chemical compounds in differentiation and death of stem cells
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Chemical compounds in differentiation and death of stem cells. Celia Conesa Montanel. Introducción. Developmental Potential. Pluripotent. Totipotent. Multipotent. Unipotent. Firestone y Chen ACS Chemical Biology, 2010, 5:15-34. Introducción. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
Chemical compounds in differentiation and death of stem cells
Celia Conesa Montanel
Introducción
Firestone y Chen
ACS Chemical Biology, 2010, 5:15-34
Developmental Potential
Totipotent
Pluripotent
Multipotent
Unipotent
Introducción
Compuestos químicos que modifican la actividad proteica
directa (cambios fenotípicos)
reversa (cambios en proteína, y luego efecto fenotípico)
Genética Química
Firestone y Chen
ACS Chemical Biology, 2010, 5:15-34
Introducción
Firestone y Chen
ACS Chemical Biology, 2010, 5:15-34
Genética Química
•DIFERECIACIÓN CELULAR:Tipos celulares
específicos
•DESDIFERENCIACIÓN CELULAR:iPS
•TOXICIDAD SELECTIVA:Control de carcinomasSelección SC
Introducción
Tejidos: proliferación celular muerte celular
Tipos:
Muerte celular
APOPTOSIS
NECROSIS
http://www.anatomiahumana.ucv.cl/biologia
Desarrollo y MorfogénesisProcesos fisiológicosEliminación selectiva
Extrínseca
Intrínseca
Hipótesis
En colecciones complejas de compuestos químicos hay compuestos capaces de activar o inhibir:
diversas proteínas que participan en la proliferación y diferenciación de células madre
rutas apoptóticas de forma selectiva en células madre o células diferenciadas
Objetivos
Identificar compuestos químicos que induzcan diferenciación celular a cardiomiocitos a partir de células madre embrionarias de ratón
Identificar compuestos químicos que induzcan muerte celular programada durante la proliferación y diferenciación de estas células.
Línea celular: mES CGR8-AMPIGX-7 AMPIGX-7: GFP bajo el control de la cadena pesada de la miosina alfa (-MHC).
Dr. Agapios Sachinidis (Universidad de Colonia, Alemania)
Requerimientos de cultivo: Células indiferenciadas
Sin células “feeder” Medio de cultivo con LIF
Diferenciación cardiomiocitos
Medio de cultivo sin LIF Cuerpos embrioides
Gota colgante (“Hanging drop”) Suspensión
Línea celular: mES CGR8-AMPIGX-7
Diferenciación: EB Nuevo método: placas de 96 pocillos, fondo V
Células
Medio cultivo
500 células/EB
Línea celular: mES CGR8-AMPIGX-7
Diferenciación: EB Nuevo método: placas de 96 pocillos, fondo V
• Cantidad de GFP insuficiente para ser detectada en lector de placas
• Un solo ensayo de actividad por experimento
PROBLEMA
Dos nuevas líneas celulares
A partir de la línea original mES CGR8
Nuevo gen reportador: LUCIFERASA (-MHC) Metridia Gaussia
SobrenadanteActividadLuciferasa secretada
Dos nuevas líneas celulares
Amplificación DNA
purificación
Linerización del DNA
Extracción DNA Fenol-CloroformomES CGR84x107 células/ml de PBS
ELECTROPORACIÓN
medio de propagaciónplacas de 10 cm
Medio de selección: Geneticina (G-418) a 0,5 mg/ml
Selección de clones
Clones aislados: Cilindros de clonación
Lavado con PBS
Colocación del cilindro (presión)
Tripsina (20-50 l)
Placa de 96 pocillos
Placa de 24 pocillos
Placa de 6 pocillos
Frascos de 25 cm2: Placa de 6 pocillos, pellet
-80ºC
30 clones de cada
7 clones Metridia
Selección de clones
Clones que contienen: promotor de cardiomiocitos + luciferasa
PCR
Southern blot
Selección funcional (expresión de luciferasa)
Selección de clones - Expresión luciferasa
Siembra en placas 96 fondo V, en medio de diferenciación: 500 células/EB 2000 células/EB
Incubación: 8-10 días (Diferenciación)
Ensayo de luciferasa 25 l medio de cultivo + 2,5 l sustrato luciferasa
Medida de luminiscencia
DIFERENCIACIÓN CLONES METRIDIA LUCIFERASA
0
5000
10000
15000
20000
25000
M1 M2 M3 M4 M5 M6 M14 CGR8 Medio
Clones
RLU2000 células/EB500 células/EB
Selección de clones - Expresión luciferasa
RLU
Selección de clones - Expresión luciferasa
•Respuesta a compuestos químicos (10 M):Diferenciadores: VerapamilInhibidores: Forskolin
•500 células/EB•Compuestos tras 2 días de formación del EB
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
CGR8 M1 M5 M6 M14
RLU
Control negativo
Verapamil
Forskolin
Selección de clones - Southern blot
Sonda: Digestión cDNA de MetLuc con SmaI: Luciferasa 333 pb
Digestión DNA genómico: HindIII + NotI: promotor+luciferasa Al menos 6197 pb
MWM CGR8 M1 M5 M6 M14
Objetivos
Identificar compuestos químicos que induzcan diferenciación celular a cardiomiocitos a partir de células madre embrionarias de ratón
Identificar compuestos químicos que induzcan muerte celular programada durante la proliferación y diferenciación de estas células.
CRIBADO QUIMIOTECA-Viabilidad celular
Compuestos a 5 mM
Placa intermedia4 ó 3 compuestos/pocillo (500 M)C-: DMSOC+: Camptothecin (CPT) (500 M)
2 l/100 l medio
mES CGR8
(10,000 células/pocillo)
48h incubación4 ó 3 compuestos/pocillo (10 M)C-: DMSOC+: CPT (10 M)
Ensayo colorimétrico de viabilidad
XTT proliferation kit
Medida de la absorbancia a 450 nm
XTT (2,3-bis[2-Methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl]-2H-tetrazolium-5-carboxanilide)
Formazan
Quimioteca
CRIBADO QUIMIOTECA-Viabilidad celular
Grupos de compuestos donde disminuyó la viabilidad, se seleccionaron para probarlos individualmente:
• mouse embryonic stem cells CGR8 (mES CGR8) (10,000 cells/well)• mouse embryonic fibroblasts (MEFs) (2,500 cells/well)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
CPT
Group 1Group 2Group 3Group 4Group 5Group 6Group 7Group 8Group 9Group 10Group 11Group 12Group 13Group 14Group 15Group 16Group 17Group 18Group 19Group 20Group 21Group 22Group 23Group 24Group 25Group 26Group 27Group 28Group 29Group 30Group 31Group 32Group 33Group 34Group 35Group 36Group 37Group 38Group 39Group 40
Grupos de 4 compuestos/pocillo
% Viabilidad
% Viabilidad
CRIBADO QUIMIOTECA-Viabilidad celular
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
CPT
Group 1Group 2Group 3Group 4Group 5Group 6Group 7Group 8Group 9Group 10Group 11Group 12Group 13Group 14Group 15Group 16Group 17Group 18Group 19Group 20Group 21Group 22Group 23Group 24Group 25Group 26Group 27Group 28Group 29Group 30Group 31Group 32Group 33Group 34Group 35Group 36Group 37Group 38Group 39Group 40
Grupos de 4 compuestos/pocillo
% Viabilidad
0
20
40
60
80
100
120
140
CPT 26A 26B 26C 26D
Compuestos químicos
% Viabilidad
ESCsMEFs
% Viabilidad
% Viabilidad
CRIBADO QUIMIOTECA-Viabilidad celular
0
20
40
60
80
100
120
140
CPT 26D 199A 223A
Compuestos Químicos
% Viabilidad
ESCsMEFs
COMPUESTOS CON ACTIVIDAD DIFERENCIAL A 10 M% Viabilidad
CRIBADO QUIMIOTECA-Viabilidad celular
TINCIÓN VITAL CON AZUL TRYPAN
0
20
40
60
80
100
120
Control CPT 26D 199A 223A 23B 45B 92B 219C
Compuestos Quimicos
% ViabilidadESCs
MEFs
% Viabilidad
Estudio de la muerte celular
Bax/Bak Double Knockout MEFs (DKO-MEFs) Inhibidor de caspasas: z-VAD-fmk
DKO-MEFs,mES CGR8
o MEFs
z-VAD-fmk 100 M 30 min antes que los compuestos
Compuestos a 10 M 48 h
Ensayo de XTT
Estudio de la muerte celular
26D
0
20
40
60
80
100
120
MEFs DKO-MEFs
% Viabilidad
Sin z-VAD-fmkcon z-VAD-fmk
Estudio de muerte celular
Actividad de Caspasa-3 MEFs + 26D ESCs + 119A y 223A
Compuestos a 10 M durante 12 h
Lisis celular y ensayo colorimétrico para detectar la hidrólisis de acetyl-Asp-Glu-Val-Asp p-nitroanilide (Ac-DEVD-pNA)
(200 M) por la Caspasa-3
mES CGR8o MEFs
Absorbancia a 405 nm a 0, 30 min, 1h, 2h y 4 h
Vía extrínsecaCaspasa-8
Vía intrínsecaCaspasa-9
Caspasa-3
Estudio de muerte celular
Actividad de Caspasa-3 MEFs + 26D ESCs + 119A y 223A
0
0,04
0,08
0,12
0,16
0 1 2 3 4Tiempo de incubación (horas)
O.D. (405 nm)
DMSO (ESCs)CPT (ESCs)199A (ESCs)223A (ESCs)26D (MEFs)
Abs 405 nm
Estudio de muerte celular
Inhibición de caspasas en el tiempo Incubación con los compuestos: 3, 6, 12, 24 y 48h
CPT
0
20
40
60
80
100
120
140
3 6 12 24 48
Tiempo de incubación (horas)
% Viabilidad
223A
0
20
40
60
80
100
120
140
3 6 12 24 48
Tiempo de incubación (horas)
% Viabilidad
CPT
0
20
40
60
80
100
120
140
160
3 6 12 24 48
Tiempo de incubación (horas)
% Viabilidad
26D
0
20
40
60
80
100
120
3 6 12 24 48
Tiempo de incubación (horas)
% Viabilidad
Sin z-VAD-fmk
Con z-VAD-fmk
ESCs MEFs
% Viabilidad
% Viabilidad
% Viabilidad
% Viabilidad
Estudio de muerte celular
MICROSCOPÍA- Núcleos apoptóticos
mES CGR8 (150.000 células/pocillo)MEFs (25.000 células/pocillo)
Compuestos a 10 M durante 24 h
Hoechst 33342 (1 g/ml) durante15 min
Microscopio de fluorescencia
ESCs MEFs
DMSO
26D
223A
Ensayos de dosis-respueta
Concentraciones: 0,1-100 M (Ensayo XTT)
ESCs
020406080
100120140160180
0,1 1 10 100
Concentration ( )M
% Viability
CPT
26D199A223A
MEFs
0
20
40
60
80
100
120
140
0,1 1 10 100
Concentration (mM)
% Viability
CPT26D199A223A
LD50 ~ 7 M
LD50 ~ 40 M
LD50 ~ 8 MLD50 ~ 20 MLD50 ~ 25 M
% Viabilidad
% Viabilidad
Ensayos de dosis-respuetaA Benzethonium chloride
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Concentration ( ) M
% Viability
iPS cellsMXDJ
-1HFF
B
0
20
40
60
80
100
120
140
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Concentration ( ) M
% Viability
iPS cellsMXDJ
-1HFF
223A
26D
Doss M.X., Antzelevitch C., (Nueva York, USA)
iPS cells and human fibroblasts
% Viability
% Viability
CONCLUSIONES
CRIBADO QUIMIOTECA
Se han identificado compuestos que inducen apoptosis selectivamente en SCs Uso: Eliminar células indiferenciadas y prevenir la
formación de teratomas
Se ha identificado un compuesto que induce apoptosis selectivamente en MEFs Uso: Aislamiento de células madre en tejidos
Estos compuestos pueden usarse como herramienta para estudiar diferencias en las rutas apoptóticas entre SCs y somáticas
Ensayos en ratones
Grupos experimentales:
1: Control (sin tratar)
2: Tratamiento pre-inducción
3: Tratamiento post-inducción
Ratones (Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu/un (Harlan))CGR8: 500.000 células
Compuesto 223A
Proliferación celular
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
CPT
Group 1Group 2Group 3Group 4Group 5Group 6Group 7Group 8Group 9Group 10Group 11Group 12Group 13Group 14Group 15Group 16Group 17Group 18Group 19Group 20Group 21Group 22Group 23Group 24Group 25Group 26Group 27Group 28Group 29Group 30Group 31Group 32Group 33Group 34Group 35Group 36Group 37Group 38Group 39Group 40
Grupos de 4 compuestos/pocillo
% Viabilidad% Viabilidad
Proliferación celular
BrdU ELISA
XTT
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Control DMSO
CPTP4F2P4A3P4E3P4D5P4D6P4H8P5B2P5C2P5B3P5B5P5C5P5A6P5B6P5C6P5E7P5F8P5FG8
Compuestos Químicos
% Viabilidad
ESCsMEFs
BrdU ELISA
0
50
100
150
200
250
Control DMSO
CPTP4F2P4A3P4E3P4D5P4D6P4H8P5B2P5C2P5B3P5B5P5C5P5A6P5B6P5C6P5E7P5F8P5FG8
Background
Blank
Compuestos Químicos
% Viabilidad
ESCs
MEFs
% Viabilidad
% Viabilidad
XTT
Planes para el futuro
Cribado de otras quimiotecas Proliferación celular (muerte y metabolismo)
Diferenciación celular
Mecanismos de acción
Células madre humanas: hESC (ES4) hiPS ([K]iPS4F-1)
Agradecimientos
José Alberto Carrodeguas
Javier Sancho
Verónica Tomey
Michael Xavier DossCharles Antzelevitch
Agapios Sachinidis
Stem Cell Center, Masonic Medical Research LaboratoryUtica, New York, USA
Colaboradores externos:
University of Cologne, Center of Physiology and Pathophysiology, Institute of NeurophysiologyCologne. Alemania
¡Muchas gracias!