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D N A E X P R E S S B I O T E C N O L O G I A L T D A

DNA Express Biotecnologia LTDA [email protected] Rua João Batista Nogueira 500 Módulo 29 Tel. (11) 2303 7133 / 2303 7436 Vila Nova Cumbica 07230-451 Guarulhos, SP Página 1

CERTIFICADO

No. 113/2013

Insumos para diagnósticos laboratoriais de

Influenza por Biologia Molecular

Amplificação com alta eficiência e especificidade das sequências alvos do Vírus da

Influenza e Gene RNP por RT-PCR em Tempo Real pelo kit One-Step qRT-PCR

utilizando os seguintes conjuntos de oligonucleotídeos e sondas fluorescentes:

InfA Direto, InfA Reverso e InfA Sonda

Pdm InfA Direto, Pdm InfA Reverso e Pdm InfA Sonda

Pdm H1 Direto, Pdm H1 Reverso e Pdm H1 Sonda

AH1 Direto, AH1 Reverso e AH1 Sonda

AH3 Direto, AH3 Reverso e AH3 Sonda

InfB Direto, InfB Reverso e InfB Sonda

RNP Direto, RNP Reverso e RNP Sonda

Lotes dos Insumos Certificados com Procedência DNA Express Biotecnologia

1. Água ultrapura para Biologia Molecular

Código do Produto: DNA AU100 Frasco de 100mL

Lote: F10A2830

Data da Fabricação: 07/03/2013 Data de Validade: 07/09/2014



2.Kit One-Step qRT-PCR

Código do Produto: DNA Kit One-Step qRT-PCR 500

Suficiente para 500 testes (volume final da reação de qRT-PCR de 50uL)

Suficiente para 1000 testes (volume final da reação de qRT-PCR de 25uL)

Lote: K10A1437

Data da Fabricação: 13/06/2013 Data de Validade: 13/10/2014

3.Oligonucleotídeo InfA Direto

Cód. do Produto: Primer InfA Direto 50uL 40uM

Sequência: 5’-GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA C -3’

Frasco contendo 50uL na concentração de 40uM em solução Tris EDTA pH 8.0

Lote: 29572

Data da Fabricação: 10/06/2013

4.Oligonucleotídeo InfA Reverso

Código do Produto: Primer InfA Reverso 50uL 40uM

Sequência: 5’- AGG GCA TTY TGG ACA AAK CGT CTA -3’


Lote: 29573


5.Oligonucleotídeo Pdm InfA Direto

Código do Produto: Primer Pdm InfA Direto 50uL 40uM

Sequência: 5’-TTG CAG TAG CAA GTG GGC ATG A -3’


Lote: 29574




6.Oligonucleotídeo Pdm InfA Reverso

Código do Produto: Primer Pdm InfA Reverso 50uL 40uM

Sequência: 5’- TCT TGT GAG CTG GGT TTT CAT TTG -3’


Lote: 29575


7.Oligonucleotídeo Pdm H1 Direto

Código do Produto: Primer Pdm H1 Direto 50uL 40uM

Sequência: 5’-GTG CTA TAA ACA CCA GCC TCC CAT T-3’


Lote: 29576


8.Oligonucleotídeo Pdm H1 Reverso

Código do Produto: Primer Pdm H1 Reverso 50uL 40uM

Sequência: 5’- AGA CGG GAY ATT CCT CAA TCC TG -3’


Lote: 29577


9.Oligonucleotídeo AH1 Direto

Código do Produto: Primer AH1 Direto 50uL 40uM

Sequência: 5’-AAC TAC TAC TGG ACT CTR CTK GAA-3’


Lote: 29578




10.Oligonucleotídeo AH1 Reverso

Código do Produto: Primer AH1 Reverso 50uL 40uM

Sequência: 5’-CCA TTG GTG CAT TTG AGK TGA TG-3’


Lote: 29579


11.Oligonucleotídeo AH3 Direto

Código do Produto: Primer AH3 Direto 50uL 40uM

Sequência: 5’-AAG CAT TCC YAA TGA CAA ACC-3’


Lote: 29580


12.Oligonucleotídeo AH3 Reverso

Código do Produto: Primer AH3 Reverso 50uL 40uM

Sequência: 5’-ATT GCR CCR AAT ATG CCT CTA GT-3’


Lote: 29581


13.Oligonucleotídeo InfB Direto

Código do Produto: Primer InfB Direto 50uL 40uM

Sequência: 5’-TCC TCA AYT CAC TCT TCG AGC G-3’


Lote: 29582




14.Oligonucleotídeo InfB Reverso

Código do Produto: Primer InfB Reverso 50uL 40uM

Sequência: 5’-CGG TGC TCT TGA CCA AAT TGG-3’


Lote: 29583


15.Oligonucleotídeo RNP Direto

Código do Produto: Primer RNP Direto 50uL 40uM

Sequência: 5’-AGA TTT GGA CCT GCG AGC G-3’


Lote: 29584


16. Oligonucleotídeo RNP Reverso

Código do Produto: Primer RNP Reverso 50uL 40uM

Sequência: 5’-GAG CGG CTG TCT CCA CAA GT-3’


Lote: 29585


17. InfA Sonda

Código do Produto: Sonda InfA 50uL 10uM

Sequência: 5’-(FAM) TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG (BHQ-1)-3’


Lote: 29586




18. Pdm InfA Sonda

Código do Produto: Sonda Pdm InfA 50uL 10uM

Sequência: 5’-(FAM) TGA ATG GGT C [T(BHQ-1)]A TCC CGA CCA GTG AGT AC (C3 spacer)-3’


Lote: 29587


19. Pdm H1 Sonda

Código do Produto: Sonda Pdm H1 50uL 10uM

Sequência: 5’-(FAM) ATA CAT CCG A[T(BHQ-1)]C ACM ATT GGA AAA TGT CC (C3 spacer)-3’


Lote: 29588


20. RNP Sonda

Código do Produto: Sonda RNP 50uL 10uM

Sequência: 5’-(FAM) TTC TGA CCT GAA GGC TCT GCG CG (BHQ-1)-3’


Lote: 29589


21. AH1 Sonda

Código do Produto: Sonda AH1 50uL 10uM

Sequência: 5’-(FAM) TGA YCC AAA GCC [T(BHQ-1)]CT ACT CAG TGC GAA AGC (C3 spacer)-3’


Lote: 29590




22. AH3 Sonda

Código do Produto: Sonda AH3 50uL 10uM

Sequência: 5’-(FAM) CAG GAT CAC ATA TGG GSC CTG TCC CAG (BHQ-1)-3’


Lote: 29591


23. InfB Sonda

Código do Produto: Sonda InfB 50uL 10uM

Sequência: 5’-(FAM) CCA ATT CGA GCA GCT GAA ACT GCG GTG (BHQ-1)-3’


Lote: 29592




Insumos certificados com testes realizados no equipamento 7500 Real-Time PCR

System (Applied Biosystems) utilizando os seguintes parâmetros:

Leitura do Sinal de Fluorescência:

Detector: Influenza (cor vermelha) ou RNP (cor preta)

Reporter: FAM

Quencher: (none)

Leitura do sinal de fluorescência realizada durante o 3º passo do ciclo de amplificação

(68oC por 45 segundos).



Certificação de Insumos para diagnósticos laboratoriais de Influenza por Biologia Molecular

InfA

Reagentes Kit One-Step qRT-PCR por reação de RT-PCR em Tempo Real

(concentração final de 3mM MgSO4)

2X Tampão de Reação qRT-PCR 12,5uL

Água ultrapura para Biologia Molecular 5uL

40uM InfA Direto 0,5uL

40uM InfA Reverso 0,5uL

10uM InfA Sonda 0,5uL

Corante de Referência ROX 0,5uL

Enzimas qRT-PCR 0,5uL

-------------------------------------------------------------------------------------------------

Volume por Reação de RT-PCR em Tempo Real 20uL

RNA Viral / Controle Negativo / Controle Positivo 5uL

Controle Negativo:

Água ultrapura para Biologia Molecular

Controle Positivo Lote P07 Data de Fabricação 11/06/2013

RNA sintético produzido in vitro contendo a seguinte sequência de material genético:

Influenza A virus (A/Puerto Rico/8/34(H1N1)) segment 7

Sequence ID: ref|NC_002016.1




InfA




Pdm InfA





40uM Pdm InfA Direto 0,5uL

40uM Pdm InfA Reverso 0,5uL

10uM Pdm InfA Sonda 0,5uL



-------------------------------------------------------------------------------------------------



Controle Negativo:




Influenza A virus (A/Mexico City/INERPHAC4/2010(H1N1)) segment 5 nucleocapsid protein (NP) gene

Sequence ID: gb|KC261325.1




Pdm InfA




Pdm H1




Água ultrapura para Biologia Molecular 3,5uL

50mM MgSO4 1,5uL

40uM Pdm H1 Direto 0,5uL

40uM Pdm H1 Reverso 0,5uL

10uM Pdm H1 Sonda 0,5uL



-------------------------------------------------------------------------------------------------

Volume do Mix por Reação de RT-PCR em Tempo Real 20uL

RNA Viral / Controle Positivo / Controle Negativo 5uL

Controle Negativo:




Influenza A virus (A/Mexico City/INERPHAC4/2010(H1N1)) segment 4 hemagglutinin (HA) gene





Pdm H1




AH1




Água ultrapura para Biologia Molecular 3,5uL

50mM MgSO4 1,5uL

40uM AH1 Direto 0,5uL

40uM AH1 Reverso 0,5uL

10uM AH1 Sonda 0,5uL



-------------------------------------------------------------------------------------------------

Volume do Mix por Reação de RT-PCR em Tempo Real 20uL

RNA Viral / Controle Positivo / Controle Negativo 5uL

Controle Negativo:




Influenza A virus (A/Michigan/31/2009(H1N1)) segment 4 hemagglutinin (HA) gene





AH1




AH3





40uM AH3 Direto 0,5uL

40uM AH3 Reverso 0,5uL

10uM AH3 Sonda 0,5uL



-------------------------------------------------------------------------------------------------



Controle Negativo:




Influenza A virus (A/swine/South Dakota/A01280095/2013(H3N2)) segment 4 hemagglutinin (HA) gene





AH3




InfB





40uM InfB Direto 0,5uL

40uM InfB Reverso 0,5uL

10uM InfB Sonda 0,5uL



-------------------------------------------------------------------------------------------------



Controle Negativo:




Influenza B virus (B/Arizona/03/2011) segment 8 nuclear export protein (NEP) and

nonstructural protein 1 (NS1) genes





InfB




RNP





40uM RNP Direto 0,5uL

40uM RNP Reverso 0,5uL

10uM RNP Sonda 0,5uL



-------------------------------------------------------------------------------------------------



Controle Negativo:




Homo sapiens ribonuclease P/MRP 30kDa subunit (RPP30), transcript variant 1

Sequence ID: ref|NM_001104546.1




RNP



Resultados dos Testes

Amplificação com alta eficiência e especificidade das sequências alvos do Vírus

da Influenza e Gene RNP por RT-PCR em Tempo Real pelo kit One-Step qRT-PCR

utilizando os seguintes conjuntos de oligonucleotídeos e sondas fluorescentes

Controle Positivo Controle Negativo

(Média Ct) (Ct)

InfA 25,03 Undet.

Pdm InfA 25,15 Undet.

Pdm H1 26,64 Undet.

AH1 25,84 Undet.

AH3 25,18 Undet.

InfB 23,67 Undet.

RNP 24,14 Undet.

Especificação de alta eficiência e especificidade:

Amplificação das sequências alvos do Vírus da Influenza e Gene RNP (Controles

Positivos) por RT-PCR em Tempo Real apresentado um valor da média dos Cts

menor que 30.

Ausência de amplificação do controle negativo (Ct Undet.)

Resultado: ATENDE AS ESPECIFICAÇÕES



Este certificado restringe-se apenas aos números dos lotes fornecidos.

Data da aprovação: 16/06/2013

João Marcos M. Mercado – CRBM 5579 1ª Região – SP

Gerente de Produção

Fabricado no Brasil pela DNA Express Biotecnologia LTDA:

DNA Express Biotecnologia LTDA www.dnabrasil.ind.br

CNPJ 12.958.000/0001-88 [email protected]

Rua João Batista Nogueira 500 Módulo 29

Vila Nova Cumbica, Guarulhos, SP SAC (11) 2303 7133 / 2303 7436

certificado no 113 2013 insumos para diagn sticos ... · sequência: 5’-gac cra tcc tgt cac ctc...

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