biofisica con apllcacion cllnica de la …
TRANSCRIPT
REVISTA MEDICA DE COSTA RICA Y CENTROAMERICA LVI (546) 15 . 21; 1999
BIOFISICA CON APLlCACION CLlNICAAPLICACIONES CLlNICAS
DE LAQUIMIOLUMINISCENCIA (QL)
Juan L Padilla *Alexei V. Putvinski *
* Laboratorio de Biofísica, Universidad de Iberoomérica UNIBE
Chemiluminescense (QL) is a physic<lchemical phenomenom with a wide V3
riety <lf clinical applicati<lns. It hasbeeo "sed for studies in genetics, inmunology, end<lcrin<ll<lgy and even, infectious diseases. In this article, we expose the fundamentals <lf the meth<ld, therequired instrumentation and writtenevidence that supp<lrts its use in the clinical field. The meth<ld had dem<lstrated that it is as sensitive as irnmunoassay, cheaper and easier t<l apply. CLbased immunoassays as well as measuremente <lf phag<lcytic activity of polymophonuclear leucocytes, monocytesand macrophages are llOW included asparts of routine tests in the clinical laboratory. The rate of free radical oxidation and antioxidant activity ofblood plasma, urea and other biological fluids can he measured with modern chemiluminometers.
Durante muchos años, se han intentadodesarrollar técnicas de laboratorio para lamedición cuantitati va de moléculas en-
dógenas (como hormas y anticuerpos) ydetección de substancias tóxicas y contaminantes, que fueran cada vez más costoefectivas y fácilmente disponibles para eluso clínico. A pesar del importante desarrollo de todos estos métodos, la mayoríade ellos requieren de costosos reactivos ydispositivos de alta tecnología. Esto hatomado estas prácticas fuera del alcancede la mayoría de los hospitales. Sin embargo, una técnica descrita por primeravez hace unos 40 años ha tomado auge,sobre todo en países europeos. Esta técnica, basada en el fenómeno de quimioluminiscencia (QL), es frecuentemente uti~
lizada en el campo de la investigaciónbio-tecnológjca, control ambiental, aplicaciones industriales e investigación(principalmente ensayos genéticos, determinación de ATP y de radicales libres)y diagnóstico clínico. Este artículo expone los principios fisicoquímicos de la técnica basada en quimioluminiscencia, lasaplicaciones clínicas actualmente reconocidas y sus potenciales usos futuros
Tahla 1
Definiciones y principiosfisicoquímicos:
Se define quimioluminiscencia como lageneración de luz como productos de unareacción química. Este fenómeno físicose observa cuando los productos químicos de reacciones exergónicas acumulanenergía para la transición de un estadoelectrónicamente excitado. (Figura 1).
ESCANEAR FIGURAS
Figura 1. A. El electrón pasa aun orbital de mayor energía formando uncompuesto intennedio inestable. B. Elcompuesto adopta de nuevo su estabilidad al emitir un fotón. Para los sistemasbiológicos, tejidos y células vivas se aplica principalmente que las moléculas queproducen QL son el resultado de la recombinación de radicales libres en el curso de reacciones de oxidación de diferentes sustancias con la consecuente emisiónde especies activas del oxígeno. Aunque
"NSTRUMENTACION
Aplicaciones de la Quimioluminescencia
Tabla 1: Resumen de algunas aplicaciones de la quimioluminiscencia
cambio el fotomultiplicador mide la corriente generada al chocar los fotonescontra él. De la primera manera, la lectura dará una cuantificación de fotones porsegundo, mientras que la otra mide enforma de unidades arbirtrarias de luz, conocidas como unidades relativas de luz(en inglés RLU). La eficieucia de estosequipos depende de su consistencia (poca variación entre lecturas) y su sensibilidad, es decir, su límite inferior de detección de luz. Para poder mejorar la cantidad de luz emitida es frecuente utilizarreactivas luminiscentes que favorecen laemanación de fotones y por tanto mejora
PaIDI~iPa (mecanismos celulares y moleculares de procesos patológicos), ¡.< - Influenza '" ~ '" -;, • ~ y ¡¡¡: "
- Infecciones Bacterianas "., - Enfennedadesinflamatorias inespecíficas- HipercQlesterokimia-Tumores
El instrumento utilizado para esta medición se denomina luminómetro, el cualconsta de una cámara de muestra, el detector, una unidad de procesamiento yuna pantalla de despliegue de la señal.De estos componentes, probablemente elmás importante es el fotodetector. Generalmente, se utilizan para tal fin fotodiódos y tubos fotomultiplicadores. El principio básico de funcionamiento de los 1uminómetros es el conteo de fotones. En
5. Mediciua Ambiental y Salud Ocupacional- Calidad del agua- Detección de metales pesados- Detección de polvos industriales- Humo de tabaco- Radiaciones ultravioletas- Radiaciones ionizantes
4. Diaguóstico CHnico:e Grauu16matosis- Deficieucia de Mieloperoxidasa- Artritis reumatoide- Enfennedades de la piel- Sarcoidosis- Alergia- Cardiopatías- Diabetes- Nefropatías- Periodontitis
nos de fluorescencia y fosforescencia, seinvolucran estados atómicos inestables.Por su parte en la QL las fonnas inestables son moléculas completas.
"'1:;:Esílidios fmlüamentales dé Fisi"iOgíá-Cel'Ü;;reinnwnQIQgíav, '.'- ,." , .~, . .,'. ,'.' " ". .' ,
Se han descrito tres tipos de reaccionesde quimioluminiscencia. El primer tipocorresponde a aquellas reacciones queusan compuestos sintéticos y que involucran fonnas oxidantes. El segundo tipo,llamado bioluminiscencia, se refiere a lasreacciones emisoras de luz que ocurrenen organismos vi vos en la que existe catálisis enzimática, fenómeno observadoprincipalmente en organismos marinos.
Substrato + Enzima --------- Estado Intermedio inestableEstado Intermedio Inestable ------ Producto final estable + luz
en condiciones nonnales la intensidad dela emisión espontánea de fotones es extremadamente baja (menos de 100 fotones/cm2 sec) en estados de enfermedadesta puede aumentar considerablemente.No obstante, existen algunos fenómenosnaturales en los que mediante sistemasenzimáticos altamente específicos (comoluceferin-luciferasa, Ksantin-kasantioxidasa, etc) producen emisión de luz visible. Tal es el caso de insectos y algunospeces que emiten luz.
Por último, se encuentran aquellas reacciones que requieren de una corrienteeléctrica que desencadena el fenómeno.Este tercer grupo se conoce como elec·troquimioluminiscencia. Las reacciones de primer y segundo tipo generalmente implican la ruptura de un enlaceentre átomos de oxígeno. Este tipo de ligaduras, como ocurre en los peróxidos,resulta en fenómenos intramoleculares dereorganización y liberación de energía enforma de fotones (paquetes de luz). Lacantidad de fotones emitidos (medidospor conteno por segundo) debe ser la suficiente para poder medirse a través demétodos sensibles. Así, la emisión de luzse encuentra directamente relacionadacon la concentración de materialluminiscente presente. De lo anterior se desprende la posibilidad de inferir la concentración de alguna substancia a partirde la frecuencia a la que se emite la luz.En los fenómenos físico-químicos en losque se emite luz se producen estadosinestables transitorios que se toman enestable al emitir fotones. En los fenóme-
la sensibilidad del método. La emisiónde luz es directamente proporcional a laconcentración del reactivo respectivo.Otras medidas para mejorar la sensibilidad del método incluyen escoger una cubeta de muestra de un tamaño y materialapropiado (vidrio o polipropileno), controlar la temperatura y evitar contaminación lumínica externa. El análisis de laemisión de luz, luminometría, posee laventaja sobre otras técnicas es que esmuy sensible (mucho más que las técnicas de f1uorometría y espectroscopía. deuso universal y relativamente barata.Una ventaja adicional de la técnica es queel componente lumínico de fondo (contaminaci6n originada en fosforescencia deplásticos e impurezas de los reactivos) esmucho menor que lo que se observa enfluorometría y espectroscopía.
Aplicaciones clínicas:
Inmunología, La detección de anticuerpos circulares ha permitido grandesavances en el diagnóstico de enfermedades reumatológicas e inmunodeficiencias. Estas técnicas se basan principalmente en radioinmunoensayo. Esta metodología tiene su principio en la comparación de la inhibición de ligadura de antígeno marcado a un anticuerpo determinado producida por muestras no conocidas con la inhibición producida por soluciones estándar conocidas de antígeno nomarcado. La utilidad del método de radioinmunoensayo no se limita al sistemainmune y puede ser utilizado también paradetección de proteínas ligadoras y receptores de membrana. Sin embargo, estosprocedimientos involucran reactivos moleeulares de difícil obtención y preservación. Además de la complejidad de losreactivos, se tiene el inconveniente deque las reacciones sobre las cuales sebasa el método de medición O diagnósticoes que requieran muchas veces de untiempo prolongado para dar un resultado.Esto lleva a que se retrase la obtención delos datos necesarios para tomar importantes deeisiones terapeúticas. La técnica dequimioluminiscencia ha demostrado serútil la determinación cualitativa y cuantitativa de substancias para diagnóstico depadecimientos autoinmunes y de inmuno-
deficiencia. Moxness et al. describieronel uso de un ensayo de QL para la detección de anticuerpos contra peroxidasa tiroidea (TPO), los cuales son característicos de varias enfermedades autoinmunesde tiroides. El método demostró ser másrápido y específico que la técnica deaglutinación (32). La alUl sensibilidad dela QL en la determinación de anticuerposcontra TPO fue también corroborada porKaczur et al. (19). Por otra parte, se hautilizado el método de QL para detecciónde anticuerpos específicos como 19 G, talcomo demostraron Matsunaga et al. coningenioso método utilizando partículasbacterianas magnéticas (28). Además, seha utilizado como un método de cuantificar la capacidad de defensa de los neutrófilos. Esto se basa en el principio de queuna de las principales armas de destrucción bacteriana de los neutróf.l1os es lageneración de radicales libres de oxígeno. De tal manera, en la medida en queestas células sanguíneas generen estos radicales al ser estimuladas, principalmente por zymosan (21), serán más o menosinmunocompetentes. Además se ha demostrado que esta respuesta (44) podríavariar según el estímulo. Intentando evaluar este fenómeno. La medición de lacapacidad oxidativa de los neutrófilos hasido también cuantificada por QL en paciente sometidos a determinadas medidasterapeúticas o expuestos a alguna infección en particular. Parlesak et al., demostraron como concentraciones bajas deetanol reduce la capacidad oxidativa degranulocitos y monodtos humanos inducida por endotoxina lo cual podría explicar la susceptibilidad de los pacientes alcohólicos a infecciones (37). Traykov ycolaboradores demostraron el efecto adverso sobre la capacidad leucocítica deproducir superóxido inducido por el usode fenotiazinas ampliando el conocimiento sobre los probables efectos adversos de estas drogas (46). Weiss et al. usaron Ulmbién QL para investigar el efectosobre la función neutrofílica de elomidato y propofol (50). Como hallazgo importante se descubrió que el propofol,más no el etomidato, produce una disminución de la QL neutrofílica la cual sededujo es producto del efecto directo sobre esUls células y neutralización de los
radicales libres producidos. Kubo et al.utilizaron QL para valorar la función deJeucocitos en orina y demostraron comola variación de pH, concentración deurea, sodio, potasio y creatinina en lamisma sería útil para restaurar su funcióny favorecer el control de infecciones deltracto urinario (22). Por su parte, Haugen midió los efectos de los esteroides endosis hajas sobre la producción de especies reactivas de oxígeno por parte demacrófagos y monocitos y se demostróun efecto inhibitorio (16). Otro interesante hallazgo y de potencial utilidad clínica lo obtuvo Hoeben el al.. cuando evaluaron el efecto de diferentes antibióticossobre la capacidad oxidativa granulocítica medida por QL (18). Estos autores encontraron que muchos antibióticos (porejemplo, cloranfenicol y penicilina), inhiben la producción de radicales lihrespor parte del granulocítico. Hasta quePWlto estas drogas son O no inmunosupresoras por este medio no puede aún explorarse hasta aclarar si afectan o no lasensibilidad de la lurnininometría. Finalmente, aunque en algún momento se habló de la capacidad inmunopotenciadoradel gamma interferón contra infeccionesen el período neonatal, Wittler et al.. nolograron demostrar un aumento significativo de la quimioluminiscencia de leucocitos expuestos a este agente (52). Riberet al. evaJuaron la reacción fagocíticacontra cepas de Staphylococcus epidermis demostrando que al adherirse éste asuperficies de silicón (por ejemplo, uncatéter intravascular) la quirniolumenescencia era menor (41). Esto implicaría auna fagocitosis ineficaz como parte de laetiopatogenia de infección relacionada acuerpos extraños. También en el campode estudio de la fisiopatología de las enfermedades infecciosas, McCafferty etal. demostraron que la respuesta QL delos neutrófilos disminuye con la edad porlo que esto podría explicar la suceptibilidad a infecciones que sufren los pacientes ancianos (30). Investigando efectosnutricionales, Varnling et al. examinaronel efecto de la administración de ácidosgrasos omega-e en la QL de los neutrófilos de voluntarios sanos demostrandouna disminución, aunque no significativa(48). el estudio podría vislumbrar el po-
REVISTA MEDICA DE COSTA RICA Y CENTROAMERICA
tencial papel de este tipo de nutrientes enel manejo de enfennedades inflamatorias. Finalmente, earulli et al. estudiaronla modulación plaquetaria de respuestaneutrofílica mediante QL en situacionesde uremia demostrando una reducción dela misma (4). Esto sugiere que en pacientes urémicos existe la posibilidad deproducción desmedida de radicales tóxicos sin oposición del papel modulador delas plaquetas.
Genética y biología molecular. Se bautilizado la QL para estudiar los fenómenos de expresión y regulación genética.Por ejemplo, se ha introducido esta técnica para cuantificar propiedades asociadasa genes específicos. Existen actualmentesustancias para este tipo de estudios incluyendo luciferasa. B-galactosidada. Bglucuronidasa, fosfatasa alcalina y hormona de crecimiento. Entre otros usosen el campo de la genética, Musiani et al.lo utilizaron para la detección de hibridización in situ (33). Barret et al. usaronQL al evaluar el efecto de varios quimioterapeúticos sobre la reparación de DNAin vitre. El estudio demostró inhibiciónde dicha reparación por actinomicina D,doxorubicin y mitramicina A entre otros(1). Hodges utilizó QL para la detecciónde alteraciones genéticas en enfennedades hematológicas malignas demostrando que el método es más sensible que elcalorimétrico sin mencionar que evita eluso de isótopos radiactivos (17).
Endocrinología. La detección de niveles de diversas honnaDas es indispensable para el diagnóstico de trastornos endocrinos. La mayor parte de estos métodos se basa en inmunoquímica. Sin embargo, el uso de QL ba sido también aplicado en este campo. Rodríguez Espinosa el al. demostraron como la utilizaciónde la QL, es un método eficaz y sensiblepara la cuantificación de niveles de hormonas tiroideas y por ende, para el diagnóstico de disfunción tiroidea (42). Ensu estudio, compararon QL con el método convencional (basado en inmunofluorescencia) y demostraron que el primerofue igual de sensible, más barato y mucho más rápido. De igual manera, se hautilizado el método para la detección y
cuantificación de honnonas como la tirotropina, estrógenos (20) (26), honnonadel crecimiento (14), testoterona (27),gonadotrofina coriónica (47), además dela detección de algunos factores de crecimiento específicos el similar a insulina(insulin-like-growth hormone) (8) yotros.
Estrés oxidativo. Desde hace algunosaños se ha reconocido el papel de los radicales de oxígeno en la etiopatogenia dediversos padecim.ientos. Estas especiesderivadas del oxígeno (superóxido, rndróxilo, peróxido y el oxígeno singular)se caracterizan por ser extremadamentereactivos. Una vez generados reaccionancasi inmediatamente con moléculas circundantes produciendo alteraciones estructurales en las mismas. Estos procesos se conocen actualmente son responsables de disturbios tales como lesión porisquemia/reperfusión. sepsis/síndrome derespuesta inflamatoria sistémica, toxicidad por oxígeno/drogas/ radiación y hasta se han implicado en los fenómenos deenvejecimiento. De lo anterior, se deduce la importancia de poder detectar eidealmente cuantificar los efectos de estos oxidantes sobre los diversos tejidos ysistemas del organismo. Dichos efectosse conocen con el nombre de estrés oxidativo y la QL ha tomado recientementeun papel preponderante en su estudio. Enprincipio, las reacciones de oxidación generan energía. Con reactivos amplificadores apropiados (como la lucigenina)esta liberación energética se puede traducir en la producción de fotones los cualespueden cuantificarse. Dicha cuantificación es, a su vez una forma indirecta delestrés oxidativo. La técnica se ha utilizado de manera generalizada en laboratorios de investigación científica básica.Además este mismo enfoque está siendoutilizado como método de rutina paracuantificar el estrés oxidativo de pacientes que sufren graves enfermedades. Tsaiet al. estudiaron a pacientes con pancreatitis severa, el grado de stress oxidativo ysu con-elaci6n con la evolución y pronóstico de estos pacientes. Para ello realizaron mediciones e peroxidación de grasasy quimioluminiscencia. De manera interesante, se logró demostrar que aquellos
pacientes con mayor actividad de estrésoxidativo (medido por ambos métodos)sufrían de una evolución más tórpida yun peor pronóstico (45). Debido a que lapresencia de radicales libres o de los productos de su acción sobre diferentes moléculas es un índice reconocido de lesióncelular en diversas condiciones clinicas,se ha desarrollado de manera importantela QL para tal fin. Por tal razón, existenmúltiples estuelios que utilizan la medición del estrés oxidativo en condicionesde isquemia y reperfusión (por ejemplo, anivel de miocardio y de territorio esplác·nico) y trauma. Por otra parte, se ha usado la cuantificación de este estrés en tejidos específicos expuestos a algunosagentes que inducen citotoxicidad en losmismos. Tal es el caso de usar QL paradetectar el efecto de amino-ácidos excitatorios en muestras de tejido cerebral.Kucuk.kaya usó QL para estudiar el efecto protector de antagonista de aminoácidos excitatorios en los cambios oxidativos en un modelo de epilepsia focal enratas (23). Boveris et al. demostraron QLespontánea en el cerebro e hígado de ratas luego de ser expuestas a etanol, estosugiere la generación de radicales libresampliando el conocimiento sobre los mecanismos tóxicos de este alcohol (2). Porsu parte, Promislov et al. demostraroncorrelación entre el nivel de QL y la peroxidación lipídica en un modelo animalde trauma craneocerebral (39). Yoshidaet al. demostraron que las especies reactivas de oxígeno liberadas a nivel de lamucosa gástrica durante lesión térmicaprobablemente se relacionan con la generación de lesiones mucosas agudas (54).Werscher determinó la existencia de radicales libres por QL en tejido pancreáticode ratas expuesto a nicotina demostrandoel estrés oxidativo que esta sustancia induce sobre el páncreas (51). Hasta quepunto tiene esto relación con la reconocida susceptibilidad de fumadores a desarrollar cáncer de páncreas queda por demostrar. Estudiando el efecto de algunassubstancias sobre este estrés oxidativo,Weiss et ajo demostraron que las drogassimpaticomiméticas (epinefrina, norepinephrine, dopamina y dobutamina) y losinhibidores de fosfodiesterasa (amtinoney enoximone) inhiben la producción de
radicales libres inducida (50). Palacios etal. demostraron que la vitamina A inhibela QL y la peroxidación en tejido hepático de animales de experimentación (36).Evelson el al., evaluaron el estrés oxidativo de la piel de ratones expuesta a radiación UV, demostraron que la QL in vivo impresiona ser un método útil para vigilar la cinética del estrés oxidativo y para probar el efecto de substancias tópicasantioxidantes y fotoprotectoras (10).
Bacteriología. La gran mayoría de métodos utilizados en la detección de poblaciones bacterianas requiere de un tiempoprolongado. Esto es frecuentemente inapropiado debido a que del diagnóstico delaboratorio depende el inicio de antibi6ticoterapia. La QL se ha utilizado con éxito para la detección de bacterias en diferentes fluidos corporales. Por ejemplo,Ewald el al. utilizaron QL para el estudiode la fisiopatología de la infección porYersinia enterocolítica (11). Fortier aplicaron el uso de QL para el diagnósticoserológico de toxoplasmosis. Se demostró que el método cuantitativo para medirIgG y cualitativo para medir IgM era reproducible y sensible, confirmando laposible aplicación en el diagnóstico detoxoplasmosis congénita (13). De manera similar Pate et al., usaron QL paraidentificar anticuerpos contra antígenosderivados del Criptosporidium (38).Además, Musiani usó el método para ladeterminación de Papiloma virus (34).Mayo et al. usaron QL para demostrarcomo la producción de amonio por partedel Helicobacter pylori induce depresiónde la función leucocitos polimorfonucleares in vivo (29). Además se ha usadola QL para identificación de cepas bacterianas específicas con determinada susceptibilidad a antibióticos. Youmans usóQL para identificar rápidamente mediante sondas de DNA cepas de Staphylococcus aureaus resistentes a oxacilina (55).En el campo de la virología, Erhardt et al.demostraron como el método de QL fuecasi tan sensible como la reacción de cadena de polimerasa (PCR) y aproximadamente 5 veces más sensible que el método calorimétrico en el diagnóstico de virus de hepatitis B (9). Omopia et al. demostraron que la prueba con QL posee
una sensibilidad de 100% y una especificidad de 99.9% comparada con el inmunoensayo enzimático y puede ser una alternativa del mismo para la detección deanticuerpos contra virus de hepatitis e(25). La utilidad del método no se limitaal uso clínico, sino que se ha aplicado enotras áreas de importancia en salud pública y tecnología de alimentos. Por ejemplo, basándose en el hecho de que camefresca, leche o agua potable debe carecerde orgmüsmos vivos (por ejemplo debacterias que produzcan adenosintrifosfato (ATP), cualquier lectura de QL positiva por ATP es signo indirecto de contaminación bacteriana. De manera similarse ha aplicado la QL para la detección debacterias vivas (también fuente de ATP)en productos farmaceúticos, cosméticosy otros alimentos.
Detección de otras sustancias. Identificar algunas sustancias, ya sea a ni vel sérico, otros fluidos corporales o gases exhalados es importante para el diagnósticode enfermedades o incluso dosificaciónmedicamentosa. También en este campola QL ha sido utilizada. Lindberg et al.usaron el análisis por quimilominiscenciapara detección y cuantificación de óxidonítrico en el circuito de ventiladores mecánicos (25). Debe recordarse que laventilación con este gas ha sido utilizadocomo un adyuvante para disminuir la hipertensión vascular pulmonar en pacientes con síndrome de estrés respiratorio deneonato y del adulto O con cardipatíascongénitas. Se espera este método quimilumimétrico permita una mejor administración del gas, sin defectos de dosificación y sin riesgo de fugas peligrosaspara el personal clínico a cargo del paciente (5).
Otras aplicaciones clínicas: La QL posee la utilidad de demostrar como anticuerpos contra D pueden sensibilizar loseritrocitos para ser reconocidos por monocitos. Esto puede predecir con másprecisión el pronóstico clínico de la enfermedad específica del recién nacido(15). Burt demostró mediante QL comoformas de carbonato de calcio pueden serpotentes activadores de neutrófilos y portanto participantes en el desarrollo de co-
lecistitis asociada a litiasis biliar (3).Scbrod corroboró que la aplicación de altas dosis de factor surfactante a infantesprematuros puede afectar la función antibacteriana de los fagocitos pulmonares aldemostrarse la depresión en su quimilumenescencia (43). De Lamirande también evaluó el uso de QL para demostrarla producción de superóxido por parte deespermatozoides humanos como partedel proceso de capacitación de los mismos. (7). La potencial utilidad en valoración de esterilidad queda por investigarse. Merridew et al. comprobaron que laQL es un método preciso para confirmarel diagnóstico de enfermedad celiaca enpacientes con biopsia positiva y ademáses útil para monitorizar el proceso de laenfermedad (31). Rathkrishanan et al.observó un aumento de la producción deradicales libres, médico por QL, en condrocitos lo cual podría explicar parte delos procesos de degradación de la matrizdel cartílago (40). Lerisalo-Repo, demostró que pacientes con artritis reactivasevera poseen una mayor reacción en ellíquido sinovial (24). Wahi et al. determinaron que la generación de radicalesde oxígeno ocurre de manera tempranadurante la isquemia del miocardio, y decae en 72 horas convirtiendo a la QL como un método alternativo de detecciónisquemia miocárdica (49). Fisher demostró que un tipo de 21 -aminoesteroide inhibe la producción de peróxido dehidrógeno por parte de los monocitos enpacientes con Esclerosis múltiple lo cualpodna ser útil para el tratamiento de exacerbaciones de esta enfermedad (12).Davis investigó la hipótesis sobre el papel de los radicales libres de oxígeno enla fisiopatología de la úlcera duodenaldemostraron que la infección antral porHeliocbacter se asocia con una QL aumentada, no así fumado, alcohol y uso deantiinfiamatorios no esteroideos (AINES) (6).
Conclusiones y nuevas perspectivas:Se han expuesto estudios que muestranlos diferentes campos en los que se puede aplicar, en el contexto clínico, la técnica de QL. Se ha visto como el métodoes confiable, rápida y sobre todo máscosto-eficiente que otras técnicas fre-
cuentemente utilizadas en diagnósticoquímico-clínico. Es probable que en unfuturo la QL sustituya en muchos camposa las complejas técnicas de inmunoensayo. Además, es predecible que cada vezmás se incrementará su uso clínico, incluso aplicado al lado del paciente. Estoespecialmente en pacientes que sufren depadecimientos, principalmente agudos,en los que la medición del estrés oxidativa es indispensable para tomar decisiones terapéuticas apropiadas.
La quimioluminscencia (QL) es un fenómeno fisioquímico cuantificable y degran potencial en el campo clínico. Sehan demostrado aplicaciones en genérica, inmunología, endocrinología e incluso infectología. Se exponen en este artículo los principios de la técnica, la instrumentación necesaria y la evidencia queapoya su uso en las más diversas situaciones de carácter clínico y práctico. Elmétodo ha demostrado ser tan sensiblecomo otros disponibles y sobre todo másbarato y fácil de realizar. Inmunoensayosbasados en QL y la medición de la actividad fagocítica de los leucocitos se incluyen actualmente dentro de los exámenesclínicos de rutina. El índice de oxidaciónde radicales libres y actividad antioxidante del plasma sanguíneo, urea y otrosfluídos biológicos puede medirse con losquimiolurninómetros modernos.
~FIA
1. Barret JM; Salles B; Provot C; HilI BT Evaluatian ofDNA repaJr inhibition by antitumor or antibiotic drugs using a chemiluminescence microplateassay. Carcinogenesis 1997; 18: 2441-5
2, Boveris A; Llesuy S; Azzalis LA; Giavarotti L;Simon KA; Junqueira VB; Porta EA; Videla LA;Lissi EA In situ rat brain and liver spontaneous chemilummescense after acute ethanol intake. ToxicolLett 1997; 93;23-8.
3. Burt HM; Jackson JK; Tay10r DR; Crowther RS.Activation of human oetrophils by calcium carbonate polymorphs. Dig Dis Sci 1997; 42: 1283-9
4. Carulli G; Barsotti G; Cuspisti A; Minnucci S;Gianfaldoni ML; Agostini B; Ambrogi F. Plateletneutrophil interactions in uremic patieots: effects00 neutrophil superoxide anion productioo aod chemiluminescense. Nephron 1995; 69: 248-52.
5. Channick RN, Newhart JW; Hohnson FW; Moser KM. Inhaled nitric oxide reverscs hypoxic pulmonary vasoconstriction in dogs. A practicaJ nilricoxide delivery and monotoring system. Chest 1994;105; 1842-7.
6. Davies GR; Simmonds NJ; Stevens TR; Grandison A; Blake DR; Rampton OS Mucosal reactiveoxygen metabolite pI"oduction in duodenal uleer disease. Gut 1993; 33: 1467-72.
7. De Lamirandc E; Gagnon C. Capacitation-associated production of supcroxide anion by humanspennatozoa. Free Radie Biol Med 1995; 18:48795
8. De leon DD; Asmerom y Quantification of iosulin-like growth factor I (IGF-I) without interferenceby IGF binding proteins. Endocrinology 1997;138; 2199-202
9. Erhardt A; Schacfer S; Athanassiou N; Kann M;Gerlich WH. Quantitative assay of PCR-ampJifiedhepatitis B DNA usiog a peroxidase-1abelled DNAprobe and enhanced chemiluminescensc. J. ClinMicrobiol 1996; 34: 1985-91.
10. Evelson P; Ordonez CP; Llesuy S; Boveris A.Oxidative stress and in vivo hemiluminescence inmouse skin exposed to UVA radiation. J. Photoehem PhotobjoJ B 1997, 38: 215-9.
JI. Ewald J., Heesemann J., Rudiger H. Autenriethi. lnteraction of polymorphonuc1ear 1eokocyteswith Yersinia entorocolitica: Role of the YersiniaVirulence Plasmid and Moldulation by the lronChelator Desfenioxamine BJ. Iofeet Dis 1994,170: 140-150.
12. Fisher M; Levine PH; Doyle EM; Arpano MM;Bergeron DA; Cohen RA; Hoogasian JJ.A 21-anUnosteroid inhibits stimulated monocyte hydrogeoperoxide and chemiluminescence measurementsfrom MS patients and controls. Neurology 1991;4Lp297-9.
13. Fortier B; Dao A; Coignard-Chatain C; BiavaME Application from chemiluminescence to sefOlogical diagnosis of human toxoplasmosis. Pathol;20; 48-50.
14. Guidon PT Jr; Peter R; Kuma E. Measurementoí human growth hormone using a chemiluminescence assay and a "glow" luminometer. Biotechnigues 1996; 20: 48-50.
15. Hadley AG; Wilkes A; Goodrick J; Penman O;Soothill P.; Lucas G. The ability of (he chemilullünescence test to predict c1inical outeome and !he necessity or amniocenteses in pregnancies at risk ofhaemolytic disease of the newbom. Br J. ObstetGynaecol1998; 105:231-4
16. Haugen SE; Wiik P. Glucocorticoid and ACfHregulation of rat peritoneal phagocity chemiluminescence and nimc oxide production in culture.Acta Physiol Scand 1997; 161:93-101
17. Hodges KA; Kosciol CM; Rezuke WN; Abernathy EC; Pastuszak WT; Tsongalis GJ. Chemiluminescent detecúon of gene rearrangements in hem.atologic maJjgmmcy. Ann CJin Lab Scj 1996;26;114-8
18. Hoeben D; Dosogne H; Heyneman R; Burvenich C Effect of antibiotics on rhe phagocytotic andrespiratory burst activity of bovine granulocytes.EUT J. Pharmaco1 1996; 332:289-97
19. Kaczur V; Vereb G; Monar I; Krajczar G; KissE; Farid NR; Balazs C Effect of anti-thyroid peroxidase (TPO) antibodies on TIP activity measuredby chemiluminescence assay. Clin Chem 1997;43;1392-6
20. Kim JK; Adam A; Loo JC; Ong HA chemiluminescence enzyme immunoassay (CLEIA) for thedetennination of medroxyprogesterone acctate inhuman serum. J. Pharm Biomed Anal 1995;13;885-91
21. Kopprasch S; Graessler J; KohI M; BergmannS; $chroder HE Comparrison of circulatin phagocity oxidative activity measured by chemiluminescence in whole bood and isolated palymorphonuc1ear 1eukocytes Clin Chim Acta 1996;253: 145-57
22. Kubo S; Matsumoto T; Sakumoto M; MochidaO; Abe Y; Kumazawa J. Effect of urine componenton 1eukocyte chemiJumineseenee re.~ponsc. RenFail 1993; 20:75-84.
23. Kuccukkaya B; Aker R; Yuksel M; Onat F; Yalcin AS Low dose MK-801 protects Low dose MK801 protects against iron-induced oxidative changes in a rat model of focal epilepsy. Brain Res 1998Mar 30; 788 (1-2): 133-6
24. Leirislao -Repo M; Lauhio A; Repo H. Chemotaxis and chcmiluminescence responses of synovialfluid polymorphonuclear leucocytes during acutereactive arthritis. An Rheum Dis 1990; 49:615-9
25. Lindberg L, Rydgren G, Larsson A, 01sson S.Nordstrom L. A delivery for inhalation of nitricoxide evaluated woth chemilmninescence, electrochemical fuel ceIls, and capnography. Crít CareMed 1997; 25;190-196
26. Luppa P; Hauck S; Schwab 1; Birkmaycr C;Hauptmann 6 alpha-biotinylated estrone: novel tracer in competitive hemiluminescence inununoassayof estrone in serum. Clin Chem 1995; 41:564-70.
27. Luppa P; Bruckner C; Schwab 1; Hauck S; Schmidmayr S; Birkmaycr C; Paulus B; Hauptmann H7 alpha-Biotinylated testosterone derivative~ as tracers foc a eompetitive chemilumineseence immunoassay of testosterone in serum. Clin Chem 1997;43;2345-52
28. Matsunaga T; Kawasaki M; Yu X; TsujinlUra N;Nakamura N. Chemiluminescence cnzyme immunoassay using bacterial magnetic particles. AnalChem 1996 Oc!; 68; 3551-4
29. Mayo K; Held M; Wadstrom t; Megraud F. He-
PADIUA, PUTVlN51O: QUIMIOlUMNS
licobacter pyIori-human polymorphonuclear leucocyte interaction in the presence of anunonia, Eur1. Gastroenterol Hepatol 1997; 9:457-61
30. McCaffelty AC; Cree lA; McMurdo ME. Theinfluence of age and sex on phagocyte chemilumniscence. J Biolumin Chemilumin 1995; 10:41-8
31. Merridew SR; Wilson OV; Williams EJ. Antigliadin antibody measurement by chemiluminescence ELISA in the diagnosis of coaliac disease. J.CHn Palho11995, 48, 509-12
32. Moxness M. Klee G. An Automated Chemiluminescent Assay for Antibodics Against ThyroidPeroxidase (Abstrael). Am J. Clin Pathol 1996:106-139
33. Musiani M; Pasini P; Zerbini M; Roda A; GentHomi G; Gallinella G; Vcnturoli $; Manaresi E.Chemiluminescence: a sensitivc detection systemin in sity bybridization. Histol Histopathol. 1993;13,243-8
34. Musiani M; Zerbini M; Vcnturoli S; GentilomiG; GalHnella G; Manaresi E; La Placa M; D' Antuono A; Roda A; Pa..ini P. Sensitive chemiluminesceoce in SilO hybridization for the detection of human papillomavims genomes in biopsy specimens.J. Histochem Cytochem 1997: 45:729-35
35. Ornapía GL; Karamoto K. Detection of anti-hepatitis e virus using chemiluminescence. J. ViralHepat 1995; 2:215-9
36. Palacios A; Piergiacomi VA; Catala A. VitaminA supplementation inhibits chemiluminescenccand Iipid peroxidation in isoJate rat liver mícrosomes and mitochondria. Mol Cell Biochem 1996;154,77-82.
37. Parkesak A; Diedrich JP; Schafer C; Bode CAlow concemration fo ethanol reduces the chemiluminescenee of human granulocYles and moncytesbut nol the lumor necrosis factor alpha producllonby moncytes after endoloxin stimulation. 10fecl Immun. 1998; 66:2809-13
38. Patel S; McLauchlio 1; Casemore DP. A simpleSDS-PAGE immunoblotting technique using an eohanced chemiluminescence detection system toidentify polyclonal antibody respances lo complexcryptosporidial antigen preparatioos followin a monocional antibody retesl and ¡mage overlay technique 1. Immanol Methods 1997; 205:157-61
39. Promyslov MSh; Demchuk ML; Poriadina LV;Voronov VG Chemiluminescent study of free radicallipid peroxidation io the rabbít brain after emnio-cerebral trauma. Vopr Med Khim 1997; 43:20811
40. Rathakrishanan C; Tiku ML. Lucigenin-dependent chemiluminescence in anicular chondrocYles.Free Radic Biol Med 1993; 15:143-9
41. Riber U; Espersen F; Kharaz.mi A. Comparisonof adherent and non-adherent staphylococci in theinduction of polyrnorphonuclear leukocyte activation in vitro. APMIS 1995 Juo: 103(6): 439-46.
42. Rodríguez J. Montañes R. Ordoñez LL. CunésM. González F. Evaluacioón de una nueva estralegia pam la delección de disfunción tirodea. Med.Chn 1990; 94:406-413
43. Schrod L; Homemann f; von Stockhausen HB.Chemilumíniscence activity of phagocytes fromtracheal aspirates of premature infants after swfactant therapy. Acta Paediatr 1996; 85:719-23
44. Thkaha.<;h¡ R. Edashige K; S<lto EF; Inoue M;Matsuno T; Ulsumi K. Luminol chemiluminescence and activc oxygen generation by activated neutrophils. Arch Biochem Biophys 1991; 285:325-30
45. Tsai K. Wang S, Chen T. Kong C. Chang F. LeeS. Lu F. Oxidative stress: an important phenomenom with pathogenetie significance in the progression of acute pancreatitis. Gut 1998; 42:850-855
46. TraykovT. Hadjimitova V; Goliysky P; RivarovS. Effect of phenolhiazines on aClivated macrophage-indueed lumino-dependen! chemiluminescence.Gen Physiol Biophys 1997; 16:3-14
47. Van.krieken L; De Hertogh R. Radid, automatedquanification of total human chorionic gonadotropin in semm by a chemiluminescent enzyme irnmunometric assay. Clio Chen 1995; 41:36-40
48. Warming K; Schmidt EB; Svaneborg N; MollerJM; LelVang HH; Grunnel N; Jersild C; Dyerberg 1The effecl of n-3 fatty acids on neutrophil chemiluminescence. Scand J. Clin Lab lnvest 1995; 55:4752
49. Wahi S. Kau! N; Ganguly NK; Vanna S; Sharma BK; Wahi PL. Neutrophil oxygen free radicalproduction proportionates witb the degree of myocardia! ischemia. Can J. Cardiol 1991; 7:229-33
50. Weiss M; Birkhahn A; Krone M; Scbneider EMDo etomidale and propofol innucnce oxygen radical production of netrophils? lmmunopharmaco!lnununotoxicol 1996; 18: 291-307
51. Westcher G; Bragchi M; Bagchi O; Perdikis G;Hinder PR: Claser K; Hinder. Free radical produclÍon in nicotine trealed pancreatic tissue: Free RadicBiol Mcd 1995; 18:877-88
52. Wiuler RR; Lieberman MM; Puine DD; Muehlbauer SL; Lima JE; Sachanandani DM; Pinney CAChemiuminescent and flow cytometric analysis ofgamma interferon preincubation on neonatal andadult rat polymorphonuclear leukocytes. CIioDiagn Lab TmmunoI1996; 3:527-32
53. Yoshida M; Kitahora T; Wakabayashi G; Tashiro H; Ono H; Otani Y; Shimazu M, Kubota T;¿umai K; Kitajirna M. Active oxygen species inrormation of acUle gastrie mucosal lesions inducedby thennal injury in ralS.Dig Oís Sci 1995; 40:1306-10
54. Youmans GR; Oavis TE; FuUer DO. Use ofchemiluminescent ONA probes in the rapid detection of oxacillin resistance in cLinically insolaledSlrains of Slaphylococcus <lureus. Diagn MicrobilInfeet Dls 1993; 16:99-104