bİtkİsel gidalarin toplam antİoksİdan...

BİTKİSEL GIDALARIN TOPLAM ANTİOKSİDAN

KAPASİTELERİ ve BAŞLICA FENOLİK

BİLEŞENLERİ

Esma TÜTEM

İstanbul Üniversitesi, Mühendislik Fakültesi, Kimya Bölümü,

Analitik Kimya Anabilim Dalı, Avcılar - 34320

Bu tip maddeler, eĢleĢmemiĢ elektronları sebebiyle

genellikle kararsız ve çok reaktiftirler1,2,3.

Serbest radikaller, dıĢ yörüngelerinde eĢleĢmemiĢ

elektronu bulunan moleküllerdir.

1. FANG, Y. Z., YANG, S., WU, G., 2002, Free radicals, antioxidants, and nutrition, Nutrition, 18, 872-879.

2. HALLIVEL, B., ARUOMA, O. I., 1991, DNA damage by oxygen-derived species:its mechanisms and

measurement in mammalian systems, FEBS Lett, 281, 9-19.

3. LESCEY, K. M. W., LISA, G. W., MANOHAR, L. G., 2006, Methodology for the determination of

biological antioxidant capacity in vitro: a review, Journal of the Science of Food and Agriculture, 86,

2046-2056.

Hayvanlarda ve insanlarda fizyolojik ve patolojik koĢullarda oluĢan serbest radikaller;

Reaktif oksijen türleri (reactive oxygen species, ROS)

•Süperoksit anyonu (O2.-)

•Hidrojen peroksit (H2O2)

•Peroksil radikali (ROO.)

•Hidroksil radikali (OH.)

•Singlet oksijen (O2)

Reaktif azot türleri (reactive nitrogen species, RNS)

•Azot oksit (NO)

•Azot dioksit (.NO2)

•Peroksinitrit (ONOO-)

Reaktif klor türleri (reactive chlorine species)

•Hipoklorik asit (HOCl)

Antioksidanlar, yiyeceklerde veya vücutta düĢük

deriĢimlerde bulunduğu zaman, oksidasyonu önemli derecede

engelleyen veya geciktiren maddelerdir4.

Antioksidanlar, bu reaktif türlerin olumsuz etkilerini önemli ölçüde azaltabilen bileĢiklerdir2.

4. HALLIWELL, B., AESCHBACH, R., LÖLIGER, J., ARUOMA, O. I., 1995, The characterization of

antioxidants, Food and Chemical Toxicology, 33, 601-617.

DOĞAL ANTİOKSİDANLAR

Flavonoidler

C Vitamini (Askorbik asit)

E Vitamini

Karotenoidler (A vitamini öncülleri)

Fenolik Bileşikler

Fenolik Asitler

Fenolik Polimerler (Tanenler)

FENOLĠK ASĠTLER

Hidroksisinnamik

Asitler

Hidroksibenzoik

Asitler

p-kumarik asit Kafeik asit Ferulik asitGallik Asit Protokateşuik Asit

Vanilik AsitKlorojenik asit Sinapik asit

p-kumarik asit, kafeik asit, ferulik asit,

klorojenik asit ve sinapik asit’in kimyasal yapıları

Gallik, protokateşuik ve

vanilik asit’in kimyasal yapıları

FLAVONOİDLER

Flavonoidlerin genel yapısı

Flavonoidler

Antoksantinler Antosiyaninler

Flavonlar

Flavonoller

Flavanoller

Flavanonlar

İzoflavonlar

Apigenin, luteolin ve krisin’in

kimyasal yapıları

Kuersetin, kamferol, mirisetin ve

izoramnetin’in kimyasal yapıları

Kateşin, epikateşin, epigallokateşin’in kimyasal yapıları

Hesperetin ve naringenin’in

kimyasal yapıları

Genistein ve daidzein’in

kimyasal yapıları

Antosiyanidin

Siyanidin Malvidin

Apigenidin Delfinidin

Siyanidin, malvidin, apigenidin ve delfinidin’in kimyasal yapıları

Antosiyanidinlerin

kimyasal yapısı

Fenolik Polimerler (Tanenler)

n=0 epikateşin dimer (prosiyanidin B2);

n=1 epikateşin trimer;

n=2 epikateşin tetramer;

n2 epikateşin oligomer

Prosiyanidinler’in genel kimyasal yapısı

Polifenollerin kronik dejeneratif hastalıklara, özellikle

kalp-damar hastalıklarına karĢı koruyucu etkisini destekleyen

bilimsel kanıtların sayısı hızla artmaktadır5,6.

Bu nedenle meyveler, sebzeler, tahıllar ve tıbbi bitkilerin

fenolik bileĢenlerinin ayrı ayrı tanımlanması, miktarlarının

belirlenmesi, keza toplam antioksidan kapasitelerinin tayini,

önemli ve güncel araĢtırma konularıdır7,8.

5. KAY, C.D., 2010, The futture of flavonoid research, Br. J. Nutr., 104, S91-S95.

6. HOOPER, L., et al., 2008, Flavonoids, flavonoid-rich foods, and cardiovascular risk: a meta analysis of

randomized controlled trials, Am. J. Clin. Nutr.. 88, 38-50.

7. LEE, K.W., 2003, Major phenolics in apple and their contribution to the total antioxidant capacity, J. Agric.

Food Chem., 51, 6516-6520.

8. US Department of Agriculture, Agricultural Research Service, 2009, USDA National Nutrient Database for

Standard Reference, http://www.ars.usda.gov

TOPLAM ANTİOKSİDAN KAPASİTE TAYİN

YÖNTEMLERİ

Elektron Aktarımına Dayalı Toplam Antioksidan

Kapasite Yöntemleri

CUPRAC (Cupric Reducing Antioxidant Capacity; Cu(II) Ġyonu Ġndirgeyici Antioksidan Kapasite) Yöntemi

TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity; Troloks

EĢdeğeri Antioksidan Kapasite) / ABTS Yöntemi

FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power; Demir(III)

Ġyonu Ġndirgeyici Antioksidan Gücü) Yöntemi

DPPH Yöntemi

Hidrojen Atomu Aktarımına Dayalı Toplam Antioksidan

Kapasite Tayin Yöntemleri

TRAP (Total Radical-Trapping Antioxidant Parameter; Toplam Radikal Tutucu Antioksidan Parametre) Yöntemi

Luminol Yöntemi

ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity; Oksijen Radikal Absorplama Kapasitesi) Yöntemi

TOSC (Total Oxyradical Scavenging Capacity; Toplam

Oksiradikal Süpürme Kapasitesi) Yöntemi

Diklorofloresin-diasetat (DCFH-DA) Yöntemi

Krosin Yöntemi

Fikoeritrin (PE) Esaslı Yöntem

UYGULANAN YÖNTEMLER

Spektrofotometrik Kromatografik

Toplam Antioksidan Kapasite

CUPRAC yöntemi

ABTS/HRP yöntemi

Toplam Fenol İçeriği

Folin-Ciocalteu Yöntemi

Toplam Flavonoid İçeriği

AlCl3 / KAc Yöntemi

AlCl3 / NaNO2 Yöntemi

Toplam Antosiyanin İçeriği

Farklı pH Yöntemi

RP-HPLC yöntemi

CUPRAC (Cupric Reducing Antioxidant Capacity; Cu(II) İyonu

İndirgeyici Antioksidan Kapasite) Yöntemi

9. APAK, R., GÜÇLÜ, K., ÖZYÜREK, M., KARADEMIR, S.E., 2004, Novel total antioxidant capacity

index for dietary polyphenols and vitamins C and E, using their cupric ion reducing capability in the

presence of neocuproine: CUPRAC Method, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52 (26),

7970-7981.

Apak ve arkadaĢlarının9 geliĢtirdiği bu yöntemde, 2,9-

dimetil-1,10-fenantrolin (Neokuproin-Nc)’in Cu(II) ile

oluturduğu bakır(II)-neokuproin kompleksinin (Cu(II)-Nc),

450 nm’ de maksimum absorbans veren bakır(I)-neokuproin

[Cu(I)-Nc] kelatına (ġekil 2.16) indirgenme yeteneğinden

yararlanarak antioksidan kapasite hesaplanmaktadır.

(A) Cu(II)-Nc, (B) Cu(I)-Nc komplekslerinin spektrumları

n Cu(Nc)22+ + Ar(OH)n n Cu(Nc)2

2+ + Ar(=O)n + n H+

CUPRAC Yöntemi

Normal Yöntem

1 ml Cu(II) klorür

+

1 ml Neokuproin

+

1 ml Amonyum Asetat

+

x ml Antioksidan çözeltisi

+

1 – x ml Bidistile su

30 dakika

A450 nm

Oda sıcaklığı

Ġnkübasyonlu Yöntem

1 ml Cu(II) klorür

+

1 ml Neokuproin

+

1 ml Amonyum Asetat

+

x ml Antioksidan çözeltisi

+

1 – x ml Bidistile su

50 0C

30 dakika

Soğutma

A450 nm

TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity; Troloks

Eşdeğeri Antioksidan Kapasite) / ABTS Yöntemi

10. MILLER, N.J., DIPLOCK, A.T., RICE-EVANS, C., DAVIES, M.J., GOPINATHAN, V., MILNER, A., 1993,

A novel method for measuring antioxidant capacity and its application to monitoring the antioxidant status in

premature neonates, Clin. Sci., 84, 407-412.

11. MILLER, N.J., RICE-EVANS, C., 1994, Total antioxidant status in plasma and body fluids, Methods in Enzymology,

234, 279-293.

Troloks eĢdeğeri antioksidan kapasite olarak ifade edilen

TEAC/ABTS yöntemi, ilk olarak Miller ve arkadaĢları10,11

tarafından geliĢtirilmiĢtir.

Bu yöntem; 2,2’-azinobis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonat)

(ABTS) kromojen radikal katyonunun absorbansının,

antioksidanlar tarafından inhibisyonunu temel alır.

Antioksidanlar varlığında ABTS.+ radikal katyonunun

absorbansında belirli bir süre içindeki azalmadan yararlanarak

toplam antioksidan kapasite troloks cinsinden bulunur.

ABTS.+ radikal katyonunun absorbsiyon spektrumu

ABTS.+ radikal katyonu 660, 734 ve 820 nm’de maksimum verir.

• Cano ve arkadaĢları12 tarafından hidrofilik bileĢenlerin antioksidan

aktivitesini ölçmek için ABTS/H2O2/HRP (horse radish peroxidase)

enzimatik sistemi geliĢtirilmiĢtir.

• Bu yöntemde ABTS radikal katyonu (ABTS.+) enzimatik olarak oluĢturulur

ve antioksidan veya örnek çözelti bu reaksiyon ortamına ilave edilir.

Sonuçlar ABTS.+ radikal katyonunun yok olması yani absorbansının

düĢüĢü ile elde edilir.

12. CANO, A., HERNÀNDEZ-RUÍZ, J., GARCÍA-CÀNOVAS, F., ACOSTA, M., ARNAO, M.B., 1998, An end-

point method for estimation of the total antioxidant activity in plant material, Phytochemical Analysis, 9 (4),

196-202.

ABTS / HRP Yöntemi

0.5 ml ABTS

+

0.5 ml H2O2

+

0.5 ml HRP

5 dakika

bekleme x ml Örnek

+

0.5 – x ml Etanol

5 dakika bekleme

A 730 nm

A = A Radikal çözeltisi - A Örnek Çözeltisi

Radikal çözeltisi; örnek yerine örnek çözücüsü içeren çözeltidir.

TOPLAM FENOL ĠÇERĠĞĠ TAYĠN YÖNTEMĠ

Folin Ciocalteu Yöntemi

Bu yöntem, Singleton ve arkadaşları13,14 tarafından toplam

fenolik içeriği ölçmek için geliştirilmiştir.

Yöntemin temeli, fenolik bileşiklerin Folin Ciocalteu ayıracı

(FCR) ile sadece bazik ortamda reaksiyon vermesine

dayanmaktadır.

Toplam fenolik bileşenlerin tayin yöntemi olarak bilinen Folin-

Ciocalteu ayıracı (fosfomolibdik fosfotungstik asit) kullanılan bu

yöntem, gerçekte örneğin indirgenme kapasitesini tayin

etmektedir.

13. SINGLETON, V.L., ROSSI, J.A., 1965, Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic

acid reagents, American Journal of Enology and Viticulture, 16, 144-158.

14. SINGLETON, V.L., ORTHOFER, R., LAMUELA-RAVENTOS, R.M., 1999, Analysis of total phenols and other

oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu Reagent, Methods in Enzymolology, 299, 152-

178.

x mL Örnek

+(2-x) mL distile su

+2,5 mL Lowry C

10 dakika

0,25 mL Folin-Ciocalteu

Reaktifi (1:3, v/v)30 dakika

A 750 nm

Lowry A: 0,1 M NaOH içinde % 2 (w/v) Na2CO3

Lowry B: % 1 (w/v) NaKC4H4O6 içinde % 0,5 (w/v) CuSO4

Lowry C: 50 mL Lowry A + 1 mL Lowry B

oda sıcaklığı oda sıcaklığı

Toplam fenol içeriği, genellikle gallik asit eĢdeğeri olarak

hesaplanır.

TOPLAM FLAVONOĠD ĠÇERĠĞĠ TAYĠN YÖNTEMLERĠ

Alüminyum Klorür/Potasyum Asetat Spektrofotometrik Yöntemi

• Alüminyum klorür, flavon ve flavonol grubu bileĢiklerin C-4 keto grubu ve

C-3 veya C-5 hidroksil gruplarından biriyle kararlı bir kelat

oluĢturmaktadır (Al-Flavon veya Al-Flavonol kompleksi).

• Bununla birlikte alüminyum, flavonoid grubu bileĢiklerin A ve B

halkalarındaki orto-dihidroksi gruplarıyla da kararsız kompleksler

oluĢturmaktadır.

Al(III)’un kuersetin ile oluşturduğu komplekslerin kimyasal yapısı

• Yöntem; etanol, alüminyum(III) klorür çözeltisi ve potasyum asetat

çözeltilerinin karıĢtırılmasından sonra, üzerine flavonoid çözeltisinin

(flavon, flavonol veya isoflavon bileĢikleri) ilave edilmesi ve bunu

takip eden 30 dakika sonunda referansa karĢı 415 nm’de absorbans

değerlerinin ölçülmesinden ibarettir15.

15. R. WOISKY, A., SALATINO, 1998, Analysis of propolis: some parameters and procedures for chemical

quality control, J. Apic. Res., 37, 99-105.

AlCl3/KAc Yöntemi 16

x mL Örnek

+1.5 mL Etanol

+0.1 mL %10 AlCl3

+0.1 mL 1 M CH3COOK

+(3.3 – x) mL distile su

oda sıcaklığı

30 dakika

A 427 nm

16 . CHANG, C.C., YANG, M.H., WEN, H.M., CHERN, J.C., 2002, Estimation of Total Flavonoid Content in Propolis

by Two Complementary Colorimetric Methods, Journal of Food and Drug Analysis, 10 (3), 178-182.

Alüminyum Klorür/Sodyum Nitrit Yöntemi

• Jia Zhishen ve diğerleri17 tarafından rapor edilen AlCl3/NaNO2

yönteminde toplam flavonoid içeriği, alüminyum klorür ve sodyum

nitrit ayıraçları kullanılarak, alkali ortamda pembe renkli flavonoid-

alüminyum kompleksinin meydana gelmesiyle belirlenmiĢtir.

17. ZHISHEN, J., MENGCHENG, T., JIANMING, W., 1999, The determination of flavonoid contents in mulberry

and their scavenging effects on superoxide radicals, Food Chem., 64, 555-559.

x mL Örnek

+(3.4 – x) mL distile su

+0.2 mL %5 NaNO2

oda sıcaklığı

5 dakika

0,4 mL %10 AlCl3.6H2O

oda sıcaklığı 20 dakika

1 ml 1 M NaOH

hemen

A 510 nm

AlCl3/KAc ve AlCl3/NaNO2 yöntemleriyle bulunan toplam

flavonoid içerikleri, genellikle kuersetin eĢdeğeri olarak

hesaplanır.

TOPLAM ANTOSĠYANĠN ĠÇERĠĞĠ TAYĠN YÖNTEMĠ

Farklı pH Yöntemi18

• Antosiyanin pigmentleri, pH’taki değiĢim ile farklı absorbans

spektrumlarına sahip tersinir yapısal dönüĢümlere uğrarlar.

• pH 1.0’de renkli oksonyum türü ve pH 4.5’da renksiz hemiketal türü

hakimdir.

• Farklı pH yöntemi bu duruma dayanır19.

18. WROLSTAD, R.E., DURST, R.W., LEE, J., 2005, Tracking color and pigment changes in anthocyanin

products, Food Science and Technology, 16, 423-428.

19. WROLSTAD, R.E., ACREE, T.E., DECKER, E.A., PENNER, M.H., REID, D.S., SCHWARTZ, S.J.,

SHOEMAKER, C.F., SMITH, D., SPORNS, P., 2005, Handbook of Food Analytical Chemistry: Water,

Proteins, Enzymes, Lipids, and Carbohydrates, A John Wiley&Sons, Inc., New Jersey, 0-471-71817-3.

pH 1.0 ve pH 4.5 tamponlarında saflaştırılmış turp antosiyaninlerinin (açillenmiş

pelargonidin-3-soforozit-5-glukozit türevleri) spektral karakteristikleri

Farklı pH değerlerinde antosiyaninlerin baskın yapısal türleri

• Wrolstad ve arkadaĢlarının18 geliĢtirdiği bu yöntemde örnekler

sulu pH 1.0 ve 4.5 tamponları ile seyreltilir ve absorbans pH 1.0

çözeltisinin maksimum absorbansının dalga boyunda ölçülür.

• Örnek matrikslerindeki baĢlıca antosiyaninin (çoğunlukla siyanidin-

3-glukozit) molekül ağırlığını ve molar absorplama katsayısını

kullanarak toplam antosiyanin içeriği hesaplanır.

pH 1.0 Tamponu: 125 mL 0.2 M KCl + 375 mL 0.2 M HCl

pH 4.5 Tamponu: 400 mL 1 M CH3COONa + 240 mL 1 M HCl + 360 mL H2O

Örnekler, pH 1.0 ve pH 4.5 tamponları ile seyreltilir.

Çözeltilerin absorbansları 510 ve 700 nm’de ölçülür18.

A x MW x DF X 103

ε x l Toplam Antosiyanin (mg/L) =

A = (A510nm - A700nm)pH1.0 - (A510nm - A700nm)pH4.5

MW = Molekül Ağırlığı

DF = Seyreltme Faktörü

ε = Molar absorplama katsayısı, L x mol–1 x cm–1

l = ışıma yolu (1 cm)

Molekül ağırlığı 449.2 ve molar absorptivitesi 26900 olan

siyanidin-3-glukozit eşdeğeri olarak hesaplandı.

Tablo 1. CUPRAC VE ABTS yöntemlerine ait TEAC*

katsayıları

TEACN TEACI ABTS

Askorbik asit 1.00 1.32 1.06Hidroksibenzoik asitler

Gallik asit 2.99 3.25 3.64Hidroksisinnamik asitler

Klorojenik asit 2.47 2.72 1.38

Kafeik asit 2.89 2.96 1.11

p-Kumarik asit 0.55 1.00 1.63

Ferulik asit 1.20 1.23 2.16

Rozmarinik asit 5.65 6.02 2.30Flavonlar

Luteolin 2.90 3.14 1.01

Apigenin 0.27 0.82 0.65

BULGULAR

*TEAC = εStandart / ε Troloks

Tablo 1 (devam)Flavonoller

Kuersetin 5.49 5.57 4.01

Mirisetin 4.27 4.79 3.43

Kamferol 1.47 1.92 0.86

Rutin 2.56 2.56 3.19

Izokuersitrin 3.14 3.60 3.21

Flavanoller

KateĢin 3.09 3.56 4.56

EpikateĢin 4.04 4.80 4.58Flavanonlar

Naringenin - 2.28 0.64

Naringin 0.02 0.13 0.62

Hesperetin 0.99 1.05 1.11

Hesperidin 0.97 1.11 1.40

Dihidrokalkonlar

Floridzin 1.47 2.99 1.83

Tablo 1 (devam)Prosiyanidinler

Prosiyanidin B2 7.11 8.89 6.61Antosiyanidinler

Siyanidin klorür 4.56 6.87 5.00

Kuromanin klorür 4.80 5.87 4.58

Kerasiyanin klorür 4.80 5.94 4.59

Idaein klorür 4.70 5.25 3.58

Peonidin klorür 2.60 4.20 2.41

Peonidin-3-O-glukozit 3.40 4.56 3.75

Bitkiler (maydanoz, kereviz yaprağı, ısırgan otu)20

Bitki

-40 C

Kurutulmuş (liyofilize) bitki örneği

Toz örnek

Öğütme

Çözücü

Ultrasonik banyo 15 ml 45’ + 5 ml 45’ + 5 ml 15’

Ekstrakt (25 ml’ye tamamlandı)

Süzgeç kağıdı

Süzüntü

Mikrofiltrasyon

Örnek (Analize kadar -20 0C’de bekletildi.)

20.YILDIZ, L., SÖZGEN

BAġKAN, K., TÜTEM, E.,

APAK, R., 2008, Combined

HPLC–CUPRAC (cupric ion

reducing antioxidant capacity)

assay of parsley, celery leaves,

and nettle, Talanta, 77, 304–313.

Elma

Kabuk soyulması

Et

Püre

Rendeleme

Bezden Süzme

Posa + Su

5000 rpm’de 15’ santrifüj

Su fazı

Elma suyu örneği

Mikrofiltrasyon

Elma suları21

21. KARAMAN, ġ., TÜTEM, E.,

SÖZGEN BAġKAN, K., APAK,

R., 2010, Comparison of total

antioxidant capacity and phenolic

composition of some apple juices

with combined HPLC–CUPRAC

assay, Food Chemistry 120, 1201–

1209.

ultrasonik banyo 10 mL 40’ + 10 mL 40’ + 5 mL 30’

(25 mL’ye tamamlandı)Ekstrakt

Süzgeç kağıdı

Mikrofiltrasyon

Süzüntü

Örnek (Analiz süresine kadar -20 0C’de saklandı.)

(GF/PET, 1.0/0.45µm mikrofiltre)

Lahana parçaları

Kurutulmuş (liyofilize) lahana örneği

Öğütme

Çözücü

Toz örnek ( 2 g )

Lahana22

- 40 C

22. ENCU Sevinç, 2010, Yüksek

Lisans Tezi, Ġ.Ü. Fen Bilimleri

Enstitüsü,.

Tablo 2. Bitki, lahana ve elma sularının Toplam Antioksidan

Kapasite (Total Antioxidant Capacity, TAC) değerleri (elma suları

için mmol troloks L-1, bitki ve lahanalar için mmol troloks g-1)

ÖRNEK CUPRACN CUPRACI ABTS

MAYDANOZ

70% MeOH eks. 0.050 0.079 0.040

m-fosforik asit eks. 0.016 0.023 0.008

KEREVĠZ YAPRAĞI

70% MeOH eks. 0.148 0.180 0.087

ISIRGAN

70% MeOH eks. 0.076 0.097 0.058

ELMA SULARI

King Luscious 8.26 11.4 5.32

Amasya 5.43 7.67 3.91

Ervin Spur 9.74 13.70 7.59

Sky Spur 5.85 9.06 4.55

Arap Kızı 4.70 7.77 3.08

Lutz Golden 3.39 5.78 2.84

Granny Smith 4.37 5.83 3.06

Tablo 2 (devam)

ÖRNEK CUPRACN CUPRACI ABTS

LAHANALAR

Beyaz 0.021 - 0.017

Kırmızı 0.168 - 0.189

Brüksel 0.034 - 0.028

Kara 0.058 - 0.078

Lahana Örneklerinin Spektrofotometrik Sonuçlarının

Karşılaştırılması

Lahana Ekstraktlarının Folin-CUPRAC Korelasyonu

y = 0,4467x - 0,0152

R2 = 0,9972

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

Toplam fenolik madde içeriği (mmol GA/g)

CU

PR

AC

yö

nte

miy

le T

AC

(m

mo

l T

R/g

)

Lahana Ekstraktlarının AlCl3/CH3COOK-CUPRAC Korelasyonu

y = 0,0241x + 0,0013

R2 = 0,751

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0,16

0,18

0 1 2 3 4 5 6

Toplam flavonoid içeriği (mmol QR/g) x 103

CU

PR

AC

yö

nte

miy

le T

AC

(m

mo

l T

R/g

)

Lahana Ekstraktlarının AlCl3/NaNO2- CUPRAC Korelasyonu

y = 0,0043x + 0,0197

R2 = 0,9842

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0,16

0,18

0 5 10 15 20 25 30 35

Toplam flavonoid içeriği (mmol QR/g) x 103

CU

PR

AC

yö

nte

miy

le T

AC

(m

mo

l T

R/g

)

HPLC Analizi

Maydanoz, kereviz yaprağı ve ısırgan otundaki fenolik bileĢenler için geliĢtirilen HPLC metodu (1);

• Mobil faz:

Metanol (A)

% 0.2 o-H3PO4 içeren bidistile su (B)

• 8 dak 7 % (A) , eğim (0.0);

• 8-13 dak 30 % (A), eğim (–4.0);

• 13-48 dak 66 % (A), eğim (1.0);

• 48-55 dak 75 % (A), eğim (–4.0).

• AkıĢ hızı 1 mL / dakika,

• Dedeksiyon (belirleme) dalga boyu 280 nm.

• Kolon C18

Kromatografik Analiz

Elma suyundaki fenolik bileĢenler için geliĢtirilen HPLC metodu (2);

• Mobil faz:

Metanol (A)

% 0.2 o-H3PO4 içeren bidistile su (B)

• 5 dakika % 30 (A) , eğim (0.0)

• 35 dakika % 66 (A) , eğim (1.0).

• AkıĢ hızı 1 mL / dakika,


• Kolon C18

Askorbik asit, malik asit ve fumarik asit analizi için geliĢtirilen HPLC metodu (3);

• Mobil Faz:

Metanol (A)

% 0.2 o-H3PO4 içeren bidistile su (B).

• 3 dakika % 2 (A), eğim (0,0)

• 4 dakika % 7 (A), eğim (4,0)

• 3 dakika % 7 (A), eğim (0,0).

• AkıĢ hızı 1 mL/dakika,


• Kolon C18

Isırgan otunun %70 (v/v) metanoldeki ekstraktının kromatogramı1: KateĢin; 2: Klorojenik asit

Elma suları

King Luscious elma suyunun

kromatogramı1: KateĢin + Prosiyanidin B2;

2: Klorojenik asit; 3: EpikateĢin;

4: Kafeic asit; 5: Floridzin

Amasya elma suyunun


2: Klorojenik asit; 3:EpikateĢin;

4: Kafeic asit; 5: Floridzin

Ervin Spur elma suyunun


2:Klorojenik asit; 3: EpikateĢin;

4: Kafeik asit; 5: Floridzin

Sky Spur elma suyunun


2:Klorojenic asit; 3: EpikateĢin;


Arap Kızı elma suyunun

kromatogramı1: Kateġin + Prosiyanidin B2;

2:Klorojenik asit; 3: EpikateĢin;


Lutz Golden elma suyunun


2:Klorjgenik asit; 3: EpikateĢin;

4: Kafeik asit; 5: Floridzin.

ÖRNEK KATEŞİN KLOROJENİK

ASİT

EPİKATEŞİN KAFEİK

ASİT

FLORİDZİN TOPLAM

King Luscious 115.30 276.36 16.63 79.09 12.43 499.81

Amasya 89.41 126.84 43.54 27.20 6.61 293.60

Ervin Spur 81.39 111.25 66.76 20.72 20.13 300.25

Sky spur 9.09 72.99 45.28 21.80 11.80 160.16

Arap kızı 67.52 242.30 28.04 12.14 0.52 350.52

Lutz Golden 41.62 71.92 11.58 8.22 3.57 136.91

Granny Smith 76.77 41.10 3.38 3.04 1.15 125.44

Tablo 3: Elma sularının içerdiği fenolik bileşen miktarları (mg L-1)

Elma suları içeriklerine göre sıralandığında;

KateĢin açısından

King Luscious Amasya Ervin Spur Granny Smith Arap

kızı Lutz Golden Sky Spur

Klorojenik asit açısından

King Luscious Arap Kızı Amasya Ervin Spur Sky Spur

Lutz Golden Granny Smith

EpikateĢin açısından

Ervin spur Sky Spur Amasya Arap Kızı King Luscious


Kafeik asit açısından

King Luscious Amasya Sky Spur Ervin Spur Arap Kızı


Floridzin açısından

Ervin Spur King Luscious Sky Spur Amasya Lutz Golden

Granny Smith Arap Kızı

Askorbik asit miktarlarına göre elma suları

Sky Spur Ervin Spur King Luscious Amasya

Arap Kızı, Lutz Golden ve Granny Smith elma sularında ise malik asit miktarı çok yüksek olduğu için askorbik asit miktarı belirlenememiĢtir.

Elma suyu örneklerinin toplam antioksidan kapasite sıralaması: (CUPRAC ve

ABTS)

Ervin Spur King Luscious Sky Spur Amasya Arap Kızı

Granny Smith Lutz Golden

BİRLEŞTİRİLMİŞ HPLC-CUPRAC YÖNTEMİ:

Sadece kromatografik ayırımla, gıdaların hem

antioksidan bileĢenleri hem de toplam antioksidan

kapasiteleri açısından değerlendirilmesine olanak

sağlayan yöntem

HPLC’de belirlenen deriĢimlerin sırasıyla CUPRAC-normal,

ve CUPRAC-inkübasyonlu yöntemleriyle elde edilen TEAC

katsayıları ile çarpılmasıyla hesaplanan kapasiteyi ifade

etmektedir.

(Antioksidan Kapasite) Toplam = TEACi

Ci : i- bileĢeninin HPLC yoluyla bulunan deriĢimi

TEACi : i- bileĢeninin seçilen kapasite ölçüm yöntemine

göre TEAC katsayısı

Tablo 4. BirleĢtirilmiĢ HPLC-CUPRAC yöntemiyle hesaplanan TAC

değerlerinin deneysel TAC değerlerine göre % karĢılıkları

ÖRNEK CUPRACN(%) CUPRACI (%)

ISIRGAN

70% MeOH eks. 81 71

ELMA SULARI

King Luscious 71 63

Amasya 77 71

Ervin Spur 69 66

Sky Spur 72 84

Arap Kızı 75 53

Lutz Golden 42 29

Granny Smith 40 36

BirleĢtirilmiĢ HPLC-CUPRAC yöntemi, ayrıca toplam antioksidan

kapasite tayin yöntemi uygulamak gerekmeksizi karmaĢık

örneklerin hem antioksidan bileĢenleri hem de toplam antioksidan

kapasiteleri açısından gerçekçi bir Ģekilde karĢılaĢtırılmalarını

olanaklı kılar. Bu karĢılaĢtırma, HPLC ile bulunan fenolik

bileĢiklerin kütlelerinin toplanması yoluyla gerçekleĢtirilen

karĢılaĢtırmalardan kesinlikle daha anlamlıdır23-26.

23. Gliszczynska-Swiglo, A. and Tyrakowska, B., 2003, Quality of commercial apple juices evaluated on the

basis of the polyphenol content and the TEAC antioxidant activity, J. Food Sci., 68, 1844–1849.

24. Sultana, B. and Anwar, F., 2008, Flavonols (kaempeferol, quercetin, myricetin) contents of selected

fruits, vegetables and medicinal plants, Food Chemistry, 108, 879–884.

25. Markowski, J., & Płocharski, W., 2006, Determination of phenolic compounds in apples and processed

apple products. Journal of Fruit and Ornamental Plant Research, 14, 133–142.

26. Wu, J., Gao, H., Zhao, L., Liao, X., Chen, F., Wang, Z.,. Hu, X., 2007, Chemical compositional

characterization of some apple cultivars. Food Chemistry, 103, 88–93.

Sentetik karıĢımlar için birleĢtirilmiĢ HPLC-CUPRAC

değerleri, deneysel CUPRAC değerlerine çok yakındır. Bu

bulgu, bir karıĢımdaki bileĢenlerin tanımlanabilmesi ve

miktarlandırılabilmesi durumunda, toplam kapasiteye

katkılarının doğru olarak hesaplanabileceğinin kanıtıdır.

Böylece sadece iyi bir kromatografik ayırımla bitkisel gıdaları

hem tek tek fenolik bileşikleri hem de toplam antioksidan

kapasiteleri açısından karşılaştırmak olası hale gelir.

İlginize

TEŞEKKÜRLER…

bİtkİsel gidalarin toplam antİoksİdan...

Documents