I rch. Soc. Cal. Biol., ! ol. 41 (1990) 79-88

CARACTERITZACIO ECOFISIOLOGICA D'UN MUTANT DERHODOBACTER SPHAEROIDES DEFICIENT EN LA SINTESIDE CAROTENOIDES

J. MAS-CASTELLA ', E. BALADA2 , E. FONTANET2, A. PICON2, C. QUINTANA2 1

J. URMENETA-

'Ucpartatnent de ijicrohiologia. Universitat de Barcelona.Facultat de Biologia . Universitat de Barcelona.

SUMMARY

A mutant strain of Rhodobacter sphaeroides, altered in carotenoid biosynthesis. was compared

to the wild type in relation to the physiological response of both strains to different light intensities

(230-925 lux). Absorption spectra analysis showed that spheroidene, the main carotenoid present

in this species, was substituted by chloroxanthin (hydroxyneurosporene) in the mutant strain. The

mutation does not affect significantly the growh of the mutant under neither photoorganohetero-

trophic nor chemoorganoheterotrophic metabolisms.

Mutant cells growing anaerobically at light intensities below 800 lux, surprisingly showed higher

growth rates than wild type cells. At light intensities above 800 lux, growth rates of both strains

were very similar. Growth rates in chemoorganotrophic metabolism were much higher than in

photoorganotrophic growth for both strains. Although pigments do not intervene in non-

photosynthetic metabolism, the wild type strain showed a higher growth rate than the mutant

strain.

In addition to growth rate measurement, pigment content was studied in order to characterize

the physiological behaviour of the mutant. In the wild type strain, specific pigment content

decreased as light intensity increased. Bacteriochlorophyll and carotenoids showed the same

response. On the contrary, for the mutant cells, bacteriochlorophyll specific content was much

higher at high light intensities than at the lower ones. Carotenoids had very low specific content.

which was independent of light intensity. Both the physiological implications and the possible

ecological meaning of that behaviour are discussed.

Paraules clau : Rhodobacter sphaeroides, mu- Key words: Rhodobacter sphaeroides, pigmenta-

tants de pigmentacio, velocitat i taxa de creixe- tion mutant strains, bacterial growth rate, chloro-

ment en bacteris, cloroxantina, bacteriocloro- xanthin, bacteriochlorophyll a. light intensity.

fil•la a, intensitat de Ilum.

80 .1 tI l.S-C 1STELL. i, E. B.1LAD,1, E. FONIANEI..1. PIC•ON, C. QL'INlANA /J. LRMMENE1A

INTRODUCCIO

Rhodobacter sphaeroides es un bacterifototrofic anoxigenic que es troba inclos enel grup de bacteris vermeils no del sofre al"Bergey's Manual of Systematic Bacteriol-ogy" (PFENNIG i TRUPER, 1989). Anterior-ment, a aquest grup se li havia donat lacategoria de familia, a la qua] s'anomena-va Rhodospirillaceae. Com a membre d'a-quest grup, pot creixer aerobicament ianaerobicament. En cas de creixer en ab-sencia d'oxigen, 1 en presencia de Hum icompostos organics, porta a terme un me-tabolisme fotoorganoheterotrofic. En pre-sencia d'oxigen (tingui o no tingui Ilum),passa a realitzar un metabolisme qui-mioorganoheterotrofic.

La clau del seu creixement a la Hum enanaerobiosi es la presencia de pigmentsfotosintetics, molecules que permeten albacteri captar determinades longituds d'o-na de la hum que li aporten energia. Elsdos principals grups de pigments fotosinte-tics son les bacterioclorofil•les 1 els carote-noides. Tots els bacteris vermells contenenbacterioclorofil•la a o h, pero el color tipi-cament verd d'aquesta molecula queda,en molts casos, totalment emmascarat pelscarotenoides, que son de color variable,normalment de tonalitats vermelles o mar-rons. Al Ilarg de 1'evoluci6, els bacterisfotosintetics han gnat adoptant aquellspigments que, segons el ninxol ecologicque ocupaven, realitzaven de la manerames eficac llur funcio de captacio de I'e-nergia Iluminosa. Aixf doncs, hom potpensar que els bacteris mutants que tenenalterada la via de sintesi dels pigmentspresenten un inconvenient selectiu enversles cel•lules salvatges.

Els bacteris fotosintetics regulen el seucontingut de bacterioclorofil•la 1 carotenoi-des, aixf com la seva velocitat de creixe-ment, en funcio de la quantitat de Ilumque reben. En el present treball hem estu-diat la variacio d'aquests parametres en la

soca tipus de R. sphaeroides i en una socamutant de color verd, quan ambdues crei-xen amb diferents intensitats de Hum.Quan hi ha oxigen en el medi, s'inhibeix lasintesi de pigments fotosintetics 1 s'indueixel metabolisme quimiotrofic; al mateixtemps, hi ha una progressiva disminuciodel contingut cellular de pigments. Enaquestes condicions, 1'energia necessariapel creixement s'obte de l'oxidacio decompostos organics. La soca mutant haestat tambe estudiada respecte de la socasalvatge en relac16 al creixement quimio-heterotrofic en presencia d'oxigen.

Es reconeixen als carotenoides dues fun-cions essencials. Una es la de proteccio deles molecules de bacterioclorofil•la de lafotooxidacio produida per la irradiacio ex-cessiva, i 1'altra es 1'absorci6 selectiva de laradiacio entre 450 i 550 nm de longitudd'ona (PFENNIG, 1967). L'energia absorbi-da pets carotenoides passa a la bacterioclo-rofil.la mitjancant un fenomen anomenat"conversio interna".En cultius de R. sphaeroides es relativa-

ment frequent observar l'aparicio esponta-nia de mutants que presenten una colora-cio verda o verd blavosa. Aquests mutantstenen alterada la sintesi dels carotenoides.L'objectiu d'aquest treball es investigar lescaracterfstiques fisiologiques d'un mutant,anomenat CrtD, que es deficient en la sin-tesi de carotenoides de color vermell. Homdiscuteix quina explicacio fisiologica oecologica rau sota 1'elevada frequencia d'a-quest tipus de mutac16.

Els bacteris amb fotosfntesi anoxige'nicaforen els primers organismes fototroficsque aparegueren sobre la Terra. Mes tard,amb 1'aparici6 dels cianobacteris, la con-centracio d'oxigen en I'atmosfera va aug-mentar notablement. Els microorganismeshavien viscut fins aqueila epoca amb unmetabolisme totalment anaerobic (fotosin-tetic o fermentatiu), pero aleshores varencomencar a utilitzar oxigen per oxidarcompostos organics, descobrint una nova 1

C.1RA(TL,R/TZ.4C16 ECOEISIOLOGICA D'C'N ,%ICTANT DE RHODOBACTER SPHAEROIDES

DEFICIENT EN L4 SINTESI DE CAROTENOIDES 81

mes rendible manera d'obtenir energia. A

traves de 1'evoluc16, alguns microorganis-

mes han conservat els dos tipus de meta-

bolisme, com ara els bacteris vermells no

del sofre, els quals poden adaptar-se a dife-

rents ambients naturals amb elevades pos-

sibilitats de supervivencia. El fet que bac-

teris com ara Rhodobacter presentin, avui

en dia, aquesta dualitat fisiol6gica, permet

considerar-los com a "fossils" metab6lics.

MATERIAL I METODES

Soques bacterianes i medi de cultiu

En aquest treball s'han utilitzat dues so-ques de Rhodobacter sphaeroides: una desalvatge, que es la soca tipus 2.4.1 (ATCC17023), i una coca mutant verda (CrtD),

que to alterada la sintesi de carotenoides.

Les soques procedien del grup del Dr. Jor-

di Barbe, del Departament de Genetica i

de Microbiologia de la Universitat Aut6-

noma de Barcelona. El medi de cultiu uti-

litzat ha estat el "Luria Broth" (LB).

Condicions de cultiu fototrofic

Els cultius fototr6fics es van realitzar en

absencia d'oxigen en tubs de tap de rosca

de 30 mL de capacitat, plens completa-

ment. En els tubs es deixava, pero, una

petita bombolla d'aire de la mida aproxi-

mada d'un pesol per tal d'evitar un impor-

tant increment de la pressi6 del liquid per

canvis de temperatura. En cada tub es

col•locava 3 mL d'un cultiu previament

adaptat al creixement fototrofic i poste-

riorment s'omplien amb medi LB esteril.

Els cultius s'incubaven a temperatura am-

bient (29 'C aproximadament -mes de ju-liol) i a diferents intensitats de Hum, 230,

370 i 925 lux. La font de Hum era una

bombeta incandescent blanca de 60 W. Els

valors de la intensitat de Hum van ser me-

surats amb un lux6metre Lutron Lx-101.

Es van prendre mostres de 10 mL als

3 dies, recollint les cel•lules per centrifuga-

ci6 durant 15 min a 4000 rpm i a 4 'C. Els

sediments de cel•lules obtinguts es van

congelar a -20 'C fins al seu processament

posterior.

Condicions de cultiu quimiotrofic

Es van posar 10 mL de medi LB esteril,

dins de tubs de 50 mL de capacitat. Es van

inocular amb 0,2 mL (2 % v/v) d'un cultiu

de nit del microorganisme. Els cultius es

van incubar a 30 'C a la foscor amb una

agitaci6 continua de 200 rpm. Tot el con-

tingut de diferents tubs a diferents inter-

vals de temps es va centrifugar a 4000 rpm

durant 15 min a 4 'C. Els sediments de

cel•lules obtinguts es van congelar a -20 'C

fins al seu processament posterior.

Absorbancia i nombre de cel•lules

La biomassa cellular dels cultius es vaestimar mesurant - ne l'absorbancia a650 nm en un colorimetre Coleman 6/20.Paral • lelament, es van realitzar enumera-cions totals de cel • lules a part

1rde mostres

de cultiu fixades amb formaldehid a unaconcentraci6 final del 10 % (v/v). Un vo-lum de 0 , 1 mL de la suspensi6 cellularfixada era estes, dins una superficie d' Icm', en un portaobjectes i fixat a la flama.Les cel • lules es van tenyir amb blau demetile. Amb 1'enumerac16 dels bacterispresents dins un nombre significatiu decamps del microscope , s'aconsegueix unabona estima de la concentraci6 de cel•lulesen el cultiu.

Determinacio de la concentraciode pigments i de I'espectre d'absorcio

Els pigments dels sediments cel•lularsdels cultius fototrofics i quimiotr6fics es

82 ./ If IS -c ISITLL I, li. B.IL.ID I, h le%I.IAk1. 1 /'kOv, c. (X/ALI:A.I /./. I R 1 1L.AL/I

van extreure amb una dissolucio d'acetonai metanol (7:2 v/v). Un cop descongelats,els sediments es van resuspendre en 1 mLd'aigua destil•lada i a la suspensio s'afegi-ren 9 mL de la mescla de dissolvents. Des-pres d'estar 90 min a 4 'C i protegida de laHum, la suspensi6 es va centrifugar a 6000rpm durant 15 min . Es va mesurar I'absor-bancia del sobrenedant a longituds d'onade 488, 775 i 830 nm . La concentracio debacterioclorofil • la a al sobrenedant es vacalcular (CLAYTON, 1963) utilitzant el coe-ficient d'ext1nc16

P-,,, = 75 L mmol ' cmLa concentrac16 de carotenoides es va

calcular segons la formula:carotenoides ( pgL ') = 3,3 ( A488-A830) V Von A,c es I'absorbancia corresponent a lalongitud d'ona x, v es el volum d ' extracte iV es el volum del cultiu utilitzat. Es vadeterminar 1'espectre d'absorci6 dels so-brenedants des de 300 fins a 900 nm delongitud d ' ona amb un espectrofot6metreShimadzu UV-265 FW.

Determinacio de la concentraciode proteines

Els sediments cel-lulars es digeriren ambI mL d'una dissolucio de NaOH 1 N du-rant I h a 100 V. Es va determinar laconcentracio de proteines de i'extractemitjancant el metode de Bradford (BRAD-FORD, 1976). Com a estandar es va uti-litzar albumina de serum bovi (Sigma).

RESULTATS

En la figura I A I I B es presenten, respec-tivament, els espectres d'absorcio de lessoques salvatge i mutant (CrtD) de Rhodo-hacter sphaeroides. Per a cada soca s'obser-ven diferents pics d'absorc16 maxima, laqual coca indica la diferent composicio enpigments de cadascuna. La soca salvatge

presenta pics d'absorcio maxima a 586,2 i767,6 nm (que corresponen a la bacterio-clorofil•la a) i a 431,6, 456,0 i 487,0 nm(que corresponen al carotenoide esferoi-de). L'esferoide es el carotenoide que pre-senta normalment R. sphaeroides. La socamutant CrtD, que es de color verd, mostrapies d'absorc16 maxima a 583.8 i 770,8 nm(bacterioclorfil.la a) i a 416,4, 441,0 i470,4 nm (els quals corresponen al carote-noide cloroxantina). L'esferoide no es de-tecta a les cel lutes del mutant verd, elprincipal carotenoide d'aquest mutant es,en canvi, la cloroxantina. Els espectresd'absorc16 de cadascuna de les soques erenpracticament iguals tant si les cel•lules ha-vien crescut en condicions fototr6fiquescom si ho havien fet en condicions qui-miotr6fiques (espectres no mostrats).

La soca mutant CrtD es capac de creixerfotosinteticament en condicions que sonfavorables per al desenvolupament foto-sintetic dels bacteris vermells no del sofre.Aixi doncs, l'alteracio de la sintesi de caro-tenoides no afecta d'una manera conside-rable I'eficiencia del seu sistema fotosinte-tic. D'igual manera, la soca mutant escapac de creixer en condicions de metabo-lisme quimioheterotr6fic en presencia d'o-xigen. Les possibles diferencies fisiol6gi-ques entre ambdues soques no alteren,doncs, d'una manera radical, les possibili-tats de desenvolupament en el mateix ti-pus d'ambients naturals.En el present treball hem trobat diferen-

cies fisiol6giques en la resposta a la humde Ies dues soques. En la figura 2 es mostra1'efecte de diferents intensitats de Ilum so-bre la taxa especifica de creixement (µ).Per a ambdues soques, una major intensi-tat de Hum determina una major velocitatde creixement. Els treballs pioners sobre eltema (SISTROM et al., 1956 b) mostravenque la soca tipus tenia velocitats de creixe-ment mes altes que una soca mutant simi-lar, ja que la funcio fotosintetica del mu-tant era deficient respecte de la del tipus

C'.lRI(7TRIIZACIO 1-.COFISIOLOGIC.1 DUN 51CT4V T DE RHODOBACTER SPHAEROIDES

DEFICIENT EN LA S%NTESI DE C'AROTENOIDES 83

A0.5 i T 0.5

µ (h )

0,04

003

0,02

00,01

R svnaero!des wl

R sphaero^des CrD

0,00 i---^ I

200 400 600 800 1000

Intensitat de hum (lux)

700 500 700 900

O'S

Bis

0.5

.0.5

300 T500 700

.0.5

1.5

0.5

+-03

900

Fig. I. Espectres d'absorcio d'extractes d'acetona-

metanol de la soca salvatge (A) i del mutant CrtD (B)

de Rhodohacier sphaeroides. L'espectre compren Ies

longituds d'ona des de 300 fins a 900 nm.

salvatge. En aquest estudi , pero, cal ma-titzar les diferencies de velocitat de creixe-

ment entre les soques segons el marge d'in-

tensitats de Hum que considerem . A baixesintensitats de Hum, la p es mes alta en el

mutant (0,015 h ') que en la soca salvatge

(0,009 h '). Aquests valors , pero , tendei-

xen a igualar-se quan la intensitat de la

hum s'incrementa , arribant a esser practi-

cament equivalents (0,030 h ' per a la soca

Fig. 2. Representacio grafica de la relacio existententre la taxa especifica de creixement (it) i la intensi-tat de Hum amb que s'il•lumina el cultiu fototrofic dela soca salvatge i de la mutant CrtD de Rhodohactersphaeroides.

salvatge 1 0,028 h-' per a la soca mutant) ala intensitat maxima (925 lux) emprada.

Malgrat les diferencies entre les taxes de

creixement de les dues soques, podem afir-

mar que les seves respostes fisiologiques, a

diferents intensitats de Hum, son qualitati-

vament similars: sembla que les dues so-

ques s'acostin a la velocitat maxima de

creixement quan el marge d'intensitats uti-

litzat esdeve maxim. AixO es consequencia

directa del fet que la Hum, en aquestes

condicions de creixement, sigui 1'6nica

font d'energia.En condicions de creixement quimiohe-

terotrofic, hem obtingut taxes de creixe-

ment de 0,052 h ' en el mutant CrtD 1 de0,067 h ' en la soca salvatge. La diferencia

amb respecte a les velocitats de creixementfotoheterotrofic es notable: en creixementquimioheterotrofic la velocitat es doble

que en el fotoheterotrofic. Encara que les

cel•lules utilitzin els mateixos compostos

organics (el medi de cultiu es el mateix),

no ho fan a traves de les mateixes vies

metaboliques. La utilitzacio de compostos

organics en condicions quimioheterotrofi-

ques produeix mes energia que el metabo-

lisme fotoheterotrofic. Tanmateix, consi-derant que I'oxigen inhibeix la sintesi de

pigments i que aquestes molecules no in-

84 .i_ ,ISI t. ri lr _ln.I, r.. 10A r tn^.I, L PR n.v. (. C)l IA .l.v,I I.1 t x tL.V/;I I

A

20

E

10-

Z

0200

B

aE

6

00 5

41

31

210

011

0200

0- R sphaeroides wi

R sphaoroides COD

400 600 800

Intensitat de Hum (lux)

R sphaeroides WI

R sphaerades CID

400 600 800

Intensilat de hum (lux)

1000

O

1000

Fig. 3. Representacib grafica de la relacio existententre el contingut especific de bacterioclorofil•la a (A)i de carotenoides (B) de les soques salvatge i mutantCrtD il•luminades amb diferents intensitats de Hum.

tervenen en el metabolisme quimiohete-rotrofic, esperarfem velocitats de creixe-ment similars en les dues soques (STANIERi COHEN-BAZIRE, 1957). Els nostres resul-tats mostren que la soca salvatge creix mesrapidament que la mutant en presenciad'oxigen.En la figura 3A i 3B es mostren, respecti-

vament, el contingut especific de bacterio-clorofil.la a i de carotenoides de les duessoques en creixer a diferents intensitats deHum. Per a la soca salvatge, el contingutespecific de bacterioclorofil•la a i de caro-tenoides es inversament proporcional a laintensitat de llum. Aquesta es la respostahabitual dels organismes fotosintetics a di-ferents intensitats de Hum. Una intensitatde Hum maxima determina un contingutespecific minim de pigments fotosintetics.

Tanmateix, el mutant CrtD veu incremen-tat d'una manera accentuada el seu contin-gut especific de bacterioclorofil•la a en lescel•lules a intensitats de Ilum elevades,mentre que la concentraci6 de carotenoi-des es baixa a qualsevol intensitat de Humanalitzada.

El concepte de taxa de creixement, suarautilitzat, representa el valor invers deltemps que triga la biomassa de la poblacioen fer-se el doble. En la figura 4 es mostrala relacio existent entre 1'absorbancia a50 nm i el nombre de cel•lules d'un cultiufototrofic de R. sphaeroides per a la socasalvatge (Fig. 4A) i la mutant (Fig. 4B). Enaquest estudi hem determinat I'absorban-cia d'un cultiu a 650 nm de longitud d'onacom a estima del valor de la biomassabacteriana. Per comprovar I'exactitud d'a-questa estima, s'han comparat els valorsobtinguts mitjancant 1'absorbancia, que esuna mesura indirecta, amb el nombre totalde cel•lules presents al cultiu, que es unamesura directa.

DISCUSSIO

Encara que Rhodobacter sphaeroidespresenta normalment unes colonies de co-lor vermell , es relativament frequent ob-servar en les plaques de Petri colonies ambcoloracions diferents de l'habitual , que sonmutants espontanis que tenen alterada lavia de sintesi de carotenoides. Per exem-ple, la coca Ga es de color verd i acumulaanormalment neurospore i cloroxantina(SISTROM, 1978). El fet que la soca mutantCrtD emprada en aquest treball s'obtingui-i a la vegada reverteixi al fenotip salvat-ge-, amb una elevada frequencia (EloiGari, com . pers. ), obliga a pensar en elpossible significat ecofisiolbgic d'aquestamutacio. Els gens que regulen la sintesi decarotenoides estan situats molt a prop delsde la sintesi de bacterioclorofil • la en algu-nes Rhodospirillaceae ( MARRS, 1981). En

IR.U'I) RI"IL.I( 10 L( 0I'J.S70LOUI( I/)(.% Aft IAA/ 1)1i RHODOBACTER SPH.AEROIDES

DEFICIENT E.N L4 SINTESI DE ('.9ROTENOIDES 85

A

C

c = 5.43(7 + 3.9079x R^2 = 0.847

7

0,6 0,7 0,8 0,9

A nvi

y = 6.4166 + 2.7038x R^2 = 0.878

7 10,4 0,6 0,8 1,0

A nw

1,2 1,4

1,0

1,6

Fig. 4. Representacio grafica de la relacio existententre I'absorbancia a 650 nm (A550) i la concentraciode cel-lules en un cultiu fototrofic de la soca sale atge(A) i la soca mutant CrtD (B) de Rhodohacter sphae-,Aoide'o.

R. sphaeroides, quasi tots els gens dedicatsa I'aparell fotosintetic es troben en un frag-ment de 45 kb i es regulen fonamental-ment per I'efecte de la Ilum i 1'oxigen(CHAUDHRI et al., 1988). Es tracta, pertaut, d'un cas de regulaci6 genica per fac-tors ambientals, corn ara la Ilum.

El carotenoide que es troba habitual-ment en R. sphaeroides es l'esferoide (TRU-PER i PFENNIG, 1981). La cloroxantina ohidroxineurospore, que es l'unic carotenoi-de que hem detectat a la soca mutantCrtD, es un component de la via de sinteside I'esferoide (SCHMIDT, 1978). La figura 5mostra un esquema d'aquesta. via metab6-lica. En les cellules mutants, esta blocada]a dessaturaci6 entre els carbonis en post-c16 3-4, essent la cloroxantina I'ultim pro-ducte de la sintesi. Dc fet, en el cas de

Rhodopseudornonas capsulata, s'ha propo-sat que el gen que governa el pas de cloro-xantina a 1'esferoide desmetilat es el gencrtD (SCOLNIK et al., 1980).En R. sphaeroides, la presencia d'oxigen

inhibeix la sintesi de pigments fotosinte-tics (SISTROM et al., 1956 a). Aixi doncs,en aquestes condicions, no es pot donar uncreixement de tipus fototr6fic. L'aparici6d'oxigen en els cultius determina el canvid'un metabolisme fototr6fic a un de qui-miotr6fic. Aquest comportament es potexplicar amb el fet que les condicions qui-miotr6fiques son mes avantatjoses energe-ticament per a R. sphaeroides que les fo-totr6fiques, com ho demostren les sevesrespectives taxes de creixement (Fig. 2). Sila soca mutada nomes tingues afectats elscomponents de 1'aparell fotosintetic, encondicions quimiotr6fiques hauria de pre-sentar les mateixes caracteristiques de crei-xement que la soca salvatge, ja que 1'apa-rell fotosintetic no interve en aquest tipusde metabolisme. S'observa que la velocitatde creixement de la soca mutant CrtD esinferior a la de la coca salvatge. Aix6 fapensar que la mutaci6 tambe pot afectaralgun altre aspecte, encara que potser nomassa important, del metabolisme generalde la cel-lula.

La figura 3 mostra que la soca salvatgede R. sphaeroides, quart creix fototr6fica-ment, to un contingut especific de pig-ments inversament proporcional a la in-tensitat de Hum que rep. Aquest fenomen,que es prou conegut en molts organismesfotosintetics, tambe s'ha demostrat enaquesta especie (SISTROM et al., 1956 a;STANIER et al., 1957). Aquest mecanismede regulac16 to un valor adaptatiu evident.En disminuir la intensitat de la llum, l'or-ganisme s'adapta tot augmentant conside-rablement la sintesi de pigments. Des delpunt de vista energetic, produir mes pig-ments es un clar avantatge per als organis-mes fototr6fics, que poden aprofitar millorla baixa disponibilitat de Hum. Tambe els

86 J. AIMS-(' ISI'LLLA, li. B.ILID.1 , Ii. 1.7)N7 11NET, .1. /'/(Y)9. C. Q('1S'L.I v 1 1.1. LR.t/E.Vi II

NeurosporO

OH

Cloroxanlina

Pas 1: IIIDRATAC16

1 Pas 2 : DESSATCRAC16

ErferoidO desmelilal

1 Pas 3 : METILACIO

F,feroide

(11'oA

Fig. 5. Esquema de la via biosintetica del carotenoide

esferoid e en ceflules de Rhodobacter sphaeroides.

(Adaptat de SCHMIDT, 1978.)

resulta beneficios reduir la sintesi quan la

Hum es forca abundant, ja que aixo suposa

un estalvi energetic important per a la

cel•lula.

La soca mutant verda CrtD presenta un

comportament diferent respecte a la rela-

cio existent entre la sintesi de pigments i la

intensitat de Hum. En la figura 3B s'obser-

va que el contingut especific de carotenoi-

des de CrtD es inferior at de la soca salvat-

ge. A mes, la sintesi de carotenoides en

CrtD no esta influenciada per les varia-

cions en la intensitat de llum, ja que la

seva concentrac16 d'aquests pigments es

mante constant. En la figura 3A hom pot

observar que el contingut especific de bac-

terioclorofil.la a en funcio de la intensitat

de Ilum presenta una resposta completa-

ment diferent. A mesura que augmenta la

intensitat de Hum, augmenta tambe el con-

tingut especific de bacterioclorofil•la a,

fins a un valor de 19 pg per mg de protef-

na, mentre que en la soca salvatge dismi-

nueix fins a 3.tg mg I protefna. El fet queels carotenoides tambe tinguin una funcioessencial en la fotosintesi (ja que actuencom a captadors de Ilum de diferents Ion-gituds d'ona, alhora que protegeixen labacterioclorofil•la de la fotooxidacio), fapensar que la menor eficiencia dels carote-noides de la soca mutant es corregida perun augment important en la sintesi de bac-terioclorofil.la a.En la figura 2 hom pot observar que, a

baixes intensitats de Ilum, el mutant CrtD

presenta taxes de creixement mes elevades

que la soca salvatge; i que ambdues tendei-xen a igualar-se a altes intensitats. Tanma-teix, les dues soques tenen respostes quali-

tativament similars: s'aproximen a veloci-tats maximes a mesura que augmenta laintensitat de la Hum. Aquest comporta-ment es valid per al marge d'intensitatsconsiderat (230 a 925 lux).

Les implicacions ecologiques de la in-fluencia de la intensitat de la Ilum sobre lavelocitat de creixement han estat discuti-des en el cas dels bacteris vermeils i verdsdel sofre integrants dels tapets microbians,

que son comunitats bentOniqucs (MACK iPFENNIG, 1988). En les comunitats

planctoniques, la Hum 1 el sulfhidric sonels factors essencials que regulen la distri-bucio de les poblacions, com es el cas deChromatium i de Chlorobium en la (lacunade C1s6 (GuERRERO et al., 1985).

Del nostre treball es pot deduir que, abaixes intensitats de Hum, el desenvolupa-ment mes rapid de poblacions del mutantCrtD respecte a la soca salvatge podriapermetre, per exemple, una estratificacioen fondaria en les masses d'aigua [on tam-

be es poden trobar les Rhodospirillaceae.d'acord amb BIEBL i PFENNIG (1981)]. En

un cas hipotetic, a partir d'un cert valord'intensitat de Hum, Ies cel•lules de la socasalvatge es situarien per damunt (en la co-lumna d'aigua) de les cel•lules de la socamutant, ja que les primeres es desenvolu-

parien mes rapidament. S'ha de tenir en

('.-I RACTERIIZ.I (YO LCOFISIOLOGI('.l D'(\' .t1 U1A.VI Dli RHODOBACTER SPHAEROIDESDEFI('IENT EN LA SINTESI DE C'AROTENOIDES 87

compte que la intensitat de la Hum dismi-

nueix en augmentar la fondaria. Tanma-

teix, per sota d'una intensitat de Hum do-

nada, les cel•lules de la soca mutant supe-

rarien en nombre les cel•lules salvatges en

un temps determinat. Fent una simplifica-

ci6, es pot pensar en una situaci6 en que

les cel•lules de la soca salvatge predomina-

rien durant el dia, quan la radiaci6 solar es

important, i que durant la nit, quan la

intensitat de Hum disminueix, la soca mu-

tant seria la dominant. L'observacio que

mutants de Rhodopseudomonas capsulata,incapacos de sintetitzar pigments, tenen

un avantatge selectiu quan creixen en

anaerobiosi i a la foscor (MADIGAN et al.,

1982) d6na suport a aquesta hipotesi.Les observacions del nostre treball ens

fan reflexionar sobre quina es la causa que

les poblacions microbianes naturals esti-

guin integrades per deferents soques d'una

mateixa especie. En el medi natural,

aquestes soques provenen normalment de

mutacions espontanies. Corn a consequen-

cia del dissemblant genotip, poden presen-

tar tambe un fenotip distint, el qual deter-

mina un comportament diferent envers lesvariacions dels factors ambientals. El tre-ball que presentern pot ajudar a compren-dre el que hi hagi, dins una mateixa pobla-ci6 de bacteris fotosintetics aquatics, dife-rents soques, caracteritzades per una dife-

rent composici6 de pigments, que poden

haver-se adaptat a les diferents intensitats

de hum que travessen la columna d'aigua.

Aquest cas il•lustra excel•lentment la ne-

cessitat d'estudiar l'ecologia i la genetica

dels microorganismes com un conjunt in-

dissoluble, si volem esbrinar el vertaderpaper de les poblacions microbianes natu-rals en els ecosistemes.

AgraIments

Aquest article es resultat del treball d'unsalumnes de 4rt curs (1989-90) de la Facultat deBiologia en continuar uns experiments que for-

maven part de les practiques d'Ampliaci6 de

Microbiologia. Els autors agraeixen l'ajut de

tots els altres alumnes que participaren en les

mateixes practiques; citar-los aqui, pero, resul-

taria massa llarg, encara que sense llur col•labo-

raci6 aquest treball no hauria estat possible.

Tambe agraeixen la cessi6 de les soques bacte-

rianes i les orientacions rebudes del Dr. Jordi

Barbe i d'Eloi Gari, del Departament de Gene-

tica i de Microbiologia de la Universitat Auto-

noma de Barcelona. Finalment, els autors re-

mercien la col•laboraci6 en la preparaci6 de

Particle de Pere Lopez Reverte, la revisi6 del

catala pacientment portada a terme per Merce

Piqueras, i el continu encoratjament i assesso-

rament cientific del Prof. Ricard Guerrero, Ca-

tedratic de Microbiologia de la Universitat de

Barcelona.

BIBLIOGRAFIA

BIEBL, H. i N. PFENNI(. 1981. Isolation of members

of the family Rhodospirillaceae. En: The Prokaryo-tes. A Handbook on Habitats, Isolation, and Iden-tification of Bacteria. M.P. Starr, H. Stolp, H.G.Triiper, A. Balows i H.G. Schlegel (eds.). Vol. 1.Springer-Verlag. pp. 267-273.

BRADFORD, M.M. 1976. A rapid and sensitive

method for the quantitation of microgram quanti-

ties of protein utilizing the principle of protein-dye

binding. Anal. Biochem. 72:248-254.

CHAUDHRI, M.P., S.A. COOMBER i C.N. HUNTER.

1988. Light and oxygen regulated promoters of the

photosynthetic gene cluster of Rhodobacter sphae-

roides. Llibre d'abstracts del VI International

Symposium on Photosynthetic Prokaryotes.

Noordwijkerhout, Holanda. p. 226.

CLAYTON, R.K. 1963. Toward the isolation of aphotochemical reaction center in Rhodopseudomo-nas sphaeroides. Biochem. Biphys. Acta 75:312-323.

GUERRERO, R., F. MONTESINOS, C. PEDROS-ALTO, 1.

ESTEVE, J. M.AS, H. van GEMERDEN, P.A.G. HOF-

MAN i J.F. BAKKER. 1985. Phototrophic sulfur bac-

teria in two Spanish lakes: Vertical distribution

and limiting factors. Limnol. Oceanogr. 30:919-

931.

MACK, E.E. i N. PFENNIC. 1988. Dependence ofgrowth rates on light intensities in purple and greensulfur bacteria from salt marsh microbial mats.Llibre d'abstracts del VI International Symposiumon Photosynthetic Prokaryotes. Noordwijkerhout,Holanda. p. 177.

88 -C'.IsUhT/. i. E. BALI/)A, li. FONTINFT, A. P/cON, C. Qt7.ti'TFvT /./. t'R.tf/i,h'/i/I

MADIGAN, M., J.C. Cox i H. GEST. 1982. Photopig-ments in Rhodopseudomonas capsu/ata cells grownanaerobically in darkness. J. Bacteriol. /50.1422-1429.

MARRS, B. 1981. Mobilization of the genes for pho-tosynthesis from Rhodopseudomonas capsulata bya promiscous plasmid. J. Bacteriol. /46.1003-1012.

PFENNIG, N. 1967. Photosynthetic bacteria. Annu.Rev. Microbiol. 2/:285-324.

PFENNIG, N. i H.G. TRUPER. 1989. Anoxygenic pho-tosynthetic bacteria. En: Bergey's Manual of Syste-matic Bacteriology, Vol. 3. J.T. Staley, M.P.Bryant, N. Pfennig i J.G. Holt (eds.). Williams &Wilkins. pp. 1635-1709.

SCHMIDT, K. 1978. Biosynthesis of carotenoids. En:The Photosynthetic Bacteria. R.K. Clayton i W.R.Sistrom (eds.). Plenum Press. pp. 729-750.

SCOLNIK, P.A., M.A. WALKER i B.L. MARRS. 1980.

Biosynthesis of carotenoid derived from neurospo-

rene in Rhodopseudomonas capsulata. J. Biol.Chem. 255:2427-2432.

SISTROM, W.R., M. GRIFFITHS i R.Y. STANIER. 1956 a.

A note on the porphyrins excreted by the blue-green mutant of Rhodopseudomonas sphaeroides. J.Cell. Comp. Physiol. 48:459-472.

SISTROM, W.R., M. GRIFFITHS i R.Y. STANIER. 1956 b.The biology of a photosynthetic bacterium which

lacks colored carotenoids. J. Cell. Comp. Physiol.

48.•473-515.

SISTROM, W.R. 1978. Appendix: List of mutantstrains. En. The Photosynthetic Bacteria. R.K.Clayton i W.R. Sistrom (eds.). Plenum Press. pp.927-934.

STANIER, R.Y. i G. COHEN-BAZIRE. 1957. The role of

light in the microbial world: Some facts and specu-

lations. En: Microbial Ecology. 7th Symp. Soc.

Gen. Microbiol. Cambridge University Press. pp.

56-89.

TROPER, H.G. 1 N. PFENNIG. 1981. Characterization

and identification of the anoxygenic phototrophic

bacteria. En: The Prokaryotes. A Handbook on

Habitats, Isolation, and Identification of Bacteria.

M.P. Starr, H. Stolp, H.G. Triiper, A. Balows i

H.G. Schlegel (eds.). Vol. 1. Springer-Verlag. pp.

299-312.