente di determinare se un campione di siero abbia una concentrazione di HCG superiore o inferiore a 25 mIU/mL entro il range di precisione del dosaggio. Concentrazioni superiori a questo cutoff

possono essere considerate positive per la gravidanza se sono state escluse altre cause che possano provocare livelli elevati di HCG, i.e. neoplasia trofoblastica e non trofoblastica.4,9,10,16 Concentrazioni al di sotto di questo cutoff sono attese per campioni provenienti da donne non in gravidanza o nei primi stadi della gravidanza quando l'HCG non ha ancora raggiunto la concentrazione necessaria per l'effettuazione del dosaggio. Il dosaggio di un altro campione prelevato due o più giorni dopo dovrebbe rivelarsi decisivo, poiché nei primi stadi della gravidanza i valori di HCG raddoppiano in questo lasso di tempo11 Potrebbe essere interessante anche ridosare il campione originario con la procedura quantitativa per puntualizzare in maniera più esatta la concentrazione di HCG.

Principio del Dosaggio Il Dosaggio Coat-A-Count HCG IRMA è un dosaggio immunoradiometrico in fase solida. Il dosaggio utilizza un anticorpo policlonale anti-HCG in fase liquida, ed un anticorpo monoclonale anti-HCG adeso alle pareti di una provetta di polistirene.

Nel dosaggio: L'HCG viene catturato tra il tracciante policlonale e gli anticorpi monoclonali coattati alla provetta. Il tracciante policlonale non legato viene rimosso decantando e lavando la provetta. La provetta viene contata in un gamma counter per un minuto. La concentrazione di HCG nel campione del paziente è direttamente proporzionale al numero di conte al minuto. La concentrazione di HCG è determinata comparando il numero di conte con quelle ottenute dal set di calibratori forniti. Reagenti da Dispensare: 2 Tempo Totale di Incubazione: 1 ora (su shaker) Conte Totali alla iodinazione: circa 300 000 cpm.

Avvertenze e Precauzioni Ad uso diagnostico in vitro. Reagenti: Conservare a 2–8°C in un frigorifero appositamente destinato al


materiale radioattivo. Eliminare secondo le normative di legge vigenti. Non utilizzare reagenti oltre la data di scadenza. Alcuni componenti forniti in questo kit possono contenere materiale di origine umana e/o altri ingredienti potenzialmente pericolosi che necessitano di precauzioni di utilizzo. Seguire le precauzioni universali, e manipolare tutti i componenti come se potessero trasmettere agenti infettivi. Sono stati dosati i materiali di origine umana e sono stati trovati non reattivi per la Sifilide; per gli Anticorpi Anti-HIV 1 e 2; per l'Antigene di Superficie dell'Epatite B; e per gli Anticorpi Anti-Epatite C. E' stata aggiunta Sodio Azide a concentrazioni inferiori a 0,1 g/dL come conservante. Al momento dell'eliminazione, irrorare con molta acqua per evitare la formazione di azidi metalliche potenzialmente esplosive nelle tubature di piombo e di rame. Acqua: Utilizzare solo acqua distillata o deionizzata.

Radioattività Una copia di tutti i certificati di Autorizzazione per radioisotopi (Specifica o Generica) rilasciata ad un cliente americano deve essere conservata in file presso la Siemens Healthcare Diagnostics prima che i kit o i componenti contenenti materiale radioattivo possano essere spediti. Questi materiali radioattivi possono essere acquisiti da qualsivoglia cliente in possesso dell'Autorizzazione Specifica. Con l'Autorizzazione Generica questi materiali radioattivi possono essere acquistati solo da medici, veterinari che esercitino la professione, laboratori clinici ed ospedalieri – e solo per l'esecuzione di test clinici o di laboratorio in vitro che non implichino somministrazione interna o esterna del materiale radioattivo o delle sue radiazioni alle persone o animali. La sua acquisizione, ricevimento, conservazione, utilizzo, trasferimento ed eliminazione sono soggette a regolamentazioni e ad Autorizzazione (Generica o Specifica) della Commissione Statunitense per il Nucleare o dello Stato con il quale l'NRC abbia stipulato un accordo per l'esercizio del controllo regolatorio.

Manipolare i materiali radioattivi secondo quanto previsto dall'Autorizzazione Generica o Specifica. Per minimizzare l'esposizione alle radiazioni, l'utilizzatore deve attenersi alle linee guida stabilite dal National Bureau of Standards publication su “Safe Handling of Radioactive Materials” “Norme per una corretta manipolazione dei Materiali Radioattivi”.(Guida N° 92, pubblicata il 9 Marzo 1964) e successive edizioni pubblicate dallo Stato e dalle Autorità Federali. Assorbire immediatamente le fuoriuscite e decontaminare le superfici contaminate. Evitare la formazione di aerosol. Eliminare i rifiuti solidi radioattivi secondo quanto previsto dall'Autorizzazione. Le licenze generiche (possessori di NRC Form 483) possono eliminare i rifiuti radioattivi solidi come non radioattivi, dopo aver rimosso l'etichetta. I detentori di autorizzazioni specifiche (NRC Form 313) devono fare riferimento al Titolo 10, Codice delle Regolamentazioni Federali Parte 20. I detentori di Autorizzazioni negli Stati che hanno stipulato un accordo con l'NRC dovrebbero far riferimento alle regolamentazioni idonee dei loro stati. I detentori di Autorizzazioni Generali possono eliminare i rifiuti radioattivi liquidi del tipo contenuto in questo prodotto attraverso il lavello del laboratorio. I detentori di autorizzazione devono eliminare o rendere illeggibili le etichette dei contenitori vuoti di materiali radioattivi prima di eliminare i rifiuti solidi. I detentori di autorizzazioni specifiche possono eliminare piccoli quantitativi di rifiuti radioattivi liquidi del tipo utilizzato in questo prodotto attraverso il lavello del laboratorio. Fare riferimento alle regolamentazioni appropriate applicabili al Vostro laboratorio.

Materiali Forniti – Preparazione Iniziale

Provette HCG Coattate con Anticorpo (ICG1) Provette di polistirene coattate con anticorpi monoclonali murini anti-HCG e confezionate in buste a cerniera. Conservare refrigerate al riparo dall'umidità, richiudendole dopo l'utilizzo. Stabili a 2–8°C fino alla data di scadenza


indicata sulla confezione. IKCG1: 100 provette.

Anticorpi anti-HCG marcati con I125 (ICG2) Un anticorpo policlonale iodinato anti-HCG in forma liquida, pronto all'uso. Ciascun flacone contiene 5,5 mL. Stabile a 2–8°C per 30 giorni dopo l'apertura, o fino alla data di scadenza indicata sull'etichetta. IKCG1: 2 flaconi.

Calibratori HCG (CGI3–9) Sette flaconi, etichettati dalla A alla G, di Calibratori HCG in una matrice di siero umano priva di HCG, con conservanti. I calibratori sono forniti liofili. Almeno 30 minuti prima dell'uso, ricostituire il calibratore zero A con 10 mL di acqua distillata o deionizzata, il calibratore C con 5 mL, ed i rimanenti calibratori B e D fino alla G con 2 mL ciascuno. (Vedi tabella di seguito fornita). Utilizzare pipette volumetriche e mescolare scuotendo o capovolgendo dolcemente. Stabile a 2–8°C per 30 giorni dopo la ricostituzione o a –20°C per 6 mesi (aliquotato). IKCG1: 1 set.

Flaconi dei Calibratori Volume di

Ricostituzione

Calibratore A 10,0 mL

Calibratore B 2,0 mL

Calibratore C 5,0 mL

Calibratori D – G 2,0 mL

I calibratori sono standardizzati vs. (ma non preparati da) 3°Standard Internazionale del WHO per Immunodosaggi HCG, numero 75/537. Nei termini di questo standard, i calibratori rappresentano 0, 5, 25, 50, 100, 250 e 500 milliunità internazionali di HCG per millilitro (mIU/mL, 3rd IS 75/537). I valori dei calibratori in termini di WHO 2° Standard Internazionale per l'HCG, numero 61/6 sono identici. I punti intermedi della calibrazione possono essere ottenuti mescolando i calibratori in proporzioni idonee. Attenzione che i calibratori Coat-A-Count HCG IRMA non sono interscambiabili con quelli forniti con il Dosaggio Doppio Anticorpo HCG. Il calibratore da 25 mIU/mL (Calibratore C) serve come riferimento positivo nella procedura qualitativa. Altri calibratori forniti

in questo kit possono essere utilizzati come controlli in questo contesto.

Tampone HCG (CGAB) 11 mL di un diluente tampone. Stabile a 2–8°C per 30 giorni dopo l'apertura o fino alla data di scadenza indicata sull'etichetta. IKCG1: 1 flacone.

Soluzione/Tampone di Lavaggio Concentrata (2TSBW) Soluzione/tampone salina e concentrata con surfactanti e sodio azide come conservante. Utilizzare un contenitore per il trasferimento, diluire il contenuto di ciascun flacone con 600 mL d'acqua distillata, per un volume totale di 660 mL. Conservare refrigerato: stabile a 2–8°C per 6 mesi dopo la preparazione. IKCG1: 1 flacone × 60 mL.

Materiali Richiesti Ma Non Forniti Gamma counter — compatibile con provette standard da 12x75 mm. Rack shaker — settato a circa 200 colpi al minuto.

Preparazione dei Reagenti Pipette: 2,0 mL, 5,0 mL e 10,0 mL Acqua distillata o deionizzata. Cilindro Graduato — per la dispensazione di 600 mL Contenitore di plastica con coperchio – per la preparazione e la conservazione della Soluzione di Lavaggio.

Immunodosaggio Micropipetta: 100 µL Dispensatore — per la dispensazione di 2,0 mL di Soluzione di Lavaggio. Foam per la decantazione — disponibile presso Siemens Healthcare Diagnostics (Codice: FDR). Carta per grafici log-log a 3 cicli Un controllo per immunodosaggi a base sierica umana a tre livelli, contenente HCG tra gli oltre 25 costituenti dosati, disponibile presso Siemens Healthcare Diagnostics (Codice: CON6).


Prelievo dei Campioni Non è necessario che il paziente sia a digiuno, non sono necessarie preparazioni particolari. Prelevare il sangue in provette19 semplici, eparinizzate o vacutainer EDTA, annotando l'ora del prelievo. Si consiglia l'utilizzo di un'ultracentrifuga per schiarire i campioni lipemici. I campioni emolizzati posson indicare il trattamento non idoneo del campione prima dell'arrivo al laboratorio; per questo motivo, i risultati devono essere interpretati con prudenza. Provette per il prelievo di sangue di produttori diversi possono dare valori differenti, a seconda dei materiali e degli additivi usati, incluso gel o barriere fisiche, attivatori di coaguli e/o anticoagulanti. L'Coat-A-Count IRMA HCG non é stato verificato con tutte le possibili variazioni di tipi di provette. Consultare la sezione riguardante Campioni Alternativi per dettagli sulle provette testate. Volume Richiesto: 100 µL di siero o di plasma per provetta. Conservazione: 2–8°C per 7 giorni, o fino a 2 mesi a –20°C. Prima del dosaggio, consentire ai campioni di raggiungere temperatura ambiente (15–28°C) e mescolare scuotendo leggermente o capovolgendo la provetta. Aliquotare, se necessario per evitare cicli ripetuti di congelamento e scongelamento. Non tentare di scongelare campioni congelati riscaldandoli in un bagnetto ad acqua.

Diluizioni: La procedura quantitativa ha un range fino a 500 mIU/mL, ma livelli fino a 100 000 mIU/mL o oltre possono essere riscontrati nel corso di gravidanze normali. Campioni di gravidanze normali, anche quelle che raggiungono valori di picco nel primo trimestre, produrranno conte al minuto superiori alle conte del calibratore più elevato, se dosati senza diluizione. Campioni con livelli elevati inclusi quelli di gravidanze molari,4,9,10,16 devono essere convenientemente diluiti con il calibratore zero prima del dosaggio. Per evitare ritardi causati da ridosaggi dei campioni “fuori curva” alcuni laboratori possono optare per una serie di diluizioni

1:10 su ogni campione. Il dosaggio di campioni non diluiti 1:10 e 1:100 nella maggior parte dei casi porta la concentrazione dei campioni entro il range del dosaggio; un'ulteriore diluizione di 1:1000 può essere preparata per campioni in eccesso di 100 000 mIU/mL.

Dispensazione: Occorre fare attenzione nella preparazione delle diluizioni e nella dispensazione dei campioni per evitare errori dovuti al carryover. E' importante utilizzate micropipette con puntali monouso, cambiando il puntale tra i campioni per evitare la contaminazione da carryover. Pipette a dislocazione positiva e diluitori-pipettatori automatici devono essere utilizzati solo se la possibilità che si verifichi il carryover sia stata valutata e trovata non rilevante. Dispensare tutti i campioni ed i reagenti direttamente al fondo. Tutti i campioni, inclusi i calibratori ed i controlli, devono essere dosati in duplicato. Ispezionare i risultati per verificarne la correlazione entro coppie di provette. Coppie di provette di controllo possono essere spaziate lungo tutta la seduta come aiuto nella verifica dell'assenza di scostamenti significativi.

Procedura Quantitativa Tutti i componenti devono essere portati a temperatura ambiente (15–28°C) prima dell'utilizzo. 1 Etichettare con A quattordici provette

coattate con anticorpo HCG (legame non specifico) e dalla B alla G ("legame massimo") in duplicato. Etichettare altre Provette Coattate con HCG anch'esse in duplicato, per i controlli ed i campioni. In maniera opzionale, etichettare con T due provette semplici (non coattate) da 12×75 mm di polistirene (conte totali) in duplicato, e metterle da parte fino al punto 6.


Calibratori HCG mIU/mL 3° IS 75/537

HCG mIU/mL 2° IS 61/6

T* — —

A (NSB) 0 0

B 5 5

C 25 25

D 50 50

E 100 100

F 250 250

G ("MB") 500 500

* Opzionali

2 Dispensare 100 µL di ciascun calibratore, controllo e campione nelle provette preparate. Pipettare direttamente al fondo. Campioni con livelli attesi di HCG superiori a 500 mIU/mL devono essere adeguatamente diluiti con il calibratore zero prima del dosaggio. Utilizzare una micropipetta con puntali monouso cambiando il puntale tra un campione e l'altro per evitare errori dovuti al carryover. Pipette a dislocazione positiva e pipettatori-diluitori automatici devono essere utilizzati solo se la possibilità che si verifichi il carryover è stata valutata e trovata insignificante.

3 Aggiungere 100 µL del Tampone HCG in ogni provetta. Pipettare direttamente al fondo. Si consiglia per questo passaggio e per l'aggiunta del traccianto al punto 6, l'utilizzo di un dispensatore a ripetizione.

4 Scuotere per 30 minuti su shaker.Per la Procedura Qualitativa, 15 minuti sono sufficienti.

5 Decantare ed asciugare completamente. Aggiungere 2,0 mL di Soluzione di Lavaggio ad ogni provetta. Attendere 1 o 2 minuti, quindi decantare ed asciugare completamente. Rimuovere tutta l'umidità visibile aumentando così la precisione. Dopo lavaggio, decantare il contenuto di tutte le provette utilizzando un foam. Tamponarle su carta assorbente per eliminare completamente i liquidi.

6 Aggiungere 100 µL di anticorpo HCG marcato con I125 in ogni provetta. Non devono passare più di 10 minuti nella dispensazione del tracciante. Mettere da parte le provette T per la conta (al punto 9); non sono necessari ulteriori passaggi.

7 Scuotere per 30 minuti su shaker. Per la Procedura Qualitativa,15 minuti sono sufficienti.

8 Decantare completamente. Aggiungere 2 mL di Soluzione di Lavaggio ad ogni provetta. Attendere 1 o 2 minuti, quindi decantare completamente. Aggiungere ancora 2 mL di Soluzione di Lavaggio, attendere 1 o 2 minuti, e decantare completamente. Rimuovere tutta l'umidità visibile aumentando così la precisione. Dopo il secondo lavaggio, decantare il contenuto di tutte le provette (ad eccezione delle provette T) utilizzando un foam e fare in modo che si asciughino per 2 o 3 minuti. Tamponarle su carta assorbente per eliminare completamente i liquidi.

9 Contare per 1 minuto in un gamma counter. Nei gamma counter multi-testina, le provette delle Conte Totali (opzionali) devono essere separate dalle rimanenti provette di almeno uno spazio, per minimizzare la possibilità che si verifichino fuoriuscite.

Procedura Qualitativa La Procedura Qualitativa rappresenta una semplificazione della Procedura Quantitativa poiché viene utilizzato un solo punto di riferimento invece di una curva di calibrazione completa. Consente di determinare se il campione di siero o di plasma abbia una concentrazione di HCG superiore o inferiore a 25 mIU/mL, entro il range di precisione del dosaggio. Campioni con livelli attesi di HCG superiori dovrebbero essere dosati a diluizioni appropriate con la Procedura Quantitativa sopra descritta. 1 Etichettare con C due Provette

Coattate con Anticorpo anti-HCG, per il riferimento positivo da 25 mIU/mL. Etichettare altre Provette Coattate con


un Anticorpo anti-HCG, anch'esse in duplicato per i controlli ed i campioni. Etichettare con T due provette semplici di polistirene (non coattate, opzionali) da 12x75 mm (Conte totali).

Calibratore HCG mIU/mL 3° SI 75/537

HCG mIU/mL 2° SI 61/6

T* — —

C (Riferimento) 25 25

* Opzionale

Continuare come nella Procedura Quantitativa più sopra descritta (punti 2 fino a 9). Il tempo di incubazione ai punti 4 e 7 può essere ridotto a 15 minuti.

Calcolo e Controllo di Qualità

Procedura Quantitativa Per calcolare le concentrazioni di HCG da una rappresentazione log-log della curva di calibrazione, correggere inizialmente le conte al minuto (CPM) di ciascuna coppia di provette sottraendo i CPM medi delle provette del legame non specifico (calibratore A): Conte Nette = (Media dei CPM) Meno (Media CPM NSB)

Quindi determinare la percentuale di legato (relativa a quella del calibratore più elevato) – qui chiamato "%B/MB" – di ciascuna coppia di provette come percentuale del “legame massimo” con le conte corrette NSB del calibratore più elevato preso al 100%: Percentuale di Legato = (Conte Nette / Conte Nette MB) × 100

Utilizzando una carta per grafici log-log a tre cicli, tracciare la Percentuale di Legato vs. la Concentrazione per ciascuno dei calibratori non zero e tracciare una curva lungo questi punti. (Collegare i punti della calibrazione con archi o segmenti. Non tentare di utilizzare un'unica linea retta). Le concentrazioni per i controlli ed i campioni non noti entro il range dei calibratori non zero possono essere calcolate dalla curva di calibrazione per interpolazione. E' possibile tracciare una curva ulteriore tra la Percentuale di Legato e la Concentrazione per i tre calibratori più bassi con un grafico linear-linear per

calcolare l'interpolazione della dose prossima a zero. Commenti: Benché altri approcci risultino accettabili, il calcolo dei dati con il metodo appena descritto ha alcuni vantaggi dal punto di vista del controllo di qualità. In particolare, produce una curva di calibrazione che è relativamente lineare sia nella rappresentazione log-log che linear-linear, e relativamente stabile da dosaggio a dosaggio. Produce anche parametri di QC validi, ad es.: Valori di Percentuale di Legato (%B/MB) per i calibratori non zero. Un grafico che porta ancora più informazioni, con un senso di riproducibilità intra-dosaggio in funzione della concentrazione, può essere ottenuto direttamente tracciando i valori della Percentuale di Legato delle singole provette dei calibratori, i.e. senza prima calcolare la media dei CPM dei replicati. Alternative: Benché la Percentuale di Legato possa essere calcolata direttamente dai CPM medi, la correzione per il legame non specifico produce normalmente una curva di calibrazione che è più lineare lungo il suo range. Una curva di calibrazione può anche essere costruita tracciando i CPM o la Media dei CPM direttamente vs. la concentrazione sia su grafico log-log che linear-linear. (non utilizzare grafici semi-log). Questo approccio ha il vantaggio della semplicità, ma è meno auspicabile dal punto di vista del controllo di Qualità. Calcolo Computerizzato dei Dati: Sono accettabili metodi "Punto-a-punto", incluse linee spline cubiche e lineari; ma poiché sono poco d'aiuto nel monitoraggio dell'integrità del dosaggio, è importante preparare la rappresentazione log-log della curva di calibrazione, sia manualmente che con il computer come step del controllo di qualità. Possono essere utilizzate anche le tecniche di calcolo dei dati basate sul modello logistico. All'interno di questa famiglia, le routine di curve-fitting basate sulla logistica a 4 o 5 parametri sono i candidati più idonei. Tuttavia, alcuni algoritmi ad oggi in uso possono non convergere in modo uniforme, anche quando il modello logistico è in accordo con i dati. Se viene adottato un metodo logistico, è essenziale verificarne l'appropriatezza per la routine giornaliera monitorando il calcolo dei calibratori e di altri parametri. Inoltre, si


consiglia una rappresentazione log-log della curva di calibrazione, poiché fornisce più informazioni della rappresentazione convenzionale semi-log. Manipolazione dei Campioni: Le istruzioni per la manipolazione e la conservazione dei campioni e dei componenti devono essere attentamente osservate. Diluire i campioni dei pazienti con concentrazioni attese di HCG superiori al calibratore più elevato (500 mIU/mL) con il calibratore zero prima del dosaggio. Tutti i campioni, inclusi i calibratori ed i controlli devono essere dosati almeno in duplicato. E' importante utilizzare una micropipetta con puntale monouso, cambiando il puntale da un campione all'altro, per evitare la contaminazione da carryover. Pipette a dislocazione positiva e pipettatori-diluitori automatici devono essere utilizzati solo se la possibilità che si verifichi il carryover è stata valutata e ritenuta insignificante. Coppie di provette possono essere intervallate lungo tutto il dosaggio per aiutare nella verifica dell'assenza di deviazioni significative. Ispezionare i risultati per verificare la correlazione entro le coppie di provette. Gamma Counter: Per minimizzare la possibilità che si verifichino fuoriuscite in gamma counter multi-pozzetto, le provette delle conte totali opzionali (T) devono essere separate da uno o più spazi dalle altre provette. In alternativa, aggiungere solo 25 µL del tracciante ad ognuna delle provette T al punto 6, e moltiplicare le conte per minuto osservate in queste provette per 4. Controlli: controlli o pool di sieri con almeno due livelli di concentrazioni di HCG (basso ed alto) devono essere dosati routinariamente come campioni non noti, ed i risultati annotati giorno dopo giorno come indicato in Westgard JO, et al. A multi-rule chart for quality control. Clin Chem 1981;27:493-501. Ripetere i campioni costituisce un utile strumento per monitorare la precisione interdosaggio. Parametri di QC: Consigliamo di annotare i risultati delle prestazioni come segue: T = Conte Totali (conte al minuto)

%NSB = 100 × (Conte NSB Medie / Conte Totali)

%MB = 100 × (Conte Nette / Conte Totali)

Ed i valori della Percentuale di Legato ("%B/MB") di tutti i calibratori tranne il più elevato tra i calibratori non zero, ad esempio: %C/MB = 100 × (Conte Nette del Calibratore "C" / Conte Nette MB)

Archivio Dati: Si consiglia per ogni dosaggio di annotare i numeri di lotto dei componenti utilizzati, le date di ricostituzione o di apertura. Ulteriori Letture: Vedi Dudley Ra et al. Guidelines for immunoassay data Reduction. Clin Chem 1985;31:1264-71. Seduta Esemplificativa, Procedura Quantitativa: a solo scopo illustrativo e non per calcolare i risultati di un'altra seduta. (Vedi tabella "Example Run, Quantitative Procedure".)

Procedura Qualitativa Se le conte (medie) al minuto per le provette dei pazienti sono inferiori alle conte (medie) al minuto del Calibratore C, il campione contiene meno di 25 mIU/mL di HCG, entro il range di precisione del dosaggio. Se le conte dei campioni sono superiori a quelle del Calibratore C, allora il campione contiene più di 25 mIU/mL di HCG, entro il range di precisione del dosaggio. In relazione alla Gravidanza: Concentrazioni al di sopra del cutoff di 25 mIU/mL possono essere considerate positive per la gravidanza a patto che altre cause che provocano un innalzamento dei livelli di HCG siano state escluse i.e. neoplasia trofoblastica e non trofoblastica, gravidanze recenti o aborto spontaneo, e così via. 4,9,10,16 Sono attese concentrazioni inferiori ad un cutoff di 25 mIU/mL per campioni provenienti da adulti maschi in buona salute e da donne non in gravidanza. (Vedi sezione “Valori Attesi”). Concentrazioni inferiori a 25 mIU/mL sono attese anche per campioni di donne ad uno stadio iniziale della gravidanza quando la concentrazione di HCG non ha ancora raggiunto un livello decisivo per la procedura qualitativa. Il Dosaggio di un altro campione raccolto due o più giorni dopo dovrebbe rivelarsi decisivo, poiché nei primi stati della gravidanza il livello di HCG raddoppia in questo arco di tempo.11 Controllo di Qualità: Verificare le conte al minuto di tutti i campioni per la


correlazione entro coppie di provette. Controlli o pool di sieri o plasma, con concentrazioni di HCG al di sopra ed al di sotto di quella del riferimento di 25 mIU/mL (calibratore C) devono essere dosati di routine come campioni non noti. Altri calibratori forniti con il kit – specificatamente, i calibratori da 5 e 50 mIU/mL (B, D) – possono essere processati come controlli aggiuntivi. Consigliamo di annotare le conte al minuto del riferimento (calibratore C) e dei controlli come percentuale delle conte totali, i.e. %C/T = 100 × (Conte Medie del Calibratore "C" / Media delle Conte Totali)

L'abitudine a determinare le medie ed i CV intradosaggio, sulla base delle conte, per diversi replicati ciascuno di un controllo basso, alto e del calibratore C possono essere d'aiuto nel monitoraggio dell'integrità del dosaggio giorno dopo giorno. Seduta Esemplificativa: a solo scopo illustrativo e non per calcolare i risultati di un'altra seduta. (Vedi tabella "Example Run, Qualitative Procedure".)

Valori Attesi Campioni di siero di 47 uomini in buona salute e 38 donne non in gravidanza sono stati dosati con il dosaggio Coat-A-Count HCG IRMA con i seguenti risultati: 95% dei valori dei maschi erano inferiori a 1,0 mIU/mL. Il 90% dei valori delle donne erano inferiori a 3 mIU/mL. Il 100% di tutti I valori (maschi e femmine) era 5 mIU/mL o inferiori. I risultati sono in linea con un limite superiore di normalità di circa 5 mIU/mL in assenza di gravidanza. Tuttavia, i laboratori dovrebbero considerare questi risultati solo come linee guida. In un altro studio, 286 campioni di siero di donne con età gestazionale nota sono stati dosati con il dosaggio Coat-A-Count HCG IRMA. L'età gestazionale è stata classificata in base alle settimane dopo il primo giorno dell'ultimo periodo mestruale (LMP). I risultati sono come segue:

Valore Mediano Range Assoluto Range al 95%

Valore Mediano Range Assoluto Range al 95%

4 settimane dopo LMP (n=5)

291 196 – 3 537

5 Settimane dopo LMP (n=12)

4 117 1 026 – 30 964

6 Settimane dopo LMP (n=23)

18 897 4 250 – 81 172

7 – 8 Settimane dopo LMP (n=40)

54 266 6 002 – 114 430


48 841 18 344 – 98 807

11 – 14 settimane dopo LMP (n=52)

50 841 21 874 – 120 766

15 – 22 settimane dopo LMP (n=67)

16 418 4 106 – 57 393


11 872 2 468 – 36 142

Campioni seriali di donne nelle prime 2–5 settimane di gravidanza hanno presentato un raddoppio dei tempi per concentrazioni di HCG da 1,5 a 3 giorni con una media doppia del tempo di 2,2 giorni. Considerare questi limiti soltanto come linee guida. Ogni laboratorio dovrebbe stabilire i propri range di riferimento.

Prestazioni del Dosaggio Le seguenti sezioni contengono dati reppresentativi delle prestazioni del dosaggio Coat-A-Count HCG IRMA. Nelle sezioni di seguito fornite, i risultati di HCG sono espressi in milliunità internazionali di HCG per millilitro (mIU/mL). Range di Calibrazione: Fino a 500 mIU/mL (3° SI 75/537 e 2° SI 61/6). Standardizzazione: il dosaggio ha un range di calibrazione da 5 a 500 mIU/mL nella procedura quantitativa. Il calibratore da 25 mIU/mL serve come riferimento positivo nella procedura qualitativa. Il dosaggio è standardizzato in termini di WHO 3° Standard Internazione per l'HCG (3° SI 75/537), ed anche in termini di Secondo Standard Internazionale per l'HCG (2° SI 61/6). Sensibilità Analitica: 0,3 mIU/mL, Effetto Gancio a Dosi Elevate: Nessun effetto fino a 1 000 000 mIU/mL.


Precisione Intra-Dosaggio (All'interno della stessa seduta): Sono state calcolate statistiche per campioni dai risultati di 20 coppie di provette in un unico dosaggio. (Vedi tabella “Intraassay Precision”.) Precisione Inter-Dosaggio (Da una seduta all'altra): Sono state calcolate statistiche per campioni dai risultati di coppie di provette in 20 dosaggi diversi. (Vedi tabella “Interassay Precision”.) Effetto Fine-Seduta: Nessuno fino a circa 350 provette. (vedi tabella "End-of-Run Effect"). Linearità: I campioni sono dosati a varie diluizioni. (Vedi tabella “Linearità” per dati rappresentativi.) Recupero: Sono stati dosati campioni diluiti 1:19 con tre soluzioni di HCG (200, 1 000, e 5 000 mIU/mL). (Vedi tabella “Recovery” per dati rappresentativi). Specificità: L'anticorpo utilizzato nel dosaggio Coat-A-Count HCG IRMA è altamente specifico per l'HCG intatto, con una crossreattività bassa verso altri ormoni glicoproteici presenti nei campioni dei pazienti. Un campione contenente 23,2 mIU/mL HCG è stato diluito con quantitativi diversi di FSH, LH e TSH. Il campione è stato dosati sia diluito che non diluito con il Dosaggio Coat-A-Count HCG IRMA. (Vedi tabella "Specificity 1"). Sono state anche studiate le sottounità alfa e beta dell'HCG. La sottounità HCG β- (WHO 75/551), è stata aggiunta nel calibratore zero del Dosaggio Coat-A-Count HCG IRMA. (Vedi tabella "Specificity 2".)

La sottounitàα dell'HCG (WHO 75/569), è stata aggiunta nel calibratore zero del Dosaggio Coat-A-Count HCG IRMA (Vedi tabella "Specificity 3") Bilirubina: La presenza di bilirubina in concentrazioni fino a 200 mg/L non ha nessun effetto sui risultati entro il range di precisione del dosaggio. Emolisi: La presenza di globuli rossi impaccati in concentrazioni fino a 30 µL/mL non ha effetto sui risultati entro il range di precisione del dosaggio. Tipo di Campione Alternativo: Per determinare l'effetto di campioni alternativi, è stato prelevato del sangue da 20 volontari in provette semplici,

eparinizzate, EDTA e Becton Dickinson vacutainer SST®. Tutti i campioni si sono analizzati mediante il procedimento di HCG dell'Coat-A-Count IRMA, con i risultati seguenti. (EDTA) = 1,00 (Siero) – 0,5 mIU/mL r = 0,996

(Eparina) = 1,04 (Siero) + 0,3 mIU/mL r = 0,994

(SST) = 0,98 (tubi semplici) + 1,65 mIU/mL r = 0,993

Valore medio: 101 mIU/mL (Siero) 106 mIU/mL (Eparina) 101 mIU/mL(EDTA) 101 mIU/mL (SST)

Comparazione di Metodi: il Dosaggio Coat-A-Count HCG IRMA è stato comparato ad un altro dosaggio immunoradiometrico per l'HCG (Kit A) ed anche ad un radioimmunodosaggio per l'HCG (Kit B) su 48 campioni di pazienti. I campioni presentavano livelli di HCG da 5 a 500 mIU/mL. La regressione lineare ha prodotto le seguenti statistiche. (CAC IRMA) = 1,19 (Kit A) + 0,9 mIU/mL r = 0,998

Valore Medio: 217 mIU/mL (Coat-A-Count IRMA) 182 mIU/mL (Kit A)

(CAC IRMA) = 1,25 (Kit B) – 24,4 mIU/mL r = 0,983

Valore Medio: 217 mIU/mL (Coat-A-Count IRMA) 193 mIU/mL (Kit B)

Assistenza Tecnica All'estero: Si prega di contattare il proprio Distributore Nazionale. www.siemens.com/diagnostics

Il Sistema Qualità della Siemens Healthcare Diagnostics Inc. è certificato ISO 13485:2003.

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Coat-A-Count HCG IRMA Utilização: O Coat-A-Count HCG IRMA é um ensaio imunoradiométrico concebido para a medição qualitativa e quantitativa da gonadotropina coriónica humana (HCG) em soro e em plasma. Destina-se estritamente a uso de diagnóstico in vitro


por técnicos qualificados de laboratório e como auxiliar na detecção da gravidez. Números de catálogo: IKCG1 (100 tubos)

O kit de 100 tubos contém menos de 20 microcuries (740 quilobecquerels) de anti-HCG

radioactivo policlonal 125I.

Sumário e explicação do teste A gonadotropina coriónica humana (HCG) é uma hormona glicoproteína de cadeia dupla (MW ≈ 37 000) que se encontra normalmente no sangue e na urina apenas durante a gravidez. É segregada pelo tecido placentário, começando com o trofoblasto primitivo, datando praticamente da altura da implantação, e serve para suportar o corpus luteum durante as primeiras semanas de gravidez. O material da HCG ou tipo HCG é também produzido por uma grande variedade de casos de neoplasia trofoblástica e não trofoblástica.4,9,10,16 A sua medição por sistemas de ensaio de sensibilidade e especificidade adequadas demonstrou já ser de grande valor na detecção e acompanhamento da gravidez. Segundo a literatura disponível, a HCG atinge normalmente níveis de aproximadamente 2 000 mIU/mL um mês após a concepção.2,3,10,11 Valores máximos de 50 000 ou mesmo de 100 000 mIU/mL são obtidos no terceiro mês, registando-se um declínio gradual a partir desse momento. Depois do parto, o nível de HCG sofre normalmente uma diminuição rápida, atingindo concentrações fora da gravidez (normalmente inferiores a 5 mIU/mL) cerca de duas semanas mais tarde.10 Casos de gravidez ectópica e de gravidez terminando em aborto espontâneo tendem a apresentar valores inferiores aos normais, enquanto os casos de gravidez múltipla registam frequentemente valores ligeiramente superiores. O procedimento qualitativo representa uma simplificação do procedimento quantitativo, na medida em quel é usado um único ponto de referência em vez de uma curva de calibração completa. Isto permite determinar se uma amostra de soro tem uma concentração de HCG superior ou inferior a 25 mIU/mL, dentro da precisão do ensaio. As concentrações acima deste intervalo podem ser

consideradas como resultados positivos de gravidez, desde que tenham sido excluídas outras causas possíveis dos níveis elevados de HCG, ex. casos de neoplasia trofoblástica e não trofoblástica.4,9,10,16 Prevêem-se concentrações abaixo deste intervalo em amostras de pessoas que não estejam grávidas, bem como em pessoas numa fase tão inicial da gravidez que a concentração da HCG não tenha atingido ainda o nível de decisão definido para o procedimento. O ensaio de uma nova amostra recolhida dois ou mais dias mais tarde deverá produzir um resultado decisivo, uma vez que num estado inicial de gravidez se prevê que o nível da HCG duplique mais ou menos dentro deste período.11 Este facto pode também ser de interesse para submeter o espécimen original a novo ensaio, segundo o procedimento quantitativo, de modo a apurar com maior precisão a concentração da HCG.

Princípio do Procedimento O Coat-A-Count HCG IRMA é um ensaio imunoradiométrico de fase sólida. O ensaio utiliza um anticorpo policlonal anti-HCG na fase líquida marcado com 125I, e um anticorpo monoclonal anti-HCG imobilizado na parede de um tubo de poliestireno.

No procedimento: A HCG é capturada entre o marcador policlonal e os anticorpos monoclonais que revestem o tubo. O marcador policlonal não ligado é removido por decantação e lavagem do tubo. O tubo é contado num contador gama durante um minuto. A concentração da HCG na amostra de paciente é directamente proporcional ao número de contagens por minuto. A concentração da HCG é determinada comparando o número de contagens com as contagens obtidas a partir do conjunto de calibradores fornecido. Reagentes para Pipetar: 2 Tempo de Incubação: 1 hora (num agitador mecânico. Contagens Totais na Marcação com o Iodo: aproximadamente 300 000 cpm


Precauções Para uso de diagnóstico in vitro. Reagentes: Conservar a 2–8°C num frigorífico destinado para materiais radioactivos. Eliminar de acordo com as leis aplicáveis. Não utilize reagentes com prazo de validade expirado. Alguns componentes fornecidos com este dispositivo podem conter matéria de origem humana e/ou outros ingredientes potencialmente perigosos que necessitem de algumas precauções. Manipule com as devidas precauções todos os materiais capazes de transmitir doenças infecciosas. As matérias primas, obtidas de soro humano, foram testadas, revelando resultados negativos para a sífilis, para os anticorpos do vírus da imunodeficiência humana (HIV) 1 e 2; para o antigénio de superfície da hepatite B (HBsAg) e para os anticorpos do vírus da hepatite C. Azida de sódio foi adicionada como conservante; para evitar acumulações de azidas metálicas explosivas em canalizações de cobre e alumínio, os reagentes devem ser rejeitados no esgoto apenas se estiverem diluídos e forem lavados com grandes volumes de água. Água: Utilize água destilada ou desionizada.

Radioactividade Uma cópia da licença de uso de produtos radioactivos (especifico ou geral) enviada pelo cliente, deve estar em poder da Siemens Healthcare Diagnostics antes do envio dos kits ou componentes contendo material radioactivo. Estes materiais radioactivos podem ser adquiridos por qualquer cliente que possua a necessária licença especifica. Com uma licença generalista estes produtos radioactivos só podem ser adquiridos por médicos, veterinários na prática de medicina veterinária, laboratórios clinicos e hospitais. E somente para uso clinico in vitro ou testes laboratoriais não envolvendo administração externa ou interna do material radioactivo ou da sua radiação para o ser humano ou outros animais. A sua aquisição, receita, armazenamento uso, transporte e eliminação estão sujeitas aos

regulamentos e à licenciada Comissão de Regulação Nuclear ou do Estado respectivo de acordo com a lei em vigor. Tratar os materiais radioactivos de acordo com a regulamentação da sua licença, específica ou generalista. De modo a minimizar a exposição à radiação deve o utilizador seguir as instruções da publicação do Departamento Nacional de Padrões (Utilização segura de materiais radioactivos-Livro No. 92, publicado em Março de 1964) e publicações seguintes do Estado e Autoridades Federais. Limpar os derrames prontamente e descontamine as superficies afectadas. Evitar os aerossois. Elimine os lixos radioactivos de acordo com a regulamentação da licença. As licenças generalistas (portadores da licença NRC 483) podem eliminar os lixos sólidos radioactivos como lixo não radioactivo depois de remover os rótulos. Licenças Especificas (Licença NRC 313) devem ter em conta o Capitulo 10 do artigo 20, do Código de Regulamentações Federais. Cada Estado deve referir a legislação em vigor aprovada para o seu território. As licenças generalistas podem eliminar os lixos radioactivos liquidos do tipo deste produto para um esgoto de laboratório. Os licenciados devem remover os rótulos dos frascos vazios de materiais radioactivos antes de os colocar no esgoto sólido. As licenças especificas podem eliminar pequenas quantidades de lixo radioactivo deste tipo de produto para o esgoto normal do laboratório. Ter em atenção as regulamentações em vigor para o seu laboratório.

Materiais Fornecidos – Preparação Inicial

Tubos Revestidos com Anticorpos HCG (ICG1) Tubos de poliestireno revestidos com anticorpos monoclonais murinos anti-HCG e embalados em saquetas de fecho hermético. Conservar refrigerado e protegido da humidade, selar os sacos cuidadosamente após cada abertura. Estável a 2–8°C até à data de validade inscrita na embalagem. IKCG1: 100 tubos.


Anticorpos 125I HCG (ICG2) Anticorpo policlonal anti-HCG iodado na forma líquida, pronto a usar. Cada frasco contém 5,5 mL. Estável a 2–8°C durante 30 dias depois de aberto ou até ao prazo de validade indicado no rótulo. IKCG1: 2 frascos.

Calibradores HCG (CGI3–9) Sete frascos, rotulados de A a G, de calibradores HCG numa matriz de soro humano sem HCG, com conservante. Os calibradores são fornecidos liofilizados. No mínimo 30 minutos antes da utilização, reconstituir o calibrador zero A com 10 mL de água destilada ou desionizada, o calibrador C com 5 mL, e os restantes calibradores B e D a G com 2 mL cada. (Ver tabela abaixo.) Usar pipetas volumétricas e misturar com movimentos lentos ou por inversão. Estável a 2–8°C durante 30 dias depois de reconstituído ou a –20°C durante 6 meses (aliquotado). IKCG1: 1 conjunto.

Frasco de Calibrador Volume de

Reconstituição

Calibrador A 10,0 mL

Calibrador B 2,0 mL

Calibrador C 5,0 mL

Calibradores D – G 2,0 mL

Os calibradores são normalizados (mas não preparados) de acordo com a Terceira Norma Internacional para Imunoensaios da HCG, número 75/537, da Organização Mundial de Saúde. Segundo esta norma, os calibradores representam 0, 5, 25, 50, 100, 250 e 500 milli-Unidades Internacionais de HCG por mililitro (mIU/mL, 3ª NI 75/537). Os valores do calibrador de acordo com a Segunda Norma Internacional para a HCG, número 61/6, da Organização Mundial de Saúde, são idênticos. Os pontos de calibração intermédios podem ser obtidos misturando os calibradores nas proporções adequadas. De notar que os calibradores do Coat-A-Count HCG IRMA não podem ser substituídos pelos calibradores fornecidos com o kit Duplo de Anticorpo HCG. O calibrador de 25 mIU/mL (Calibrador C) funciona como referência positiva no procedimento qualitativo. Outros calibradores fornecidos

com este kit podem ser usados como controlos neste contexto.

Tampão de Ensaio HCG (CGAB) 11 mL de diluente tamponizado. Estável a 2–8°C durante 30 dias depois de aberto, ou até ao prazo de validade indicado no rótulo. IKCG1: 1 frasco.

Concentrado de Solução de Lavagem Tamponizado (2TSBW) Solução salina de concentrado tamponizado, com surfactantes e azida de sódio como conservante. Usando um recipiente de transporte de amostra, diluir o conteúdo de cada frasco com 600 mL de água destilada, para um volume total de 660 mL. Armazenar refrigerado: estável a uma temperatura de 2–8°C durante seis meses depois de preparado. IKCG1: 1 frasco × 60 mL.

Materiais necessários mas não fornecidos Contador gama — compatível com tubos standard 12x75 mm Agitador mecânico — definido para aproximadamente 200 movimentos por minuto.

Preparação de Reagentes Pipetas: 2,0 mL, 5,0 mL e 10,0 mL Água destilada ou desionizada Proveta graduada — para uma dosagem de 600 mL Contentor plástico de armazenamento com tampa — para preparação e armazenamento da Solução de Lavagem Tamponizada

Imunoensaio Micropipeta: 100 µL Dispensador — para uma dosagem de 2,0 mL de Solução de Lavagem Tamponizada. Dispositivo de decantação de espuma — disponível na Siemens Healthcare Diagnostics (Números de catálogo: FDR). Papel milimétrico log-log de 3 ciclos Um controlo de imunoensaio baseado em soro humano de três níveis, contendo HCG como um dos 25 constituintes submetidos a ensaio, está disponível na


Siemens Healthcare Diagnostics (Números de catálogo: CON6).

Colheita O paciente não necessita dieta. Não são necessárias preparações especiais. Colher sangue por punção venosa19 para tubos lisos, heparinizados, ou tubos de vácuo de ácido-etileno-diamino-tetracético, anotando a data e hora da colheita. Recomenda-se o uso de uma ultra centrífuga para clarear amostras lipémicas. Amostras hemolisadas podem indicar tratamento incorrecto de uma amostra antes do envio para o laboratório; portanto os resultados devem ser interpretados com cuidado. Os tubos para colheita sanguínea de diferentes fabricantes, podem originar diferentes valores, dependendo dos materiais e aditivos, incluíndo gel ou barreiras fisicas, activadores do coágulo e/ou anti coagulantes. Coat-A-Count IRMA HCG não foram ainda testados com todas as possiveis variações originadas pelos tipos de tubos. Consultar a secção Tipos de Amostras Alternativas para obter detalhes sobre os tubos que foram testados. Volume de Amostra: 100 µL de soro ou plasma por tubo. Armazenamento: 2–8°C durante 7 dias, ou até 2 meses a –20°C. Deixar as amostras atingir a temperatura ambiente (15–28°C) e agitar suavemente ou por inversão. Aliquotar se necessário para evitar repetidos congelamentos/ descongelamentos. Não tentar liquefazer os espécimens congelados, aquecendo-os em banho-maria.

Diluições: O procedimento quantitativo tem uma gama de até 500 mIU/mL, no entanto, podem ser encontrados níveis de paciente até 100 000 mIU/mL ou superiores no decurso de uma gravidez normal. As amostras em gravidez normal, incluindo as que atinjam valores máximos no primeiro trimestre, produzirão contagens por minuto superiores às contagens do calibrador mais elevado, se submetidas a ensaio sem diluição. Amostras que se preveja que contenham níveis elevados, incluindo amostras de casos de gravidez molar,4,9,10,16 devem ser adequadamente diluídas com o calibrador zero antes do ensaio. A fim de evitar atrasos devidos ao facto de terem de ser submetidas a novo ensaio amostras "fora da curva", alguns laboratórios poderão manter uma prática de definir uma série de diluições de 1 para 10 em todas as amostras. Submeter a ensaio amostras não diluídas, nas proporções de 1 para 10 e 1 para 100 fará, na maioria dos casos, com que as amostras registem concentrações dentro da gama do ensaio; uma diluição adicional de 1 para 1 000 pode ser preparada para as amostras que se preveja que contenham um nível superior a 100 000 mIU/mL.

Pipetação: As diluições e a pipetação das amostras deve ser cuidadosa a fim de evitar erros por contaminação. É importante usar uma micropipeta de ponta descartável, substituindo a ponta entre as amostras, a fim de evitar contaminação. Pipetas de transporte e pipetadores-diluidores automáticos deverão ser usados apenas se a possibilidade de contaminação tiver sido avaliada e considerada como não significativa. Pipetar todas as amostras e reagentes directamente para a base do tubo. Todas as amostras, incluindo os calibradores e os controlos, deverão ser submetidas a ensaio duplicado. Analisar os resultados para verificar a concordância entre os pares de tubos. Os pares de tubos de controlos podem ser espaçados ao longo do ensaio a fim de verificar a ausência de desvio significativo.


Procedimento Quantitativo Todos os componentes devem estar à temperatura ambiente(15–28°C) antes de usar. 1 Rotular catorze Tubos A Revestidos

com Anticorpos HCG (ligação não específica) e B a G ("ligação máxima") em duplicado. Rotular Tubos Revestidos com Anticorpos HCG adicionais, também em duplicado, para controlos e amostras de paciente. Opcionalmente, rotular dois tubos T lisos de poliestireno (não revestidos) 12x75 mm (contagens totais) em duplicado, e separá-los até à etapa 6.

Calibrador HCG mIU/mL 3ª NI 75/537

HCG mIU/mL 2ª NI 61/6

T* — —

A (NSB) 0 0

B 5 5

C 25 25

D 50 50

E 100 100

F 250 250

G ("MB") 500 500

* Opcional

2 Pipetar 100 µL de cada calibrador, controlo e amostra de paciente para os tubos preparados. Pipetar directamente para a base dos tubos. As amostras de paciente que se preveja contenham níveis de HCG superiores a 500 mIU/mL deverão ser adequadamente diluídas com o calibrador zero antes do ensaio. Usar uma micropipeta de ponta descartável, substituindo a ponta entre amostras, a fim de evitar erros por contaminação. Pipetas de transporte e pipetadores-diluidores automáticos deverão ser usados apenas se a possibilidade de contaminação tiver sido avaliada e considerada como não significativa.

3 Adicionar 100 µL de Tampão de Ensaio HCG a cada tubo. Pipetar directamente para a base dos tubos. Recomenda-se um dispensador de repetição (Nichiryo ou equivalente) para esta etapa, bem

como para a adição do marcador na etapa 6.

4 Misturar durante 30 minutos num agitador mecânico. Para o Procedimento Qualitativo, 15 minutos é suficiente.

5 Decantar e drenar cuidadosamente. Adicionar 2,0 mL de Solução de Lavagem Tamponizada a cada tubo. Esperar 1 a 2 minutos, e de seguida, decantar e drenar cuidadosamente. Removendo todo o líquido remanescente melhora-se bastante a precisão. Após a lavagem, decantar o conteúdo de todos os tubos usando um dispositivo de decantação de espuma. Eliminar todas as gotas residuais com papel absorvente.

6 Adicionar 100 µL de Anticorpos 125I HCG a cada tubo. Adicionar o marcador I 125 no espaço de 10 minutos após pipetar os calibradores, controlos e amostras. Deixar os tubos T para as contagens (nº 9); não necessitam mais processamento.

7 Misturar durante 30 minutos num agitador mecânico. Para o Procedimento Qualitativo, 15 minutos é suficiente.

8 Decantar e drenar cuidadosamente. Adicionar 2,0 mL de Solução de lavagem Tamponizada a cada tubo. Esperar 1 a 2 minutos, de seguida, decantar e drenar cuidadosamente. Adicionar novamente 2,0 mL de Solução de Lavagem Tamponizada, esperar 1 a 2 minutos, e Decantar vigorosamente. Removendo todo o líquido remanescente melhora-se bastante a precisão. Após a segunda lavagem, decantar o conteúdo de todos os tubos (à excepção dos tubos T) usando um dispositivo de decantação de espuma e deixar drenar durante 2 ou 3 minutos. Eliminar todas as gotas residuais com papel absorvente.

9 Contar durante 1 minuto num contador gama. Em contadores gama de cabeça múltipla, os tubos de Contagem Total (opcionais) deverão ser separados


dos restantes tubos de ensaio pelo menos um espaço, a fim de minimizar o risco de derrame.

Procedimento Qualitativo O procedimento Qualitativo representa uma simplificação do Procedimento Quantitativo, na medida em quel é usado um único ponto de referência em vez de uma curva de calibragem completa. Isto permite determinar se uma amostra de soro ou plasma apresenta uma concentração de HCG inferior ou superior a 25 mIU/mL, dentro da precisão do ensaio. As amostras que se preveja que contenham níveis elevados de HCG deverão ser submetidas a ensaio com as diluições apropriadas segundo o Procedimento Quantitativo completo acima descrito. 1 Rotular dois Tubos C Revestidos com

Anticorpos HCG, para a referência positiva de 25 mIU/mL. Rotular Tubos Revestidos a Anticorpos HCG adicionais, também em duplicado, para controlos e amostras de paciente. Opcionalmente, rotular dois tubos T lisos de poliestireno (não revestidos) 12x75 mm (contagens totais).

Calibrador HCG mIU/mL 3ª NI 75/537

HCG mIU/mL 2ª NI 61/6

T* — —

C (Referência) 25 25

* Opcional

Prosseguir agora com o Procedimento Quantitativo acima descrito (etapas 2 a 9). O tempo de incubação das etapas 4 e 7 pode ser reduzido para 15 minutos.

Cálculos e Controlo de Qualidade

Procedimento Quantitativo Para calcular concentrações de HCG a partir de uma representação log-log da curva de calibração, começar por corrigir as contagens por minuto (CPM) de cada par de tubos subtraindo a CPM média dos tubos de ligação não específica (calibrador A): Contagens reais = (Média CPM) minutos (Média NSB CPM)

De seguida, determinar a percentagem de ligação (relativa à do calibrador mais elevado) – aqui designada "%B/MB" – de cada par de tubos como uma percentagem da "ligação máxima," com as contagens corrigidas com NSB do calibrador mais elevado consideradas como 100%: Percentagem de Ligação = (Contagens reais / Contagens MB reais) × 100

Usando papel milimétrico log-log de 3 ciclos, representar a Percentagem de Ligação relativamente à Concentração para cada um dos calibradores diferentes de zero, e desenhar uma curva aproximando a trajectória destes pontos. (Ligar os pontos de calibração com arcos ou segmentos de linha recta. Não tentar aplicar uma única linha recta aos dados.) Podem então calcular-se por interpolação a partir da curva de calibração as concentrações de HCG para controlos e amostras desconhecidas dentro da gama dos calibradores diferentes de zero. Uma representação adicional da Percentagem de Ligação relativamente à Concentração para os três ou quatro calibradores mais baixos em papel milimétrico linear-linear pode ser usada para interpolação próximo da dose zero. Observações: Embora sejam aceitáveis outras abordagens, a redução de dados pelo método acabado de descrever oferece certas vantagens do ponto de vista do controlo da qualidade. Em particular, produz uma curva de calibração relativamente linear tanto em representações log-log como linear-linear, e relativamente estável de ensaio para ensaio. Produz igualmente parâmetros de CQ úteis, tais como valores de Percentagem de Ligação (%B/MB) para os calibradores diferentes de zero. Pode obter-se um gráfico ainda mais informativo, que veicula uma ideia de reprodutibilidade intra-ensaio como função da concentração, representando directamente os valores da Percentagem de Ligação de tubos de calibrador individuais, ou seja, sem ter de calcular primeiro a média da CPM das réplicas. Alternativas: Embora a Percentagem de Ligação possa ser calculada directamente a partir da CPM Média, a correcção da ligação não específica produz normalmente uma curva de calibração


mais linear em toda a sua amplitude. Também é possível gerar uma curva de calibração representando directamente a CPM ou a CPM Média relativamente à Concentração em papel milimétrico log-log ou linear-linear. (Não deve ser usado papel milimétrico semi-logarítmico). Esta abordagem tem a vantagem de ser mais simples, mas é menos recomendável do ponto de vista do controlo da qualidade. Redução de Dados Computadorizados: Os métodos “ponto-a-ponto”, incluindo as aproximações lineares e por spline cúbico, são adequadas; todavia, uma vez que fornecem pouca ajuda na monitorização da fiabilidade de um ensaio, é importante preparar a representação log-log recomendada da curva de calibração, manualmente ou por computador, como etapa do controlo da qualidade. As técnicas de redução de dados baseadas no modelo logístico poderão também ser aplicadas. Nesta família, as rotinas de aproximação de curvas baseadas em logística de 4 ou 5 parâmetros são as possibilidades mais adequadas. Deve contudo, ter-se em atenção que alguns algoritmos actualmente utilizados não convergem com êxito, mesmo quando o modelo de logística é fiel aos dados. Se for adoptado um método logístico, é essencial verificar a sua adequabilidade para o ensaio de cada dia, monitorizando o cálculo de confirmação dos calibradores e outros parâmetros. Além disso, é altamente recomendada uma representação da curva de calibração em log-log, já que é mais informativa do que a representação semi-logarítmica convencional. Manuseamento das Amostras: Devem ser criteriosamente observadas as instruções de manuseamento e armazenamento das amostras de paciente. Diluir as amostras de paciente que se preveja que contenham concentrações de HCG superiores às do calibrador mais elevado (500 mIU/mL) com o calibrador zero antes do ensaio. Todas as amostras, incluindo os calibradores e controlos, deverão ser submetidas a ensaio pelo menos duplo. É importante usar uma micropipeta de ponta descartável, substituindo as pontas entre as amostras, a fim de evitar contaminação. Pipetas de transporte e pipetadores-diluidores automáticos

deverão ser usados apenas se a possibilidade de contaminação tiver sido avaliada e considerada como não significativa. Os pares de tubos de controlos podem ser espaçados ao longo do ensaio a fim de verificar a ausência de desvio significativo. Analisar os resultados relativamente à concordância entre os pares de tubos. Contador Gama: Para minimizar a possibilidade de derrame em contadores gama de reservatório múltiplo, os tubos opcionais de contagens totais (T) deverão ser separados por um ou mais espaços dos restantes tubos do ensaio. Alternativamente, adicionar apenas 25 µL do marcador a cada um dos tubos T na etapa 6, e multiplicar por 4 as contagens por minuto observadas nestes tubos. Controlos: Os controlos ou os pools de soro ou plasma de paciente com pelo menos dois níveis de concentração de HCG (baixo e elevado) devem por rotina ser submetidos a ensaio como amostras desconhecidas, e os resultados devem ser representados em gráfico de dia para dia de acordo com o procedimento descrito em Westgard JO, et al. Um gráfico de regras múltiplas para controlo de qualidade. Clin Chem 1981; 27:493-501. A repetição das amostragens constitui uma ferramenta adicional útil para monitorizar a precisão inter-ensaios. Parâmetros de CQ: Recomendamos o acompanhamento destas medições de desempenho: T = Contagens Totais (como contagens por minuto)

%NSB = 100 × (Média Contagens NSB / Contagens Totais)

%MB = 100 × (Contagens reais / Contagens Totais)

E os valores de Percentagem de Ligação ("%B/MB") de todos os calibradores excepto do calibrador diferente de zero mais elevado, por exemplo: %C/MB = 100 × (Contagens Líquidas Calibrador "C" / Contagens Líquidas MB)

Manutenção de Registos: È boa prática laboratorial registar para cada ensaio o número do lote dos componentes usados, bem como as datas de quando foram primeiro reconstituidas ou abertas.


Literatura Adicional: Ver Dudley RA, et al. Guidelines for immunoassay data reduction. Clin Chem 1985;31:1264-71. Exemplo de Ensaio, Procedimento Quantitativo: Apenas para ilustração, não para calcular resultados de outro ensaio. (Ver tabela "Exemplo de Ensaio, Procedimento Quantitativo".)

Procedimento Qualitativo Se as contagens por minuto (média) para os tubos de amostras de paciente forem inferiores às contagens por minuto (média) do calibrador C, a amostra conterá menos de 25 mIU/mL de HCG, dentro da precisão do ensaio. Se as contagens da amostra de paciente forem superiores às do calibrador C, a amostra conterá mais de 25 mIU/mL de HCG, dentro da precisão do ensaio. Relação com a Gravidez: Concentrações superiores ao valor de 25 mIU/mL podem ser consideradas como resultado positivo de gravidez, desde que tenham sido excluídas outras causas de níveis elevados de HCG, ex. Neoplasia trofoblástica e não trofoblástica, gravidez ou aborto espontâneo recente, e outras.4,9,10,16 Concentrações inferiores ao valor de 25 mIU/mL devem ser esperadas em amostras de indivíduos do sexo masculino saudáveis e indivíduos do sexo feminino fora da gravidez. (Ver Valores Esperados abaixo.) Concentrações inferiores a 25 mIU/mL são também esperadas em indivíduos do sexo feminino numa fase inicial da gravidez em que a concentração de HCG não tenha ainda atingido o nível de decisão definido para o procedimento qualitativo. Submeter a ensaio nova amostra recolhida dois ou mais dias mais tarde deverá produzir um resultado decisivo, uma vez que se prevê que em estados iniciais de gravidez o nível de HCG duplique dentro deste período aproximadamente.11 Controlo de Qualidade: Analisar as contagens por minuto de todas as amostras para verificar a concordância entre os pares de tubos. Os controlos, ou os pools de amostras de paciente (soro ou plasma), com concentrações de HCG superiores ou inferiores ao valor de referência 25 mIU/mL (calibrador C) devem ser por rotina submetidos a ensaio como amostras desconhecidas. Outros

calibradores fornecidos com o kit – especificamente, os calibradores de 5 e 50 mIU/mL (B, D) – podem ser processados como controlos adicionais. Recomendamos que sejam acompanhadas as contagens por minuto da referência (calibrador C) e dos controlos como uma percentagem das contagens totais, ex. %C/T = 100 × (Contagens Médias do Calibrador "C" / Contagens Totais Médias)

Uma prática comum para determinar as médias e amostragens coriónicas intra-ensaio, com base em contagens, para várias réplicas, cada uma delas de baixo controlo, um controlo elevado e o calibrador C podem prestar um auxílio adicional na monitorização da fiabilidade dia a dia do ensaio. Exemplo de Ensaio: Apenas para ilustração, não para calcular resultados de outro ensaio. (Ver tabela "Exemplo de Ensaio, Procedimento Qualitativo".)

Valores de Referência As amostras de soro de 47 indivíduos do sexo masculino saudáveis e 38 indivíduos do sexo feminino fora da gravidez foram analisadas segundo o procedimento Coat-A-Count HCG IRMA com os seguintes resultados: 95% dos valores dos indivíduos do sexo masculino foram inferiores a 1,0 mIU/mL 90% dos valores dos indivíduos do sexo feminino foram inferiores a 3 mIU/mL 100% de todos os valores (indivíduos do sexo masculino e feminino) foram de 5 mIU/mL ou inferiores Os resultados são consistentes com um limite superior dos valores normais de cerca de 5 mIU/mL fora da gravidez. No entanto, os laboratórios deverão considerar estes resultados apenas como orientação. Num outro estudo, foram submetidas a ensaio 286 amostras de soro de indivíduos do sexo feminino com idade gestacional conhecida segundo o procedimento Coat-A-Count HCG IRMA. A idade gestacional foi classificada por semanas depois do primeiro dia do último período menstrual (UPM). Os resultados foram os seguintes:


Mediana Gama Absoluta 95% Gama

4 semanas Depois UPM (n=5)

291 196 – 3 537

5 Semanas Depois UPM (n=12)

4 117 1 026 – 30 964

6 Semanas Depois UPM (n=23)

18 897 4 250 – 81 172

7 – 8 Semanas Depois UPM (n=40)

54 266 6 002 – 114 430


48 841 18 344 – 98 807

11 – 14 semanas Depois UPM (n=52)

50 841 21 874 – 120 766

15 – 22 semanas Depois UPM (n=67)

16 418 4 106 – 57 393


11 872 2 468 – 36 142

As amostras de série de indivíduos do sexo feminino nas primeiras 2 a 5 semanas de gravidez mostraram períodos de duplicação das concentrações de HCG entre 1,5 e 3 dias, com um tempo de duplicação médio de 2,2 dias. Considere estes limites apenas como directrizes. Cada laboratório deve estabelecer os seus próprios valores de referência.

Características do Ensaio As secções seguintes contêm dados representativos do desempenho do kit Coat-A-Count HCG IRMA. Nas secções abaixo, os resultados de HCG são expressos em milli-Unidades Internacionais de HCG por mililitro (mIU/mL). Calibração: Até 500 mIU/mL (3ª NI 75/537 e 2ª NI 61/6). Normalização: O ensaio apresenta uma gama de calibração de 5 a 500 mIU/mL no procedimento quantitativo. O calibrador de 25 mIU/mL funciona como referência positiva no procedimento qualitativo. O ensaio é normalizado segundo a terceira Norma Internacional para HCG (3ª NI 75/537) da Organização Mundial de Saúde, e também de acordo com a Segunda Norma Internacional para HCG (2ª NI 61/6).

Sensibilidade Analítica: 0,3 mIU/mL, Efeito Hook de Alta Dose: nenhum até 1 000 000 mIU/mL. Precisão Intra-ensaio (Entre ensaios): Foram calculadas estatísticas para amostras a partir dos resultados de 20 pares de tubos num único ensaio. (Consulte a tabela “Precisão Intra-ensaio".) Precisão Inter-ensaio (Ensaio a ensaio): Foram calculadas estatísticas para amostras a partir dos resultados de pares de tubos em 20 ensaios diferentes. (Consulte a tabela “Precisão Inter-ensaio".) Efeito fim-de-série: Nenhum até aproximadamente 350 tubos. (Ver tabela "Efeito fim-de-série".) Linearidade: As amostras foram doseadas sob várias diluições. (Consulte a tabela "Linearidade" para dados representativos.) Recuperação: Foram submetidas a ensaio amostras a que foram adicionadas três HCG (200, 1 000, e 5 000 mIU/mL) na proporção de 1 para 19. (Ver tabela de "Recovery" para dados representativos.) Especificidade: O anticorpo usado no procedimento Coat-A-Count HCG IRMA é altamente específico para HCG intacta, com baixa reactividade cruzada com outras hormonas de glicoproteína presentes em amostras de paciente. Foram adicionadas diferentes quantidades de FSH, LH e TSH a um espécimen de paciente contendo 23,3 mIU/mL de HCG. A amostra foi submetida a ensaio com e sem adição segundo o procedimento Coat-A-Count HCG IRMA. (Ver tabela "Especificidade 1".) As subunidades alfa e beta da HCG foram também estudadas. A -subunidade β de HCG (OMS 75/551), foi adicionada no calibrador zero do Coat-A-Count HCG IRMA. (Ver tabela "Especificidade 2".)

A subunidade α de HCG (OMS 75/569), foi adicionada no calibrador zero do Coat-A-Count HCG IRMA. (Ver tabela "Especificidade 3".) Bilirrubina: A presença de bilirrubina em concentrações até 200 mg/L não tem efeito em resultados, dentro da precisão do ensaio.


Hemólise: A Presença de eritrocitos em concentrações até 30 µL/mL não tem efeito no resultado, dentro da precisão do ensaio. Tipo de amostra alternativa: Para determinar o efeito de amostras alternatives, foi colhido sangue de 20 voluntários em tubos secos, com EDTA, heparinizados e tubos de vacum SST® da Becton Dickinson. Todas as amostras foram ensaiadas pelo método Coat-A-Count HCG IRMA, com os seguintes resultados. (EDTA) = 1,00 (Soro) – 0,5 mIU/mL r = 0,996

(Heparina) = 1,04 (Soro) + 0,3 mIU/mL r = 0,994

(SST) = 0,98 (tubos simples) + 1,65 mIU/mL r = 0,993

Médias: 101 mIU/mL (Soro) 106 mIU/mL (Heparina) 101 mIU/mL(EDTA) 101 mIU/mL (SST)

Comparação de Métodos: O procedimento Coat-A-Count HCG IRMA foi comparado com outros ensaios imunoradiométricos para HCG (Kit A) e também com um radioimunoensaio HCG (Kit B) em 48 amostras de paciente. As amostras apresentavam níveis de HCG entre 5 e 500 mIU/mL. A análise de regressão linear produziu os seguintes dados estatísticos (CAC IRMA) = 1,19 (Kit A) + 0,9 mIU/mL r = 0,998

Médias: 217 mIU/mL (Coat-A-Count IRMA) 182 mIU/mL (Kit A)

(CAC IRMA) = 1,25 (Kit B) – 24,4 mIU/mL r = 0,983

Médias: 217 mIU/mL (Coat-A-Count IRMA) 193 mIU/mL (Kit B)

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Origin: US

Siemens Healthcare Diagnostics Inc.Los Angeles, CA 90045 USA

Siemens Healthcare Diagnostics Ltd.Sir William Siemens Sq. Frimley, Camberley, UK GU16 8QD

2010-11-01

PIIKCG – 9

Changes in this Edition: cc#19759: Removed IKCG2 and IKCG5 kit sizes and all associated component sizes and radioactivity information. In Materials Required But Not Provided section, added FDR catalog number for foam decanting rack; removed “available from Siemens” claim for graph paper ZPIRM, rack shaker DPSR1/DPSR2, and 2 mL dispenser DB2ML. Removed Technical Bulletin ZJ019 from Further Reading section. Minor editing: Corrected kit name in English Alternate Sample Type section.

Understanding the Symbols Understanding the Symbols En English

Erklärung der Symbole De Deutsch

Descripción de los símbolos Es Español

Explication des symboles Fr Français

Comprensione dei simboli It Italiano

Descrição dos símbolos Pt Português

The following symbols may appear on the product labeling: / Die folgenden Symbole können auf dem Produktetikett verwendet werden: / Los siguientes símbolos pueden aparecer en la etiqueta del producto: / Les symboles suivants peuvent apparaître sur les étiquettes des produits : / Sull'etichetta del prodotto possono essere presenti i seguenti simboli: / Os seguintes símbolos podem aparecer no rótulo dos produtos:


Symbol Definition

En: In vitro diagnostic medical device De: Medizinisches Gerät zur In-vitro Diagnose Es: Dispositivo médico para diagnóstico in vitro Fr: Dispositif médical de diagnostic in vitro It: Dispositivo medico per diagnostica in vitro Pt: Dispositivo médico para diagnóstico in vitro

En: Catalog Number De: Katalog-Nummer Es: Número de referencia Fr: Numéro de référence catalogue It: Numero catalogo Pt: Número de catálogo

En: Manufacturer De: Hersteller Es: Fabricante Fr: Fabricant It: Produttore Pt: Fabricante

En: Authorized Representative in the European Community De: Autorisierte Vertretung in der Europäischen Union Es: Representante autorizado en la Unión Europea Fr: Représentant agréé pour l’Union européenne It: Rappresentante autorizzato nella Comunità europea Pt: Representante Autorizado na Comunidade Europeia

En: CE Mark De: CE-Kennzeichen Es: Símbolo de la CE Fr: Marque CE It: Marchio CE Pt: Marca CE

En: CE Mark with identification number of notified body De: CE-Kennzeichen Identifikationsnummer der benannten Stelle Es: Marca de la CE con número de identificación del organismo notificado Fr: Marque CE avec numéro d’identification du corps notifié It: Marchio CE con numero identificativo dell'ente notificato Pt: Marca CE, com número de identificação do órgão notificado

Symbol Definition

En: Consult instructions for use De: Bedienungshinweise beachten Es: Consulte las instrucciones de uso Fr: Consulter le mode d’emploi It: Consultare le istruzioni per l'uso Pt: Consulte as instruções de utilização

En: Caution! Potential Biohazard De: Vorsicht! Biologisches Risikomaterial Es: ¡Precaución! Peligro Biológico Potencial Fr: Avertissement ! Risque biologique potentiel It: Attenzione! Potenziale Pericolo Biologico Pt: Precaução! Potenciais Riscos Biológicos

En: Radioactive Materials De: Radioaktives Material Es: Materiales radiactivos Fr: Matériaux radioactifs It: Materiali radioattivi Pt: Materiais Radioactivos

En: Caution De: Vorsicht Es: Precaución Fr: Avertissement It: Attenzione Pt: Precaução

En: Temperature limitation (2–8°C) De: Temperaturgrenze (2–8°C) Es: Limitación de la temperatura (2–8°C) Fr: Limites de température (2–8°C) It: Limiti di temperatura (2–8°C) Pt: Limites de temperatura (2–8°C)

En: Upper limit of temperature (≤ -20°C) De: Obere Temperaturgrenze (≤ -20°C) Es: Limitación superior de la temperatura (≤ -20°C) Fr: Limite supérieure de température (≤ -20°C) It: Limite superiore di temperatura (≤ -20°C) Pt: Limite máximo de temperatura (≤ -20°C)


Symbol Definition

En: Lower limit of temperature (≥2°C) De: Mindesttemperatur (≥2°C) Es: Temperatura maxima (≥2°C) Fr: Limite inférieure de température (≥2°C) It: Limite inferiore di temperature ( ≥2°C) Pt: Limite inferior de temperatura (≥2°C)

En: Do not freeze (> 0°C) De: Nicht einfrieren (> 0°C) Es: No congelar (> 0°C) Fr: Ne pas congeler (> 0°C) It: Non congelare (> 0°C) Pt: Não congele (> 0°C)

En: Keep away from sunlight De: Vor Sonneneinstrahlung schützen Es: Mantener protegido de la luz solar Fr: Maintenir hors de portée de la lumière du soleil It: Non esporre alla luce del sole Pt: Manter protegido da luz solar

LOT

En: Batch code De: Chargenbezeichnung Es: Código de lote Fr: Numéro de code du lot It: Codice lotto Pt: Código de lote

En: Contains sufficient for (n) tests De: Es reicht für (n) tests Es: Contiene material para (n) pruebas Fr: Suffisant pour (n) tests It: Contiene materiale sufficiente per (n) test Pt: Contém o suficiente para (n) testes

2008-01 En: Date format (year-month) De: Datumsformat (Jahr-Monat) Es: Formato de fecha (año-mes) Fr: Format de la date (année-mois) It: Formato data (anno-mese) Pt: Formato de data (ano-mês)

En: Use by De: Verwendbar bis Es: Fecha de caducidad Fr: A utiliser avant It: Usare entro Pt: Use até

Symbol Definition

En: Harmful De: Gesundheitsschädlich Es: Nocivo Fr: Nocif It: Nocivo Pt: Nocivo

En: Corrosive De: Ätzend Es: Corrosivo Fr: Corrosif It: Corrosivo Pt: Corrosivo

En: Toxic De: Giftig Es: Tóxico Fr: Toxique It: Tossico Pt: Tóxico

En: Dangerous for the environment De: Umweltgefährlich Es: Peligroso para el medio ambiente Fr: Dangereux pour l'environnement It: Pericoloso per l'ambiente Pt: Perigoso para o ambiente

meditecno.ptmeditecno.pt/upload/product/archive/hcg_irma,_coat-a-count_-_…meditecno.pt

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