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T h e e n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y ( E L I S A ) *T h e e n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y " ELISA " d e v e l o p e d i n r e c e n t y e a r s r e p -r e s e n t s a s i g n i f i c a n t a d d i t i o n t o e x i s t i n g s e r o l o g i c a l t o o l s . E n c o u r a g i n g p r e l i m i n a r y r e s u l t s

o b t a i n e d t h r o u g h i t s a p p l i c a t i o n t o a n u m b e r o f p a r a s i t i c d i s e a s e s d u r i n g t h e l a s t t w o y e a r si n d i c a t e t h e v a l u e o f f u r t h e r i n v e s t i g a t i o n s a n d t r i a l s w h i c h w i l l p e r m i t a t r u e e v a l u a t i o n .A l t h o u g h t h e t e c h n i q u e i s e a s y t o p e r f o r m a n d q u i t e s e n s i t i v e , t h e r e a r e c e r t a i n p r o b -l e m s t o b e s o l v e d b e f o r e i t b e c o m e s w i d e l y u s a b l e . I n t h e p r e s e n t Memorandum t h et e c h n i c a l d e t a i l s a r e g i v e n a n d t h e a d v a n t a g e s a n d s h o r t c o m i n g s o f t h e p r o c e d u r e a r ed i s c u s s e d . P r e s e n t a p p l i c a t i o n s a n d f u t u r e p r o s p e c t s a r e r e v i e w e d .

A n u m b e r o f s e r o l o g i c a l t e c h n i q u e s a r e c u r r e n t l yb e i n g a p p l i e d t o p a r a s i t i c d i s e a s e s . I n t e r p r e t a t i o n o ft h e r e s u l t s o b t a i n e d , h o w e v e r , i s r a t h e r d i f f i c u l t , e s p e -c i a l l y w h e n s p e c i f i c a n d w e l l - d e f i n e d a n t i g e n s c a n n o tb e u s e d . A t p r e s e n t t h e l a c k o f s p e c i f i c a n t i g e n s i s as e r i o u s h a n d i c a p , b u t w i t h p r o g r e s s i n r e s e a r c ht o w a r d s d e f i n i n g t h e c h a r a c t e r i z i n g p a r a s i t e a n t i g e n sa n d m a k i n g t h e m a v a i l a b l e , s e r o l o g y w i l l b e c o m ea m o r e u s e f u l t o o l .

A t t e n t i o n w a s d r a w n t o t h i s p r o b l e m d u r i n g ar e c e n t WHO c o n s u l t a t i o n i n G e n e v a , a t w h i c hv a r i o u s a s p e c t s o f p a r a s i t e a n t i g e n s w e r e d i s c u s s e da n d c o l l a b o r a t i v e p r o g r a m m e s w e r e s e t u p amongl a b o r a t o r i e s e n g a g e d i n w o r k o n a n t i g e n i s o l a t i o n .I t i s e x p e c t e d t h a t i n t h e n e a r f u t u r e s p e c i f i c a n t i g e n s ,p a r t i c u l a r l y o f P l a s m o d i u m , S c h i s t o s o m a , O n c h o -c e r c a , w i l l b e c o m e a v a i l a b l e . S u c h a n t i g e n s w i l l b es u b m i t t e d t o f i e l d t r i a l s i n w h i c h s e v e r a l e s t a b l i s h e ds e r o l o g i c a l m e t h o d s w i l l b e a p p l i e d i n p a r a l l e l a n dt h e r e s u l t s c o m p a r e d w i t h t h o s e o f c o n c u r r en t p a r a -

s i t o l o g i c a l e x a m i n a t i o n s . T h e s e t r i a l s w i l l p e r m i t a ne v a l u a t i o n n o t o n l y o f t h e a n t i g e n s b u t a l s o o f t h es e r o l o g i c a l t e c h n i q u e s . I t i s o n l y t h r o u g h p a r a l l e ls t u d i e s o f t h i s k i n d t h a t s e r o l o g y c a n b e p l a c e d i ni t s r i g h t c o n t e x t .E f f o r t s i n s e v e r a l l a b o r a t o r i e s i n r e c e n t y e a r s h a v el e d t o t h e d e v e l o p m e n t o f p r o m i s i n g n e w s e r o l o g i c a lt e c h n i q u e s . T h e e n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y( E L I S A ) , a n d i n p a r t i c u l a r i t s a p p l i c a t i o n t o p a r a s i t i cd i s e a s e s , w h i c h i s t h e s u b j e c t o f t h i s M e m o r a n d u m ,r e p r e s e n t s a s i g n i f i c a n t a d d i t i o n t o e x i s t i n g s e r o l o g i c a lt o o l s . T h e m e t h o d s e e m s p r a c t i c a l , e a s y t o p e r f o r m ,a n d q u i t e s e n s i t i v e . As w i t h a n y n e w t e c h n i q u e ,a n u m b e r o f p r o b l e m s m u s t s t i l l b e s o l v e d b e f o r eE L I S A b e c o m e s w i d e l y u s a b l e .E n c o u r a g i n g r e s u l t s h a v e b e e n o b t a i n e d w i t hELISA i n p r e l i m i n a r y c o l l a b o r a t i v e s t u d i e s a n d i ns o m e f i e l d a p p l i c a t i o n s i n m a l a r i a , t r y p a n o s o m i a s i s ,s c h i s t o s o m i a s i s , a n d t r i c h i n o s i s .

DESCRIPTION AND R EV I EW OF E L I S APRINCIPLE ( 8 , 9 , 2 1 )

I m m u n o e n z y m e m e t h o d s h a v i n g b e e n s u c c e s s f u l l ya p p l i e d t o t h e l o c a l i z a t i o n o f i n t r a c e l l u l a r a n t i g e n sb o t h a t t h e l i g h t a n d e l e c t r o n m i c r o s c o p e l e v e l , t h es a m e g e n e r a l p r i n c i p l e w a s e m p l o y e d t o d e t e c ts o l u b l e a n t i g e n s a n d a n t i b o d i e s i n b o d y f l u i d s .I m m u n o e n z y m e a s s a y s w e r e t h e r e f o r e d e v e l o p e d a sa l t e r n a t i v e s t o r a d i o i m m u n e a s s a y s .S p e c i f i c a n t i b o d i e s c a n b e e s t i m a t e d q u a n t i t a t i v e l yb y E L I S A . A f t e r i n c u b a t i n g t h e t e s t s e r u m i n a na n t i g e n - c o a t e d p o l y s t y r e n e t u b e o r p l a t e , e n z y m e -l a b e l l e d a n t i - i m m u n o g l o b u l i n i s a d d e d a n d t h e e n -

z y m e t h e n r e m a i n i n g i n t h e t u b e o r p l a t e a f t e r w a s h -i n g p r o v i d e s a m e a s u r e o f t h e a m o u n t o f s p e c i f i ca n t i b o d y i n t h e s e r u m . T h e t e s t r e l i e s o n t h e i n s o l u -b i l i z a t i o n o f a n t i g e n s b y p a s s i v e a d s o r p t i o n t o a s o l i dp h a s e , e . g . t h e p o l y s t y r e n e s u r f a c e .T h e s a m e a p p r o a c h m ay b e u s e d f o r t h e d e t e c t i o no f a n t i g e n s i n b o d y f l u i d s . A n t i g e n s p r e s e n t i n t h e

* T h i s M e m o r a n d u m w a s d r a f t e d b y t h e s i g n a t o r i e s l i s t e do n p a g e 1 3 6 . R e p ri n ts c a n b e o b t a i n e d f r o m t h e D i v i s i o n o fM a l a r i a a n d P a r a s i t i c D i s e a s e s , W o r l d H e a l t h O r g a n i z a t i o n ,1 2 1 1 G e n e v a 2 7 , S w i t z e r l a n d . A F r e n c h t r a n s l a t i o n o f t h eM e m o r a n d u m w i l l b e p u b l i s h e d i n a f u t u r e i s s u e o f t h eB u l l e t i n .3 4 9 8 1 2 9 - B U L L . WORL D H E A L TH O R G A N . , V o l . 5 4 , 1 9 7 6

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130 MEMORANDUM

t e s t s o l u t i o n m a y t h e n b e d e t e c t e d b y p e r f o r m i n go n e o f t h e f o l l o w i n g a s s a y s :( 1 ) A c o m p e t i t i v e a s s a y . U s i n g t u b e s c o a t e d w i t h

a n t i s e r u m , a known q u a n t i t y o f e n z y m e - l a b e l l e da n t i g e n , e m p l o y e d a s r e f e r e n c e a n t i g e n , i s m i x e dw i t h t h e unknown s a m p l e a n d t h e d e c r e a s e i nr e a c t i o n p r o d u c t i s p r o p o r t i o n a l t o t h e a n t i g e np r e s e n t i n t h e t e s t s o l u t i o n .

( 2 ) A d o u b l e - a n t i b o d y E L I S A . A f t er c o a t i n g t h et u b e w a l l w i t h a n t i b o d y , t h e t e s t s e r u m i s a d d e df o l l o w e d b y c o n j u g a t e c o n s i s t i n g o f t h e i n i t i a l a n t i -b o d y l a b e l l e d w i t h t h e e n z y m e . T h e r e a c t i o n p r o d -u c t i s p r o p o r t i o n a l t o t h e a m o u n t o f a n t i g e n i n t h et e s t f l u i d .

( 3 ) A n i n h i b i t i o n a s s a y . T h e t e s t f l u i d c o n t a i n i n ga n t i g e n i s i n c u b a t e d w i t h t h e s t a n d a r d a n t i s e r u m .T h e l e v e l o f t h e r e m a i n i n g a n t i b o d y i s t h e n m e a s u r e db y p e r f o r m i n g E L I S A i n a n t i g e n - c o a t e d t u b e s o rw e l l s .A l t h o u g h t h e u s e o f ELISA f o r a n t i g e n d e t e c t i o n

h o l d s s o m e p r o m i s e f o r d i a g n o s t i c p u r p o s e s i n p a r a -s i t i c d i s e a s e s a n d a l t h o u g h t h e m e t h o d ' s p o t e n t i a lf o r c l i n i c a l a p p l i c a t i o n i s r e c o g n i z e d , t h i s r e p o r t w i l lp r i m a r i l y d e a l w i t h i t s u s e f o r t h e d e t e c t i o n o f s e r u ma n t i b o d i e s a n d w i l l e m p h a s i z e i t s a p p l i c a t i o n i ns e r o e p i d e m i o l o g i c a l s t u d i e s .

M A T E R I A L S U S ED AND STEPS TO BE FOLLOWED aT h e a n t i g e n b

S t a n d a r d i z a t i o n . A n t i g e n s u s e d f o r ELISA a r es o l u b l e , b u t c a n b e made i n s o l u b l e b y a d s o r p t i o nt o a s o l i d p h a s e . S a t i s f a c t o r y a n t i g e n s c a n b e f o u n do n l y b y p e r f o r m a n c e t e s t i n g a g a i n s t r e f e r e n c e s e r a .S t a b l e a n t i g e n p r e p a r a t i o n s s h o u l d b e u s e d i n o r d e rt o e n s u r e o p t i m a l r e p r o d u c i b i l i t y . I n g e n e r a l , s t a n -d a r d i z a t i o n o f t h e f o l l o w i n g f a c t o r s s h o u l d b e c o n -s i d e r e d :

( a ) s p e c i e s , s t r a i n , a n d d e v e l o p m e n t a l s t a g e o fp a r a s i t e ;( b ) s p e c i e s a n d s t r a i n o f a n i m a l i f a m a i n t e n a n c e

h o s t i s u s e d , o r i f n o t , t h e i n v i t r o c o n d i t i o n s em-p l o y e d ;( c ) p o s t - i n f e c t i o n p e r i o d b e f o r e r e c o v e r y o f p a r a -s i t e s ;a S e e Annex 2 .b S e e a l s o t h e M e m o r a n d u m e n t i t l e d " P a r a s i t e a n t i g e n sB u l l . W o r l d H e a l t h O r g a n . , 5 2 , 2 3 7 - 2 4 9 ( 1 9 7 5 ) .

( d ) i s o l a t i o n m e t h o d ;( e ) m e t h o d o f p r e p a r i n g t h e s o l u b l e a n t i g e n s ; c( f ) q u a l i t y c o n t r o l .A d s o r p t i o n t o s o l i d p h a s e . M o s t a n t i g e n s a d h e r et o p o l y s t y r e n e s u r f a c e s b y p h y s i c a l a d s o r p t i o n . A t

p r e s e n t i t i s n o t known w h a t p a r t o f t h e a n t i g e n i sp r e f e r e n t i a l l y b o u n d t o t h e s o l i d p h a s e . C o a t i n g o ft h e s u r f a c e s e e m s t o d e p e n d o n t h e q u a l i t y o f t h ep o l y s t y r e n e s u r f a c e , a m o n g o t h e r f a c t o r s . A l t h o u g ht h e u s e o f p h y s i c a l a d s o r p t i o n a s a m e a n s o f b i n d i n ga n t i g e n s t o a s o l i d p h a s e s e e m s a t t r a c t i v e , i t s d r a w -b a c k i s t h a t n o p r e c i s e i n f o r m a t i o n o n t h e b i n d i n gi t s e l f c a n b e o b t a i n e d . T h e r e f o r e , t h e u s e o f v a r i o u sa c t i v a t i o n m e t h o d s o r s p e c i f i c " s p a c e r s " h a s b e e ns t u d i e d i n o r d e r t o e n s u r e a more s t a n d a r d i z e d a n t i -g e n b i n d i n g p r o c e d u r e . A t t e n t i o n i s c u r r e n t l y f o c u s e do n t h e u s e o f d i f f e r e n t p o l y s t y r e n e s u r f a c e s . T h e b i n d -i n g c a p a c i t i e s o f new b a t c h e s o f p o l y s t y r e n e t u b e so r p l a t e s c a n b e t e s t e d i n a c h e c k e r - b o a r d t i t r a t i o nu s i n g s t a n d a r d a n t i g e n s , a n t i s e r a , a n d c o n j u g a t e s .A p a r t f r o m t h e n a t u r e o f t h e s u r f a c e m a t e r i a l ,a d s o r p t i o n o f a n t i g e n t o a s o l i d p h a s e i s a l s o d e p e n -d e n t on t i m e , t e m p e r a t u r e , a n d p H . P r o l o n g e d a d -s o r p t i o n p r o c e d u r e s ( o v e r n i g h t ) a t 4 C s e e m t o g i v ea more u n i f o r m c o a t i n g . O r i g i n a l l y a l k a l i n e c o n -d i t i o n s w e r e e m p l o y e d , b u t , i n s o m e a p p l i c a t i o n s ,c o a t i n g a t pH 7 w a s f o u n d t o b e e q u a l l y s a t i s f a c t o r y .C o a t i n g s h o u l d p r e f e r a b l y b e d o n e i m m e d i a t e l yb e f o r e a s s a y , i t b e i n g p r e f e r a b l e t o a v o i d s t o r i n gc o a t e d t u b e s o r p l a t e s c o n t a i n i n g t h e a n t i g e n s o l u t i o n .

C o n c e n t r a t i o n . F o r e a c h a p p l i c a t i o n , t h e o p t i m a la n t i g e n c o n c e n t r a t i o n s h o u l d b e e s t a b l i s h e d b yc h e c k e r - b o a r d t i t r a t i o n .L y o p h i l i z a t i o n . I n s o m e c a s e s l y o p h i l i z a t i o n d o e sn o t a f f e c t t h e a n t i g e n a c t i v i t y , a n d t h e s a m e b a t c ho f a n t i g e n c a n t h e n b e u s e d o v e r a l o n g p e r i o d .

T h e w a s h i n g f l u i dW a s h i n g i s p e r f o r m e d : ( i ) a f t e r c o a t i n g t h e s u r f a c ew i t h a n t i g e n d i r e c t l y b e f o r e t h e a s s a y , ( i i ) a f t e rs e r u m i n c u b a t i o n , a n d ( i i i ) a f t e r i n c u b a t i o n o f t h ec o n j u g a t e . P h o s p h a t e - b u f f e r e d s a l i n e ( 0 . 0 1 m o l / l i t r eP B S , pH 7 . 2 ) w i t h 0 . 5 g / l i t r e o f p o l y s o r b a t e - 2 0 ( e . g . ,Tween 2 0 ) c a n b e u s e d a s w a s h i n g f l u i d . T a p w a t e rm a y b e s u b s t i t u t e d f o r t h e P B S , p r o v i d e d i t h a s an e u t r a l pH a n d a l o w c h l o r i n e c o n t e n t . W a s h i n gc D e s c r i p t i o n s o f a n t i g e n p r e p a r a t i o n s c o u l d i n c l u d e

d e t a i l s s u c h a s p r o t e i n c o n t e n t a n d c h r o m a t o g r a p h y p a t t e r n s .T h e r e s u l t s o f o t h e r s e r o l o g i c a l t e s t s u s i n g s o l u b l e a n t i g e n sm a y a l s o b e v a l u a b l e f o r s t a n d a r d i z a t i o n p u r p o s e s .

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E N ZY M E - L I NK ED I M M U N O S O R B E N T A S S A Y

s h o u l d c o n s i s t o f ; i n s i l n g t h e t u b e s o r p l a t e s t h r e et i m e s f o r 3 - 5 m i n Wch.a s n i n g t i r . e s m a y b er e d u c e d t o 1 m i n i f t u b z s a r e f l u s h e d w i t ' - a n e x c e s so f w a s h i n g f l u i d u n d e r p r e s s u r e ( 1 - 2 a t m ) .D i l u t i o n o f a n t i s e r u m

S e r u m d i l u t i o n s m ay b e m a d e i n PBS c o n t a i n i n g0 . 5 g / l i t r e o f p o l y s o r b a t e - 2 0 . I n s o m e i n s t a n c e s t h ea d d i t i o n o f 5 g / l i t r e b o v i n e s e r u m a l b u m i n ( B S A )d e c r e a s e s n o n - s p e c i f i c ( i . e . , b a c k g r o u n d ) s t a i n i n g .When E L I S A i s p e r f o r m e d b y t e s t i n g a t o n e s e r u md i l u t i o n o n l y , t h e a p p r o p r i a t e d i l u t i o n i s f o u n d b yc a r r y i n g o u t a p r e l i m i n a r y t e s t w i t h p o s i t i v e a n dn e g a t i v e r e f e r e n c e s e r a , a n d t h e d i l u t i o n t h a t i sf o u n d t o g i v e max imum d i f f e r e n c e s i n e x t i n c t i o n v a l -u e s b e t w e e n t h e known p o s i t i v e a n d n e g a t i v e s e r ai s t h e n u s e d . On a n o t h e r h a n d , w h e n E L I S A i s u s e df o r d e t e r m i n i n g e n d p o i n t t i t r e s , s e v e r a l d i l u t i o n s o ft h e t e s t s e r a s h o u l d b e m a d e .T h e c o n j u g a t e ( 1 , 1 3 )

I n t h e p r e p a r a t i o n o f c o n j u g a t e s t h e f o l l o w i n gi n f o r m a t i o n s h o u l d b e t a k e n i n t o a c c o u n t :

( a ) I m m u n o g l o b u l i n p r e p a r a t i o n( i ) t h e t y p e o f i m m u n o g l o b u l i n p r e p a r a t i o n u s e df o r i m m u n i z a t i o n , e . g . , I g G ( H + L ) , I g G ( H ) ;( i i ) t h e a n i m a l s p e c i e s u s e d f o r i m m u n i z a t i o n , e . g . ,

s h e e p , r a b b i t ;( i i i ) t h e i m m u n o g l o b u l i n f r a c t i o n s f r o m h y p e r -i m m u n e s e r u m u s e d f o r l a b e l l i n g I g , I g G , a n di m m u n o s p e c i f i c a l l y p u r i f i e d I g G .

( b ) E n z y m e s . D e t a i l s c o n c e r n i n g :( i ) t h e a l k a l i n e p h o s p h a t a s e ( 8 , 9 ) ;( i i ) t h e h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e ( 2 1 ) ;( i i i ) t h e g l u c o s e o x i d a s e .( c ) C o u p l i n g p r o c e d u r e . D e t a i l s o f :( i ) t h e g l u t a r a l d e h y d e m e t h o d s ( c h e m i c a l b i n d i n g ) ;( i i ) t h e o x i d a t i o n o f e n z y m e b y s o d i u m p e r i o d a t e( c h e m i c a l b i n d i n g ) ;( i i i ) t h e p e r o x i d a s e - a n t i p e r o x i d a s e c o m p l e x ( i m -m u n o l o g i c a l b i n d i n g ) .A l k a l i n e p h o s p h a t a s e a n d h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s eh a v e u s u a l l y b e e n u se d a s t h e m a r k e r e n z y m e . Com-m e r c i a l l y a v a i l a b l e c o n j u g a t e s a r e p r e p a r e d u s i n gt h e g l u t a r a l d e h y d e c o u p l i n g m e t h o d w i t h p e r o x i d a s e .

S o f a r , no s p e c i f i c a t i o n s f o r c o n j u g a t e s i n t e r m s o f

e r . a e / p r o t e & n r a t i o , a b se n c e o f u n l a b e l l e d i m m u n o -3 c 1 . i n , f r e e e n z y m e , a n d / o r f r e e g l u t a r a l d e h y d e ,h a v e b e e n l a i d d o w n .T h e o p t i m a l c o n j u g a t e d i l u t i o n t o b e u s e d i n t h et e s t s h o u l d b e d e t e r m i n e d b y c h e c k e r - b o a r d t i t r a t i o n .I n o r d e r t o o b t a i n m a xi m u m d i f f e r e n c e s b e t w e e np o s i t i v e a n d n e g a t i v e s e r a , t h e e x t i n c t i o n v a l u e s o ft h e " c o n j u g a t e c o n t r o l " ( i . e . , a n t i g e n c o a t e d t u beo r w e l l , i n c u b a t e d w i t h c o n j u g a t e a n d s u b s t r a t e )s h o u l d b e n e g l i g i b l e . One w a y o f d e c r e a s i n g b a c k -g r o u n d s t a i n i n g i s b y a d d i n g a BS A s o l u t i o n( 4 0 g / l i t r e ) t o t h e p o l y s o r b a t e - 2 0 a s d i l u e n t f o r t h ec o n j u g a t e .T h e s u b s t r a t e

4 - N i t r o p h e n y l p h o s p h a t e , w h i c h i s t h e s u b s t r a t eu s e d f o r a l k a l i n e p h o s p h a t a s e , i s s a f e t o u s e . How-e v e r , 5 - a m i n o s a l i c y l i c a c i d , w h i c h i s t h e s u b s t r a t ec u r r e n t l y u s e d f o r t h e v i s u a l i z a t i o n o f h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e , m a y b e c a r c i n o g e n i c , t h o u g h much l e s ss o t h a n 3 , 3 ' - d i a m i n o b e n z i d i n e , w h i c h i s r o u t i n e l yu s e d f o r t h e v i s u a l i z a t i o n o f p e r o x i d a s e i n l i g h t a n de l e c t r o n m i c r o s c o p y ; a l t h o u g h n o r m a l h a n d l i n g o ft h e m a t e r i a l d o e s n o t c o n s t i t u t e a h e a l t h h a z a r d , i t i sa d v i s a b l e t o c o n t i n u e t h e s e a r c h f o r p o s s i b l e a l t e r -n a t i v e s u b s t r a t e s .

I n c u b a t i o n t i m e . T h e e n z y m e - s u b s t r a t e r e a c t i o ns h o u l d b e s t o p p e d w i t h i n t h e l i n e a r p h a s e o f t h er e a c t i o n c u r v e . When l a r g e n u m b e r s o f t e s t s a r ec a r r i e d o u t s i m u l t a n e o u s l y , a n i n c u b a t i o n t i m e o f a tl e a s t 3 0 m i n s h o u l d b e a l l o w e d , s i n c e t h i s r e d u c e st i m i n g e r r o r s . F o r q u a l i t a t i v e p u r p o s e s , a s t a n d a r di n c u b a t i o n t i m e c a n b e i n t r o d u c e d , b u t f o r q u a n t i -t a t i v e p u r p o s e s , i t i s b e t t e r t o f o l l o w t h e r e a c t i o nk i n e t i c s .R e a d i n g a n d a s s e s s m e n t o f t h e r e s u l t sWhen E L I S A r e s u l t s a r e b a s e d o n s e v e r a l d i l u -t i o n s , e n d p o i n t t i t r e s a r e d e t e r m i n e d a n d r e a c t i o n s

m a y t h e r e f o r e b e r e a d v i s u a l l y ; b u t , w h e n r e s u l t sa r e b a s e d o n o n e d i l u t i o n o n l y , r e a d i n g s s h o u l d b ep e r f o r m e d w i t h a s p e c t r o p h o t o m e t e r .ELISA r e s u l t s m ay b e e x p r e s s e d i n t h e f o l l o w i n gw a y s :( a ) E x t i n c t i o n v a l u e . T h i s i s b a s e d o n o n e s e r u md i l u t i o n o n l y . T h e s i g n i f i c a n c e o f a c e r t a i n e x t i n c t i o nv a l u e s h o u l d b e a s s e s s e d a g a i n s t known p o s i t i v e a n dn e g a t i v e r e f e r e n c e s e r a . T h e e x t i n c t i o n v a l u e s o f t h en e g a t i v e s e r a m a y b e u s e d t o s e t c e r t a i n c o n f i d e n c el i m i t s .( b ) E n d p o i n t t i t r e .

1 3 1

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M E MORANDUM( c ) P e r c e n t a g e o f a p o s i t i v e r e f e r e n c e s e r u m . T h i si s b a s e d on o n e d i l u t i o n o f t h e t e s t s e r u m o n l y .( d ) P r o b a b i l i t y p e r c e n t a g e . T h i s a p p l i e s whene i t h e r e n d p o i n t t i t r e s o r e x t i n c t i o n v a l u e s a r e b e y o n d

t h e n o r m a l r a n g e .C o m m e n t s

F o r s o m e p u r p o s e s t e s t s s h o u l d b e p e r f o r m e d i nd u p l i c a t e o r t r i p l i c a t e . E L I S A p e r f o r m e d i n t u b e sc l e a r l y r e q u i r e s a l a r g e r v o l u m e o f r e a g e n t t h a n d o e st h e s a m e a s s a y i n p l a t e s , b u t i n e i t h e r c a s e o n l ys m a l l v o l u m e s o f t e s t m a t e r i a l a r e u s e d . B l o o ds a m p l e s c o l l e c t e d i n c a p i l l a r i e s c a n b e p u t o n f i l t e rp a p e r ( s e e Annex 2 ) .

A DV ANT AG E S AND D I S ADV AN T AG E SOF THE TECHNIQUE

I n T a b l e 1 , t h e a d v a n t a g e s a n d d i s a d v a n t a g e s o fE L I S A , r a d i o i m m u n e a s s a y ( R I A ) , a n d t h e i m m u n o -f l u o r e s c e n c e ( I F ) t e s t , a r e c o m p a r e d .A l t h o u g h t h e RI A h a s n o t b e e n w i d e l y a p p l i e dt o t h e s e r o l o g y o f p a r a s i t i c d i s e a s e s , i t w a s t h o u g h ti m p o r t a n t t o c o m p a r e v a r i o u s a s p e c t s o f t h i s t e c h -n i q u e w i t h E L I S A b e c a u s e o f t h e i r c l o s e r e s e m -b l a n c e . H o w e v e r , f o r p r a c t i c a l p u r p o s e s t h e com-p a r i s o n w i t h I F i s more r e l e v a n t , a s t h e t e c h n i q u eh a s b e e n w i d e l y u s e d .

One o f t h e a d v a n t a g es o f E L I S A i s t h e p o s s i b i l i t yt h a t i t m a y b e u s e d f o r t he d e te c t i on o f c i r c u l a t i n ga n t i g e n s . A l t h o u g h RI A a n d I F c a n a l s o b e u s e df o r t h i s p u r p o s e , t h e D A S S ( d e f i n e d a n t i g e n s u b -s t r a t e s p h e r e s ) s y s t e m m u s t u s u a l l y b e a p p l i e d a t t h es a m e t i m e ( 6 ) .W i t h E L I S A i t i s e a s i e r t h a n w i t h I F t o s c r e e ns e r a s i m u l t a n e o u s l y f o r t h e p r e s e n c e o f a n t i b o d i e st o v a r i o u s i n f e c t i v e a g e n t s . T h i s i s e s p e c i a l l y i m p o r t -a n t f o r c e r t a i n f i e l d a p p l i c a t i o n s s u c h a s f o r e s t a b -l i s h i n g e p i d e m i o l o g i c a l p r o f i l e s .As m e n t i o n e d i n T a b l e 1 ( s e e a l s o p a g e 1 3 1 ) q u a l i t ys t a n d a r d s f o r c o n j u g a t e s a r e s t i l l u n d e r e v a l u a t i o n ;c o n t i n u e d r e s e a r c h i n t h i s a r e a i s n e c e s s a r y .To e v a l u a t e t h e r e l i a b i l i t y o f t h e t e s t i t i s e s s e n t i a lt o h a v e b o t h known p o s i t i v e r e f e r e n c e s e r a , a n d as t o c k o f s e r a f r o m n o n - i n f e c t ed p e r s o n s f r o m t h es a m e a r e a . T h e s e s e r a s h o u l d b e o f k now n s t a t u sw i t h r e g a r d t o t h e p o s s i b l e p r e s e n c e o f a n t i b o d i e st o p a r a s i t e s o t h e r t h a n t h e s p e c i e s u n d e r s t u d y .D e t e c t i o n o f f r e e ( c i r c u l a t i n g ) a n t i g e n s ( 5 )As m e n t i o n e d a b o v e , E LI SA m ay b e u s e d f o r t h ed e t e c t i o n o f a n t i g e n s i n b o d y f l u i d s i n g e n e r a l . T h i ss e e m s p a r t i c u l a r l y u s e f u l a s a m e a n s o f d i s c r i m i n a t -i n g b e t w e e n t h e e a r l y p h a s e s o f a d i s e a s e a n d a p a s te x p e r i e n c e . I t s u s e t o w a r d s t h i s e n d w i l l d e p e n d ,

h o w e v e r , o n t h e a v a i l a b i l i t y o f h i g h l y s p e c i f i c r e a g e n t s .

T a b l e 1 . C o m p a r i s o n o f E L I S A w i t h o t h e r i n d i r e c t a n t i g l o b u l i n t e s t s ( R I A a n d I F )C r i t e r i o n E L I S A RlAa I F

S e n s i t i v i t yS p e c i f i c i t yR e p r o d u c i b i l i t yR e a d i n gA n t i g e n p r e p a r a t i o nC o n j u g a t eF e a s i b i l i t y o f p e r f o r m a n c e u n d e rf i e l d c o n d i t i o n sM e c h a n i z a t i o n o f a s s a yR e l a t i v e c o s t p e r t e s tS h e l f - l i f e o f r e a g e n t s bH e a l t h h a z a r d s f o r l a b o r a t o r yp e r s o n n e l b

h i g hd e p e n d s o n a n t i g e np r e p a r a t i o na c c e p t a b l eo b j e c t i v ec a n b e c o m p l i c a t e du n d e r e v a l u a t i o ne a s yp o s s i b l el o wl o n gn o n e o r m i n o r

h i g hd e p e n d s o n a n t i g e np r e p a r a t i o na c c e p t a b l eo b j e c t i v ec a n b e c o m p l i c a t e dq u a l i t y s t a n d a r dn o t e a s yp o s s i b l eh i g hs h o r tp r e s e n t

a R I A i s n o t w i d e l y u s e d f o r t h e d i a g n o s i s o f p a r a s i t i c d i s e a s e s .b S h o u l d b e r e g a r d e d a s a l i m i t i n g f a c t o r .

u s u a l l y l o w e rh i g ha c c e p t a b l eu s u a l l y s u b j e c t i v ee a s yq u a l i t y s t a n d a r di n t e r m e d i a t ed i f f i c u l th i g hl o n gnone o r m i n o r

1 3 2

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E NZYME - L I NKE D I M MUNO SORB ENT ASSAY 13 3

APPLICATION OF E L I S A TO PARASITIC DI S E A S E SM A L A R I A ( 2 2 , 2 3 )

U s i n g a h e t e r o l o g o u s a n t i g e n ( e . g . , P l a s m o d i u mk n o w l e s i f r o m m o n k e y s ) i t h a s b e e n p o s s i b l e t o d i s -c r i m i n a t e b e t w e e n s e r a f r o m e n d e m i c a n d n o n -e n d e m i c a r e a s . I n a n o t h e r s t u d y , u s i n g P . f a l c i p a r u ma s a n t i g e n , E L I S A t e s t s w e r e a p p l i e d t o human s e r af r o m S o u t h A m e r i c a a n d i t w a s p o s s i b l e t o i d e n t i f yt h e g r o u p s o f p e o p l e f r o m a m a l a r i a e n d e m i c a r e aa n d t h o s e f r o m a n a r e a w h e r e m a l a r i a h a d b e e ne r a d i c a t e d .

I n c o m p a r i n g E L I S A r e s u l t s w i t h t h o s e o f o t h e rs e r o l o g i c a l t e s t s , a s o m e w h a t b e t t e r c o r r e l a t i o n w a so b t a i n e d w i t h t h e p a s s i v e h a e m a g g l u t i n a t i o n t e s tu s i n g t h e s a m e a n t i g e n t h a n w i t h t h e I F t e s t u s i n gt h e w h o l e m a l a r i a p a r a s i t e a s a n t i g e n . A p o s s i b l ea d v a n t a g e o f ELISA i s i t s p o t e n t i a l f o r l a r g e - s c a l ea p p l i c a t i o n i n s e r o e p i d e m i o l o g y . 2P r e s e n t a c t i v i t i e s a n d f u t u r e p r o s p e c t s

A t p r e s e n t t h e u s e o f E L I S A f o r m a l a r i a i s b e i n ge v a l u a t e d a t t h e N a t i o n a l B a c t e r i o l o g i c a l L a b o r a -t o r y , S t o c k h o l m , t h e N u f f i e l d I n s t i t u t e d f C o m p a r a -t i v e M e d i c i n e , L o n d o n , a n d t h e S c h o o l o f P u b l i cH e a l t h , T e h e r a n . T h e N u f f i e l d I n s t i t u t e o f Com-p a r a t i v e M e d i c i n e , L o n d o n , a n d t h e N a t i o n a l B a c -t e r i o l o g i c a l L a b o r a t o r y , S t o c k h o l m , a r e a l s o c o n -d u c t i n g f i e l d e v a l u a t i o n s i n A f r i c a , S o u t h A m e r i c a ,P a p u a Ne w G u i n e a , a n d S r i L a n k a . I t m a y a l s o b ep o s s i b l e t o i n c o r p o r a t e ELISA i n a WHO p r o j e c ti n B e n i n , N i g e r i a . T h e f u t u r e u s e o f E L I S A m a y ,h o w e v e r , b e l i m i t e d b y t h e a v a i l a b i l i t y o f t h e m a l a r i aa n t i g e n n o w e m p l o y e d . I n f e c t e d A o t u s m o n k e y s a r ea t p r e s e n t t h e o n l y s o u r c e o f a s u i t a b l e m a l a r i aa n t i g e n , b u t a r e g u l a r s u p p l y o f t h e s e a n i m a l s c a n n o tb e g u a r a n t e e d a n d s o o n a n t i g e n f r o m t h i s s o u r c ew i l l p r o b a b l y n o l o n g e r b e m a d e a v a i l a b l e b y t h eN u f f i e l d I n s t i t u t e o f C o m p a r a t i v e M e d i c i n e . I n v i e wo f t h i s s i t u a t i o n , o t h e r s o u r c e s o f a n t i g e n s h o u l d b ee x p l o r e d .

T R I C H I N O S I SE L I S A h a s b e e n u s e d f o r t h e d e t e c t i o n o f s e r u ma n t i b o d i e s t o T r i c h i n e l l a s p i r a l i s i n p i g s a n d i n m a n .a I t m a y b e n o t e d t h a t t h e g e n e r a l a p p l i c a t i o n s o f s e r o l o g yt o m a l a r i a i n c l u d i n g a n t i g e n p r e p a r a t i o n h a v e a l r e a d y b e e nd i s c u s s e d i n a p u b l i s h e d Memorandum: " S e r o l o g i c a l t e s t i n g

i n m a l a r i a " , B u l l . W o r l d H e a l t h O r g a n . , 5 0 , 5 2 7 - 5 3 5 ( 1 9 7 4 ) .

I n o r d e r t o t e s t t h e s y s t e m c u r r e n t l y i n u s e , t h es e n s i t i v i t y o f E L I S A w a s a s s e s s e d i n p a t h o g e n - f r e ep i g s e x p e r i m e n t a l l y i n f e c t e d w i t h T . s p i r a l i s , a s w e l la s i n c o n v e n t i o n a l l y r a i s e d p i g s , e x p e r i m e n t a l l y o rn a t u r a l l y i n f e c t e d w i t h t h i s p a r a s i t e . O f p a r t i c u l a ri n t e r e s t w a s t h e f a c t t h a t t h e p r e s e n c e o f a n t i b o d i e sw a s d e m o n s t r a t e d b e f o r e d a y 1 7 p o s t - i n f e c t i o n , i . e . ,b e f o r e t h e n u m b e r o f d a y s r e q u i r e d f o r m u s c l el a r v a e t o b e c o m e i n f e c t i v e f o r a n o t h e r p o s s i b l e h o s t .F u r t h e r m o r e , ELISA p r o v e d t o b e much m o r e s e n -s i t i v e t h a n t h e c l a s s i c a l d i a g n o s t i c m e t h o d , t r i c h i n o -s c o p y . ELISA c o m p a r e d f a v o u r a b l y w i t h o t h e r s e r o -l o g i c a l t e s t s s u c h a s I F , i m m u n o d i f f u s i o n , a n dc o u n t e r - c u r r e n t e l e c t r o p h o r e s i s . U s i n g a c r u d e s a l i n ee x t r a c t o f m u s c l e l a r v a e a s a n t i g e n , i t i s p o s s i b l e t od i s c r i m i n a t e b e t w e e n s e r a f r o m i n f e c t e d a n d n o n -i n f e c t e d c o n v e n t i o n a l l y r a i s e d p i g s .ELISA i s now u s e d r o u t i n e l y i n s c r e e n i n g f o r t h ep r e s e n c e o f T . s p i r a l i s i n f e c t i o n s i n p i g s f o r s l a u g h t e ro n a r a n d o m s a m p l i n g b a s i s . T h e a s s a y h a s a l r e a d yb e e n m e c h a n i z e d a n d , u n d e r p r e s e n t c o n d i t i o n s ,u p t o 4 0 0 0 s e r a d a i l y c a n b e t e s t e d b y m i c r o -ELISA ( 7 , 1 4 - 2 0 ) .P r e s e n t a c t i v i t i e s a n d f u t u r e p r o s p e c t sELISA i s b e i n g r o u t i n e l y u s e d i n f o r t r i c h i n o s i st e s t i n g a t t h e N a t i o n a l I n s t i t u t e o f P u b l i c H e a l t h ,B i l t h o v e n , T h e N e t h e r l a n d s . I n a t t e m p t s t o i m p r o v et h e t e c h n i q u e , t h e u s e o f m o r e s p e c i f i c a n t i g e n s i sb e i n g s t u d i e d a n d c o n j u g a t e s p r e p a r e d i n v a r i o u sw a y s a r e b e i n g t e s t e d . M o r e o v e r , a c o m p a r a t i v ep r o g r a m m e a i m e d a t s t a n d a r d i z a t i o n o f t h e t e c h -n i q u e i s b e i n g c o n d u c t e d b y t h e E u r o p e a n E c o n o m i cC o m m u n i t y c o u n t r i e s a n d i s c o - s p o n s o r e d b y WHO.

SCHISTOSOMIASISS e r a f r o m i n d i v i d u a l s i n f e c t e d w i t h S c h i s t o s o m am a n s o n i w e r e c o m p a r e d w i t h s e r a f r o m E u r o p e a na n d A f r i c a n c o n t r o l s . ELISA w a s p e r f o r m e d u s i n gb o t h a c r u d e a d u l t a n t i g e n a n d a p u r i f i e d e g ga n t i g e n . T h e e x t i n c t i o n v a l u e s o f t h e p a t i e n t s i n f e c t e dw i t h S . m a n s o n i w e r e h i g h e r t h a n t h o s e o f t h e n o n -i n f e c t e d c o n t r o l s , p a r t i c u l a r l y w h e n t h e p u r i f i e da n t i g e n w a s u s e d . H o w e v e r , s o m e f a l s e n e g a t i v ea n d f a l s e p o s i t i v e r e s u l t s w e r e o b t a i n e d , b u t t h i sa l s o o c c u r s i n a l l t h e o t h e r s e r o l o g i c a l t e s t s u s e d u pt o n o w i n s c h i s t o s o m i a s i s . I n g e n e r a l , p a t i e n t s w i t h

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MEMORANDUM

S . n a n s o n i i n f e c t i o n s h o w h i g h e r t i t r e s t h a n t h o s ew i t h S . h a e m a t o b i u m i n f e c t i o n ( 5 , 1 2 ) .

I n t h e p a s s i v e h a e m a g g l u t i n a t i o n t e s t , S . m a n s o n ia n d S . h a e m a t o b i u m a n t i g e n s w i l l d e t e c t b o t h h o m o -l o g o u s a n d h e t e r o l o g o u s a n t i b o d i e s ; t h i s w i l l p r o b -a b l y a l s o b e t h e c a s e w i t h E L I S A .

T h e a p p l i c a t i o n o f E L I S A f o r t h e d e t e c t i o n o ff r e e ( c i r c u l a t i n g ) a n t i g e n s i n s c h i s t o s o m i a s i s m a y b ei m p o r t a n t .P r e s e n t a c t i v i t i e s a n d f u t u r e p r o s p e c t sE L I S A i s b e i n g u s e d a t t h e N a t i o n a l B a c t e r i o -l o g i c a l L a b o r a t o r y , S t o c k h o l m , t h e I n s t i t u t e o f P a r a -s i t o l o g y , U n i v e r s i t y o f L e i d e n , T h e N e t h e r l a n d s , t h eL a b o r a t o r y o f P a r a s i t o l o g y , F a c u l t y o f M e d i c i n e ,L i l l e , F r a n c e , t h e N u f f i e l d I n s t i t u t e o f C o m p a r a t i v eM e d i c i n e , L o n d o n , a n d t h e L o n d o n S c h o o l o f

H y g i e n e a n d T r o p i c a l M e d i c i n e . A t p r e s e n t v a r i o u sc r u d e a n d p u r i f i e d a n t i g e n p r e p a r a t i o n s a r e b e i n gu s e d i n E L I S A a n d i t i s s u g g e s t e d t h a t , i n o r d e r t oi m p r o v e t h e t e c h n i q u e , t h e e f f i c a c y o f t h e v a r i o u sa n t i g e n s s h o u l d b e c o m p a r e d .T h e e v a l u a t i o n o f E L I S A f o r s e r o e p i d e m i o l o g i c a lp u r p o s e s c o u l d b e l i n k e d w i t h e x i s t i n g WHO p r o -g r a m m e s i n A f r i c a , i n p a r t i c u l a r a WHO p r o j e c ton r e s e a r c h o n t h e e p i d e m i o l o g y o f s c h i s t o s o m i a s i si n m a n - m a d e l a k e s . A s f o r t h e e v a l u a t i o n o f E L I S Af o r c l i n i c a l u s e , t h r e e l i n e s o f r e s e a r c h a r e e n v i s a g e d :( i ) l o n g i t u d i n a l s t u d i e s i n h o s p i t a l i z e d p a t i e n t s i ne n d e m i c a r e a s ; ( i i ) l o n g i t u d i n a l s t u d i e s i n h o s p i t a l -i z e d p a t i e n t s i n n o n - e n d e m i c a r e a s ( i m p o r t e d s c h i s t o -s o m i a s i s ) ; a n d ( i i i ) l o n g i t u d i n a l s t u d i e s o f s c h i s t o -s o m i a s i s p a t i e n t s u n d e r g o i n g c h e m o t h e r a p y .

TRYPANOSOMI A S I ST h e r e s u l t s o b t a i n e d w i t h E L I S A h a v e b e e n s a t i s -f a c t o r y f o r b o t h A f r i c a n t r y p a n o s o m i a s i s ( s l e e p i n gs i c k n e s s ) a n d A m e r i c a n t r y p a n o s o m i a s i s ( C h a g a s 'd i s e a s e ) ( 2 4 , 2 5 ) . W i d e c r o s s - r e a c t i o n s b e t w e e n T r y -

p a n o s o m a c r u z i , T . b r u c e i , a n d L e i s h m a n i a w e r eo b s e r v e d . A c c e p t a b l e c o r r e l a t i o n s w e r e f o u n d b e -t w e e n t h e I F t e s t a n d E L I S A . B y u s i n g E L I S A i t wasp o s s i b l e t o d i s t i n g u i s h b e t w e e n g r o u p s o f i n d i v i d u a l sw i t h a n d w i t h o u t t r y p a n o s o m i a s i s , a l t h o u g h s o m eo v e r l a p ( i . e . , f a l s e n e g a t i v e s a n d f a l s e p o s i t i v e s )was o b s e r v e d .A n a l t e r n a t i v e t o T . b r u c e i a n t i g e n s e e m s f e a s i b l e ,s i n c e e a c h t r y p a n o s o m e s t r a i n e x h i b i t s m a n y a n t i -g e n i c t y p e s ( e . g . , m o r e t h a n 1 0 0 a n t i g e n i c t y p e s f o ro n e d e f i n e d s t r a i n ) . A s m a l l n u m b e r o f t h e s e t y p e sa r e c o m m o n t o s e v e r a l a n d m a y b e t o a l l s t r a i n s .

P r e p a r a t i o n s c o n t a i n i n g t h e g r e a t e s t n u m b e r o fi m m u n o g e n i c d e t e r m i n a n t s o f t h e s e c o m m o n a n t i -g e n i c t y p e s s h o u l d p r e f e r a b l y b e u s e d a s t h e s t a n d a r da n t i g e n ( 1 1 , 2 4 , 2 5 ) .P r e s e n t a c t i v i t i e s a n d f u t u r e p r o s p e c t s

( a ) A f r i c a n t r y p a n o s o m i a s i s . W i t h t h e c o l l a b o r -a t i o n o f WHO a n d t h e Ahm a d u B e l l o U n i v e r s i t y ,K a d u n a , N i g e r i a , t h e N u f f i e l d I n s t i t u t e o f C o m p a r a -t i v e M e d i c i n e , L o n d o n , a n d t h e N a t i o n a l I n s t i t u t eo f P u b l i c H e a l t h , B i l t h o v e n , T h e N e t h e r l a n d s , a r ee v a l u a t i n g E L I S A i n t h e s c r e e n i n g o f s e r a f o rt r y p a n o s o m i a s i s . F o r t h e s e t e s t s T . b r u c e i i s u s e da s a n t i g e n . T h e s e i n s t i t u t e s m a i n t a i n c o n t a c t s w i t hi n s t i t u t i o n s o f v e t e r i n a r y p a r a s i t o l o g y , s u c h a s t h eC e n t r e f o r T r o p i c a l V e t e r i n a r y M ed i c i n e , E d i n b u r g h ,S c o t l a n d , a n d t h e I n s t i t u t e f o r T r o p i c a l a n d P r o t o -z o a n D i s e a s e s , V e t e r i n a r y F a c u l t y , S t a t e U n i v e r s i t yo f U t r e c h t , T h e N e t h e r l a n d s , w i t h w h i c h t h e y e x -c h a n g e i n f o r m a t i o n , w i t h s p e c i a l r e f e r e n c e t o t h eu s e o f E L I S A f o r t h e d e t e c t i o n o f t r y p a n o s o m i a s i si n c a t t l e . W i t h a v i e w t o i m p r o v i n g t h e t e c h n i q u e ,t h e I n s t i t u t n a t i o n a l d e l a S a n t e e t d e l a R e c h e r c h em e d i c a l e , B o r d e a u x , F r a n c e , i s w i l l i n g t o c o l l a b o r a t ew i t h o t h e r l a b o r a t o r i e s d e a l i n g w i t h t h e s er o l o g y o ft r y p a n o s o m j a s i s t o s t u d y a n d e v a l u a t e n e w l y d e v e l -o p e d a n t i g e n s . A t a l a t e r s t a g e , E L I S A f i e l d s t u d i e sm i g h t b e i n t r o d u c e d i n a WHO t r y p a n o s o m i a s i sp r o j e c t i n U p p e r V o l t a .

( b ) A m e r i c a n t r y p a n o s o m i a s i s . E L I S A i s b e i n gu s e d a t t h e N u f f i e l d I n s t i t u t e o f C o m p a r a t i v e M e d i -c i n e , L o n d o n , a n d a t t h e London S c h o o l o f H y g i e n ea n d T r o p i c a l M e d i c i n e . E L I S A c a n b e e v a l u a t e d i nt h e f i e l d p r o j e c t s o f t h e E v a n d r o C h a g a s I n s t i t u t e ,B e l e m , B r a z i l ; a n d t h e F a c u l t y o f M e d i c a l S c i e n c e s ,F e d e r a l U n i v e r s i t y o f B r a s i l i a , m a y b e i n t e r e s t e d i nc o o p e r a t i n g i n f i e l d t e s t s u s i n g t h e p o s s i b i l i t i e s o f f e r e db y t h e p r o j e c t i n R e c i f e . B r a z i l i a n g r o u p s w o r k i n gon C h a g a s ' d i s e a s e w o u l d b e w i l l i n g t o d i s c u s s t h ep o s s i b i l i t y o f c o l l a b o r a t i v e e f f o r t s i n t h e f u t u r e .

F I L A R I A S I S , I NCLUDI NG ONCHOCERCIASISE x p e r i e n c e w i t h E L I S A i n f i l a r i a l i n f e c t i o n s i s s t i l ll i m i t e d . C r o s s - r e a c t i o n s o c c u r b e t w e e n A s c a r i s s u u m ,

D i p e t a l o n e m a , O n c h o c e r c a g u t t u r o s a , L i t o m o s o i d e sc a r i n i i , a n d B r u g i a p a h a n g i . 0 . v o l v u l u s a n t i g e n f r o mhuman s o u r c e s c a n n o t b e u s e d b e c a u s e i t i s d i f f i c u l tt o o b t a i n a p u r e a n t i g e n f r e e f r o m h o s t m a t e r i a l .H o w e v e r , w i t h a c r u d e e x t r a c t o f 0 . g u t t u r o s a i t w a sp o s s i b l e t o d i f f e r e n t i a t e b e t w e e n s e r a f r o m E u r o -p e a n s , s e r a f r o m f i l a r i a s i s - n e g a t i v e A f r i c a n s , a n d

1 3 4

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ENZYME-LINKED I M MUNO SORBENT A S S A Y

s e r a f r o m p a t i e n t s w i t h 0 . v o l v u l u s i n f e c t i o n . Mores p e c i f i c a n t i g e n p r e p a r a t i o n s a r e b ei n g d e v e l o p e d i nv a r i o u s l a b o r a t o r i e s . T h e u s e o f i m m u n o h i s t o l o g i c a lt e c h n i q u e s m a y p r o v e t o b e i m p o r t a n t i n d e t e r m i n i n gs p e c i f i c a n t i g e n s i n t h e f i l a r i a l w o r m ( 2 ) .I n f i l a r i a s i s , E L I S A c o u l d b e u s e d f o r s e r o -

e p i d e m i o l o g i c a l s t u d i e s , s p e c i a l a t t e n t i o n b ei n g p a i dt o t h e 5 - 1 0 y e a r a g e g r o u p , a s w e l l a s t o t h e d e t e r -m i n a t i o n o f a n t i b o d y l e v e l s b e f o r e a n d a f t e r c h e m o -t h e r a p y a n d t h e d e t e c t i o n o f f r e e ( c i r c u l a t i n g )a n t i g e n s .P r e s e n t a c t i v i t i e s a n d f u t u r e p r o s p e c t s

E L I S A i s b e i n g e v a l u a t e d a t t h e N u f f i e l d I n s t i t u t eo f C o m p a r a t i v e M e d i c i n e , L o n d o n , a n d t h e L o n d o nS c h o o l o f H y g i e n e a n d T r o p i c a l M e d i c i n e . I n o r d e rt o i m p r o v e t h e t e c h n i q u e f o r a p p l i c a t i o n t o f i l a r i a li n f e c t i o n s , a h i g h p r i o r i t y i s b e i n g g i v e n t o m a k i n ga n t i g e n s u p p l i e s a v a i l a b l e a n d t o t h e c o m p a r i s o no f a n t i g e n s ; t h i s t y p e o f w o r k i s b e i n g c a r r i e d o u tb y t h e M i n e r v a I n s t i t u t e f o r M e d i c a l R e s e a r c h ,H e l s i n k i , a n d t h e L o n d o n S c h o o l o f H y g i e n e a n dT r o p i c a l M e d i c i n e . L i t o m o s o i d e s c a r i n i i , w h i c h c o n -s t i t u t e s o n e r a w m a t e r i a l s o u r c e f o r a n t i g e n p r e p a r -a t i o n , i s b e i n g m a d e a v a i l a b l e b y t h e I n s t i t u t e o fP a r a s i t o l o g y a n d A n i m a l P a r a s i t i c D i s e a s e s , J u s t u sL i e b i g U n i v e r s i t y , G i e s s e n , F e d e r a l R e p u b l i c o fG e r m a n y .E L I S A c a n b e e v a l u a t e d i n f i l a r i a s i s a n d o n c h o -c e r c i a s i s f i e l d p r o g r a m m e s i n v a r i o u s r e p r e s e n t a t i v ee n d e m i c a r e a s , i n p a r t i c u l a r t h r o u g h l i n k s b e t w e e nN u f f i e l d I n s t i t u t e o f C o m p a r a t i v e M e d i c i n e , L o n d o n ,a n d v a r i o u s p r o g r a m m e s i n A f r i c a , P a p u a Ne wG u i n e a , a n d I n d i a , a n d t h r o u g h l i n k s b e t w e e n t h eI n s t i t u t e o f T r o p i c a l H y g i e n e a n d P u b l i c H e a l t h ,H e i d e l b e r g , F e d e r a l R e p u b l i c o f G e r m a n y , a n d p r o -g r a m m e s o f t h e C o a l M i n e s L a b o u r W e l f a r e O r g a n -i z a t i o n , D h a n h a d , I n d i a , a n d o f t h e C a l c u t t a S c h o o lo f T r o p i c a l M e d i c i n e , I n d i a . T h e u s e o f E L I S A i nt h e WHO O n c h o c e r c i a s i s C o n t r o l P r o g r a m m e i n t h eV o l t a R i v e r B a s i n i s b e i n g c o n s i d e r e d , a n d i t s a p p l i -c a t i o n f o r m u l t i p u r p o s e s e r o e p i d e m i o l o g i c a l a n dc l i n i c a l s t u d i e s i s c o n t e m p l a t e d i n a r e a s t h a t a r ea l s o e n d e m i c f o r m a l a r i a , t r y p a n o s o m i a s i s , a n ds c h i s t o s o m i a s i s . E L I S A f i e l d s t u d i e s c o u l d a l s o b em a d e i n a r e a s o f S u d a n , T a n z a n i a , a n d A m e r i c a n

S a m o a w h e r e WHO p r o g r a m m e s a r e i n o p e r a t i o n o rb e i n g p l a n n e d .OTHER P ARASIT IC INFECTIONS

T o x o p l a s m o s i sV a r i a b l e r e s u l t s h a v e b e e n o b t a i n e d w i t h E L I S Af o r t h e d e t e c t i o n o f a n t i b o d i e s a g a i n s t T o x o p l a s m ag o n d i i . M o s t i n v e s t i g a t o r s h a v e r e p o r t e d a r a t h e ru n s a t i s f a c t o r y c o r r e l a t i o n w i t h t h e I F a n d d y e t e s t sa n d a b e t t e r c o r r e l a t i o n w i t h t h e p a s s i v e h a e m a g -g l u t i n a t i o n t e s t w h e n t h e s a m e a n t i g e n w a s u s e d .Some s a t i s f a c t o r y r e s u l t s h a v e b e e n o b t a i n e d w i t hE L I S A , h o w e v e r , a n d i n p a r t i c u l a r g o o d c o r r e -l a t i o n s h a v e b e e n e s t a b l i s h e d w i t h t h e c l i n i c a ls t a t u s o f t h e p a t i e n t . T h e s e v a r i a b l e r e s u l t s m i g h t b ea t t r i b u t e d t o d i f f e r e n c e s i n t h e a n t i g e n p r e p a r a t i o n s .

S i n c e a n t i b o d i e s t o c e l l m e m b r a n e a r e t h e f i r s t t o b ef o r m e d , a n t i g e n s u s e d i n ELISA s h o u l d c o n t a i n t h i st y p e o f m a t e r i a l i f a g o o d c o r r e l a t i o n b e t w e e n E L I S Av a l u e s a n d t h e c l i n i c a l p i c t u r e i s t o b e o b t a i n e d .S u c h a n t i g e n s s h o u l d a l s o b e u s e d i f ELISA i s t ob e a p p l i e d t o t h e m a s s s c r e e n i n g o f h i g h - r i s k g r o u p s ,s u c h a s p r e g n a n t w o m e n ( 5 , 2 6 ) .H y d a t i d o s i sGood r e s u l t s h a v e b e e n o b t a i n e d w i t h E L I S A i n

t h e d e t e c t i o n o f a n t i b o d i e s i n h y d a t i d o s i s ( 5 , 1 0 ) .A m o e b i a s i sP r o m i s i n g r e s u l t s h a v e b e e n o b t a i n e d w i t h ELISAi n t h e d e t e c t i o n o f a n t i b o d i e s i n a m o e b i a s i s ( 3 , 4 ) .

DETECTION OF FREE ( C I R C U L A T I N G ) ANTIGENSIN PARASITIC INFECTIONS

I n a n u m b e r o f p a r a s i t i c i n f e c t i o n s , p a r t i c u l a r l yt h o s e i n t h e b l o o d , f r e e a n t i g e n s h a v e b e e n d e t e c t e d ,u s i n g v a r i o u s i m m u n o l o g i c a l t e s t s . E L I S A , b e c a u s eo f i t s h i g h s e n s i t i v i t y , m a y b e v e r y s u i t a b l e f o r t h ed e t e c t i o n o f s u c h a n t i g e n s . I t i s i m p o r t a n t t o r e l a t et h e p r e s e n c e o f f r e e ( c i r c u l a t i n g ) a n t i g e n s t o t h e c l i n i -c a l s t a t u s o f t h e p a t i e n t , a s t h e s e m a y b e a b e t t e ri n d i c a t o r o f h i s a c t u a l d i s e a s e s t a t e t h a n t h e p r e s e n c eo f s e r u m a n t i b o d i e s . I n f i l a r i a s i s , p a r t i c u l a r l y , a n t i g e nd e t e c t i o n c o u l d b e a d v a n t a g e o u s .

TR A IN INGI n s p e c i a l i z e d l a b o r a t o r i e s s e r o l o g y p r o v i d e d t h e y r e c e i v e a d e q u a t e f i n a n c i a l

T h e l a b o r a t o r i e s w h e r e ELISA i s n o w b e i n g s u p p o r t . When s e l e c t i n g t h e l a b o r a t o r y f o r t r a i n i n ga p p l i e d w i l l a c c e p t t r a i n e e s w i t h s o m e e x p e r i e n c e i n i n t h e E L I S A t e c h n i q u e s , t h e i n t e r e s t s o f t h e t r a i n e e

1 3 5

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136 MEMORANDUM

s h o u l d b e c o n s i d e r e d f r o m t h e f o l l o w i n g v i e w p o i n t s :( a ) c l i n i c a l d i a g n o s i s ; a n d ( b ) s e r o e p i d e m i o l o g i c a ls t u d i e s . A f e w w e e k s s h o u l d b e a d e q u a t e f o r s u c ht r a i n i n g ; WHO c o u l d h e l p i n m a k i n g s u c h a r r a n g e -m e n t s .F i e l d t r a i n i n t g

T h e s p e c i a l i z e d l a b o r a t o r i e s n o w u s i n g E L I S A c a np r o v i d e " o n t h e s p ot " t r a i n i n g i n f i e l d s i t u a t i o n s .S u c h t r a i n i n g s h o u l d b e s p o n s o r e d b y WHO. I n d e e d ,i t i s f e l t t h a t t h i s p r o g r a m m e i s h i g h l y r e l e v a n t t o t h ee f f o r t s o f WHO i n t h e f i e l d o f p a r a s i t i c d i s e a s e s .

** *

Dr D . E . B i d w e l l , N u f f i e l d I n s t i t u t e o f C o m p a r a t i v e M e d i -c i n e , T h e Z o o l o g i c a l S o c i e t y o f L o n d o n , R e g e n t ' s P a r k ,L o n d o n , E n g l a n dDr A . A . B u c k , E p i d e m i o l o g i c a l M e t h o d o l o g y a n d C l i n i -c a l P a t h o l o g y , D i v i s i o n o f M a l a r i a a n d O t h e r P a r a s i t i cD i s e a s e s , WHO, G e n e v a , S w i t z e r l a n d

Dr H . J . D i e s f e l d , I n s t i t u t e o f T r o p i c a l H y g i e n e a n dP u b l i c H e a l t h , H e i d e l b e r g , F e d e r a l R e p u b l i c o f G e r -m a n yDr B . E n d e r s , B e h r i n g w e r k e AG, M a r b u r g / L a h n , F e d e r a lR e p u b l i c o f G e r m a n yDr J . H a w o r t h , R e s e a r c h a n d T e c h n i c a l D o c u m e n t a t i o n ,D i v i s i o n o f M a l a r i a a n d O t h e r P a r a s i t i c D i s e a s e s ,WHO, G e n e v a , S w i t z e r l a n dDr G . H u l d t , N a t i o n a l B a c t e r i o l o g i c a l L a b o r a t o r y , S t o c k -h o l m , S w e d e nDr N . H . K e n t , E p i d e m i o l o g i c a l M e t h o d o l o g y a n d C l i n i -c a l P a t h o l o g y , D i v i s i o n o f M a l a r i a a n d O t h e r P a r a s i t i cD i s e a s e s , WHO, G e n e v a , S wi t z e r l a n d

M r s C . K i r s t e n , I n s t i t u t e o f T ro p i c a l H y g i e n e a n d P u b l i cH e a l t h , H e i d e l b e r g , F e d e r a l R e p u b l i c o f GermanyDr P . M a t t e r n , U n i t e d e R e c h e r c h e s s u r l ' I m m u n o l o g i ed e s A f f e c t i o n s p a r a s i t a i r e s ( U - 8 9 ) , I n s t i t u t n a t i o n a l d el a S a n t e e t d e l a R e c h e r c h e m e d i c a l e , D o m a i n e d eC a r r e i r e , B o r d e a u x , F r a n c e

Dr E . J . R u i t e n b e r g , L a b o r a t o r y o f P a t h o l o g y , N a t i o n a lI n s t i t u t e o f P u b l i c H e a l t h , B i l t h o v e n , T h e N e t h e r l a n d sDr A . V o l l e r , N u f f i e l d I n s t i t u t e o f C o m p a r a t i v e M e d i c i n e ,T h e Z o o l o g i c a l S o c i e t y o f L o n d o n , R e g e n t ' s P a r k ,L o n d o n , E n g l a n d

Annex ]E L I S A METHODS

E L I S A m a y b e p e r f o r m e d i n t u b e s ( m a c r o - a s s a y )o r i n m i c r o p l a t e s ( m i c r o - a s s a y ) , d e p e n d i n g o n t h er e a g e n t s a v a i l a b l e . B o t h m e t h o d s a r e d e s c r i b e d b e l o w .

M A C R O - A S S A YT h e f o l l o w i n g m e t h o d i s a p p l i c a b l e t o T r i c h i n e l l as p i r a l i s i n f e c t i o n i n p i g s ( 1 7 , 1 8 ) .I m m e d i a t e l y b e f o r e t h e a s s a y , d i s p o s a b l e p o l y -s t y r e n e t u b e s ( 5 0 mm h i g h a n d 1 1 mm w i d e a t t h eb a s e ) a a r e c o a t e d w i t h a n t i g e n a s f o l l o w s : 1 m l o ft h e a n t i g e n s o l u t i o n , c o n t a i n i n g 5 , u g o f p r o t e i n

p e r m l , d i s s o l v e d i n s o d i u m c a r b o n a t e b u f f e r( 0 . 1 m o l / l i t r e ; pH 9 . 6 ) w i t h s o d i u m a z i d e ( 0 . 2 g / l i t r e ) ,i s p l a c e d i n e a c h t u b e . Th e t u b e s a r e i n c u b a t e d i n aw a t e r b a t h a t 3 7 C f o r 3 0 m i n . T h e y a r e t h e n w a s h e d3 t i m e s w i t h 2 m l p e r t u b e o f p h o s p h a t e - b u f f e r e ds a l i n e ( P B S - 0 . 0 1 m o l / l i t r e ; pH 7 . 2 ) c o n t a i n i n g0 . 5 g o f p o l y s o r b a t e - 2 0 ( T w e e n 2 0 ) p e r l i t r e , e a c hw a s h i n g l a s t i n g 5 m i n . S e r a a r e d i l u t e d 1 t o 1 0 w i t hPBS c o n t a i n i n g 5 g p e r l i t r e o f b o v i n e s e r u m a l b u m i n

a L K B - P r o d u c t e r AB, S t o c k h o l m , S w e d e n .

( B S A ) a n d 0 . 5 g p e r l i t r e o f p o l y s o r b a t e - 2 0 . On e m i l l i -l i t r e o f a s e r u m d i l u t i o n i s a d d e d t o e a c h t u b e .T h e t u b e s a re i n c u b a t e d u n d e r r o t a t i o n a t 3 7 Cf o r 3 0 m i n . T h e y a r e t h e n w a s h e d 3 t i m e s , f o r 5 m i ne a c h t i m e , w i t h PBS c o n t a i n i n g 0 . 5 g o f p o l y s o r -b a t e- 20 p e r l i t r e . One m i l l i l i t r e o f c o n j u g a t e ( a n t i -s p e c i e s I g G - h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e ) , b d i l u t e d t o a no p t i m a l d i l u t i o n i n a 4 0 g / l i t r e BS A s o l u t i o n c o n -t a i n i n g 0 . 5 g o f p o l y s o r b a t e - 2 0 p e r l i t r e , i s a d d e dt o e a c h t u b e . T h e t u b e s a r e a g a i n i n c u b a t e d u n d e rr o t a t i o n a t 3 7 C f o r 3 0 m i n a n d w a s h e d 3 t i m e s , f o r5 m i n e a c h t i m e , w i t h PBS c o n t a i n i n g 0 . 5 g p o l y -s o r b a t e- 2 0 p e r l i t r e . F i n a l l y , t h e a m o u n t o f e n z y m eb o u n d t o t h e t u b e s i s d e t e r m i n e d . T h e s p e c i f i cs u b s t r a t e u s e d i s 5 - a m i n o s a l i c y l i c a c i d ( 5 A S ) a n dh y d r o g e n p e r o x i d e . T h i s s u b s t r a t e i s p r e p a r e d b yd i s s o l v i n g 8 0 m g o f 5A S i n 1 0 0 m l o f d i s t i l l e d w a t e ra t a p p r o x i m a t e l y 7 0 C . J u s t b e f o r e t h i s s t o c k s o l u t i o ni s u s e d , i t s pH s h o u l d b e b r o u g h t t o 6 . 0 w i t h1 m o l / l i t r e NaOH; 1 m l o f a 0 . 5 m l / l i t r e s o l u t i o no f h y d r o g e n p e r o x i d e i s a d d e d t o 9 m l o f 5 A S .

b I n s t i t u t P a s t e u r , P a r i s , F r a n c e .

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E N ZY M E - L I NK ED I M M U N O S O R B E N T A S S A Y 137

I n c u b a t i o n i s p e r f o r m e d a t t o o m t e m p e r a t u r e w h i l et h e t u b e s a r e s h a k e n g e n t l y . T h e r e a c t i o n i s s t o p p e da f t e r 1 h b y t h e a d d i t i o n o f 0 . 1 m l o f 1 m o l / l i t r eNaOH. T h e r e a c t i o n p r o d u c t , w h i c h i s b r o w n i nc o l o u r , i s p o u r e d i n t o a c u v e t t e . T h e d e n s i t y i s m e a s -u r e d i n a s p e c t r o p h o t o m e t e r a t 4 4 9 o r 4 5 0 n m . T h es u b s t r a t e c o n t r o l ( a n t i g e n - c o a t e d t u b e s i n c u b a t e dw i t h t h e s u b s t r a t e o n l y ) i s u s e d t o o b t a i n t h e z e r ol e v e l o f t h e s p e c t r o p h o t o m e t e r .

MICRO-ASSAYT h i s m e t h o d i s a p p l i c a b l e t o m a l a r i a ( 2 2 ) .

S e n s i t i z a t i o n o f p l a t e sP o l y s t y r e n e m i c r o - h a e m a g g l u t i n a t i o n p l a t e s w i t hw e l l s ( C o o k e M i c r o t i t e r a M2 9AR) a r e u s e d a s t h e

c a r r y i n g s u r f a c e f o r t h e a n t i g e n . E a c h w e l l i s s e n s i -t i z e d w i t h 0 . 3 m l o f t h e s o l u b l e a n t i g e n d i l u t e d i n0 . 0 5 m o l / l i t r e c a r b o n a t e b u f f e r , pH 9 . 6 . A f t e r s e n s i -t i z a t i o n , w h i c h i s a c h i e v e d o v e r n i g h t a t 4 C o r i n1 h a t 3 7 C , t h e p l a t e s a r e w a s h e d 3 t i m e s f o r a t o t a lo f 1 5 m i n i n s a l i n e c o n t a i n i n g 0 . 5 g o f p o l y s o r b a t e - 2 0p e r l i t r e . T h e p l a t e s a r e t h e n s h a k e n d r y a n d a r er e a d y f o r i m m e d i a t e u s e .P e r f o r m a n c e o f t h e t e s t1 . T h e t e s t s e r a a r e d i l u t e d i n PBS ( p H 7 . 2 ) c o n -t a i n i n g 0 . 5 g o f p o l y s o r b a t e - 2 0 p e r l i t r e .a D y n a t e c h L a b o r a t o r i e s , A l e x a n d r i a , V A , USA.

2 . A f t e r a d d i n g 0 . 3 m l o f e a c h a p p r o p r i a t e l yd i l u t e d s e r u m t o s e p a r a t e w e l l s i n t h e s e n s i t i z e dm i c r o - h a e m a g g l u t i n a t i o n p l a t e s , t h e p l a t e s a r e i n -c u b a t e d i n a h u m i d a t m o s p h e r e f o r 2 h a t roomt e m p e r a t u r e o f 1 h a t 3 7 0 C .

3 . T h e w e l l s a r e e m p t i e d a n d t h e p l a t e s a r e w a s h e dw i t h t h r e e c h a n g e s o f s a l i n e c o n t a i n i n g 0 . 5 g o fp o l y s o r b a t e - 2 0 p e r l i t r e , f o r a t o t a l o f 1 5 m i n . T h ep l a t e s a r e t h e n s h a k e n d r y .

4 . To e a c h w e l l i s a d d e d 0 . 3 m l o f t h e o p t i m a l l yd i l u t e d c o n j u g a t e a n d t h e p l a t e s a r e t h e n i n c u b a t e df o r 3 h a t room t e m p e r a t u r e o r 1 h a t 3 7 C .5 . T h e w e l l s a r e e m p t i e d a n d t h e w a s h i n g i s

r e p e a t e d a s i n s t e p 3 .6 . To e a c h w e l l i s a d d e d 0 . 3 m l o f e n z y m e s u b -s t r a t e a n d t h e p l a t e s a r e t h e n i n c u b a t e d a t room

t e m p e r a t u r e .7 . T h e r e a c t i o n i s s t o p p e d a f t e r a n a p p r o p r i a t e

t i m e w i t h 0 . 0 5 m l o f 2 m o l / l i t r e NaOH.8 . A b s o r b a n c e o f t h e c o n t e n t s o f e a c h w e l l i s r e a di n a s p e c t r o p h o t o m e t e r a t 4 0 0 n m ( = = E L I S A v a l u e ) .T h e c o n j u g a t e u s e d i n t h i s t e s t i s a l k a l i n e p h o s -

p h a t a s e c o u p l e d w i t h a n t i h u m a n g l o b u l i n , a n d t h es u b s t r a t e i s 4 - n i t r o p h e n y l p h o s p h a t e ( 1 g / l i t r e ) m a d eu p i n d i e t h a n o l a m i n e b u f f e r ( p H 9 . 8 ) c o n t a i n i n g0 . 5 m o l / l i t r e o f m a g n e s i u m c h l o r i d e .

A n n e x 2COLLECTION OF SERUM AND P L A S M A S A M P L E S a

S e r u m a n d p l a s m a c a n b o t h b e u s e d i n E L I S A .I n many i n s t a n c e s w h e r e v e n i p u n c t u r e i s i n a d v i s a b l e ,i t i s p o s s i b l e t o c o l l e c t b l o o d b y f i n g e r - p i c k i n t oh e p a r i n i z e d c a p i l l a r y t u b e s . W h e r e v e r p o s s i b l e , t h ec a p i l l a r y t u b e m e t h o d s h o u l d b e u s e d f o r t h e c o l -l e c t i o n a n d t r a n s p o r t o f s a m p l e s , a l t h o u g h u n d e rc e r t a i n c o n d i t i o n s t h e o n l y p r a c t i c a l w a y m ay b e t ou s e t h e f i l t e r - p a p e r t e c h n i q u e .

S ERU MI n o r d e r t o o b t a i n s e r u m , t h e b l o o d c o l l e c t e d

s h o u l d b e c o a g u l a t e d a t r o o m t e m p e r a t u r e w i t h i na f e w h o u r s a n d n o t a t 4 C , o t h e r w i s e s i g n i f i c a n t

q u a n t i t i e s o f I g M , a n d t o a l e s s e r e x t e n t o f I g G ,m ay b e l o s t .

PLA S MAC a p i l l a r y t u b e s

T h e f i n g e r i s c l e a n e d w i t h a n a l c o h o l - m o i s t e n e ds w a b a n d i s a l l o w e d t o d r y i n o r d e r t o p r e v e n th a e m o l y s i s o f t h e s a m p l e . A d i s p o s a b l e l a n c e t i s t h e nu s e d t o p r i c k t h e f i n g e r a n d t h e f i r s t d r o p o f b l o o di s w i p e d o f f , t h e n o n e o r m o r e l a b e l l e d h e p a r i n i z e da R e f e r a l s o t o a M e m o r a n d u m a l r e a d y p u b l i s h e d :"S e r o l o g i c a l t e s t i n g i n m a l a r i a " , B u l l . W o r l d H e a l t h O r g a n . ,

5 0 : 5 2 7 - 5 3 5 ( 1 9 7 4 ) .

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1 3 8 MEMORANDUMc a p i l l a r y t u b e s ( w i t h a minimum i n t e r n a l d i a m e t e ro f 1 . 1 mm a n d a l e n g t h o f 7 5 m m ) , p r e f e r a b l y c o n -t a i n i n g d r i e d t h i o m e r s a l , a r e f i l l e d . T h e c a p i l l a r yt u b e s a r e t h e n s e a l e d a t o n e e n d , e i t h e r b y p l u g g i n gw i t h p l a s t i c i n e o r b y h e a t , a n d c e n t r i f u g e d w i t h i n af e w h o u r s . A n e l e c t r i c a l c e n t r i f u g e o r e f f e c t i v e a l t e r -n a t i v e s h o u l d b e u s e d . Th e c a p i l l a r i e s a r e t h e n c u ta t t h e p l a s m a - c e l l i n t e r f a c e . T h e p l a s m a s e c t i o n i sa g a i n s e a l e d a t b o t h e n d s w i t h p l a s t i c i n e a n d s t o r e d .F i l t e r p a p e r

U n d e r f i e l d c o n d i t i o n s , t h e b l o o d s a m p l e s c o l -l e c t e d i n t o c a p i l l a r y t u b e s m a y b e a b s o r b e d o n t of i l t e r p a p e r f r o m w h i c h t h e s e r u m c a n b e e l u t e dp r i o r t o s e r o l o g i c a l t e s t i n g . I n t h i s c a s e , i t w i l l b en e c e s s a r y t o a b s o r b p r e c i s e l y m e a s u r e d q u a n t i t i e s o fb l o o d o n t o t h e f i l t e r p a p e r , e . g . , u s i n g c a p i l l a r yt u b e s . T h e i m p r e g n a t e d f i l t e r p a p e r s m u s t n o t c omei n t o c o n t a c t w i t h f i x i n g a g e n t s a n d s h o u l d b e d r i e da s s o o n a s p o s s i b l e , a v o i d i n g t e m p e r a t u r e e x c e e d -i n g 5 6 C . A l t h o u g h t h e s e d r i e d b l o o d s a m p l e s o nf i l t e r p a p e r a r e k now n t o w i t h s t a n d n o r m a l e n v i r o n -m e n t a l t e m p e r a t u r e s i n s u b t r o p i c a l c o n d i t i o n s f o ra t l e a s t a f o r t n i g h t w i t h o u t l o s s o f s e r o r e a c t i v i t y ,i t i s a d v i s a b l e t o s t o r e t h e m a s s o o n a s p o s s i b l ea t - 2 0 C , a t w h i c h t e m p e r a t u r e , e x p e r i e n c e i n d i -c a t e s , t h e y c a n b e p r e s e r v e d f o r a t l e a s t a y e a r .F o r t h e t e s t s , t h e e l u a t e i s u s e d . I f t h e b l o o ds a m p l e i s 7 0 , u l , a s i s t h e c a s e w i t h t h e s t a n d a r dh a e m a t o c r i t c a p i l l a r y t u b e s , e a c h f i l t e r p a p e r i s

p l a c e d i n 0 . 7 m l o f b u f f e r s o l u t i o n o f pH 7 . 2 a n di s l e f t o v e r n i g h t a t a t e m p e r a t u r e o f 4 C . T h i s c o r -r e s p o n d s t o a d i l u t i o n o f 1 / 2 o n a n a s s e s s e d h a e -m a t o c r i t v a l u e o f 5 0 % . E v e n w h e n t h e h a e m a t o c r i tv a l u e s a r e v e r y l o w , o v e r e s t i m a t i o n o f t h e t i t r e v a l u ei s n o t g r e a t .R e c e n t i n v e s t i g a t i o n s s u g g e s t t h a t a b s o r p t i o n o fb l o o d o n t h e f i l t e r p a p e r m ay d e s t r o y t h e r e a c t i v i t yo f I g M a n t i b o d i e s . T h e r e f o r e , f o r s e r o e p i d e m i o l o g i -c a l s t u d i e s o f i n f e c t i o n s i n w h i c h s u c h a n t i b o d i e sa r e o f d i a g n o s t i c i m p o r t a n c e , f r e s h p l a s m a s a m p l e ss h o u l d b e u s e d .

STORAGE OF S E RUMT h e r e a p p e a r t o b e v e r y f e w r e p o r t s o n t h e s t a b i l -i t y o f p a r a s i t e a n t i b o d i e s i n human s e r u m d u r i n g

s t o r a g e , b u t g e n e r a l e x p e r i e n c e s u g g e s t s t h e f o l l o w i n g :1 . I d e a l l y , t e s t s s h o u l d b e c a r r i e d o u t o n f r e s hs e r u m .

2 . S e r a s h o u l d b e s t o r e d i n s m a l l a l i q u o t s a n dp r e f e r a b l y a t a t e m p e r a t u r e o f -70C o r l o w e r .3 . B a c t e r i a l g r o w t h s h o u l d b e a v o i d e d . T h i s c a nb e a c h i e v e d b y h a n d l i n g t h e s e r u m s o a s t o a v o i d

g r o s s c o n t a m i n a t i o n a n d b y t h e a d d i t i o n o f s o d i u ma z i d e o r t h i o m e r s a l t o t h e b l o o d o r s e r u m s a m p l e .4 . D e l i p i d i z a t i o n m a y b e p r e f e r a b l e i n c e r t a i nc a s e s .

R EF ER ENC E S1 . A V R A M E A S , S . & T E R N Y N C K , T . P e r o x i d a s e l a b e l l e da n t i b o d y a n d Fab c o n j u g a t e s w i t h e n h a n c e d i n t r a -c e l l u l a r p e n e t r a t i o n , I m m u n o c h e m i s t r y , 8 : 8 7 1 ( 1 9 7 1 ) .2 . B A R T L E T T , A . E T A L . P r e l i m i n a r y s t u d i e s o n t h e a p p l i -

c a t i o n o f e n z y m e i m m u n o a s s a y i n t h e d e t e c t i o n o fa n t i b o d i e s i n o n c h o c e r c i a s i s , T r o p e n m e d . P a r a s i t o l . ,2 6 : 3 7 0 - 3 7 4 ( 1 9 7 5 ) .3 . B o s , H . J . & E I J K , A . A . VAN D E N . E n z y m e - l i n k e di m m u n o s o r b e n t a s s a y i n t h e s e r o d i a g n o s i s o f a m e -b i a s i s . I n : P r o c e e d i n g s o f I n t e r n a t i o n a l C o n f e r e n c eo n A m e b i a s i s , M e x i c o C i t y , 1 9 7 5 , A r c h . I n v e s t . m e d .( M e x . ) ( i n p r e s s ) .4 . B o s , H . J . E T A L . A p p l i c a t i o n o f E L I S A - e n z y m e -l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y - i n t h e s e r o d i a g n o s i s o fa m o e b i a s i s , T r a n s . R o y . S o c . T r o p . M e d . H y g . ( i np r e s s ) .5 . B o U T , D . E T A L . L e d i a g n o s t i c i m m u n o e n z y m o l o g i q u ed e s a f f e c t i o n s p a r a s i t a i r e s . I I . I m m u n o e n z y m o l o g i eq u a n t i t a t i v e ( E L I S A ) , L i l l e M e d i c a l , 20 : 5 6 1 ( 1 9 7 5 ) .

6 . D E E L D E R , A . M. & P L O E M , J . S . A n i m m u n o f l u o r -e s c e n c e r e a c t i o n f o r S c h i s t o s o m a m a n s o n i u s i n g t h ed e f i n e d a n t i g e n s u b s t r a t e s p h e r e s ( D A S S ) s y s t e m ,J . i m m u n o l . M e t h o d s , 4 : 2 3 9 ( 1 9 7 4 ) .7 . E N G V A L L , E . & L J U N G S T R O M , I . D e t e c t i o n o f humana n t i b o d i e s t o T r i c h i n e l l a s p i r a l i s b y e n z y m e - l i n k e di m m u n o s o r b e n t a s s a y , E L I S A , A c t a p a t h . m i c r o b i o l .s c a n d . S e c t . C , 8 3 : 2 3 1 ( 1 9 7 5 ) .8 . E N G V A L L , E . & P E R L M A N N , P . E n z y m e - l i n k e d i m m u -n o s o r b e n t a s s a y ( E L I S A ) . Q u a n t i t a t i v e a s s a y o fI g G , I m m u n o c h e m i s t r y , 8 : 8 7 1 ( 1 9 7 1 ) .9 . E N G V A L L , E . & P E R L M A N N , P . E n z y m e - l i n k e d i m -m u n o s o r b e n t a s s a y E L I S A . I I I . Q u a n t i t a t i o n o fs p e c i f i c a n t i b o d i e s b y e n z y m e l a b e l l e d a n t i - i m m u n o -g l o b u l i n i n a n t i g e n c o a t e d t u b e s , J . I m m u n o l . , 1 0 9 :12 9 ( 1 9 7 2 ) .1 0 . F A R A G , H . E T A L . S p e c i f i c i m m u n o d i a g n o s i s o fhuman h y d a t i d o s i s b y t h e e n z y m e - l i n k e d i m m u n o -s o r b e n t a s s a y ( E L I S A ) , B i o m e d i c i n e ( i n p r e s s ) .

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E N ZY M E - L I NK ED I M MUNO SORBENT A S S A Y 139

1 1 . G I R O U D , C . E T A L . A n t i g e n i c v a r i a t i o n o f T r y p a n o -s o m a e q u i p e r d u m i n r a b b i t , E x p . P a r a s i t o l . ( i n p r e s s ) .1 2 . H U L D T , G . E T A L . D e t e c t i o n o f a n t i b o d i e s i n s c h i s t o -s o m i a s i s b y e n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y( E L I S A ) , A n n . t r o p . M e d . P a r a s i t o l . , 6 9 ( 4 ) : 4 8 3 - 4 8 8( 1 9 7 5 ) .1 3 . K A W A O I , A . & N A K A N E , P . K . A n i m p r o v e d m e t h o do f c o n j u g a t i o n o f p e r o x i d a s e w i t h p r o t e i n s , F e d .P r o c . , 3 2 : 8 4 0 , a b s t r . N o . 3 5 0 8 ( 1 9 7 3 ) .1 4 . L J U N G S T R O M , I . E T A L . E L I S A : a n e w t e c h n i q u e f o rt h e s e r o d i a g n o s i s o f T r i c h i n e l l a s p i r a l i s i n f e c t i o n s .I n : P r o c e e d i n g o f t h e B r i t i s h S o c i e t y f o r P a r a s i t o -l o g y , P a r a s i t o l o g y , 6 9 : XXIV ( 1 9 7 4 ) .1 5 . R U I T E N B E R G , E . J . E T A L . A p p l i c a t i o n o f i m m u n o -f l u o r e s c e n c e a n d i m m u n o e n z y m e m e t h o d s i n t h es e r o d i a g n o s i s o f T r i c h i n e l l a s p i r a l i s i n f e c t i o n , A n n .N . Y . A c a d . S c i . , 2 5 4 : 2 9 6 ( 1 9 7 5 ) .1 6 . R U I T E N B E R G , E . J . E T A L . M i c r o s y s t e m f o r t h e a p p l i -

c a t i o n o f ELISA ( e n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n ta s s a y ) i n t h e s e r o d i a g n o s i s o f T r i c h i n e l l a s p i r a l i si n f e c t i o n s , M e d i k o n N e d e r l a n d , 4 : 3 0 ( 1 9 7 5 ) .1 7 . R U I T E N B E R G , E . J . E T A L . S e r o d i a g n o s i s o f T r i c h i n e l l as p i r a l i s i n f e c t i o n s i n p i g s b y e n z y m e - l i n k e d i m m u n o -s o r b e n t a s s a y , B u l l . W o r l d H e a l t h O r g a n . , 5 1 : 1 0 8( 1 9 7 4 ) .1 8 . R U I T E N B E R G , E . J . E T A L . R e l i a b i l i t y o f t h e e n z y m e -

l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y ( E L I S A ) f o r t h e s e r o -d i a g n o s i s o f T r i c h i n e l l a s p i r a l i s i n f e c t i o n s i n c o n -

v e n t i o n a l l y r a i s e d p i g s , J . i m m u n o l . M e t h o d s 1 0 :6 7 - 8 3 ( 1 9 7 6 ) .1 9 . R u I T E N B E R G , E . J . E T A L . ELISA ( e n z y m e - l i n k e di m m u n o s o r b e n t a s s a y ) a s a p r e v e n t i v e a n d r e p r e s s i v ec o n t r o l m e t h o d f o r t h e d e t e c t i o n o f T r i c h i n e l l a s p i -r a l i s i n f e c t i o n s i n n a t u r a l l y i n f e c t e d s l a u g h t e r p i g s ,W i a d o m o s c i P a r a z y t o l o g i c z n e , 21 : 7 4 7 ( 1 9 7 5 ) .2 0 . VA N K N A P E N , F . E T A L . R e l i a b i l i t y o f ELISA ( e n -z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y ) a s a c o n t r o lm e t h o d f o r t h e d e t e c t i o n o f T r i c h i n e l l a s p i r a l i s i n f e c -t i o n s i n n a t u r a l l y i n f e c t e d s l a u g h t e r p i g s , J . P a r a s i t o l .i n p r e s s ) .2 1 . VA N W E E M E N , B . K . & S C H U U R S , A . H . W. M. I m -m u n o a s s a y u s i n g a n t i g e n e n z y m e c o n j u g a t e s , FEBSL e t t e r s , 1 5 : 2 3 2 ( 1 9 7 1 ) .2 2 . V O L L E R , A . E T A L . A m i c r o p l a t e m e t h o d o f e n z y m e -l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y a n d i t s a p p l i c a t i o n t om a l a r i a , B u l l . W o r l d H e a l t h O r g a n . , 5 1 : 2 0 9 ( 1 9 7 4 ) .2 3 . V O L L E R , A . Ne w s e r o l o g i c a l t e s t f o r m a l a r i a a n t i -b o d i e s , B r . m e d . J . , 1 : 6 5 9 ( 1 9 7 5 ) .2 4 . V O L L E R , A . M i c r o p l a t e e n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r -b e n t a s s a y f o r C h a g a s ' d i s e a s e , L a n c e t , 1 : 4 2 6 ( 1 9 7 5 ) .2 5 . V O L L E R , A . A s e r o l o g i c a l s t u d y o n human T r y p a n o -s o m a r h o d e s i e n s e i n f e c t i o n s u s i n g a m i c r o - s c a l ee n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y , T r o p e n m e d .P a r a s i t o l . , 26 : 2 4 7 - 2 5 1 ( 1 9 7 5 ) .2 6 . V O L L E R , A . A m i c r o p l a t e e n z y m e i m m u n o a s s a y f o rT o x o p l a s m a a n t i b o d y , J . c l i n . P a t h o l . , 2 9 ( 2 ) : 1 5 0 - 1 5 3( 1 9 7 6 ) .