chitin synthesis and inhibition: a revisit

5
Chitin synthesis and inhibition: a revisit Ephraim Cohen* Department of Entomology, Faculty of Agricultural, Food and Environmental Sciences, The Hebrew University of Jerusalem, Rehovot 76-100, Israel Abstract: Chitin is an abundant biologically important aminopolysaccharide composed of N-acetyl-D- glucosamine units. Individual polymers, which are synthesized intracellularly by chitin synthase CS), a membrane-bound glycosyl transferase, are translocated across the plasma membrane and coalesce to form rigid crystallites. These crystallites, inter alia, are integral parts of septa and cell walls in yeast and ®lamentous fungi, respectively, and of cuticles in invertebrates, notably crustaceans and insects. Despite decades of intensive research, many events associated with the complexity of chitin formation and deposition are still obscure, or only partially understood. The list includes the hormonal control of CS at the transcriptional and translational levels as well as the post-translational CS packaging; traf®cking and guidance of CS clusters to proper sites in the cells and their intricate insertion into the plasma membranes; activation of the catalytic step and its control or modulation; and translocation of chitin chains across cell membranes, their orientation, ®brillogenesis and association with other extracellular structural components such as polysaccharides fungi) and cuticular proteins insects). Also the precise biochemical lesions in¯icted by CS inhibitors, such as the acylurea insect growth regulators, are largely unclear. The recent isolation and sequencing of insect CS genes should help in elucidating various aspects of chitin biochemistry and inhibition. In particular, the large number of transmembrane segments, characteristic of the insect CS, are speculated to be involved in chitin translocation and are expected to shed light on the mode of action of acylurea insecticides. # 2001 Society of Chemical Industry Keywords: chitin; chitin synthesis; chitin synthase; chitin synthesis inhibitors 1 INTRODUCTION Cellulose and chitin are the most copious polysac- charides in the biosphere. Both biopolymers in their ®brillar crystallite) form contribute strength and rigidity to structural elements and serve as mechanical support and useful protective barriers in either cell walls of plants, ferns, algae and fungi or in exoskele- tons of arthropods. Chitin is produced in abundance by invertebrates, notably arthropods insects, crusta- ceans), and to a minor extent in molluscs, annelids and nematodes eggs). It is an integral component in cell walls of fungi except in Oomycetes) but is absent from plants and vertebrates. This taxonomic difference provides the rationale for considering chitin as a safe and largely selective target for pest control agents. 1 Insecticidal acylurea molecules, which act as highly potent inhibitors of chitin synthesis, have been commercialized and applied against a variety of insect pests. It is rather surprising that, although these bioactive molecules were introduced almost three decades ago, their exact mechanism of biochemical lesion has not been resolved. Conceivably, this failure resides in a lack of in-depth knowledge about chitin synthesis and deposition, and is due in particular to sketchy information concerning post-catalytic events. This situation may change in light of the recent cloning and sequencing of the insect gene that encodes the chitin polymerizing protein. 2 CHITIN FORMATION Formation of chitin and its deposition is a highly complex, multi-faceted inter-connected series of bio- chemical and biophysical events which starts intracel- lularly and ends in the inclusion of chitin in exterior supra-macromolecular structures such as cuticles and peritrophic membranes in arthropods or cell walls in fungi. Fig 1). The cascade of events encompasses: a) Sequential biotransformations of sugars such as trehalose or glucose that include phosphorylation, amination and formation of the substrate UDP-N- acetylglucosamine b) Synthesis of chitin synthase CS) units, followed by their translocation, proper insertion into plasma membranes and activation. A CS unit is (Received 30 November 2000; revised version received 20 March 2001; accepted 4 May 2001) * Correspondence to: Ephraim Cohen, Department of Entomology, Faculty of Agricultural, Food and Environmental Sciences, The Hebrew University of Jerusalem, Rehovot 76-100, Israel E-mail: [email protected] Based on a paper presented at the Conference ‘Insect Toxicology 2000’, organized by John E Casida and Gary B Quistad, and held at the University of California at Berkeley, USA, on 17–19 July, 2000 # 2001 Society of Chemical Industry. Pest Manag Sci 1526±498X/2001/$30.00 946 Pest Management Science Pest Manag Sci 57:946±950 2001) DOI: 10.1002/ps.363

Upload: ephraim-cohen

Post on 06-Jul-2016

212 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

���� ����� ��� ������ ���� ���� �� -.(431240/ �.//$�+"!( $/�$//.7���919

Chitin synthesis and inhibition: a revisit†Ephraim Cohen�Department of Entomology, Faculty of Agricultural, Food and Environmental Sciences, The Hebrew University of Jerusalem,Rehovot 76-100, Israel

(Rec

� CoUnivE-ma† BasUniv

� .

��������� ���� �� �� �� ����� ������������ ��������� ������������������ �������� �������������

�� �������� ����� ������� �� ��������� ��� ��� ���������� ��������� ����� �� ����� ������� � !�

� ����������� �� �������� ������������ ��� ������������ ������ �� ������ �������� ��� ��������

�� ���� ����� ������������� "��� ������������� ����� ����� ��� �������� ����� �� ����� ��� ���� ����� �� �����

��� #������� � � ���� ������������� ��� �� � ������ �� �������������� ������� �� �������� ��� ��������

������� ������� �� ��������� �������� ���� ������ ���������� ��� �� ������$��� �� ����� ���������

��� ���������� ��� ����� ���� ��� �� ���� ��������� ���������� "� ���� ���� ��� �� ������� ������� ��

�� �� ��������������� ��� ������������� ������ �� ���� �� �� ������������������ ���%�����&

����#�%��� ��� � ������ �� �� ����� �� ������ ����� �� �� ����� ��� ���� ��������� ��������� ���� ��

������ ���������& ���������� �� �� ��������� ���� ��� ��� ������� �� ��� ������& ��� ������������� ��

����� ����� ������ ���� ���������� ���� ������������ #������������� ��� ����������� ��� ����

�$������� ��� ��� �� ��� ���������� � � �� �������������� �� ���! ��� � ��� ��� �������� ��������!�

���� �� ������� ���������� ������� ��'����� �� ���������� � � �� �� ���� ��� ������ �����

��� ������� ��� ������� ������� "� ������ ��������� ��� ��( ������ �� ������ ����� �� �� ��� ��

�� �������� ����� � ������� �� ����� ����������� ��� ���������� �� ������ ���� �� ����� � ���� ��

������������� ��������� ������������� �� �� ������ � ��� ���� ����� �� �� �������� �� �����

������������� ��� ��� �$������ �� ��� ���� �� �� ���� �� ������ �� ���� ��� �������������

� )**+ ������ �� ������ ��� ����

,�������� ������� ������ ��������� ������ ������� ������ �������� �������� �

1 INTRODUCTION������� �� ������ �� ���� ������� �������

�� ��� �� �� ������ � ���� �������� � �� ���

�� ��� �� �������� �� � ���� ���� �� ���� ��

������� �� �� ���� � ����� �� � � � �������

����� � �� ����� � ������ � � � �� ��� ���

���� �� ������ � ��� �� �� ����� � �� ��� ��

���� �� �� ������ ������ �� � ����� �� ������

�� ��� �� ��� ������ �� ����� �������� � ����

����� �� �� ���� ���� �� ��������� ������ ��

������ ������ !� �� � ���� � �������� �� ���

���� �� ����� ����� �� "������� ��� �� ���� � ��

����� �� � �� ��� #��� �������� ���� ��

� ����� �� ����� �� ������ ��� ������ � ��

�� � ��� ������ � �� �� ��� ���� �� �����$

!��������� ���� �������� ����� �� � ������

����� �������� � �� ������ ��������� �� ��

���� ����%� �� ����� ����� � ��� �� �����

����� !� �� �� �� � ����� ���� ������� ���

������� ������� � ��� ����� ����� ��

���� ��� ��� ��� ������� �� ���������

����� �� ��� �� ������ ���������� ���� ����

���� �� �� �� ������� ������ ���� ������

eived 30 November 2000; revised version received 20 March 2001; a

rrespondence to: Ephraim Cohen, Department of Entomology, Facuersity of Jerusalem, Rehovot 76-100, Israelil: [email protected] on a paper presented at the Conference ‘Insect Toxicology 2000

ersity of California at Berkeley, USA, on 17–19 July, 2000

//$ )����� �� ������ !����� �� ���� ���� �� $0.1234567.

�������� �� ���������� �� �� �� �� � ����� ��

� ���� ���� ����� ���� ���� ������������ �����

#��� ���������� ���� �� ����� �� �� ��� �������

�� �&������ �� �� ����� �� ��� ����� ��

������ ����� �%��� � �����

2 CHITIN FORMATION'� ����� �� ������ �� ��� ��������� �� ������

������� ���������� ��� �������� � �� �� ����

������ �� ���������� ���� ����� �� �� ��� ���

��� �� �� ��� �� �� ��������� �� ������ �� �� ��

��� ��� ������� �� ���� � ���� � ������� ��

� �� ����� ��� �� �� �� ����� � ��� ���� ��

������ �'�� $�� #� ���� �� ���� ��������(

�� )&����� ���� ���� ������ �� ��� � ���� �

� ���� � ������ ��� ������ ������� �������

������� �� �� ����� �� �� ����� � *+,����������������

��� )������� �� ������ ������ ��)� ������ �������

�� ��� � ���������� � �� ��� ���� ����

���� ��� �� �� ��������� - �) ���� ��

ccepted 4 May 2001�

lty of Agricultural, Food and Environmental Sciences, The Hebrew

’, organized by John E Casida and Gary B Quistad, and held at the

//$789/�// 431

Figure 1. Events associated with chitinformation and deposition. (?)=exactmechanism unknown.

������ ��������� ��� ����������

�� �%�� ������ ����� �� � � �� ����� ��

������ ������������ �� � �������� #���

����� ������� ��� � ������� ��

����� ������ ����� � ���� � ������� �� ��

��� #� ������� ��� �� � ������� �� �� �����

���� ������ �������

��� #� � ��������� �� ����� � � ��� �� ����

��� �

�� � ������%���� �� ��� ��� �� �� ����� �� ��� �

���� ��� ��� �������

��� -��������� ���� ������� � ����� �� �� �����

� � ����� �� �� �� ����� ��� ����

, � �� �� ������ ���� ���� ������ �������� ��

��� �� ����� � �� ��������� ����� �)

������� -� �� � ����� �� ������ �� �����

�������� �� �� �� �� ������� �� �� ���� ��

� � ����������� ���� ����� �������

)�� �� �� � ����� ��� ��� ���� ���� � ��

�� ���� �������� �� �) ������ �� � �� ������

����� ��� �� ������� �� ����� #� ����

�������%� %������� �) �� � ����������� ����

���.�9 �� �� �� ���� ��� ������� �%��

�� ����� � �� ���� �� ������ ��� �� ���� ������� �� ������� ������2�������� ������ � �����

�� �� �%���9�3 :� ���������� �������� � ��

������� �� ����� �� ����� �� ������ ���� ��

���� �����

���� ���� �� ���431240/ �.//$�

2.1 Trafficking and insertion of CS units���������� ��� ������� �� �� ���������� ����

�) ������� �� �� ������� �� �� ���� ��

��� �� ��� ������ ������ ���� ����� �������0�1

#� ������ �� ���� ��������� ������ � ��

����� ���; ������� ��� �� �� �� � ��� ��� �� �)

����� �� ������ ��������� #�� ������� �����

� ����� � �� �� ��������� ������� �� ��

<����� ������ %������� �) ����� �� #� ���������

������� ��� ���� �� ���� ��� � �� �� �)

����� � ����������� �������9 #� �� ������ ��

�� ����� ���� �� �� �� ������ � ��������� � ���

�� ��� ��� ��� ���� ������� �������

���� � ����� �%���� ����� ��������� � �� ��

��� ������ ���� �� ���� ��� ���5 *��� ����

������� �� ������ ����� � �� ���� �� ������

��� ����� ������ �� ����� !� �� ���� ��� �� ��

�) ��� �� ��� ��� �� �� ������ ���� ���������

�� &��������� � �� ���� ������ �����

��� ���� ������� �� �� ������ � � ����

�� � ������ ���� �� ��������� ������ =� �� �

�� ��% �� �� ����� �� ��� ���� �� �������� � �

� � ������ ����� ��4 !�� ���� �� �) ���� ����

��� ��� � �� � ��������� ������� � ��

��������� ���� ��������� ������� ������� ��

������� �� � ����� �� ��������� � ������ #�

����� � �� �� ��� ������ ���� ���� �� � �����

������� ���� �� ������

43;

Figure 3. Number of publications investigating chitin synthase (CS). g-number of studies on the CS gene and CS gene expression.

�� �����

����������� �� ���� � �� �� ��� �� �� �

����� ����� ������$/ �� �� �� ���� ���� ���

������� �� �� �� ���� ������ �� ������ !� ��

����� ��� ��� �� ����������� ������ �

��� ��� �� ����� ��� �� ����� >��� �� ��� ��

����� ������ ��� ����� ����� � �� ��

���� ��� � ��&��� � �� ���� �� ��� ������ ��

��� �� �����$$�$. #�� �� ����� ��� ��

�� ������ ���� ���� ������ �� ��� � �� ��� ������

�� �����$9 �� � � �� � ����� � �� �)

�%����

#� ����� �) ����� ��� ������ ���� ������

��� ����� ���� �� ����� � ������ �� ����

��� �� ��� �� �� �� �� �� ����� ,��������

����� ��� �� ���� � ��� ���� �� �� �� � ���%�

���� �� ��� � ����������$3 "� �� ������

��� �� ����� ���� �� �������� �� �) � ��� ���

���� � � � ���������������$0 �� ��� ��

�� ��� ����� ���� � �� �������� �� � �������

�� �� �) ����� ������ �� ���� ��� � ��

������� �� ������$1 �� ��� ���� ����� ��

����� ��� � ��� ��� ������ �� ��� ������� ���� �

��������� �� ��������� �������� ������ �������� ��

������ ����� �� � ������$;

2.2 Catalysis������ �'�� .� �� �������� � � ��� ���������

�� ���$23� ��� ��������+���������� ����%� ��

��� ������� ��������� ��� � �������

������� >� .�3�$�$1�� #� ������� ������ ������ �� ����� �� ������%� �� ��� ������ ��� ��

�� �������$5 �� �� ���� ��� ��� �� �������������� ��� ����� �� �� ���� ������ ������ � �����

���� �� �������� �� �� �� ���� � ���� ��������$4

�) ������ � ������ �� ������ ������ �� ��

��� ������� ���� ����������� �� �� ���� ��

�%��� � ��� ���� "��� �� ��� �� �

�� �� �� ����� �) �%��� � ��������� ���

�� �� =���� ����� '�� 9 ��� ��� �� ����

�� ����������� ����� ���� �) ���� $4;/ �� �� ��

$444 �� 0�� ��� ���� #� �?� ��� �� �� �������

����� ���� � ������ ���� �� ����� �%���� �

�� ����� �� ���� �) � �� ����� ������ �� ��

������ -� ��� � �� ������ ���� ���� �) ��

��� � � �� ������� ���� ������� �� �&������

�� �� ����� �) ���� � �� �� ��� �� �� ��

�������� ������./ +� ��� �� � ��� $44$2$440�

���� �� 0/@ �� �� ����������� ��� ���� �� �)

Figure 2. The dimer unit of chitin.

435

��� #��� � ���� ��� �� �� 10@ �� ����

����������� �� ������� $4412$444� >��� �� �� ����

�� ����� �) �� � �� ���� ��� ������ ���

����� �� �) ��� � �� ���� �� ������ ��

�� ����� �� #��� �� �� �� � �����.$ #� ���

�&��� ����� ���� ���� ����� �� ����� �)

��� ����� �� ���� �� ����� �� ���� �� �����

�� ����� ����� � ���� "� �� ���� �� �� �����

���� ��� �&��� �� ����� �) ������� ��� ��

������ � ����� � ������ �� ���� ���

����� �� ���� ��� �� �%�� �� �� ����

��� �� #� ���� �� ���� ������ �� �� �����

��� ����� �� ���� � � �$02$5� ��� �� �� �����

����� � �� ������� ��� �� �� � ����� �

������ ����� � ������� �� ��� �� � �� �

�������� �� � "�� ������ ������ ���� ��

������� ������ �������� ����������� ���� �

������� ������ �� � �������� � ������� &�� �

�� �) ���������

#� ������� ������ �� ����� �� ���� ���

�&��� �� ���� �� ���� �� ����� �� ����� �)

�%���� ��� �� ��������� #� ��� �������

�������� �� ����� �� ���� �� �� �������� � ���

�� *+,��������+���������� �� �� �����

������ �� � ����� � ����� � ���� � �����

� � � �� � ��� �� ����� !� �� �� ��������%�

��� �� �� ��� ��� ������ ����� � � � ���

���� ����� &�� � �� �� ���2�� �������

����� �� ����� ��� ���� ��� �� ��� �� ��

������� �����..�.9 #� �� ������� �� ���

�� ���� � �� ������� ���������.3

2.3 Post-catalytic processes,����������� ���� ��� �� ��� ������ ������

�� � ��������� �� ����� � � ��� �� ����

��� ��� !� �� �� �� ������� ������� ���

���� ���� �� ���� � �� �� ��� ��� �����

� % � ��� �����&���.3 �� � ����� � ���

���� �� �� � ���� �� � �� �� ���� �����

� ��������� �� ������� ����� ���� �� -�������

� � ���� �� � ����� � ������ �� �� �����

���� ���� �� ���431240/ �.//$�

������ ��������� ��� ����������

�) �� �������� ����� � ���� ������������ �� ����

�� ���� � � ������ �� ����� �������

!�������� ������ ����� � ������� � ��� ��

���� ��� � ����� �� �� � ��� ��� ���

������ ����� ���� � ��� �� � ������ � � �

�� �� �� �� ������� �� ������� �� ���� �

!�� ����� ��� ��� ������� ���� ����� �

������������ � ����� �� ������ �� � �) �����

������ �� �� �� ����� �� � ������� ��� ��

�� ���� #��� � ���� �� � �������� �� ���������

��� ��� ��� ��� ��� �������� ���� � ����A��

B���� � ������ �� ����� C� �� ����� �� �����

������ � ���� �� ������$1 :� ���� ����� �� ��

����� � �� �������� ������� �� ������� �

��������� �� �� �� � ���������� � �� ��% ��

�� ��� ��� ��� � ���� �� ������� ���������

3 INHIBITION OF CHITIN SYNTHESIS!� �� �� � ����������� ��� �?� � ���� ��

�������� � ��� ������ �� ������ �������� � �� �'��

3�� "� � ���� ����� ������� �� �������� ���

����� �� ���� ��� ����� �� ����� � �������

�� ����������� ������� �� �����.0�.1 �� �����

�)�.; !�� ����� ��� ���������� ����� �� � ��

������� ���� � ����� �� � ������� �� � ���

���������� ������ ,�������� �� ��� � ��

������ ���� ������ � �������� ����� � � ���� �

����%� �� ���� ������ ������������� ������ ��

D��� ��� �� ���������� ��� �� ������� � ��

���� �� ������ �� ����� ��� ����������.;

�� ��� ���� ����%���� � ��������� �� ��������

�� �� ������������

#� ����� � ��� �� ������ � �� �� ������

���� ��������� � ,������ +��� �#� :�� �����

� ����� � �������%��� � ����� �� ���������

���������� �� ��� ���.5 #� ���� � ����� �� �

� ������ ������� ��� �� ������ ������ �����

� �� ���� �� ������� � ������ )��� ��

��� �������� �� ��A���%� �� �+������� � �� � ��

���� ����%� ��������� �� ���� ���� ���� �� ��

������ ������ ���� ��������� �� �� ����

��� �� � ���� ������ ��������

#� ���������� ���� � �� ���&� ��

������� �� ���� ��� �� ������ #�� �� �����

������� �������� �� ������ � � ����� ���� �� ��

�� ����� �� �� ������� �� �� ���� � � � ����

Figure 4. Structures of selected chitin synthesis inhibitors.

���� ���� �� ���431240/ �.//$�

�� ������� �� ������ ������ ���� �� �� �� ��

����� ��� ����� �������� �� �� �� ��� ����� ��

�� � �� ���� ������ � ��� � ��������� ��

���� "� �� ���� �� ��� � �� ��� �� ������

�� ���� �� ����� ���� ������ �� �� �� ��

� � �� ������ ��� ���� �� ����� � ��

� ����� � ���� ����� � �� � ���� �� ��

����������� ���� �� �� �� ���� �� ��� ����

��� � �� ����

)����� ���� ���� �� ��� ������� �� �����

�� �� �� ��������� �� �� ��������� ��

���� � �� � �������� ���� ���� � � ����

������� ������ ������� ���� ��������� �� ��

�) �����3 � �� � ���� � �� ������ �� �)��������

��� ������ �� ���� � ���� �� ���� ��� ��.4

������ �������� �� � ������� ����� �� ����

��������� �� ������ ��� ��� �� ����� ������� -�

������� �� ��� �������� �� ��� ����������. �����

������� ���� � � � ����� �������� "� �?�

���� �� ���� ����� �� ����� �) �� ��� ��

�� � �%�� ������� �������� � ����� �

������� #�� ��� ������� ������ ����� ���

�� �� ������ � ��������� � ��� �� ���� ���

� �� !� �� ������� �� ������ ��� �� � �����

� � ������ ������� �� ���������� �� ������

�������� �� ���� �� -� �� ����� �) �� �� ��

������ � ��� � ��� � ������ ���� �� ����� ��

��������� �� ��� ��������� ����� ������ ��

���� ��

4 CONCLUDING REMARKS������ �������� �� ��������� ���� �� �&�����

� �� �� ��������� ��� ����� �� �� �����

��������� �� ���������� � ���� ������� ��� ��

����� ��� �� ��� ������ C� �� ����� �����

����� �) ��� �� �� ����� ����� ����� �)

����� � � �� ����� �� ��� �� ����� ���� ��

��� ������� �� ��� � ��� �� �� ��� ���

�������� �� �� ��� ������� �%�� � ��� �

�� � ����� ���� � ������� �� � ��������� ��

������ ����� � � ��� �� ���� ��� �� )���

������ �� ���� �������� �� �� ���� ��� ����

�� ����� ��� ���� ��� ��������� ��������� ��

���� ���� �� ����� �� ��� ����� � ��� ��

��� ������ �� � �� ������ �� ����� ��� � ���� ��

������� ������� ����� � ���� ��� ����

���� �� ���� �� ������ ��� ������( �������� ���

���� � �� ������� ���� �� ���� � ����� ��������

�� � �� � ��������� ���� #� ������ �� � ��

���� � �� ������� �� �� �� ����� �� �� �������

������� ���� �� �� ��� � �� �� ���������

� ��� �� ��� � ��� )��� � ��� �� ���� ������

�� �� ������ �������� �� ���� �� �� ���� �

ACKNOWLEDGEMENTS! ��� + C��� #��� �� � ������� ���� �����

���� ���� �� ������� �� �&������ �� �� �����

������ ������ ���

434

�� �����

REFERENCES$ ���� >� >�� ����� �������� � � � ��� �� ��� ���� ��� ��

���������� ��� ������������� � �� ���� D>� >���� )����

,������ �� -��� ��� �� .929. �$44/��

. ���� >� ������ ��������� �( �������� �� ����������� ����

��� ���� �� /)(;$249 �$45;��

9 )� �� E �� )������ �� #� ������ �� �� ���������

�� �� �������� �� ���������� ������ ������ ������� ���

��������� ���� +-*(402$// �$44;��

3 !���� ) �� =����� '� +�A���%� ��������� ����� ��

�������� �� �-=,������� � ���� ��� �� �� ����

����� �������� �� �� -� ��� ��� ��� �� ���� �� ��

����� ����������� ������ ������ ����� ���� ))(142;. �$44.��

0 � � �>� C��%�F D �� � ���� ��< �� )� )� ����

�� � ���� ����� �� ������ ������ ����������� �� ���

��� ��� �� �������� �� ������ ���� ���� ���� �� � ./(30;/2

30;3 �$4;1��

1 C��%�F D� G��%�C�� � > �� � ����� ��< �� )�

, �� ��� �� ������ ������� �� ������ ��������� � ��

��� ���� ������� ���!��� " ���� ��� )-)(999529939 �$4;;��

; )���� DF� +�� -�� H�� I� )?���� E- �� J �� "� #�

�����%���� �� ������ ������ �� ��� ���� ������ �������

����� �� ���������� ������� ����������� +0)($04$2$041

�$441��

5 G��� ����� =� -�� ���� �� �� � ��������� ������ ��

01(.142.4. �$441��

4 H����� <� =� ��?�%� ,� )���� +G �� "� ��� F�

������ �������� �� ��������� #��$���������� ������ ������ !!�

)����� ����� �� ���� A�%� �� �� ��� � � ���������

������� �� ������ ��� �� ���� � ���� ������ ������ �������

).(542$/5 �$443��

$/ ���� >� �� ����� ������ �������� �� � �����( �� ����� ��

�� ���� �� ��� ��� ���� ��� " ���� ���� +2(.532.43 �$45.��

$$ G�� =� #� �� ���� � ������ �� ������� ����� ������

���� �� �� ���������� ������ ���������% ������ ����� ���

���� ������� I�� .� � �� E �� <- �� <��� � G!�

, ���� , ��� "��� �� �� 5;2$34 �$450��

$. ���������� E�� *�� ������ � ����� �� �� ������ �� ��

��� ����A�� �������� ������ �� � ��� ���������� ��

��������� �������� �� &����� ' ���� +.($9$2$3/ �$450��

$9 G�� = �� F�� ,� -������� �� �� ��� �� ����

��� � ��&�� �� ��� ������ �� ����� �� � ������

&����� ' ���� ++(.;;2.4$ �$4;4��

$3 � ��� C+� =�� ������� �� �� A������ �� �� ��� �� ��� ���

�( ���� �� )-/(3302303 �$4;0��

$0 '�?�� =� =� ����� F� "�� - �� # �� =� :��� �����

40/

�� ������� ������ ������ ���� ������ ���� ��� ������

������ ������� ��� �� �� )/2(;02;5 �$44;��

$1 ���� >� ������ �������� �� �� ����� � � ��� �� �����

��� ������ ���� ������ ������ ������� ))(.302.1$ �$449��

$; "� ��� F� G��� +- �� G�� �-� !��������� �� ������

� �������� �� ������ ����� �� ������ �������������� ������ � ��

��� ��( >����� �� ������ �� ���������� " ������ �������

)3(3;209 �$459��

$5 � ��� �K� +� #� � ���� �� ���� �� ������ �������������

����������� " ������� ������ ����� /(1142159 �$40;��

$4 =�� C �� ��� ��� D� #� �� ���� �� ��������� " ��� ����+)*($1;2$5$ �$4;5��

./ ����� �'� <����� �� ������ ������� �� ������ ��������

�� ������ ���� ��� ��������� 0.(0/0209/ �$449��

.$ #��� CG� I������ #� D������ )>� D �� D �� , ��� C+�

!���� ������ ������� �+:- �&���� �� � ���%���� ��

�� ������ ��� " ������ )2.(1/.021/3. �.///��

.. J� #� J���" � #� : ?�� #� )���� =� - ��� =

�� J���" � =� =������� ����� �� ������ ������

. �� ������� ���� ����������� !���������� �� �������� ����

��� ����� ������� �� ��� ������� �������� ��� " ������

)-1(43$243; �$445��

.9 )�� !=� � ��� C= D � '� =� < �� C- �� F� ����

�� =��������� ������� �� ���������� � ��� ��( !��

��������� �� ������� �� ������ " ��������� +..($3$42$3.3

�$440��

.3 +�� +,� ������� �����������( >������� ���� �� ��������

��� �� ������ ���� ��� ����� ������� ����� ��� ���� -*(.302

.;1 �$444��

.0 � ���� ��< �� ) �� G����� >� !��������� ������� ���!�� ��

���������+( >����� �� ������ �������� �� �� ���������

��������� " )�� ��������� .+(9/$29/4 �$4;.��

.1 F� � =� E � � E �� =���� #� !�� ����� ���� ��������

�� ���� ��� �� ������ �������� ���� ���� ��� /1(1442

;/0 �$4;3��

.; ���� > �� ���� D>� !��������� �� &������� ��� ������

�������� ������ ������ ������� +/($.42$91 �$45/��

.5 I ���� - �� ' �� �+� ��%�������� � �L �� � ��� ��

���������� ��� � ��� ���� ������ ���������� �� ���������

��� ����� �� ��� *+�� �������� � �� ,���� DC� -�)

)�������� ) ��� -� ��� ������ )������ B���������

+�� �� .9;2.;/ �$4;;��

.4 : �� J �� =����� '� +�A���%� �� ����� ����

���� <#,��������� �.� � ���� � ��,����� �� ��� �����

������ � �� �� �������� �� �� ���� ����� � ���

��� ���� ����������� � ������� G� ������ ������ ����� ����

)0($//42$/$0 �$443��

���� ���� �� ���431240/ �.//$�