Biomarcadors d’infecció

Alicia LacomaServei de MicrobiologiaHospital Universitari Germans Trias i Pujol

Societat Catalana de Malalties Infecciosesi Microbiologia ClínicaAbril 2015alicia.lacoma@gmail.com

A characteristic that is objectively measured and evaluatedas an indicator of normal biological process, pathogenicprocess, or pharmacologic responses to a therapeuticintervention.

Biomarkers Definitions Working Group. Clin Pharmacol Ther 2001

Biomarker

1. Genòmica- Epigenòmica2. Transcriptòmica3. Proteòmica4. Metabolòmica

Crit Care 2013; 17:231

Resultat de la interacció hoste-patogen“terminal downstream end products”

A la recerca de nous biomarcadors amb tecnologies high-throughput

Identificació/Selecció de marcadors candidats

Models animalsTecnologies omics

Vía bioquímica/metabólica coneguda

Com identificar nous biomarcadors?

Desenvolupament inmunoassajos

Avaluació clinica

AJRCCM 2011; 184: 647-655

Early assessment of etiology and degree of inflammatory response Prognostic factor

Easy and quick to measureAdds timely information beyond that of readily available

Dynamic

EtiologyInfection vs inflammatory response of other origin (inflammatory chronic diseases, multiple

trauma, post-surgery…)Bacterial infection vs viral vs fungal

PrognosisCorrelation with severity and mortality risk scores

Response to antibiotic and immunomodulatory treatmentMonitoring clinical evolution

Identification of patients with higher risk of failure

Degree of inflammatory responseLack of inflammatory response, immunosuppression

Over/ Excess inflammatory response, immunopathogenicityIdentification of patients that would benefit from a certain intervention

Inflammatory mediators

Pro-inflammatory molecules Anti-inflammatory molecules

TNF-aIL-10IL-2IL-6IL-8IL-15Neutrophil elastaseIFN-7Protein kinaseMCP-1*MCP-2Leukemia inhibitory factor(D-factor)

ThromboxanePlatelet activating factorSoluble adhesion moleculesVasoactive neuropeptidesPhospholipase A2Tyrosine kinasePlasminogen activator inhibitor-1Free radical generationNeopterinCD14ProstacyclinProstaglandins

IL-1 raIL-4IL-10IL-13Type II IL-1 receptorTransforming growth factor-βEpinephrineSoluble TNF-a receptorsLeukotriene B4-receptor antagonismSoluble recombinant CD-14LPS binding protein*

Bone et al. Chest 1997

Proteins whose serum concentrations increaseProteins whose serumconcentrations decrease

Complement systemC3, C4, C9, Factor B, C1 inhibitor, C4b-binding protein, mannose-binding lectin

Coagulation and fibrinolyticsystemfibrinogen, plasminogen, tissue plasminogen activator, C protein, S protein, urokinase, vitronectin, plasminogen-activator inhibitor 1

Antiproteasesa1-protease inhibitor, a1-antichymotrypsin, pancreatic secretory trypsin inhibitor, inter-a-trypsin inhibitors

Transport proteinshaptoglobin, ceruloplasmin, hemopexin

Participants in inflammatory responsesSecreted phospholipase A2, LBP, IL-1 receptor antagonist, G-CSF

OthersC-reactive proteinSerum amyloid Aa1- acid glycoproteinFibronectinFerritinAngiotensinogen

AlbuminTransferrinTransthyretina2-HS- glycoproteina-fetoprotein Thyroxine-binding-globulin Insulin-like growth factor IFactor XII

Gabay et al. N Engl J Med 1999

Cardiovascular mediators

Beishuizen et al. Clin Chim Acta 2005

Crit Care 2010; 14: R15. Pierrakos C and Vincent JL. Review “Sepsis”, “biomarkers” 3370 referencies, 178 biomarkers

Cytokines

Turnover, short half-life

Binding proteins/ factors

Transient peaks

Compartmentalized production

Synthesis regulated by cytokines

Increase in response to infection and tissue damage

Longer half-life

Less variation in daily levels

Stable in vivo and ex vivo

Easy to measure

HormokinesAcute phase proteins

The inflammatory response

Reinhart K et al. Clin. Microbiol. Rev. 2012;25:609-634

TOXINAS

IL-1

TNF-a

NO

IL-6IL-2IFN-g

LEPTINAPCT

QUIMIOCINAS

IL-10IL-4

GM-CSF

Proteínas de fase agudaCRPHaptoglobina

ADM

FosfolipasaA2

Adapted from Bohuon CLancet, 341:515-518 (1993)

Adapted from Meisner M, J Lab Med 1999Dandona P, et al. J Clin Endocrinol Metab 1994

Harbarth S, AJRCCM 2001Becker KL, J Clin Endocrinol Metab 2004

0

1

2

3

4

5

12 24 36 48 60 72

TNF-a IL-6 PCT CRP

Endotoxina iv Temps (h)

Con

cent

raci

ó(µ

g/m

l)

C-reactive proteinSynthesis: Produced by hepatocytes in response to IL-1, IL-6 and TNF-a stimulation.Mechanism of action: Binds to bacterial membrane and to phosphorylcholine presentin damaged cells.Function: Opsonization and activation of complement.Indications: Systemic infection> localised. Bacterial>viral.Chronic inflammatory diseases monitoring (autoimmune diseases)

NeopterinStructure: 2-amino-4-OH pteridinSynthesis: Produced by monocytes and macrophages in response to IFN-g(secreted by lymphocytes T) and LPS.Function: Marker of cell mediated immunity.Indications: Infections caused by intracellular pathogens (virus, parasites).Bacterial systemic infections. Monitoring: autoimmune and inflammatorydiseases, neoplasia, post-transplantation, polytrauma.

Marcadors “clàssics”

Biomarcadors disponibles

Thyroidal C-Cells

CT

Thyroidal C-cell

CT-mRNA

Golgi apparatus

ProCT

endocrine

Adipose Tissue

Parenchymal Cells

Golgi apparatus

BacterialInfection(e.g.endotoxin)

IL-1bTNFa

Infl

amm

ator

y H

ost

Res

pons

e

CT

Regulated secretion(Ca2+, gastrin)

ProCT

CT-mRNAConstitutive secretion

ProCT

"hormokine"

ViralInfection

IFNg

Linscheid et al. Endocrinology 2003, Crit Care Med 2004

Procalcitonina

Function: Phosphate-calcium metabolism.Immunological: Regulates massive release of TNF-a during sepsis. Regulatesrelease NO. Regulates chemotaxis.

Acts at different levels of inflammatory response

Indicacions: Infecció bacteriana vs infecció viral. Infecció amb afectació sistèmica. Determinacions seriades à Valor pronòsticInici/ durada tractament antibiòtic àMolts estudis multicèntrics i RCT publicats * Systematic review of RCT and recommendations for clinical algorithmsArch Intern Med 2011; 171: 1322-1331* Meta-analisis en infeccions del tracte respiratori. AAC 2011; 55:5900-5906* Meta-analisis en pacients a UCI (PRORATA). Lancet 2010; 375: 1606-474Actualment (2012) hi ha 7 clinical trials a UCI valorant la determinació de PCT per guiar el tractament antibiòtic.

Homeostasis alterations

Atrial natriuretic peptide Hemodynamic(Dys)function

Endothelial(Dys)function

Vasopressin(Copeptin)

EndothelinAdrenomedullin

Natriuresis Water retention

VasoconstrictionVasodilation

Pro-atrial natriuretic peptideStructure: Member of natriuretic peptide family.Synthesis: Mainly at cardiomyoctes.Function: Marker of cardiac stress. Regulates renal and cardiovascular processes. Duringconditions that involve cardiac dysfunction, levels of ANP and its precursor (pro-ANP)increase acute heart failure during sepsis, comorbidities such as chronic heart failure,congestive heart failure and renal failure.Indications: Severity and prognostic marker.

Rubattu et al. J Hypertens 2001 FH.Martini. Fundamentals of anatomy and Physiology

Pro-adrenomedullinStructure: proADM (164 aa) → AM and proadrenomedullin N-terminal 20 peptide (PAMP). CALC gene family.Synthesis: Wide range of tissues and ubiquitous synthesis.Functions: Potent vasodilating and bronchodilating agent. It has also immune modulating, antibacterial and metabolic properties.Physiology: Pleiotropic effects; vascular actions, growth and development, endocrine, renal and innate immunity.Indications: Severity and prognostic marker. Bacterial infection.

Zudaire et al. J Leukoc Biol 2006

Samson et al. Annu Rev Physiol 1999

CopeptinaEstructura: Deriva del mateix precursor que la arginina vasopressina (AVP), però és mésestable i fàcil de detectar.Síntesi: Es produeix a l'hipotàlam.Funció: Regula principalment l’homeòstasi i el sistema cardiovascular, de manera que encondicions infeccioses, hipòxiques o d’hipotensió, la seva producció es veu incrementada.Indicacions: Marcador severitat/ pronostic

Christ-Crain M et al. ERJ 2007; 30:556-573

CD64Estructura: Receptor de membrana (tipus Fcγ -I) que reconeix anticossos tipus IgGSíntesi: S’expressa a monòcits (de forma constitutiva) i a neutròfils (quan han estat activatsper l’IFN-γ, i per G-CSF). Els nivells de CD64 s’incrementen fins a x10, en presencia decitocines pro-inflamatòries.Tècnica de detecció: Citometria de flux. Mostra de sang (50µl) (1h ½).Indicacions:Activació més elevada en infecció sistèmica vs infecció amb afectació local.No discrimina origen bacterià vs viral.Útil per diagnòstic infecció bacteriana. No obstant els estudis estan fets en diferentspoblacions (adults, pediatria, nounats) per tant els cut-off no estan ben definits. A més amés no hi ha estandardització metodològica.En pacients ingressats a UCI, correlaciona amb l’índex APACHE, i amb mortalitat als 28 dies→ pocs estudis sobre la seva utilitat com a biomarcador per valorar el pronòstic.

Altres biomarcadors…

Int J Infect Dis 2013; 17(1):e12-23

Presepsina (sCD14-ST)Estructura: CD14 és una glicoproteïna que s’expressa a monòcits i macròfags.Funció: És el receptor del complexe lipopolisacàrid- lipopolysaccharide binding protein (LPS-LBP). Durant el procés inflamatori,s’alliberen fragments solubles del CD14, i un d’ells s’haidentificat com a presepsina.

Tècnica de detecció: Immunoassaig quimioluminescent en mostra de sang total/ sèrum/ plasma (20 min).Indicacions:Nivells elevats en pacients amb sèpsia i shock sèptic, en comparació amb pacients noinfectats.Correlaciona amb la severitat i mortalitat.En mostres seriades, els nivells es mantenen elevats en pacients amb pitjor pronòstic.→ Calen estudis multicèntrics

Intensive Care Medicine 2015 ;41(1):12-20J Clin Microbiol 2015 ;53(4):1239-44

Soluble triggering receptor expressed on myeloid cells (sTREM-1)Estructura: Membre de la família de les immunoglobulinesSíntesi: S’expressa a neutròfils i macròfags.Funció: Indueix la producció de citocines i quimiocines, contribuint a la respostainflamatòria. També promou la degranulació dels neutròfils.Tècnica de detecció: Mitjançant ELISA. Es pot mesurar en mostra de sang, així com líquidcefaloraquidi, rentat broncoalveolar, i liquid pleural.Nivells més elevats en població pediàtrica/ població adulta.Indicacions:Poca sensibilitat en infecció del tracte urinari.Dades no consistents entre estudis quant a la seva utilitat com a biomarcador diagnòstic ipronòstic → Calen més estudis de validació.

Intensive Care Medicine 2009; 35(4):587-95.

Faix JD. Crit Rev Clin Lab Sci 2013

Soluble urokinase-type plasminogen activator receptor (suPAR)Síntesi: Es troba a la membrana cel·lular de monòcits i macròfags. Durant processosinflamatoris, s’allibera en forma soluble.Funció: Implicat en la migració de les cèl·lules inflamatòries del torrent sanguini cap alsteixitsTècnica de detecció: ELISA. Es pot detectar en sang, orina i líquid cefaloraquídiIndicacions:Correlaciona amb severitat i mortalitatà valor pronósticDeterminacions seriades per valorar resposta al tractament antibiòtic: resultats noconcloents.

Long pentraxin 3 (PTX3)Estructura: Reactiu de fase aguda (estructura similar a la PCR)→ actua com a PRR, unint-se a components específics de fongs, bacteris i virus.Funció: Indueix el procés de fagocitosi unint-se al component C1q del sistema delcomplement.Tècnica de detecció: ELISAIndicacions:En pacients amb CAP, nivells correlacionen amb indexs PSI i APACHE II à valor pronostic(Clin Chem Lab 2013; 51(4):907). En pacients amb confirmació de VAP, els nivells son méselevats. En pacients amb sèpsia severa i xoc sèptic, els nivells persistentment elevatscorrelacionen amb la severitat (Heart Lung 2013; 42(2):139). En pacients amb febre aUrgències, nivells elevats s’associen a ingrés a cures intermitjes i son predictors debacteremia (J Infection 2010; 60(2):122).

Calen més estudis

Endothelial cell specific molecule -1 (ESM-1)/ EndocanEstructura: Proteoglicà de 50KDa.Funció: S’expressa a cèl·lules epitelials, sobretot a pulmó en resposta a citocinesinflamatòries. Marcador de disfunció endotelial i inhibeix el reclutament dels leucòcits.Tècnica de detecció: ELISA sèrum/plasmaIndicacions: Correlaciona amb la severitat de la sèpsia. És marcador de acute respiratorydistress syndrome (ARDS) durant sepsis i nivells baixos a l’ingrés s’associen ambdesenvolupament de acute lung injury.

ETIOLOGY PROGNOSIS

Microbiological diagnosisMicroscopic examination

CultureAntigen detection

Nucleic acid detectionMR-proANP

Copeptin

Endotelin

Acute phasereactant

CRP, PXT3

sCD14-STNeopterin

Procalcitonin

Cytokines

MR-proADM

CD64

suPAREndocan

sTREM-1

Procalcitonin yes yes yesC reactive protein yes yes yesNeopterin yes yes noPro-Adrenomedulin yes yes yesMR-proANP no yes yes

“Tipus” de marcadorsValor diagnòstic: especificitatScreening: sensibilitatMonitorització-estratificació: tractament/pronòsticSurrogate: indicador indirecte d’una intervenció terapèutica

Infeccions fúngiquesInfeccions víriques severes

InmunodepressióInmunosenescència

Influència tractament antibiòtic previInfluència tractament antiinflamatoris

Cost- eficacia per limitar el sobre ús d’antibiòtics

Influència del microorganisme(grampositius i gramnegatius): proteïnes de superfície

i secreció de toxines

Alguns reptes pendents

Importància de l’assaig i del grup d’estudi a l’hora d’establir els cut-offs òptims

à Estudis de validació

Clin Chem 2005; 51: 1823-1829.Clin Chem 2006; 52: 112-119.Clin Chem 2004; 50: 234-236.Clin Chem 2006; 52: 1144-1151.

La determinació de pèptids amb activitat biològica és més dificil per la presènciade receptors, proteases o binding proteins

Mid regional proANP

Neurophysin-2-

CTCT--C-terminalproVasopressin

Vasopressin (AVP) - Copeptin

CT-proAVP

C-terminalPro-Vasopressin

MR-proANPANP

Mid

-1

CTCT--proETproET--11CT-proET -1

Endothelin-1

-1C-terminal pro-Endothelin 1

Mid-

proAdrenomedullin

MRMR--

Adrenomedullin

MR-proADM

Mid-

N- 20 terminal peptide (PAMP)

terminal

Molècules precursores de mediadors

Formes solubles de mediadorssuPARCD14 solublesTREM-1

Mètodes de detecció

Point of care tests

Analitzadors multitest

Control band

Test band

PCT-Q PCT direct

Plasma Yes Yes

Whole blood No Yes (<20µl)

Quantitative result No Yes

Concentration range <0.5 ng/ml0.5 - 2 ng/ml2 - 10 ng/ml

>10ng/ml

0.1 – 10 ng/ml

Quick Yes (30 min) Yes (25 min)

• Influence of temperature on analytical membrane and conjugate solution stability.• Interference of anticoagulants.• Sample aging.• Quality control

Sensibilitat, especificitat i valors de cut offs → assaig i població d’estudi

Modified from Christ-Crain et al. Swiss Med Wkly 2005

Avaluacions POCT

Scandinavian Journal of Clinical & Laboratory Investigation 2013; 73: 627–634

Comparativa entre diferents assajos à important tenir en compte lescaracterístiques dels assajos (límit de detecció, sensibilitat, especificitat,reproducibilitat, interferències)

Combinació de marcadors amb indicacions complementàries Combinació de marcadors i paràmetres clínics

Combinació de marcadors amb índexs ja establerts

Nostra experiència• Score meningitis (EJCMID 2004; 23(2):136)• PCT, CRP, neopterina i pro-ANP en pneumònies (PIDJ. 2003; 22(11):963, J Infect. 2006;

52(3):169, J Infect. 2007;55(5):400, EJCMID 2012; 31(5):825)• Correlació de MRproADM amb índexs de severitat (EIMC. 2014; 32(3):140).• Algoritme predicció bacteremia [Med Clin (Barc). 2010; 135(15):685].• Score complicació cirurgia colorectal

Combinacions en la literatura• CURB65 i adrenomedulina en pneumònies (BMC Infect Dis. 2011;11:112)• PCT y CPIS en pneumònia del ventilat (ICM 2008;34:1434, ERJ 2008;31:356)• SAPSII+proANP, SOFA+proANP (ERJ 2011;37:595)• PCT, sTREM-1, CD64 en pacients crítics (AJRCCM 2012;186:65)• Estudi PERSEVERE, 8 biomarcadors en sèrum (Luminex) i edat

(Crit Care. 2012 ;16(5):R174, PLoS One. 2014 ; 9(1):e86242).

Selecció de pacientsQuin és l’ objectiu de la determinació?Diagnòstic, pronòstic, monitorització?Limitacions de cada marcadorEs important considerar les possibles causes de falsos-positius i falsos-negatius, així com la vida mitja dels diversos marcadors ensèrum/plasma.Cut-offs òptimsVariaran en funció dels context clínic, l’edat, l’extensió de la infecció ila presencia de comorbilitats.

Determinacions seriadesCombinació de marcadors

Factors depenents del microorganisme

ResultatsConsideracions finals

Valor complementari als paràmetres clínics i microbiològics per a l’orientació diagnòstica i terapèutica.

Els biomarcadors son una eina complementaria als paràmetres clínics imicrobiològics en el maneig dels pacients amb infecció severa.

Per a un ús òptim dels biomarcadors, es important tenir en compte les principalsindicacions i limitacions, així com la influència de l’edat, les comorbilitats, aixícom els tractaments previs.

La combinació de paràmetres clínics i analítics en forma de score pot resultar demajor utilitat pràctica.

La combinació de biomarcadors que reflexen etiologia juntament amb els quereflexen severitat, així com la seva determinació seriada poden ser útils en elmaneig inicial, monitorització i seguiment de teràpies antibiòtiques iinmunomoduladores.

Els assajos automatitzats son sensibles, però tests ràpids per la valoració point ofcare poden ser una alternativa interessant per al maneig inicial.

Conclusions

Biomarcadors d’infecció

Alicia LacomaServei de MicrobiologiaHospital Universitari Germans Trias i Pujol

Societat Catalana de Malalties Infecciosesi Microbiologia ClínicaAbril 2015alicia.lacoma@gmail.com