biodiversité moléculaire des écotypes de chèvres (capra hircus) du cameroun

Bienvenue à Soutenance publiquede thèse de Doctorat/PhD

Biotechnologies et Productions AnimalesOption: Amelioration Génétique et Systèmes de Production

Félix MeutchieyeIng. Agro., MSc

République du Cameroun

Republic of Cameroon

Peace – Work - Fatherland

Université de Dschang

University of DschangScholae Thesaurus Dschangensis Ibi Cordum

Faculté d’Agronomie et des Sciences

Agricoles

Faculty of Agronomy and Agricultural

Sciences

Département des Productions Animales

Department of Animal Production

2

Biodiversité moléculaire des écotypes de chèvres (Capra hircus)

du Cameroun

3

Titre:

Plan de l’exposé

• Introduction

• Matériels et Méthodes

• Résultats et discussions

• Conclusions et perspectives

4

5

Biodiversité = la variabilité des organismes vivants detoute origine (Nations Unies, 1992) => Capital vital global

Figure 2: Différentes échelles de la biodiversité

Introduction

Introduction

6

Enjeu mondial: effets néfastes des changements climatiques :la biodiversité la sécurité alimentaire (FAO, 2010).

Les animaux domestiques sont un maillon clé dans larecherche des réponses durables (FAO, 2008).

Figure 1: Illustration d’une scene de vie dans un environnement semi- aride

Declaration de Malabo% role élevage (AU,2014) :

- Resilience de + 70%des petits producteurs

-Accroissement de + 30% de l’investissement

7

Marqueurs génétiques:

Phénotypiques: couleur, resistance... hérédité simple

Biochimiques: isoenzymes/isozymes

Moléculaires (ADN): RFLP, RAPD, AFLP, SSR, ADNmt

Figure 3: Polymorphisme de l’ADN avec des marqueurs microsatellites

Introduction

Etude de diversitéMarqueurs

moléculairesneutres

Introduction

8

Problème global : Erosion des RGAn dans le mondeSolution globale: Déclaration d’Interlaken (FAO, 2007)Situation régionale : Variable et pauvre en Afrique

Figure 4: Statut des stratégies et plans d’action de gestion des ressourcesgénétiques animales par région (Source: FAO, 2015)

Figure 5 : Risques d’érosion génétique chez les animaux domestiques (FAO, 2015)9

Introduction

Croissancenumeriqueimportante

30% du cheptelmondial enAfrique

Interetspecifique enraison de sariche diversitebiologique

Introduction

10

Diver

sité

Histo

rique

Cultu

relle

Traits

speci

fiques

Speciali

sation

Potentiel

d'adaptation

Adapta

tion

Socio-

econo

mique

Recherche

Securité

alimentaire

Usages

uniques

Aperçu sur les Caprins au Cameroun

Figure 6: Usages des caprins

Diversité phénotypique riche Fonctions plurielles

Introduction

11

Descriptions majoritairement morpho-physiques(Doutresoulle, 1947; Epstein, 1951 et 1962 ; Devendra et Burns,1982 ; Lauvergne et al., 1993; Meutchieye, 2008).

Appellations => la variabilité (Epstein, 1962; Wangtchibing,1990; Le Gal et Planchenault, 1993 ; Devendra et Burns, 2001),

Aucune évaluation biomoléculaire (FAO et al., 2003 ; RC, 2012) .

Part de la variabilité moléculaire dans le polymorphismephénotypique des écotypes de chèvres du Cameroun?

Hypothèse de travail : La diversité caprine au Cameroun est lefait de la variabilité agro-écologique

Introduction

12

Objectif général: Contribuer à une meilleure connaissance de la chèvre locale du Cameroun

Objectifs spécifiques : déterminer les caractéristiquesmajeures du polymorphisme de

• 8 écotypes caprins du Cameroun à partir de 12 et 17marqueurs microsatellites hétérologues et homologues;

• l’ADN mitochondrial des 8 écotypes caprins;

Introduction

13

Objectifs spécifiques (suite):

• En déduire la structure et les relations phylogénétiquesdes 8 écotypes, et enfin,

• Evaluer l’efficacité relative des approches utilisées dans lacaractérisation de la diversité moléculaire.

En vue de leur amélioration génétique et de leurpréservation

14

Matériels & Méthodes

Figure 7 : Carte des zones agro-écologiques du Cameroun(Source : IRAD, 2008)

Zones d’étude

Cinq (05) zones agro-écologiques du Cameroun:Soudano-sahélienne Hautes savanes guinéennesHautes terres de l’OuestForestière humide à régime pluviométrique monomodal Forestière humide à régime pluviométrique bimodal

15


Ecotypes Types morphologiques Mensurations Robe Objectifs

Sahelienne (CHSHL) Longipes HG ≥65cm;PV =20-45kg Plus blanche Viande, peau, lait

Kirdi (CHKRD) Longipes-Mediopes HG≈ 60cm; PV=20-35kg Variable Viande, peau, lait

Djallonke SG (DJHSG) Longipes-Mediopes HG≤ 60cm; PV=15-40kg Variable Viande, peau (lait)

Djallonke OU (DJHTOU) Longipes-Brevipes HG≤ 60cm; PV=15-30kg Variable Viande et petits

Djallonke NW (DJHTNW) Longipes-Brevipes HG≤ 60cm; PV=15-30kg Variable Viande

Djallonke FC (DJFOC) Brevipes HG≤ 55cm; PV=15-25kg Variable Viande

Djallonke FE (DJFOE) Brevipes HG≤ 55cm; PV=15-25kg Variable Viande

Djallonke Cotes (DJCOT) Brevipes HG≤ 55cm; PV=15-25kg Variable Viande

Sources: Douffissa (1983 et 1986), Yaya (1988), Lauvergne et al. (1993), Ngo Tama et al.(1996), Planchenault et Boutonnet (1997) ; Meutchieye et al. (2008) et Choupamom(2009)

Tableau 1 : Principales caractéristiques des écotypes caprins du Cameroun

16


Figure 8 : Photos des écotypes de chèvres étudiées (Source : Meutchieye)

17


Echantillonnage et collecte des tissus

Des poils et sang des chèvres adultes (males et femelles), nonapparentées étaient choisis au hasard dans des exploitations

Tableau 2 : Répartition des échantillons par période et écotypes

De l’ADN obtenu du sang de 21 chèvres locales (petite chèvre orientaleafricaine = East African Small Goat)

18


Tache de sang sec

Figure 9 : Photo du sang sur une carte FTA (Source : Meutchieye)

19


Extraction de l’ADN génomique

Figure 10 : Schéma du protocole d’extraction de l’ADNg du sang séché de chèvre(Sambrook et al., 1989)

20


Vérification de la qualité et normalisation l’ADN génomique

Figure 11 : Profil de teneur d’ADNg d’un extrait de sang de chèvre

OD260/OD280

21


Tab. 7 : Caractéristiques des microsatellites hétérologues utilisés (FAO, 2004b)

Choix des microsatellites hétérologues et homologues

22


Tab. 8 : Caractéristiques des microsatellites homologues utilisés (FAO, 2011a)

23


Tableau 9 : Composition du ready mix pour amplification des microsatellites hétérologues

24


Tableau 10 : Composition du ready mix pour amplification des microsatellites homologues

25


Tableau 11 : Profil thermique d’amplification par PCR des échantillons

Figure 12 : Fragments amplifiés sur gel d’agarose 2%

26


Génotypage et analyses des fragments

Figure 13 : Electrophérogrammes mono et polymorphe du microsatellite INRA063

27


Choix de la séquence de la boucle D de l’ADNmt

Tableau 12: Caractéristiques des amorces de l’ADNmt (position 15711 à 16489)

Source: Sardina et al., (2006).

28


Tableau 13 : Composition du ready mix pour amplification de la séquence de boucle D de l’ADNmt

Tableau 14 : Profil thermique de la PCR pour la boucle D de l’ADNmt

29


Figure 14 : Schéma du protocole de purification de l’ADNmt de chèvre

Purification de l’ADNmt

30


Figure 15 : Profil des fragments amplifiés sur gel d’agarose 1%

Génotypage et analyses des fragments

Et 83 accessions pour l’identification de la sequence consensus

Un total de 28 séquences caprines d’alignement disponibles de GenBank a étéconsidéré: 06 d’Afrique de l’est (Tanzanie) ; 06 d’Europe occidentale (Espagne, France,Suisse et Italie) ;06 du Moyen Orient (Egypte, Iran et Turquie) ; 06 du sud-est asiatique(Chine et Inde) ; 03 d’Asie centrale (Azerbaïdjan, Laos et Mongolie) ; 01 du Pacifique(Australie).

31


Evaluation des indicateurs de diversité génétique

Diversité génétique intra population

Protocole de Peakall et Smouse (2009) sous GenAlex 6.0. Les paramètresconsidérés ont été les suivants :- Nombre moyen d’allèles par locus-Fréquence allélique: estimée selon (Nei, 1968).- Déviation à l’Equilibre de Hardy Weinberg : estimée au seuil de 5%.-Hétérozygotie et diversité de gène : estimations de Ho et de Hecalculées selon Nei (1978).

-Taux de polymorphisme : directement estimé dans l’échantillon étudié.- Coefficient de consanguinité FIS: mesure de l’écart des individus à l’étathétérozygote dans la population.

32


Diversité génétique interpopulation

Protocole de Peakall et Smouse (2012) sous GenAlex 6.5.- Nombre d’allèles privés : mesure de la richesse allélique spécifique ;- F statistiques de Wright : indices de fixation (FIS), de différenciation (FST)et de consanguinité globale (FIT).- Corrélations croisées des FST : estiment l’identité et la divergence desécotypes ont été calculées sous Arlequin et sous GenAlex 6.5- Flux de genes (Nm) : mesure la différenciation génétique au sein de lapopulation globale sous l’effet des migrants effectifs par génération.- Index de Shannon (sHa): mesure de la richesse globale de la population.- Contenu de l’Information Polymorphique (PIC): estimé des fréquencesalléliques des sujets distants de chaque écotype.- Distances génétiques et relations: construction du dendrogrammeNeighbour Joining (NJ) a été faite sous PowerMarker V.3.25 selon Liu etMouse (2005) pour estimer les distances génétiques Ds de Nei entre despaires d’écotypes de chèvres sur la base des marqueurs microsatellites.

33

Diversité génétique interpopulation (suite)

- Analyse par Composantes Principales (ACP): Composantes Principalesestimées obtenues avec les programmes PowerMarker V.3.25 et Darwin3.0.- Edition et la correction du brin inverse des fragments amplifiés del’ADNmt : faites sous Chromas Lite. Alignement et estimation desMutations effectués sous Clustal X.2 et ATGC PhySic Online.- Séquence consensus : mise en évidence sous DNAsp et MEGA5 sur labase des séquences tirées du GenBank.- Haplogroupes et Haplotypes : déterminés ainsi que leur paramètresassociés (nombre, diversité et clades) sous les programmes MEGA5,DNAsp, NetWork 4.6.0.0 sur la base des séquences de référence boucle Dde l’ADNmt de chèvres dans la base GenBank selon la procédure de Naderiet al. (2007) et Vacca et al. (2010).- Arborescence phylogénétique (variabilité des clades) : construite sous lesprogrammes MEGA5, FigTree et SplisTree).

34

Analyses statistiques

Les différents indices ont été calculés sous le logiciel Arlequin 3.5.1.3 pourdes niveaux de signification obtenus à 10.000 permutations (Schneider etal., 1997).

Le test de sphéricité de Barlett a été utilisé pour évaluer la nullité del’hypothèse des corrélations croisées entre indices (Tanagra, 2012).

Le modèle statistique du PIC est le suivant:

L’Analyse de la Variance Moléculaire (AMOVA) estimée en utilisant lesprocédures décrites par Weir et Cockerham (1984), Excoffier et al. (1992)et Weir (1996) sous GenAlex 6.0 et Arlequin 3.5.1.3.

L’estimation du niveau dilution (admixture) de la population caprine a étéfaite selon l’approche Pritchard et al. (2000), et Falush et al. (2003 et2007). L’algorithme utilisé était Bayesien.


35

Analyses statistiques

Les différents indices ont été calculés sous le logiciel Arlequin 3.5.1.3 pourdes niveaux de signification obtenus à 10.000 permutations (Schneider etal., 1997).

Le test de sphéricité de Barlett a été utilisé pour évaluer la nullité del’hypothèse des corrélations croisées entre indices (Tanagra, 2012).

Le modèle statistique du PIC est le suivant:

L’Analyse de la Variance Moléculaire (AMOVA) estimée en utilisant lesprocédures décrites par Weir et Cockerham (1984), Excoffier et al. (1992)et Weir (1996) sous GenAlex 6.0 et Arlequin 3.5.1.3.

L’estimation du niveau dilution (admixture) de la population caprine a étéfaite selon l’approche Pritchard et al. (2000), et Falush et al. (2003 et2007). L’algorithme utilisé était Bayesien.


36

Résultats & Discussions

R1: Biodiversité génétique des écotypes caprins à partir desmicrosatellites hétérologues

• Nombre d’allèles: 0 à 6 pour l’ensemble des écotypes avec une de 2 (1,833pour l’écotype DJCOT à 2,833 pour l’écotype CHKRD). L’écotype DJFOE est le plusmonomorphique.

• Taux d’hétérozygoties : Ho et He plus élevés pour l’écotype DJHSG (0,825) =>taux de consanguinité plus faible, donc un système de reproduction plus contrôlé.

• Index de fixation (F) : DJFOE présente un excès d’homozygotie = fortesituation de consanguinité par rapport à une population panmictique alors que lesautres écotypes présentent plutôt un excès d’heterozygotie

De manière générale, une riche biodiversité génétique caractérise la trèsgrande majorité des écotypes considérés (82,5%).

37


Table 15 : PIC, diversité de gène et estimés de Fst en fonction desmicrosatellites

38


Tableau 16: Pourcentage des locus polymorphiques par écotype

39


Tableau 17 : Tests de probabilités de l’équilibre de Hardy Weinberg parmarqueur et en fonction de l’écotype

40


Tableau 18 : Fréquence des allèles privés en fonction des écotypes

7 marqueurs pour 10 alleles privés dont 3 pour DJHTNW

41


DJHSG

DJFOE

DJHTO

CHSHL

DJHTNW

CHKRD

DJCOT

DJFOC

Co

ord

. 2

Coord. 1

CHSHL = Chèvre Sahélienne ; CHKRD= Chèvre Kirdi ; DJHSG= Chèvre Djallonké des Hautes savanes guinéennes;

DJHTOU= Chèvre Djallonké des Hautes terres de l’Ouest ; DJHTNW= Chèvre Djallonké des Hautes terres du Nord-

Ouest; DJFOC= Chèvre Djallonké de la Forêt-Centre ; DJFOE= Chèvre Djallonké Forêt-Est ; DJCOT = Chèvre

Djallonké de la région côtière

Figure 16 : Analyse par Coordonnées Principales des écotypes caprins du Cameroun

42


CHSHL = Chèvre Sahélienne ; CHKRD= Chèvre Kirdi ; DJHSG= Chèvre Djallonké des Hautes savanes guinéennes;

DJHTOU= Chèvre Djallonké des Hautes terres de l’Ouest ; DJHTNW= Chèvre Djallonké des Hautes terres du Nord-

Ouest; DJFOC= Chèvre Djallonké de la Forêt-Centre ; DJFOE= Chèvre Djallonké Forêt-Est ; DJCOT = Chèvre

Djallonké de la région côtière

Figure 17 :Structure des populations caprines du Cameroun

43


CHSHL = Chèvre Sahélienne ; CHKRD= Chèvre Kirdi ; DJHSG= Chèvre Djallonké des Hautes savanes guinéennes; DJHTOU=Chèvre Djallonké des Hautes terres de l’Ouest ; DJHTNW= Chèvre Djallonké des Hautes terres du Nord-Ouest; DJFOC= ChèvreDjallonké de la Forêt-Centre ; DJFOE= Chèvre Djallonké Forêt-Est ; DJCOT = Chèvre Djallonké de la région côtière

Figure 18: Relations phylogénétiques entre les écotypes caprins du Cameroun

44


R2: Biodiversité génétique des écotypes caprins à partir des microsatelliteshomologues

- Nombre d’allèles : 1 à 10 pour l’ensemble des écotypes. Jusqu'à 11pour les types génétiques CHKRD et EASG. C’est l’écotype DJFOE qui aété le plus monomorphique

- Taux d’hétérozygoties : Ho et He varient de 0,052 (écotype DJFOE)à 0,550 (écotype CHSHL), et 0,232 (écotype DJFOE) à 0,644 (écotypeCHSHL). EASG a la variabilité génétique la plus importante avec Ho =0,665 et He = 0,706.

- Index de fixation (F): variable. L’écotype DJFOE présente une trèsforte situation de consanguinité (F = -0,48).

La très grande majorité des écotypes considérés (83%) résententune riche très biodiversité génétique.

45


Table 19 : PIC, diversité de gène et estimés de FST en fonction desmicrosatellites

46


Tableau 20: Pourcentage des locus polymorphiques en fonction del’écotype

47


•EASG = East African Small Goat ; CHSHL = Chèvre Sahélienne ; CHKRD= Chèvre Kirdi ; DJHSG= Chèvre Djallonké des Hautes savanes guinéennes;

DJHTOU= Chèvre Djallonké des Hautes terres de l’Ouest ; DJHTNW= Chèvre Djallonké des Hautes terres du Nord-Ouest; DJFOC= Chèvre Djallonké de

la Forêt-Centre ; DJFOE= Chèvre Djallonké Forêt-Est ; DJCOT = Chèvre Djallonké de la région côtière * P<0,05 ; ** P<0,01 ; *** P<0,001

Tableau 21 : Tests de probabilités de l’équilibre de Hardy Weinberg par marqueuret en fonction de l’écotype

48

Résultats & Discussions Tableau 22: Fréquence des allèles privés en fonction de l’écotype

11 marqueurs pour 23 alleles privés dont 9 pour EASG

49


Entre Ecotypes6%

Entre Indiv45%

Intra Indiv49%

Pourcentages de la Variance Moleculaire

Figure 19 : Représentation graphique de l’AMOVA des caprins du Cameroun

50


EASG

DJFOC DJFOE

CHKRD

DJCOT

DJHSGDJHTNW

DJHTOCHSHL

Co

ord

. 2

Coord. 1

EASG = East African Small Goat ; CHSHL = Chèvre Sahélienne ; CHKRD= Chèvre Kirdi ; DJHSG= ChèvreDjallonké des Hautes savanes guinéennes; DJHTOU= Chèvre Djallonké des Hautes terres de l’Ouest ;DJHTNW= Chèvre Djallonké des Hautes terres du Nord-Ouest; DJFOC= Chèvre Djallonké de la Forêt-Centre ;DJFOE= Chèvre Djallonké Forêt-Est ; DJCOT = Chèvre Djallonké de la région côtière

Figure 20: Analyses par Coordonnées Principales des écotypes caprins

51


EASG = East African Small Goat ; CHSHL = Chèvre Sahélienne ; CHKRD= Chèvre Kirdi ; DJHSG= Chèvre Djallonké des Hautes savanes guinéennes;DJHTOU= Chèvre Djallonké des Hautes terres de l’Ouest ; DJHTNW= Chèvre Djallonké des Hautes terres du Nord-Ouest; DJFOC= ChèvreDjallonké de la Forêt-Centre ; DJFOE= Chèvre Djallonké Forêt-Est ; DJCOT = Chèvre Djallonké de la région côtière

Figure 21 : Structure des populations caprines du Cameroun par des microsatelliteshomologues

52


EASG = East African Small Goat ; CHSHL = Chèvre Sahélienne ; CHKRD= Chèvre Kirdi ; DJHSG= Chèvre Djallonkédes Hautes savanes guinéennes; DJHTOU= Chèvre Djallonké des Hautes terres de l’Ouest ; DJHTNW= ChèvreDjallonké des Hautes terres du Nord-Ouest; DJFOC= Chèvre Djallonké de la Forêt-Centre ; DJFOE= ChèvreDjallonké Forêt-Est ; DJCOT = Chèvre Djallonké de la région côtière

Figure 22: Interrelations estimées entre les écotypes de chèvres du Cameroun

53


R3 : Biodiversité génétique des écotypes caprins à partir de l’ADNmt

Figure 23 : Vue partielle de l’alignement des séquences de la position 309 à 659

54


Tableau 23 : Taux moyen de substitution des nucléotides de l’ADNmt des caprinsen fonction de différents modèles

55


Figure 24: Principaux clades à partir des mutations de l’ADNmt chez les chèvresdu Cameroun

56


Figure 25 : Origines phylogéniques des chèvres du Cameroun à partir de l’ADNmt

57


Figure 26: Diversité des haplogroupes des chèvres du Cameroun à partir de l’ADNmt

58


R4 : Efficacité comparée des méthodes d’évaluation de diversité moléculairecaprine

Les microsatellites homologues plus polymorphes que lesmicrosatellites hétérologues (4 regroupements possibles).

L’analyse de l’ADNmt a fait ressortir 5 clades, et uniquement enrapport avec la diversité des origines maternelles.

En considérant les relations phylogénétiques, il apparaît que cesont les microsatellites homologues qui donnent des résultatsles plus vraisemblables au regard de la répartitiongéographique des écotypes.

59


Les microsatellites ont permis l’identification des allèles privés(plus important pour le jeu de microsatellites homologues)

L’analyse de l’ADNmt a été un outil complémentaire, notammentla formation des clades sur la base des fréquences de mutationset d’évolution minimum enregistrés.

Le matériel génétique de base dans cette étude a étéchromosomique (microsatellites) et mitochondrial (ADNmt).

Pris individuellement, l’effectivité de l’évaluation de la diversitén’a pas été uniforme comme il apparaît selon les méthodes, aussibien, sur le plan intra qu’inter-population.

60

Conclusion

Les écotypes de chèvres du Cameroun ont une importantediversité génétique, intra et inter écotypes.

Elles constituent une part spéciale dans la biodiversitéanimale mondiale. Cette richesse génétique est le pilier de lacréation des races, de leur amélioration en vue d’une bonneexploitation et encore mieux de leur préservation.

Le polymorphisme relatif des microsatellites homologuesindiquent une meilleure aptitude de ce dernier groupe pourdes analyses de diversité plus élargies.

61

Conclusion

L’existence des allèles privés au sein des écotypes constitue unatout majeur dans l’évaluation de l’adaptation des chèvres.

Les perturbations de l’Equilibre de Hardy Weinberg ont eupour facteurs le flux de gènes et la dilution par croisementshasardeux entre écotypes.

Le flux de gènes bien que source de variation génétique, ilaboutira à l’uniformisation génotypique et donc à unesérieuse perte de biodiversité s’il est constant.

62

Conclusion

Les 8 écotypes caprins considérés sont distinctsgénétiquement, formant 4 groupes (certains se comportantcomme des hybrides entre types extrêmes).

Le peuplement caprin du Cameroun des origines maternellesmultiples et est du plus grand Haplogroupe A.

Le niveau de diversité des haplotypes des écotypes est élevé.

L’étude met en évidence la richesse génétique des écotypescaprins du Cameroun et leurs interrelations.

63

Recommandations et perspectives

Recommandations :

Utilisation des poils et adaptations des méthodes pour desanalyses moléculaires du bétail pour des raisons économiques;

L’application préférentielle du panel microsatelliteshomologues;

Documentation/information publique sur les typesgénétiques caprins du Cameroun;

Développement d’un plan d’amélioration des caprins duCameroun et appui aux initiatives actuelles (Stationsspécialisées et groupements)

64

Recommandations et perspectives

Perspectives :

L’étude du polymorphisme de l’ADNmt pourrait être complétéepar l’analyse de la séquence SRYM18 transmise uniquement parles mâles à la descendance chez les caprins du Cameroun.

L’analyse métagénomique permettrait d’associer les mutationset délétions identifiées aux phénotypes spécifiques desécotypes caprins du Cameroun.

Le polymorphisme du nucléotide monocaténaire (Singlenucleotide polymorphisms -SNPs) pourrait être appliqué dansdes investigations futures.

Enfin, cette investigation pourrait être étendue aux payslimitrophes avec qui il y a échanges du matériel génétique

Remerciements

Africa Biosciences Challenge Funds

65

ContributeursAcadémiques Financiers

Scientifiques

Techniques

biodiversité moléculaire des écotypes de chèvres (capra hircus) du cameroun

Education