CENTRE OF THE REGION HANÁ FOR BIOTECHNOLOGICAL

AND AGRICULTURAL RESEARCH-

PLANT BIOTECHNOLOGY IN OLOMOUC

This project is jointly financed by the European Regional Development Fund in the framewwork of the Operational Programme Research and Development for Innovations and by the state budget of the Czech Republic

Ivo Frébort27.04. 2011

Program přednášky

1. Představení C.R. Haná a projektu OP VaVpI

2. Výzkumné programy C.R. Haná

3. Příprava transgenního ječmene

Project information

OP Research and Development for Innovations: CZ.1.05/2.1.00/01.0007

Project budget : 832 938 232 CZK

Implementation period: 03/2010 – 12/2013

Grant recipient: Palacký University in Olomouc

Partners: Institute of Experimental Botany, AS CR (IEB)

Crop Research Institute (CRI)

Investment: 80% of the budget, 4 new buildings for R&D Olomouc-Holice,equipment and research instruments

Start-up grant: 20% of the budget, implementation costs, wages, services

Human resources: 170 employees in 2013, 80 new position for researchers

Structure of C.R. Haná

• Council and Board of the Centre

• Executive Director – Ivo Frébort

• Technical and Economical Department

• Department of Education and HR

• Department of Technology Transfer

• Scientific Director - Jaroslav Doležel

• Scientific Board

• Research Units

Management Units

Research Units

• Technology Centre (Palacký University)• Department of Protein Biochemistry and Proteomics• Department of Biophysics• Laboratories for Contract Research

• Centre of Molecular Biology and Genetics (Palacký University)• Department of Growth Regulators• Department of Molecular Biology• Department of Cell Biology

• Centre of Plant Structural and Functional Genomics (IEB)• Laboratory of Genome Structure of Cereals and Forage Crops• Laboratory of Biology of Agronomically Important Traits• Laboratory of Cell Structure Proteomics• Laboratory of Bioinformatics

• Centre of Applied Research of Vegetables and Special Crops (CRI)• Department of Genetic Resources of Vegetables, Medical Plants and Special Crops• Department of Growing and Quality of Vegetables, Medical Plants and Special Crops

Miroslav StrnadPalacký University

Growth Regulators

Jaroslav Doležel – Scientific DirectorInstitute of Experimental Botany

Structural and Function Genomics

Marek ŠebelaPalacký University

Biochemistry and Proteomics

Karel DušekCrop Research Institute

Gene Bank of Vegetables and Special Crops

Ivo Frébort - Executive DirectorPalacký University

Biochemistry and Molecular Biology

Key scientists of the centre

Jozef ŠamajPalacký University

Cell Biology

Equipment of the centre

Total expected costs – 220 mil. CZK

Key instruments

• Laser scanning confocal microscope (07/2010)

• High-speed flow cytometer and sorter (09/2010)

• Confocal microscope system for live cell imagining (planned for 2011)

• Mass spectrometer MALDI-TOF/TOF (planned for 2012)

• NMR spectrometer 500 MHz (planned for 2012)

• HPLC/MS (planned for 2012)

• Phytotrons and automated high resolution phenotypic evaluation of plants

Completion of the Faculty of Science (PU) Campus in Holice – „Centre for Science and Education“

Zoning approval issued in 11/2008

Investment funds, allocated in the project budget for the new construction infrastructure: Expected total building cost: 530 million CZKfrom which: technological laboratory equipment cost - 38 million CZK

other interior equipment cost - 16 million CZKphytotron chambers cost - 40 million CZK

Centre of plant structural and functional genomics

Technology centre

Centre of applied research of vegetables and special crops

Building permission issued in 11/2009

Centre of molecular biology and genetics

Investor: Crop Research InstituteBuilding D - Centre of applied research of vegetables and special crops

Research departments:

Department of Genetic Resources of Vegetables, Medical Plants and Special CropsDepartment of Growing and Quality of Vegetables, Medical Plants and Special Crops

Expected investment cost: 67.570 thousand CZK

Floor plan: 2nd level

Investor: Institute of Experimental Botany AS CRBuilding E – Centre of plant structural and functional genomics Research departments:Laboratory of Genome Structure of Cereals and Forage Crops Laboratory of Biology of Agronomically Important TraitsLaboratory of Cell Structure Proteomics Laboratory of Bioinformatics

Expected investment cost: 151.760 thousand CZK

Floor plan: 1st level

Investor: Palacký UniversityBuilding F2 – Technology centre

Management unit of the Centre Research departments:

Department of Protein Biochemistry and Proteomics Department of Biophysics Laboratories for Contract Research

Expected investment cost: 127.270 thousand CZK

Floor plan: 2nd level

Investor: Palacký UniversityBuilding H – Centre of molecular biology and genetics

Research departments:

Department of Growth RegulatorsDepartment of Molecular BiologyDepartment of Cell Biology

Expected investment cost: 161.740 thousand CZK

Floor plan: 1st level

Building H: room 137 Building E: room 312

Building D: room 212 Building F2: room 125

Example of laboratory equipment in new buildings

Building F2: conference room 225

Building D: office 205 Building E: common dining room 207

Building H: computer room 215

Example of administrative parts equipment

Building works timetable:

• Completion of the documentation for the building works contractor tender 06/2010

• Public tender for the general building works contractor07- 12/2010

• Start of building works01/2011

• Consecutive buildings approval processes, putting buildings into operation 07- 09/2012

• Finish of building works and passing buildings to users 12/2012

CR Haná 2013

CR Haná 2010

Sustainable growth and development

Centre of the Region Haná for Biotechnologicaland Agricultural Research,

Palacký University in Olomouc, Czech Republic

Výzkumná problematika řešená v rámci centra

Proteinová biotechnologieVedoucí výzkumného programu: prof. Mgr. Marek Šebela, Dr.

Chemická biologie a genetikaVedoucí výzkumného programu: prof. Ing. Miroslav Strnad, DSc.

Nové materiály a metody šlechtění rostlinVedoucí výzkumného programu: doc. Ing. Jaroslav Doležel, DrSc.

Rostlinné biotechnologieVedoucí výzkumného programu: prof. RNDr. Jozef Šamaj, DrSc.

Fytofarma, genetické zdroje zelenin, léčivých, aromatických a kořeninových rostlin (zahájení 1.1.2013)Vedoucí výzkumného programu: Ing. Karel Dušek, CSc.

Výzkumné programy C.R. Haná

Vývoj metodiky pro identifikaci patogenů rostlin na základě databáze proteinových profilů z hmotnostní spektrometrie

•na povrchu listu –mimobuněčný růst

•pouze haustoriaepidermální buňky

• suché a teplé počasí –pozdní léto a počátek podzimu

•uvnitř pletiv –mezibuněčný růst

•haustoria (výživové orgány) prorůstají mesofyl

• vlhké počasí – jaro, počátek léta

obligátní biotrofní rostlinní paraziti

infikují zelené části rostlinrychlé šíření = epidemická

onemocněnílikvidace úrody (víno, chmel,

zelenina…)

Porovnání spekter - shoda

Proteinová biotechnologie

Plísně Padlí

Vývoj nových metod- stanovení absorpční kapacity kyslíkových

radikálů (ORAC)- optimalizace extrakce flavonoidu eupatorinu

pro analýzy s buněčnými kulturami- vývoj UPLC-MS/MS metody pro kvantifikaci

silybinu z Ostropestřce mariánského- vývoj UPLC-MS/MS metody pro kvantifikaci

eupatorinu v Trubkovci tyčinkovitém- vývoj UPLC-MS/MS metody pro kvantifikaci

diterpenoidu andrografolidu v Právence latnaté

Aplikovaný výzkum- stanovení ORAC sójových výrobků

(KALMA k.s.)- stanovení celkového obsahu fenolových

látek v extraktech (Fytopharma s.r.o.)- stanovení silybinu v galenických

produktech (Fytopharma s.r.o.)

Proteinová biotechnologieAnalýza přírodních látek

Rychlé stanovení vysokoteplotní odolnosti rostlin• 10 - 20 min. měření• metoda: detekce fluorescence chlorofylu

při kontinuálním ohřevu listů• vývoj komerční aparatury ve spolupráci s

firmou Photon Systems Instruments (Brno)• společný grantový projekt TA ČR -

program ALFA

Ječmen jarní

Proteinová biotechnologie

Nový růstový regulátor pro modulaci výnosu zemědělských plodin

Ozimá řepka 2010

020406080

100120140160

% o

f con

trol

10 µM

50 µM

INCYDE

Aplikovaná koncentrace

Chemická biologie a genetika

Patentová přihláška:Mik, V., Szüčová, L., Doležal, K., Spíchal, L., Galuszka, P., Strnad, M.: Použití 6-substituovaných 9-halogenalkyl purinů pro regulaci růstu a vývoje rostlin, rostlinných orgánů a buněk, nové 6-substituované 9-halogenalkyl puriny. PV 2010-670.Vynález se týká nových derivátů cytokininů pro regulaci růstu a vývoje rostlin, rostlinných orgánů a buněk, jejich použití v zemědělství, včetně přípravků obsahujících tyto deriváty

Projekt TAČR AGROCYT „Výzkum, testování a výroba cílenýchrůstových regulátorů, nových hnojiv a kombinovaných přípravků prorostlinnou produkci“ (2011-2016)Řešitelé: Fosfa akciová společnost, Univerzita Palackého v Olomouci,Ústav experimentální botaniky AVČR, v.v.i. a Agrotest fyto, s.r.o.

Chemická biologie a genetika

Plán výzkumné činnosti:

Vývoj agonistů a antagonistů regulačních drah (zejména růstové regulátory, přírodní látky a jejich deriváty)

Modulace percepce, signalingu, biosyntézya degradace

Studie molekulárních mechanizmů účinku

Studie metabolismu, transportu a funkce nových sloučenin

Farmakologie a toxikologie těchto derivátů

Chemická biologie a genetika

Nové materiály a metody šlechtění rostlinIdentifikace 21766 genů ječmene a určení jejich polohy v genomu

Nová strategie analýzy dědičné informace plodin:chromozomová genomika

Lokus QPm-tut-4A = rezistence v celém vegetačním období

Pšenice napadená padlím travním

Rezistentní pšenice

Nové materiály a metody šlechtění rostlin

Izolace genu pro rezistenci pšenice vůči padlí travnímu

DNA čip typu DArT

Genetické mapování

Identifikace a právní ochrana nových odrůd

Studium genetické variability

Určení kříženců kostřav a jílků (Festulolium)

Křížení pomocí markerů (vazba s agronomicky významnými znaky) – odolnosti proti chorobám, mrazuvzdornost)

Nové materiály a metody šlechtění rostlin

Rostlinné biotechnologie

Signalizace při vývoji a stresu u Arabidopsis

Col0 wild type

mpk4 mutant

Poruchy v mikrotubulárním cytoskeletonu

formují se aberantní buňky s mnoha jádry

Rostlinné biotechnologie

Plán na další období: Genetická modifikace Claviceps purpurea Zvýšení produkce ergoidních alkaloidů

používaných jako terapeutika Spolupráce s TEVA Czech Industries, Opava

Funkční proteomika – hledání nových proteinů a jejich funkce při stresu

Mutanty: mpk4, mpk6, anp2/3, yoda

control treatment

Contact information

Centre of the Region Haná for Biotechnological and Agricultural Research

Šlechtitelů 813/21783 71, Olomouc – Holice

Czech Republic

Phone: +420 585 634 970, +420 585 634 971, +420 585 634 979

E-mail: projekty_eu@upol.czWeb pages: www.cr-hana.eu

Centre of the Region Haná for Biotechnologicaland Agricultural Research,

Palacký University in Olomouc, Czech Republic

Preparation of transgenic barley with improved quality

NHN

NN

NH

NHN

NN

NH OH

NHN

NN

NH

O

NHN

NN

NH

NHN

NN

NHOH

NHN

NN

NH

OCH3

Zeatin (t-Z)Isopentenyladenine (iP)

Kinetin 2-CH3OBAp-Topolin (4-OHBA) Benzyladenine (BA)

Cytokinins – plant growth hormones

NHN

NN

NH CH2 R

NHN

NN

NH2

CH RO

CKX

+ H2O

FAD FADH2

Final acceptor

QQH2

+

Cytokinin Adenine Aldehyde

Regulation of active cytokinin levelCytokinin dehydrogenase (CKX, EC 1.5.99.12)

Galuszka et al. Eur. J. Biochem. 268, 450 (2001)

Q0

O2

- High rate(kcat ~ 200)

- Low rate(kcat < 1.0)

N CFAD binding domain ~ 550 aa

ZmCKX1 - maize kernelsMalito E. et al., J. Mol. Biol., 27, 1237 (2004)

Expression and targeting of CKX in A. thaliana

vacuolecytosol

plastid

apoplast

AtCKX1AtCKX3

AtCKX2, AtCKX4AtCKX5, AtCKX6

AtCKX7

cytokinins

PUP Cytokinin receptor

Werner et al., Plant Biol. 8, 371 (2006) Galuszka et al., J. Plant Growth Regul. 26, 255 (2007)

Substrate specificity of Arabidopsis thaliana CKXs

0

50

100

150

200

250

300

350

400

rela

tive

reac

tion

rate

s (%

)

AtCKX1 AtCKX2 AtCKX3 AtCKX4 AtCKX5 AtCKX6 AtCKX7

Production of recombinant protein in Pichia pastoris

Galuszka et al., J. Plant Growth Regul. 26, 255 (2007)

WT

HvCKX-M

gHvCKX-S

WT HvCKX-MGaluszka et al. (2004) Eur. J. Biochem. 271, 3990-4002

2x activity

50x activity

- Cytokinins stimulate plant differentiation

- Overexpression of CKX causes cytokinin-deficient phenotype

- Possible applications in agriculture

Cytokinin contentdown to 30–50%

CKX as a transgene (expression under 35S promoter in tobacco)

Genetic transformation of barleywith Agrobacterium tumefaciens

- Monocots much more difficult to transform than dicots - A. tumefaciens (supervirulent strain) applied on wounded immature embryo- Acetosyringone added to stimulate the infection- Difficult plant regeneration from calli, fine tuning of cytokinin and auxin needed

WT HvCKX1 silenced line

Relative specific CKX activity in roots 1.0 0.50 ± 0.12

Relative HvCKX1 transcript level1.0 0.31 - 0.59

Mass of 1.000 grains26.6 g26.6 g 32.5 g32.5 g

WT HvCKX1 silenced line

Increased level of cytokinins in aleurone layer

Increase of cereal plant yieldTransgenic barley with silenced CKX

Zalewski W., Galuszka P., et al., J. Exp. Bot. 61, 1839-1851 (2010)

Constitutive overexpression of CKX in barley(pBRACT vector, ubiqutin promoter, ZmCKX1 gene)

• significantly enhanced root system• delayed development of the aerial part• sterility and earlier onset of senescence

Mrízová et al., J. Biotechnol., submitted

PHT promoter- Promoter of phosphate transporter gene- Expression in root-hair and elongation zone

RAF promoter- Promoter of the root abundant factor- Expression in root tip and vascular bundles

Root specific promoters

- Promoters from dicots are often not active in monocots- Promoters from monocots often work in dicots- PHT and RAF promoters cloned from barley, tested in Arabidopsis- bGLU promoter cloned from maize

PTH/GUS

RAF/GUS

Gu et al., Plant Cell Rep., 2006

bGLU promoter- β-glucosidase promoter- Expression in roots

bGLU/GUS

Transgenic barley plants – T0 generation

1 2 3

1 2 3

1 2 3

Transgenic barley plants – T1 generation

1 2 3

1 2 3

1 2 3

Centre of the Region Haná for Biotechnological and AgriculturalResearch (ERDF project CZ.1.05/2.1.00/01.0007), Olomouc, CZPetr GaluszkaHana PospíšilováKatarína MrízováLudmila Ohnoutková

John Innes Centrum, Norwich Research Park, Norwich, UKWendy Harwood

www.cr-hana.eu