carrera de especializacion en biotecnologia...
TRANSCRIPT
CARRERA DE ESPECIALIZACION EN
BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
FCEyN-INTI
Materia de Articulación CEBI_E3
Cultivos Celulares
Docente: Erina Petrera
CEBI_E3_2 : Métodos de cultivo de células animales
EL SUSTRATO/SOPORTE
LA FASE GASEOSA
CONDICIONES FÍSICO-QUÍMICAS, NUTRICIONALES Y
FISIOLÓGICAS
LAS CONDICIONES DE CULTIVO
SOPORTE
CÉLULAS
COMPONENTES DE UN CULTIVO
EL SUSTRATO
• Brinda a las células, tejidos u órganos en cultivo el soporte físico
necesario para realizar sus reacciones metabólicas, desarrollar su
metabolismo y desarrollar sus procesos morfogénicos.
Vidrio
Plástico (poliestireno)
Microsoportes
Sustratos metálicos
Recipiente o soporte Superficies tratadas
‘Feeder layers’
Matrices tridimensionales
Interfases
Haces microcapilares permeables
Nuevos dispositivos (p. Ej. Opticell)
CULTIVOS ADHERIDOS A UN SOPORTE
POLICUBETAS PLACAS DE PETRI
Línea celular BHK-21 Línea celular MDCK
CÉLULAS FBHE CRECIDAS
DURANTE 5 DÍAS SOBRE
SOPORTE PLÁSTICO
DESNUDO
CÉLULAS FBHE CRECIDAS
DURANTE 5 DÍAS SOBRE
SOPORTE PLÁSTICO CON
COBERTURA DE COLÁGENO
Superficies cubiertas con sustancias que
favorecen el crecimiento celular
TITULACIÓN DE VIRUS EN POLICUBETAS CON COLORACIÓN FINAL
CULTIVOS EN SUSPENSIÓN
CULTIVOS EN SUSPENSIÓN
FRASCOS ESTÁTICOS
BOTELLAS RODANTES (ROLLERS)
CULTIVO EN MICROCARRIERS
BAJA DENSIDAD ALTA DENSIDAD
CULTIVOS EN MICROCARRIERS
SOPORTE
CÉLULAS
COMPONENTES DE UN CULTIVO
FASE GASEOSA
LA FASE GASEOSA
•La concentración de oxígeno necesaria
depende de los requisitos de las células
•La concentración de dióxido de carbono
depende de la capacidad buffer del medio de
Cultivo
•Usualmente el equilibrio dióxido de carbono (en la fase
gaseosa) - bicarbonato (en la fase líquida) actúa como buffer
del cultivo
LAS CONDICIONES DE CULTIVO
pH 7,4
Piruvato: aumenta el CO2 endógeno haciendo a la célula
independiente del CO2 externo
SOPORTE
CÉLULAS
COMPONENTES DE UN CULTIVO
FASE GASEOSA
MEDIOS DE
CULTIVO
CONDICIONES FÍSICO-QUÍMICAS, NUTRICIONALES Y
FISIOLÓGICAS DEL MEDIO DE CULTIVO
pH 7,4 fibroblastos normales 7,4- 7,7
células transformadas 7,0-7,4
células epidérmicas 5,5
Osmolaridad 260-320 mOsm/kg
Temperatura 37°C
Viscosidad
Tensión superficial
MEDIOS PARA EL CULTIVO DE CELULAS
1900-1932 ……extractos de tejidos, suero, plasma,
peptonas
1932……………importancia de los aminoácidos
1940……………plasma dializado + aminoácidos
1948……………medios definidos: V605
1950……………medios definidos: 199
1955……………medios definidos: Eagle (BEM; MEM)
MEDIOS: solución salina balanceada + nutrientes
Solución salina equilibrada
Aminoácidos esenciales
Vitaminas
Trazas de: Mg, Cu, Fe, Zn, etc.
Indicador de pH
Suero: aporta proteínas como fuente de nutrientes y
adhesión (fibronectina, fetuína)
inhibidores de proteasas
factores de crecimiento (EGF, FGF, PDGF)
hormonas (insulina, hormona de crecimiento)
Agua
COMPOSICIÓN DE MEDIOS DE
CULTIVO
CaCl2 0,02 ------- 0,14
KCl 0,04 0,20 0,40
KH2PO4 ---------- 0,20 0,06
MgCl2 x 6 H20 ---------- --------- 0,10
MgSO4 x 7 H20 0,20 --------- 0,10
NaCl 6,68 8,00 8,00
NaHCO3 2,20 --------- 0,35
Na2HPO4 x 7 H2O ----------- 2,16 0,09
NaH2PO4 x H2O 0,14 -------- --------
D-Glucosa 1,00 -------- 1,00
Rojo Fenol 0,01 -------- 0,01
Soluciones salinas (g/l)
Earle Dulbecco Hanks
Solución salina equilibrada
Aminoácidos esenciales
Vitaminas
Trazas de: Mg, Cu, Fe, Zn, etc.
Indicador de pH
Suero: aporta proteínas como fuente de nutrientes y
adhesión (fibronectina, fetuína)
inhibidores de proteasas
factores de crecimiento (EGF, FGF, PDGF)
hormonas (insulina, hormona de crecimiento)
Agua Inhibidores de crecimiento de contaminantes
COMPOSICIÓN DE MEDIOS DE
CULTIVO
Inhibidores del crecimiento de los contaminantes
Penicilina 100 UI/mL/ Estreptomicina 100 mg/mL
Penicilina 100 UI/mL/ Estreptomicina 100 mg/mL/ Fungizona
Gentamicina 50 mg/mL
Anfotericina B 2,5 mg/mL
CULTIVOS CERRADOS CULTIVOS ABIERTOS
MEM con sales Hanks MEM con sales Earle
NaHCO3 4mM 26mM
CO2 Atmosférico y producido 4-5%
por el cultivo
MEDIOS DE CULTIVO
INDICADOR DE pH
Rojo fenol
Amarillo
Rojo
CALIDAD DE AGUA PARA CULTIVO
Ósmosis reciclado continuo
reversa
Rec. Intermedio…..carbón.....deionización…… microfiltración
Destilador agua semi-pura agua ultra-pura
de vidrio
lavado de material medios de cultivo
ESTERILIZACÍÓN POR FILTRACIÓN
CON PRESIÓN NEGATIVA
Proteínas: nutrientes
adhesión (fibronectina)
inhibidores de proteasas
transportadores de minerales, ácidos grasos
Polipéptidos: factores de crecimiento: epitelial (EGF),
fibroblástico (FGF), plaquetas (PDGF)
Hormonas: insulina, hormona de crecimiento, hidrocortisona
Aminoácidos, glucosa, cetoácidos, Fe, Cu, Zn, Se, etc.
FACTORES NUTRITIVOS DEL SUERO
Esterilidad: sin crecimiento en caldos controles para bacterias
y hongos a temperatura ambiente y 37 °C.
Mycoplasma y virus: ausentes
Eficiencia de crecimiento: comparado con el crecimiento de
cultivos con suero control
Valor de pH (7,2-7,8)
Osmolaridad (290-310 mosm/l)
Contenido de endotoxina: menos de 2 ng/ml
Contenido de hemoglobina: menos de 20 mg %
Medios sin suero: Medio mínimo + factores de crecimiento y hormonas
Ej: para la línea HeLa: F12 + DMEM + insulina, transferrina, hidrocortisona
EGF, FGF
CONTROL DE CALIDAD DEL SUERO
¿CÓMO SE REALIZAN LOS
SUBCULTIVOS?
Objetivos:
i. Propagación de la línea celular
ii. Producción de células para la experimentación
Usualmente se realizan al llegar a confluencia.
Evitar que el medio de cultivo esté agotado.
CURVA DE CRECIMIENTO
Número de pasajes:
es el número de veces que un cultivo ha sido
subcultivado.
Número generacional:
es el número de veces que la población celular se
duplicó
ORGANIZACIÓN DE UN SUBCULTIVO
• El objetivo de un subcultivo (pasaje) es mantener las células en condiciones de replicación normal.
• En el subcultivo se renueva el medio de cultivo y se lleva la relación células/medio/superficie de soporte a la inicial.
• Las células adheridas a soportes sólidos deben ser primero despegadas de este soporte y separadas enzimáticamente (tripsina). Luego se resuspenden, se tiñen con colorante vital (Azul Tripán) y se cuentan en cámara de Neubauer.
• Si se parte de un cultivo de células en suspensión directamente se procede a contar las células.
• Una vez conocida la concentración de células en el
material de origen, se definen las condiciones del
subcultivo deseado y se realiza el pasaje.
– Ejemplo
• Material de origen: 2x106 cél/ml
• Destino: tres botellas de 175 cm2 con una
concentración inicial de 35000 cél/cm2
• Necesidad: 3 x 175 x 35000 = 1,8x107 células
• 1,8x107 células / 2x106 cél/ml = 9 ml (3 ml/botella)
ORGANIZACIÓN DE UN SUBCULTIVO
Monocapa crecida
a confluencia
Remoción del medio
Tripsina
Remoción de
tripsina
Redondeamiento
celular
Resuspensión en
medio
Re-siembra en
nueva botella
Diseminación
celular
FACTORES CRÍTICOS
• Temperatura de cultivo: depende del origen de las células.
Mamíferos: 37ºC, peces e insectos: 18 – 22ºC, aves: 38,5ºC,
etc.
• Contaminaciones: gran complicación en los laboratorios de
cultivos celulares, principalmente a escala industrial. Pueden
deberse a levaduras, hongos, virus, bacterias, Mycoplasma,
otras células, etc.
• Orden
• Limpieza
• Higiene personal
• Vigilancia microscópica
• Estudio adecuado de los problemas
• Análisis de problemas potenciales
• Trazabilidad de los cultivos
• Protocolización exhaustiva
FACTORES CRÍTICOS
NO BIOLÓGICOS
POR LO TANTO...
Los cultivos celulares pueden ser una
herramienta poderosa si se conducen
apropiadamente o una gran pérdida de
tiempo y dinero cuando se trabajan
desordenadamente