biochemj00616-0162 a pinene synthesis

8/6/2019 Biochemj00616-0162 a Pinene Synthesis

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B i o c h e m . J . ( 1 9 7 2 ) 1 3 0 , 1 0 5 5 - 1 0 6 1P r i n t e d i n G r e a t B r i t a i n

T h e B i o s y n t h e s i s o f ( + ) a - P i n e n e i n P i n u s S p e c i e s

B y DEREK V . BANTHORPE a n d GEOFFREY N . J . LE PATOURELC h r i s t o p h e r I n g o l d L a b o r a t o r i e s , U n i v e r s i t y C o l l e g e L o n d o n ,

2 0 G o r d o n S t r e e t , L o n d o n WCIH O A J , U . K .

( R e c e i v e d 2 5 J u l y 1 9 7 2 )

1 . T h e d e g r a d a t i o n o f ( + ) - a - p i n e n e b i o s y n t h e s i z e d f r o m 3 R S - [ 2 - 1 4 C ] m e v a l o n a t e b yP i n u s r a d i a t a o r P i n u s n i g r a r e v e a l e d a n a s y m m e t r i c a l l a b e l l i n g p a t t e r n w h e r e b y t h em o i e t y d e r i v e d f r o m i s o p e n t e n y l p y r o p h o s p h a t e c o n t a i n e d a t l e a s t 90% o f t h e i n c o r p o r -a t e d t r a c e r . T h i s p a t t e r n d i f f e r e d b o t h i n a s y m m e t r y a n d p o s i t i o n o f l a b e l l i n g f r o mp r e v i o u s r e s u l t s o b t a i n e d w i t h P . n i g r a , b u t i s c o n s i s t e n t w i t h t h e g e n e r a l l y a c c e p t e dh y p o t h e t i c a l m e c h a n i s m f o r t h e b i o s y n t h e s i s o f t h e p i n a n e s k e l e t o n . 2 . ( + ) - a - P i n e n eb i o s y n t h e s i z e d i n P i n u s a t t e n u a t a a n d i n t h e p r e v i o u s l y n a m e d t w o s p e c i e s f r o m

3 R S - [ 2 - _ 4 C , ( 4 R ) - _ 4 3 H j ] m e v a l o n a t e a n d i t s ( 4 S ) - i s o m e r r e t a i n e d a l l t h e 4R h y d r o g e na t o m s ( w i t h i n t h e e x p e r i m e n t a l e r r o r ) b u t l o s t a l l t h e 4 S h y d r o g e n a t o m s o f t h e

p r e c u r s o r . T h i s s t e r e o s p e c i f i c i t y o f h y d r o g e n l o s s i s t h e s a m e a s t h a t p r e v i o u s l y f o u n df o r t h e f o r m at i o n o f g e r a n i o l a n d n e r o l i n o t h e r p l a n t s p e c i e s , a n d t h e r e s u l t may b er e a s o n a b l y i n f e r r e d t o b e g e n e r a l f o r m o n o t e r p e n e s .

I n c o r p o r a t i o n e x p e r i m e n t s u s i n g 3 R S - [ 2 - ' 4 C , ( 4 R ) -4 - 3 H l ] m e v a l o n a t e a n d i t s ( 4 S ) - i s o m e r h a v e s h o w nt h a t b o t h g e r a n i o l a n d n e r o l w e r e f o r m e d i n c e r t a i nR o s a a n d P e l a r g o n i u m s p e c i e s w i t h a l m o s t c o m p l e t el o s s o f t h e p r o - 4 S h y d r o g e n a t o m o f t h e p r e c u r s o r a n dw i t h a l m o s t c o m p l e t e r e t e n t i o n o f t h e e p i m e r i c p r o - 4 Rh y d r o g e n a t o m ( B a n t h o r p e e t a l . , 1 9 7 2 b ) . T h e s er a t h e r u n e x p e c t e d r e s u l t s w e r e e x p l a i n e d o n t h e b a s i se i t h e r o f n e r o l b e i n g f o r m e d f r o m g e r a n i o l ( f r e ea l c o h o l s o r t h e p y r o p h o s p h a t e e s t e r s b e i n g i n v o l v e d )o r o f d i f f e r e n t p r e n y l t r a n s f e r a s e s d i r e c t l y p r o d u c i n gt h e t w o i s o m e r i c p yr o p h o s p h a t e s o f t h e a l c o h o l s .C y c l i c m o n o t e r p e n e s w o u l d b e e x p e c t e d t o s h o w a

s t e r e o s p e c i f i c i t y o f h y d r o g e n l o s s t h a t w a s s i m i l a r t on e r o l , f o r t h e l a t t e r i s g e n e r a l l y c o n s i d e r e d t o b et h e i r p a r e n t .

We h e r e r e p o r t t h e s t e r e o c h e m i s t r y o f h y d r o g e nl o s s i n t h e f o r m a t i o n o f ( + ) - a - p i n e n e ( I ) i n t h r e eP i n u s s p e c i e s a s w e l l a s t h e e l u c i d a t i o n o f t h e l a b e l l i n gp a t t e r n r e s u l t i n g f r o m i n c o r p o r a t i o n o f [ 2 - 1 4 C ] -m e v a l o n a t e .

R e s u l t s

D o u b l e - l a b e l l i n g e x p e r i m e n t s

P r e l i m i n a r y s c r e e n i n g o f t h e u p t a k e o f t r a c e r f r o m[ 2 - 1 4 C ] m e v a l o n a t e i n t o o c - p i n e n e s h o w e d t h a t i n -c o r p o r a t i o n s w e r e l o w a n d r a t h e r v a r i a b l e i n f o l i a g ef r o m a l l t h r e e P i n u s s p e c i e s . H o w e v e r , i n a l l c a s e si n c o r p o r a t i o n s i n c r e a s e d t o a p l a t e a u v a l u e o v e ra p p r o x . 5 d a y s .

T a b l e 1 r e c o r d s t h e 3 H / 1 4 C r a t i o s i n ( + ) - a c - p i n e n e

T a b l e 1 . 3 H / 1 4 C r a t i o s i n ( + ) - a c - p i n e n e f o r m e d a f t e r u p t a k e o f 3 R S - [ 2 - 1 4 C , ( 4 R ) - 4 _ 3 H 1 ] m e v a l o n a t e a n d i t s( 4 S ) - i s o m e r b y P i n u s s p e c i e s

F o r e x p e r i m e n t a l d e t a i l s s e e t h e t e x t . A v e r a g e v a l u e s f o r i n c o r p o r a t i o n s a r e g i v e n w h e n t w o s e p a r a t e f e e d i n ge x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d . T h e 3 H / 1 4 C r a t i o i n p r o d u c t s w a s m e a s u r e d a f t e r p u r i f i c a t i o n t o c o n s t a n t s p e c i f i cr a d i o a c t i v i t y ( m o s t e x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d i n d u p l i c a t e ) .

3 H - l a b e l l e d3 R S - [ 2 - 1 4 C ] m e v a l o n a t e

[ ( 4 S ) _ 4 _ 3 H 1 ]( ( 4 R ) 4 _ 3 H 1 ][ ( 4 S ) _ 4 _ 3 H 1 ][ ( 4 R ) _ 4 _ 3 H 1 ][ ( 4 S ) _ 4 _ 3 H 1 ]

[ ( 4 R ) - 4 _ 3 H 1 ]V o l . 1 3 0

S p e c i e sP . a t t e n u a t a

P . a t t e n u a t a

P . r a d i a t aP . r a d i a t aP . n i g r a

P . n i g r a

T i m eb e f o r e h a r v e s t i n g

( d a y s )115

5

5

5

I n c o r p o r a t i o n o f3 R - p r e c u r s o r

2 x 1 0 - 32 x 1 0 - 35 x 1 0 - 45x10-4

1 x 1 0 -

I x 1 0 -

1 0 5 5

3 H / 1 4 C r a t i oi n p r e c u r s o r

1 . 5 61 . 5 32 . 0 12 . 0 12 . 0 1

2 . 0 1

3 H / 1 4 C r a t i oi n p r o d u c t s

< 0 . 0 1

1 . 5 0 , 1 . 5 1< 0 . 0 1 , < 0 . 0 1

1 . 9 2 , 1 . 9 60 . 0 2 , 0 . 0 1

1 . 9 9 , 1 . 9 8



D . V . BANTHORPE AND G . N . J . LE PATOUREL

i s o l a t e d a n d p u r i f i e d t o c o n s t a n t s p e c i f i c r a d i o a c t i v i t ya f t e r 3 R S - [ 2 - 1 4 C , ( 4 R ) 4 3 H I ] m e v a l o n a t e a n d i t s ( 4 S ) -i s o m e r h a d b e e n f e d t o t h e p l a n t s f o r v a r i o u s t i m e -p e r i o d s . P e r c e n t a g e i n c o r p o r a t i o n s r a t h e r t h a nd i l u t i o n f a c t o r s a r e c a l c u l a t e d f o r r e a s o n s p r e v i o u s l yd e s c r i b e d ( B a n t h o r p e e t a l . , 1 9 7 2 b ) . T h e 3 H / 1 4 C

r a t i o s r e c o r d e d a r e m e a n s o f t h r e e a s s a y s o n e a c h

s a m p l e o f p u r i f i e d m a t e r i a l a n d h a v e s t a n d a r d d e v i -a t i o n s o f ± 0 . 0 3 : a l l f e e d i n g s e x c e p t o n e w e r e c a r r i e do u t i n d u p l i c a t e . R a d i o a c t i v i t i e s i n t h e 1 4 C c h a n n e l

v a r i e d o v e r t h e r a n g e 3 x 1 0 2 4 x 1 0 4 d . p . m . ( a b o v eb a c k g r o u n d ) i n t h e v a r i o u s e x p e r i m e n t s .

I n c o r p o r a t i o n o f 1 4 C : d e g r a d a t i o n o f ( + ) - a - p i n e n e

( + ) - x - P i n e n e b i o s y n t h e s i z e d b y P i n u s r a d i a t a f r o m

[ 2 - 1 4 C ] m e v a l o n a t e w a s p u r i f i e d t o c o n s t a n t s p e c i f i cr a d i o a c t i v i t y a n d w a s d e g r a d e d t h r o u g h t h e s e q u e n c e s

( I ) - ( V ) a n d ( I ) - ( V I I I ) ( s e e S c h e m e 1 ) . ( + ) - o c - P i n e n es i m i l a r l y f o r m e d i n P i n u s n i g r a w a s a l s o d e g r a d e d

( I )

Cl><

( I X )

. 1

0

C02H

( I I )

. 1

CO2H

( V I )

CO2H NH2CO2H - NH2 + 2 C 0 2

( I I I ) ( I V )( V )

NH2

( V I I )

+ CO2

( V I l I )

( X )

S c h e m e 1 . D e g r a d a t i o n s c h e m e f o r a c - p i n e n e

( I ) a c - P i n e n e ; ( I I ) p i n o n i c a c i d ; ( I I I ) p i n i c a c i d ; ( I V ) 2 , 2 - d i m e t h y l - 1 - a m i n o m e t h y l - 3 - a m i n o c y c l o b u t a n e ;( V ) C 0 2 ; ( V I ) 2 , 2 - d i m e t h y l - 3 - e t h y l - 1 - c a r b o x y m e t h y l c y c l o b u t a n e ; ( V I I ) 2 , 2 - d i m e t h y l - 3 - e t h y l - 1 - a m i n o m e t h y l -c y c l o b u t a n e ; ( V I I I ) C O 2 .

T a b l e 2 . S p e c i f i c r a d i o a c t i v i t i e s o f ( + ) - a c - p i n e n e b i o s y n t h e s i z e d f r o m [ 2 - 1 4 C ] m e v a l o n a t e b y P i n u s s p e c i e s a n do f i t s d e g r a d a t i o n p r o d u c t s

F o r e x p e r i m e n t a l d e t a i l s s e e t h e t e x t . a e - P i n e n e w a s c o u n t e d f o r r a d i o a c t i v i t y a s p i n o n i c a c i d ( I I , S c h e m e 1 ) . F o rs t r u c t u r e s o f p r o d u c t s , s e e S c h e m e 1 .

I n c o r p o r a t i o n o f3R p r e c u r s o r ( % )

2 x 1 0 - 43 x 1 0 - 3

5 x 1 0 - 2

S p e c i f i c r a d i o a c t i v i t y ( d . p . m . / m m o l )

a % - P i n e n e

8 4 09 3 2 0

1 7 2 3 2

D e g r a d a t i o n p r o d u c t s

( I I I ) 8 3 2 ; ( I V ) 0 ; ( V ) 7 2 9( V I ) 9 1 1 5 ; ( V I I ) 1 3 0 ; ( V I I I ) 8 9 9 0

( V I ) 1 7 0 1 2 ; ( V I I ) 3 2 1 ; ( V I I I ) 1 6 9 1 0

1 9 7 2

S p e c i e s

P . r a d i a t aP . r a d i a t a

P . n i g r a

1 0 5 6



BIOSYNTHESIS OF a-PINENE

b y t h e l a t t e r r o u t e . R e s u l t s a r e s h o w n i n T a b l e 2 . I nt h e f i r s t e x p e r i m e n t w i t h P . r a d i a t a , a - p i n e n e w a sh a r v e s t e d 2 4 h a f t e r c o m p l e t i o n o f u p t a k e o f t r a c e r .I n t h e o t h e r t w o e x p e r i m e n t s a m e t a b o l i s m t i m e o f5 d a y s w a s a l l o w e d .

I n T a b l e 2 t h e s p e c i f i c r a d i o a c t i v i t i e s o f t h e

d e g r a d a t i o n p r o d u c t s h a d s t a n d a r d d e v i a t i o n s o fa p p r o x . ± 5 % o f t h e q u o t e d v a l u e s , e x c e p t f o rc o m p o u n d ( V ) i n t h e f i r s t d e g r a d a t i o n , w h i c h h a d av a l u e o f a p p r o x . ± 1 0 % . Compound ( I V ) ( f i r s t d e -g r a d a t i o n ) h a d a r a d i o a c t i v i t y i n d i s t i n g u i s h a b l ef r o m t h e b a c k g r o u n d , i . e . t h e s p e c i f i c r a d i o a c t i v i t yw a s l e s s t h a n a p p r o x . 3 0 d . p . m . / m m o l .

D i s c u s s i o n

T h e d o u b l e - l a b e l l i n g s t u d i e s o n P . a t t e n u a t aL e m m . , P . r a d i a t a D . D o n . a n d P . n i g r a v a r .A u s t r i a c a ( F a m i l y C o n i f e r a e ) f o l l o w t h e p a t t e r no b s e r v e d f o r b o t h g e r a n i o l a n d n e r o l a n d t h e i rg l u c o s i d e s f r o m R o s a a n d P e l a r g o n i u m s p e c i e s i nt h a t , w i t h i n e x p e r i m e n t a l e r r o r , t h e p r o - 4 R h y d r o g e na t o m o f m e v a l o n a t e w a s c o m p l e t e l y r e t a i n e d w h e r e a st h e a n a l o g o u s p r o - 4S h y d r o g e n a t o m w a s c o m p l e t e l ye l i m i n a t e d . T h e i n c o r p o r a t i o n o f t r a c e r w a s l o w , b u tt h i s i s t y p i c a l f o r l e a f m o n o t e r p e n e s ( L o o m i s , 1 9 6 7 ;B a n t h o r p e e t a l . , 1 9 7 2 a ) a n d h a s b e e n r e a s o n a b l ye x p l a i n e d ( B a n t h o r p e e t a l . , 1 9 7 0 ) . I t h a s b e e n c l a i m e dt h a t [ 2 - ' 4 C ] m e v a l o n a t e i s i n c o r p o r a t e d i n t o c - p i n e n ef r o m P . a t t e n u a t a i n 0 . 5 % y i e l d ( S t a n l e y , 1 9 5 8 ) , b u tt h e p r o d u c t w a s n o t p u r i f i e d t o c u r r e n t l y r e q u i r e d

s t a n d a r d s a n d may h a v e c o n t a i n e d a r a d i o a c t i v e l yl a b e l l e d i m p u r i t y .O u r r e s u l t s c o n f i r m t h e p r e v i o u s f i n d i n g s ( B a n -

t h o r p e e t a l . , 1 9 7 2 b ) t h a t t h e r e i s n o c o r r e l a t i o n

b e t w e e n l o s s o f t h e p r o - 4 S a n d p r o - 4 R h y d r o g e na t o m s o f m e v a l o n a t e a n d t h e r e s p e c t i v e b i o s y n t h e s i so f a t r a n s - o r c i s - s u b s t i t u t e d d o u b l e b o n d i n mono-

t e r p e n e s , a l t h o u g h s u c h a c o r r e l a t i o n d o e s e x i s t f o rt h e f o r m a t i o n o f r u b b e r ( A r c h e r e t a l . , 1 9 6 6 ) a n d f o rc e r t a i n p o l y i s o p r e n o i d a l c o h o l s ( G o u g h & H e m m i n g ,

1 9 6 7 , 1 9 7 0 ; S t o n e & H e m m i n g , 1 9 6 7 ) . T h e p a t t e r no b s e r v e d i s c o n s i s t e n t w i t h t h e h y p o t h e s i s t h a t n e r y lp y r o p h o s p h a t e i s a p a r e n t o f c y c l i c m o n o t e r p e n e s .A r o u t e t o t h e s e c o m p o u n d s i n v o l v i n g i s o m e r i z a t i o no f g e r a n y l p y r o p h o s p h a t e t o l i n a l o y l p y r o p h o s p h a t ea n d c y c l i z a t i o n o f t h e l a t t e r i s f e a s i b l e , a n d a n e n z y m es y s t e m f r o m o r a n g e - j u i c e v e s i c l e s t h a t c y c l i z e s l i n a l o o lt o m e n t h a n e d e r i v a t i v e s w i t h t h e s u p p o s e d i n t e r -m e d i a t e f o r m a t i o n o f l i n a l o y l p y r o p h o s p h a t e i s known( P o t t y e t a l . , 1 9 7 0 ) , b u t t h e c o n s e n s u s o f o p i n i o ni s t h a t n e r y l p y r o p h o s p h a t e i s p r o b a b l y t h e p r e c u r s o r

o f c y c l i c m o n o t e r p e n e s ( B a n t h o r p e e t a l . , 1 9 7 2 a ) .D e g r a d a t i o n o f ( + ) - o c - p i n e n e b i o s y n t h e s i z e d f r o m

[ 2 - ' 4 C ] m e v a l o n a t e i n P . r a d i a t a a n d P . n i g r a s h o w e dt h a t t r a c e r w a s a l m o s t e n t i r e l y ( a t l e a s t 9 0 % ) l o c a t e da t C - 3 ( s e e S c h e m e 2 , s t r u c t u r e X I ) . T h i s p a t t e r n o fa s y m m e t r i c l a b e l l i n g i s t y p i c a l o f t h a t f o u n d i n s e v e r a lm o n o - a n d s e s q u i - t e r p e n e s a f t e r i n c o r p o r a t i o n o f

[ 2 - 1 4 C ] m e v a l o n a t e ( B a n t h o r p e e t a l . , 1 9 7 2 a ; C r o t e a u& L o o m i s , 1 9 7 2 ) . T h e l o c a t i o n o f t r a c e r a t C - 3s u p p o r t s t h e g e n e r a l l y a c c e p t e d h y p o t h e s i s ( R u z i c k a ,1 9 5 3 ) t h a t t h e p i n a n e s k e l e t o n i s c o n s t r u c t e d b yi n t e r n a l a d d i t i o n o f a c a t i o n i c c e n t r e t o t h e d o u b l eb o n d i n t h e i o n ( X I I ) ( o r i t s b i o g e n e t i c e q u i v a l e n t )d e r i v e d f r o m a - t e r p i n e o l .

P r e v i o u s w o r k e r s h a v e o b t a i n e d r e s u l t s t h a t d i f f e rf r o m t h o s e r e c o r d e d h e r e ( S a n d e r m a n n & S c h w e e r s ,1 9 6 2 ; S a n d e r m a n n e t a l . , 1 9 6 8 ) . o c - P i n e n e o f u n -s p e c i f i e d c h e m i c a l , o p t i c a l a n d r a d i o c h e m i c a l p u r i t y

1 0

1 2

784

5

(Xi) ( X I I )

SCH2CO2H

( X I V )

( X I I I )

,0#OH

( X V )

S c h e m e 2 . N u m b e r i n g a n d s t r u c t u r e o f o c - p i n e n e , i t s a d d u c t s a n d r e l a t e d c o m p o u n d s

( X I ) a - P i n e n e . ( X I I ) P r o b a b l e m e c h a n i s m f o r c y c l i z a t i o n o f o c - t e r p i n e o l t o f o r m o c - p i n e n e . ( X I I I ) P r e v i o u s l yr e p o r t e d l a b e l l i n g p a t t e r n f o r o - p i n e n e ( = 1 4 C ) . ( X I V ) S t r u c t u r e o f a d d u c t o f o c - p i n e n e a n d 2 - t h i o a c e t i c a c i d .

( X V ) ( + ) - N e o i s o p i n o c a m p h e o l [ d e r i v e d b y m o d i f i c a t i o n o f t h e a d d u c t o f ( + ) - a o - p i n e n e a n d 2 - t h i o a c e t i c a c i d ] .V o l . 1 3 0

1 0 5 7



D . V . BANTHORPE AND G . N . J . LE PATOUREL

w a s o b t a i n e d a f t e r a d m i n i s t r a t i o n o f [ 2 - 4 C ] m e v a l o -

n a t e t o P . n i g r a v a r . A u s t r i a c a , a n d o n t h e b a s i s o f

p a r t i a l d e g r a d a t i o n a p a t t e r n o f l a b e l l i n g ( S c h e m e 2 ,f o r m u l a X I I I ) w a s r e p o r t e d i n w h i c h t h e m o i e t i e s

d e r i v e d f r o m i s o p e n t e n y l p y r o p h o s p h a t e a n d 3 , 3 -d i m e t h y l a l l y l p y r o p h o s p h a t e w e r e e q u i v a l e n t l y l a b e l -

l e d . T h i s ' s y m m e t r i c a l ' p a t t e r n s e e m e d v e r y r e a s o n -a b l e a t t h e t i m e , b u t t h e u n e x p e c t e d l o c a t i o n o f

t r a c e r a t C - 1 ( r a t h e r t h a n a t C - 3 ) w a s i n c o n s i s t e n tw i t h t h e m e c h a n i s m p r o p o s e d b y R u z i c k a ( 1 9 5 3 ) ( s e ea b o v e ) a n d n e c e s s i t a t e d t h e p o s t u l a t i o n o f r a t h e ru n l i k e l y b i o s y n t h e t i c r o u t e s i n v o l v i n g e i t h e r c y c l i z a -t i o n o f a m o n o c y c l i c p r e c u r s o r w i t h t h e i n t e r m e d i a t e

f o r m a t i o n o f a n o v e l z w i t t e r i o n ( S a n d e r m a n n &

S c h w e e r s , 1 9 6 2 ) o r a n i n t r a m o l e c u l a r D i e l s - A l d e r

c y c l i z a t i o n o f a n a c y c l i c p r e c u r s o r ( R i c h a r d s &

H e n d r i c k s o n , 1 9 6 4 ) .A s t h e o p t i c a l p u r i t y o f t h e o a - p i n e n e u s e d i n t h e s e

e a r l y e x p e r i m e n t s w a s u n s p e c i f i e d , i t m i g h t b e a r g u e d

t h a t t h e m a t e r i a l w a s m a i n l y t h e ( - ) - i s o m e r a n d t h a tt w o d i s t i n c t e n z y m i c r o u t e s , g i v i n g d i f f e r e n t l a b e l l i n gp a t t e r n s , o c c u r r e d c o r r e s p o n d i n g t o t h e f o r m a t i o no f e a c h o p t i c a l i s o m e r . Tw o e n z y m i c r o u t e s t o t h ep i n a n e s k e l e t o n m u s t i n d e e d o c c u r ( a n d f r e q u e n t l yo c c u r a t t h e s a m e t i m e ) a s a - p i n e n e t y p i c a l l y e x i s t si n a n o p t i c a l l y i m p u r e f o r m , w h e r e a s f l - p i n e n e i su s u a l l y o p t i c a l l y p u r e ( K u g l e r & K o v a t s , 1 9 6 3 ) , a n da l m o s t i n v a r i a b l y ( t h e p r e d o m i n a n t ) ( + ) - a - p i n e n eo c c u r s t o g e t h e r w i t h ( - ) - f l - p i n e n e o f t h e o p p o s i t ea b s o l u t e c o n f i g u r a t i o n ( K o v a t s , 1 9 6 3 ; B a n t h o r p e &W h i t t a k e r , 1 9 6 6 ) . S u c h a d i c h o t o m y o f r o u t e s t o t h e

p i n a n e s k e l e t o n h a s a l s o b e e n i n d e p e n d e n t l y d e d u c e df r o m c h e m o t a x o n o m i c s t u d i e s o n n u m e r o u s P i n u s

s p e c i e s ( Z a v a r i n , 1 9 7 0 ) a n d c a n b e i n f e r r e d f r o m t h ep a t t e r n o f t i m e - i n c o r p o r a t i o n o f t r a c e r i n t o a - a n d, - p i n e n e i n n e e d l e s o f P . r a d i a t a ( V a l e n z u e l a e t a l . ,1 9 6 6 ) . H o w e v e r , t h e o c - p i n e n e s a m p l e s o b t a i n e d f r o mo u r s p e c i m e n s o f P . r a d i a t a a n d P . n i g r a b o t h c o n -

t a i n e d ( + ) - a n d ( - ) - i s o m e r s i n t h e a p p r o x i m a t er a t i o 4 : 1 , a n d s o a n y d i f f e r e n c e i n l a b e l l i n g p a t t e r nr e s u l t i n g f r o m t h e f o r m a t i o n o f s k e l e t o n s o f o p p o s i t ea b s o l u t e c o n f i g u r a t i o n w o u l d h a v e b e e n d e t e c t e d .Ou r r e s u l t s t h u s s u g g e s t t h a t a s i m i l a r m e c h a n i s mw a s u t i l i z e d f o r t h e b i o s y n t h e s i s o f b o t h o p t i c a l

i s o m e r s , a n d i t s e e m s l i k e l y t h a t t h e e p i m e r i c s p e c i e sf o r m a l l y r e p r e s e n t e d b y s t r u c t u r e ( X I I ) a r e t h ep r e c u r s o r s .A m i n o r c o n c l u s i o n a r o s e f r o m t h e d e g r a d a t i o n

e x p e r i m e n t s . o c - P i n e n e w a s p u r i f i e d t h r o u g h i t sa d d u c t w i t h 2 - t h i o a c e t i c a c i d . A l t h o u g h t h e p r o d u c th a d b e e n r e p o r t e d p r e v i o u s l y , i t w a s i l l - c h a r a c t e r i z e da n d i t s s t r u c t u r e w a s u n k n o w n ( S u t h e r l a n d & W e l l s ,1 9 5 6 ; B u e s s e t a l . , 1 9 5 7 ) a n d u n c e r t a i n b e c a u s e o ft h e r e a d y t e n d e n c y o f t h e p i n a n e s k e l e t o n t o u n d e r g oW a g n e r - M e e r w e i n r e a r r a n g e m e n t . E l e m e n t a l a n dm a s s - s p e c t r o m e t r i c a n a l y s i s s h o w e d t h a t t h e p u r i f i e dp r o d u c t w a s a 1 : 1 a d d u c t a n d t h e s p e c t r a w e r e c o n -

s i s t e n t w i t h s t r u c t u r e ( X I V ) : t h u s a n i . r . b a n d a t

2 8 9 0 c m - 1 w a s a t t r i b u t a b l e t o R 3 C - H , a n d t h e n . m . r .s p e c t r u m r e s e m b l e d t h a t o f a c - p i n e n e b u t w i t h a m u l t i -p l e t ( 3 H ) a t 6 . 4 - 6 . 8 T a t t r i b u t a b l e t o S - C H i a n dS - C H . I n a d d i t i o n , t h e f r a g n e n t a t i o n p a t t e r n u n d e re l e c t r o n i m p a c t ( a t 7 0 e V ) w a s c o m p l e t e l y c o n s i s t e n tw i t h s t r u c t u r e ( X I V ) . T h i s a s s i g n m e n t w a s c o n f i r m e d ,

a n d i n a d d i t i o n t h e s u l p h u r - c o n t a i n i n g g r o u p a n dt h e m e t h y l g r o u p a t C - 2 w e r e s h o w n t o b e o c - a n d

# - o r i e n t a t e d , b y e s t e r i f i c a t i o n o f t h e a d d u c t f o l l o w e d

b y S - m e t h y l a t i o n a n d Hofmann d e g r a d a t i o n o f t h e

r e s u l t i n g - o n i u m s a l t . T h i s p r o c e d u r e g a v e a - p i n e n e( 2 2 % ) , a n u n i d e n t i f i e d m o n o t e r p e n e ( 2 3 % ) , w h i c hp r o b a b l y w a s 8 - p i n e n e ( p i n - 3 - e n e ) , a n d ( + ) - n e o i s o -p i n o c a m p h e o l ( X V , 4 0 % ) .

E x p e r i m e n t a l

A l l m e l t i n g p o i n t s w e r e u n c o r r e c t e d . N . m . r .

s p e c t r a w e r e m e a s u r e d i n 10% s o l u t i o n i n c a r b o nt e t r a c h l o r i d e o r d e u t e r i o c h l o r o f o r m w i t h t e t r a m e t h y l -s i l a n e ( , r 1 0 . 0 0 ) a s i n t e r n a l s t a n d a r d o n a P e r k i n -

E l m e r R 1 2 6 O MHz s p e c t r o m e t e r .

M a t e r i a l s

P i n u s s p e c i e s . P . r a d i a t a a n d P . n i g r a [ 0 . 6 m( 2 f t ) s p e c i m e n s ] w e r e o b t a i n e d f r o m H i l l i e r a n dS o n s ( W i n c h e s t e r , H a n t s . , U . K . ) a n d w e r e c u l t i v a t e do u t d o o r s i n C e n t r a l L o n d o n ; y o u n g t e r m i n a l f o l i -a g e o f P . a t t e n u a t a w a s o b t a i n e d f r o m t h e N a t i o n a l

P i n e t u m ( B e d g e b u r y , K e n t , U . K . ) a s r e q u i r e d .F e e d i n g w i t h r a d i o a c t i v e m a t e r i a l s . T h e s e e x p e r i -m e n t s w e r e c a r r i e d o u t i n t h e p e r i o d M a y - S e p t e m b e r ,u s u a l l y i n J u l y o r A u g u s t . T h e l a c t o n e s o f 3 R S - [ 1 4 C ] -o r 3 R S - [ 3 H ] - m e v a l o n a t e w e r e c o n v e r t e d i n t o t h e s a l t so f t h e a c i d s b y i n c u b a t i o n w i t h a q . 0 . 1 M-NaHCO3( 1 . O m l ) f o r 1 h a t 3 7 ° C , i m m e d i a t e l y b e f o r e f e e d i n g .3 R S - [ 2 - 4 C ] - a n d 3 R S - [ 4 R ( S ) - 4 - 3 H l ] - m e v a l o n a t e( f r o m T h e R a d i o c h e m i c a l C e n t r e , A m e r s h a m , B u c k s . ,U . K . ) w e r e u s e d a t s p e c i f i c r a d i o a c t i v i t i e s o f 6 . 4 a n d1 1 6 m C i / m m o l r e s p e c t i v e l y .

P r e l i m i n ar y e x p e r i m e n t s t o d e t e r m i n e t h e t i m e -c o u r s e o f l a b e l l i n g u s e d b a t c h e s ( 2 0 - 3 0 g ) o f f o l i a g e ,

w h i c h w e r e f e d w i t h [ 2 - 1 4 C ] m e v a l o n a t e ( a p p r o x .2 0 , t C i ) i n w a t e r ( l m l ) i n s t e r i l e c o n d i t i o n s u n d e ri l l u m i n a t i o n a n d w i t h f o r c ed t r a n s p i r a t i o n . A f t e r

u p t a k e o f t r a c e r t h e f o l i a g e w a s m a i n t a i n e d o ns t e r i l e n u t r i e n t m e d i u m f o r t h e p r e d e t e r m i n e d t i m e s .F u l l d e t a i l s o f t h e s e f e e d i n g t e c h n i q u e s h a v e b e e nr e p o r t e d ( B a n t h o r p e & W i r z - J u s t i c e , 1 9 6 9 ; B a n -t h o r p e e t a l . , 1 9 7 0 ) . E a c h s a m p l e o f f o l i a g e ( a p p r o x .5 g ) w a s e x t r a c t e d w i t h h e x a n e , t h e e x t r a c t w a ss e p a r a t e d b y c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y a n d g . l . c . ( s e e' P u r i f i c a t i o n o f a - p i n e n e ' b e l o w ) a n d t h e a - p i n e n ef r a c t i o n w a s a s s a y e d f o r t r a c e r b y u s i n g a 2 7 r - r a d i o -c h r o m a t o g r a p h y s c a n n e r ( T r a c e r l a b I n s t r u m e n t s

I n c . ; T e x a s I n s t r u m e n t s , H o u s t o n , T e x . , U . S . A . ) .1 9 7 2

1 0 S 8



BIOSYNTHESIS OF ( x - P I N E N E

I n t h e i n c o r p o r a t i o n e x p e r i m e n t s p r o p e r , s i m i l a rq u a n t i t i e s o f n e e d l e s a n d t e r m i n a l m e r i s t e m o f t h e

P i n u s s p e c i e s w e r e f e d w i t h m e v a l o n a t e ( 5 0 - 1 0 0 , u C ii n v a r i o u s e x p e r i m e n t s ) a n d w e r e h a r v e s t e d a f t e rb e i n g m a i n t a i n e d o n n u t r i e n t m e d i u m f o r t h e t i m e s

r e c o r d e d i n t h e t a b l e s . M o s t f e e d i n g s i n t h e e x p e r i -m e n t s w i t h d o u b l y l a b e l l e d p r e c u r s o r w e r e d o n e i nd u p l i c a t e .

P u r i f i c a t i o n o f o c - p i n e n e

T h e f o l i a g e w a s g r o u n d i n l i q u i d N 2 a n d t h e r e s u l t -i n g p o w d e r p l u s a n e q u a l w e i g h t o f a n h y d r o u sN a 2 S O 4 w a s r e f l u x e d w i t h h e x a n e ( 2 0 m l ) f o r 4 h .

S a m p l e s ( 0 . 1 - 0 . 5 g ) o f a - p i n e n e ( f r o m B u s h B o a k eA l l e n L t d . , L o n d o n E . 1 5 , U . K . ; > 9 8 % p u r e b y g . l . c . )w e r e a d d e d a s c a r r i e r ; t h e s o l u t i o n w a s c o n c e n t r a t e d

t o a p p r o x . 5 m l a t - 1 0 ° C , a n d t h i s r e s i d u e w a s

c h r o m a t o g r a p h e d o n a c o l u m n o f s i l i c a g e l H ( f r o mE . M e r c k , D a r m s t a d t , G e r m a n y ) - A g N O 3 ( N o r i n &W e s t f e l t , 1 9 6 3 ) w i t h h e x a n e - e t h e r ( 2 : 1 , v / v ) . a -P i n e n e w a s o b t a i n e d f r o m t h e a p p r o p r i a t e c o n -

c e n t r a t e d f r a c t i o n s ( w h i c h w e r e m o n i t o r e d b y t . l . c . )b y p r e p a r a t i v e g . l . c . o n C a r b o w a x 20M ( 2 0 % , w / w ,o n C h r o m o s o r b W; 6 0 - 8 0 m e s h ) i n a c o l u m n ( 6 m x

1 cm e x t e r n a l d i a m . ) m a i n t a i n e d a t 9 0 ° C , w i t h a f l o w

r a t e o f 5 . 4 l i t r e s o f N 2 / h . T h e e f f l u e n t w a s t r a p p e dw i t h a p p r o x . 70% r e c o v e r y b y u s i n g a p r e v i o u s l yd e s c r i b e d a p p a r a t u s ( B a n t h o r p e e t a l . , 1 9 7 2 b ) .

T h e n i t r o s o c h l o r i d e d e r i v a t i v e o r t h e a d d u c t w i t h

2 , 4 - d i n i t r o b e n z e n e s u l p h e n y l c h l o r i d e ( K h a r a s c h ,

1 9 5 6 ) c o u l d n o t b e o b t a i n e d i n a c r y s t a l l i n e f o r m i ns a t i s f a c t o r y y i e l d s , a n d a c - p i n e n e w a s t r e a t e d ( S u t h e r -l a n d & W e l l s , 1 9 5 6 ; B u e s s e t a l . , 1 9 5 7 ) w i t h f r e s h l yd i s t i l l e d 2 - t h i o a c e t i c a c i d , b . p . 9 0 ° C a t 1 . 2 4 k N / m 2( l O m m H g ) t o g i v e a n a d d u c t t h a t w a s p u r i f i e d b yc h r o m a t o g r a p h y o n a c o l u m n o f s i l i c i c a c i d ( S i l i c a rC C 7 ; M e r c k ) w i t h h e x a n e - e t h e r ( 1 : 1 , v / v ) a s e l u e n t .T h e r e s u l t i n g m a t e r i a l ( y i e l d 7 1 % ) h a d n " 1 . 4 6 6 0 ,( c 2 c - 1 6 . 8 ± 1 0 , w h e n p r e p a r e d f r o m c - p i n e n e ,[ D C ] i + 2 1 . 3 ± 1 0 ; i . r . b a n d s a t 2 9 1 0 , 2 8 9 0 , 1 7 1 0 , 1 2 9 5 ,1 1 2 5 , 9 3 0 c m - ' ; n . m . r . a b s o r p t i o n a t 6 . 4 - 6 . 8 r ( m u l t i -p l e t , 3 H : S - C H 2 , S - C H ) ; m a s s s p e c t r u m , b a s e p e a k 4 1( a b u n d a n c e 1 0 0 ) , p a r e n t p e a k 2 2 8 ( 5 . 6 ) , o t h e r m a i n

p e a k s a t 1 7 3 , 1 6 9 , 1 0 9 , 1 4 5 , 1 3 7 , 1 3 6 , 9 1 a n d 5 5 w i t ha b u n d a n c e s o f 5 . 9 , 2 . 9 , 9 . 1 , 5 . 6 , 3 . 3 , 9 . 1 , 9 . 1 a n d3 9 . 7 ; m o l e c u l a r f o r m u l a ( m a s s s p e c t r o m e t r y )C 1 2 H 2 0 S O 2 ( F o u n d : C , 6 3 . 0 , H , . 8 . 9 . C a l c . f o rC 1 2 H 2 0 S O 2 : C , 6 3 . 1 ; H , 8 . 9 % ) . T h e b e n z y l i s o -t h i u r o n i u m s a l t o f t h e a d d u c t h a d m . p . 1 5 5 ° C a f t e rr e c r y s t a l l i z a t i o n f r o m a c e t o n e : s a m p l e s f o r r a d i o -a c t i v e a s s a y w e r e p u r i f i e d b y r e c r y s t a l l i z a t i o n o f t h i sd e r i v a t i v e a n d w e r e r e c o n v e r t e d i n t o t h e a - p i n e n e -t h i o a c e t i c a c i d a d d u c t b e f o r e r a d i o a c t i v i t y c o u n t i n g .To p r o v e t h e s t r u c t u r e o f t h e l a t t e r a d d u c t , t h e

c o m p o u n d ( p r e p a r e d b y u s i n g a l m o s t o p t i c a l l y p u r e( + ) - c x - p i n e n e , [ a ] i A ° + 5 1 ± 1 0 ) w a s c o n v e r t e d i n t o i t s

m e t h y l e s t e r w i t h d i a z o m e t h a n e a n d t h e c r u d e p r o -

V o l . 1 3 0

d u c t w a s m e t h y l a t e d w i t h m e t h y l i o d i d e t o g i v e t h e

s u l p h o n i u m i o d i d e a s a r e d o i l ( F o u n d : I , 3 1 . 9 .C 1 j H 2 7 S O 2 I r e q u i r e s I , 3 1 . 9 % ) . T r e a t m e n t o f t h i sw i t h a t w o f o l d m o l a r e x c e s s o f NaOH i n d i o x a n -w a t e r ( 3 : 2 , v / v ) a t 1 0 0 ° C g a v e : ( + ) - n e o i s o p i n o -c a m p h e o l ( X V , y i e l d 4 0 % ) , [ o C ] 2 0 +21±10 ( c 1 0 i n

b e n z e n e ) , a c - p i n e n e ( y i e l d 2 2 % ) a n d a n u n i d e n t i f i e dh y d r o c a r b o n ( y i e l d 2 3 % ) . T h e p r o d u c t s w e r e i s o l a t e db y p r e p a r a t i v e g . l . c . o n t h e C a r b o w a x 20M c o l u m nd e s c r i b e d a b o v e a n d t h e f i r s t t w o c o m p o u n d s w e r ei d e n t i f i e d b y c o m p a r i s o n o f t h e i r i . r . s p e c t r a w i t ht h o s e o f a u t h e n t i c s a m p l e s : t h e l a s t p r o d u c t h a d as p e c t r u m v e r y s i m i l a r t o t h a t o f & - p i n e n e a n d w a sp r o b a b l y a - p i n e n e ( p i n - 3 - e n e ) . No P - p i n e n e w a sd e t e c t e d a n d n o i n t e r c o n v e r s i o n o f c x - , , B - a n d t h e

p r e s u m e d 8 - p i n e n e o c c u r r e d i n c o n t r o l s .o c - P i n e n e f r o m P . r a d i a t a , P . a t t e n u a t a a n d P .

n i g r a h a d [ a ] 2 5 ( c 5 i n e t h a n o l ) + 3 5 . 2 , + 3 0 . 2 a n d+ 3 6 . 7 0 ( a l l ± 1 0 ) a f t e r p u r i f i c a t i o n b y t h e g . l . c . a n dt . l . c . p r o c e d u r e s o u t l i n e d a b o v e . T h e y i e l d o f o i lf r o m t h e n e e d l e s w a s a p p r o x . 0 . 2 % ( w / w e t w t . ) i ne a c h c a s e .

D e g r a d a t i o n s c h e m e s

T h e p r o c e d u r e s u s e d a r e m o s t l y w e l l d e s c r i b e d i nt h e l i t e r a t u r e ( s e e S i m o n s e n , 1 9 5 7 ) a n d w e r e s c a l e ddown t o e m p l o y 1 0 0 - 5 0 0 m g o f s u b s t r a t e a t e a c h s t e p .C a r r i e r w a s a d d e d i f n e c e s s a r y t o m a i n t a i n a p p r o -p r i a t e q u a n t i t i e s . A l l t h e w e l l - a u t h e n t i c a t e d p r o d u c t s

h a d m e l t i n g o r b o i l i n g p o i n t s i n a g r e e m e n t ( ± 1 0 C )w i t h l i t e r a t u r e v a l u e s a n d h a d e l e m e n t a l a n a l y s e s a n di . r . a n d n . m . r . s p e c t r a c o n s i s t e n t w i t h t h e a c c e p t e ds t r u c t u r e s .

a c - P i n e n e w a s o x i d i z e d w i t h KMnO4 ( D u p o n t ,

1 9 2 3 ) t o f o r m c i s - p i n o n i c a c i d ( I I ) , w h i c h w a s p u r i f i e db y p a s s a g e , w i t h b e n z e n e - e t h e r ( 1 : 1 , v / v ) a s e l u e n t ,t h r o u g h a c o l u m n o f s i l i c i c a c i d ( S i l i c a r C C 7 ; M e r c k )t o w h i c h 0 . 0 2 5 M - H 2 S O 4 ( 4 0 % , w / w ) h a d b e e n a d d e dt o m a i n t a i n a f r e e - r u n n i n g p o w d e r ( K i n n o r y e t a l . ,1 9 5 5 ) . T h e p r o d u c t , y i e l d 5 3 % , h a d m . p . 1 0 4 ° C a f t e rr e c r y s t a l l i z a t i o n f r o m w a t e r a n d f o r m e d a t o s y l -h y d r a z o n e , m . p . 1 3 5 ° C ( a f t e r r e c r y s t a l l i z a t i o n f r o m

e t h a n o l ) a n d a s e m i c a r b a z o n e , m . p . 2 1 0 ° C ( a f t e rr e c r y s t a l l i z a t i o n f r o m a q . e t h a n o l ) . T h e r a d i o a c t i v ea s s a y w a s made o n c i s - p i n o n i c a c i d . T h i s a c i d w a sa l s o r e c o v e r e d a s i t s t o s y l h y d r a z o n e ( y i e l d 5 8 % )a f t e r o z o n o l y s i s o f o c - p i n e n e i n m e t h a n o l a t - 7 8 0 Ca n d p r e p a r a t i o n w i t h p e r f o r m i c a c i d b y t h e s t a n d a r dt e c h n i q u e .

c i s - P i n o n i c a c i d ( I I ) w a s s u b j e c t e d t o t h e b r o m o -f o r m r e a c t i o n ( B a e y e r , 1 8 9 6 ) t o g i v e p i n i c a c i d ( I I I ) ,y i e l d 9 0 % , m . p . 9 0 ° C ( a f t e r r e c r y s t a l l i z a t i o n f r o mw a t e r ) ; S c h m i d t r e a c t i o n o f t h e l a t t e r ( W o l f f , 1 9 4 6 ;H e d r i c k , 1 9 5 9 ) g a v e t h e d i a m i n e ( I V ) i n 5 8% y i e l dt o g e t h e r w i t h C O 2 ( V ) i n 80% y i e l d . T h e CO2 w a s

c o l l e c t e d f r o m a q . B a ( O H ) 2 a s B a C O 3 a n d t h e

1 0 5 9



1 0 6 0 D . V . BANTHORPE AND G . N . J . LE PATOUREL

d i a m i n e w a s p u r i f i e d o n c o l u m n s o f a l u m i n a a n ds i l i c a g e l H ( M e r c k ) w i t h m e t h a n o l - e t h e r ( 1 : 1 , v / v )a n d m e t h a n o l - e t h y l a c e t a t e ( 1 9 : 1 , v / v ) a s e l u e n t sr e s p e c t i v e l y . A d i a c e t y l d e r i v a t i v e c o u l d n o t b e r e a d i l yp r e p a r e d a n d p u r i f i c a t i o n f o r r a d i o a c t i v e a s s a y w a se f f e c t e d t h r o u g h t h e t e t r a p h e n y l b o r o n s a l t ( F l a s c h k a

& B a r n a r d , 1 9 6 0 ) , m . p . 1 1 5 ° C ( d e c o m p . ) ( a f t e rr e c r y s t a l l i z a t i o n f r o m a q . a c e t o n e ) , o r t h e d i h y d r o -c h l o r i d e , m . p . 2 6 0 ° C ( a f t e r r e c r y s t a l l i z a t i o n f r o mc h l o r o f o r m - e t h e r ) , o r t h e d i p i c r a t e , m . p . 2 6 8 ° C( a f t e r r e c r y s t a l l i z a t i o n f r o m a q . e t h a n o l ) .

I n t h e a l t e r n a t i v e d e g r a d a t i o n p r o c e d u r e , H u a n g -M i n l o n - t y p e r e d u c t i o n o f c i s - p i n o n i c a c i d f o r m e dc o m p o u n d ( V I ) , m . p . 1 3 0 ° C ( a f t e r r e c r y s t a l l i z a t i o nf r o m w a t e r ) i n 60% y i e l d . T h i s w a s d e c a r b o x y l a t e db y t h e S c h m i d t p r o c e d u r e ( W o l f f , 1 9 4 6 ) t o f o r m t h eh i t h e r t o u n r e p o r t e d a m i n e ( V I I ) ( y i e l d 7 2 % ) a n dC O 2 ( y i e l d 9 5 % ) , w h i c h w a s c o l l e c t e d a s d e s c r i b e da b o v e .

1 - A m i n o m e t h y l - 2 , 2 - d i m e t h y l - 3 - e t h y l c y c l o b u t a n e( V I I ) w a s p u r i f i e d a s i t s h y d r o c h l o r i d e , m . p . 2 4 3 ° C( a f t e r r e c r y s t a l l i z a t i o n f r o m c h l o r o f o r m ) ; r e c o n v e r -s i o n i n t o t h e f r e e a m i n e g a v e a p r o d u c t o f b . p . 2 3 5 ° C ,m o l e c u l a r f o r m u l a ( m a s s s p e c t r o m e t r y ) C g H l g N( F o u n d : C , 7 6 . 5 ; H , 1 3 . 0 ; N , 9 . 9 ; C g H 1 g N r e q u i r e sC , 7 6 . 6 ; H , 1 3 . 4 ; N , 9 . 9 % ) w i t h n . m . r . s p e c t r u m c o n -s i s t e n t w i t h t h e a s s u m e d s t r u c t u r e .

T h e s e m e t h o d s e n a b l e t r a c e r a t C - 2 , C - 3 , a n dC - 1 0 t o b e m e a s u r e d . C o m p l e t e d e g r a d a t i o n c o u l d b ea c h i e v e d i f a - p i n e n e w a s c o n v e r t e d i n t o b o r n y lc h l o r i d e ( I X ) i n 30% y i e l d b y t r e a t m e n t w i t h H C l

i n c h l o r o f o r m a t 0 ° C ( T h u r b e r & T h i e l k e , 1 9 3 1 ) , a n dt h i s p r o d u c t f u r t h e r c o n v e r t e d i n t o b o r n e n e ( X ,y i e l d 5 2 % ) o f t h e s a m e o p t i c a l p u r i t y a s t h e s t a r t i n gm a t e r i a l ( c f . B o r o w i e c k i & C h r e t i e n - B e s s i e r e , 1 9 6 7 )b y h e a t i n g w i t h a t w o f o l d e x c e s s o f p o t a s s i u m 2 -b u t y l c y c l o h e x o x i d e ( H a n a c k & H a h n l e , 1 9 6 2 ) o rp o t a s s i u m m e n t h o x i d e i n t h e c o r r e s p o n d i n g a l c o h o la s s o l v e n t a t 8 0 ° C . T h e s e s t e p s w e r e c a r r i e d o u t o ni s o t o p i c a l l y n o r m a l m a t e r i a l a n d a o - p i n e n e w a s c o n -v e r t e d i n t o b o r n e n e i n 1 5 % o v e r a l l y i e l d . M e t h o d s a r ea v a i l a b l e ( B a n t h o r p e & B a x e n d a l e , 1 9 7 0 ) f o r t h ef u r t h e r d e g r a d a t i o n o f c o m p o u n d ( X ) .

R a d i o c h e m i c a l m e t h o d s

T h e p r o c e d u r e s a n d t h e c o u n t i n g s t a t i s t i c s u s e dh a v e b e e n d e s c r i b e d i n d e t a i l ( B a n t h o r p e e t a l . , 1 9 7 2 b ) .A l l t r a c e r - c o n t a i n i n g m a t e r i a l s w e r e a s s a y e d a s s o l i d st h a t h a d b e e n r e c r y s t a l l i z e d ( u s u a l l y t h r e e t i m e s ) t oc o n s t a n t s p e c i f i c r a d i o a c t i v i t y . 0 C - [ ' 4 C , 3 H ] P i n e n e w a sc o u n t e d a s t h e a d d u c t w i t h 2 - t h i o a c e t i c a c i d , w h e r e a s_ - [ 1 4 C ] p i n e n e w a s p u r i f i e d b y g . l . c . a n d t . l . c . t e c h -

n i q u e s a n d t h e n w a s o x i d i z e d a n d c o u n t e d a s t h e( s o l i d ) p i n o n i c a c i d .

T y p i c a l l y 3 0 - 1 0 0 m g s a m p l e s o f l a b e l l e d m a t e r i a lw e r e a s s a y e d , c o n t a i n i n g 5 0 0 - 5 0 0 0 d . p . m . a b o v e

b a c k g r o u n d .

We a r e g r a t e f u l t o D r . D . B a r n a r d ( N a t u r a l R u b b e rP r o d u c e r s R e s e a r c h A s s o c i a t i o n , W e l w y n G a r d e n C i t y ,H e r t s . , U . K . ) f o r a d v i c e a n d t o D r . G . A y r e y ( Q u e e nE l i z a b e t h C o l l e g e , L o n d o n ) f o r h e l p w i t h r a d i o c h e m i c a lt e c h n i q u e s . We a l s o t h a n k D r . D . B a x e n d a l e , M i s s C a r o lV o l l e r a n d M r . C . G a t f o r d f o r h e l p w i t h c e r t a i n e x p e r i -m e n t s ,

a n d U n i l e v e r L t d . ( L o n d o n ) f o r p r o v i d i n g as t u d e n t s h i p f o r G . N . J . L e P .

R e f e r e n c e s

A r c h e r , B . L . , B a r n a r d , D . , C o c k b a i n , E . G . , C o r n f o r t h ,J . W . , C o r n f o r t h , R . H . & P o p j i k , G . ( 1 9 6 6 ) P r o c . R o y .S o c . S e r . B 1 6 3 , 5 1 9 - 5 2 3

B a e y e r , A . ( 1 8 9 6 ) B e r . D e u t . C h e m . G e s . 2 9 , 1 - 2 6B a n t h o r p e , D . V . & B a x e n d a l e , D . ( 1 9 7 0 ) J . C h e m . S o c . C

2 6 9 4 - 2 6 9 7B a n t h o r p e , D . V . & W h i t t a k e r , D . ( 1 9 6 6 ) C h e m . R e v .

6 6 , 6 4 3 - 6 5 6

B a n t h o r p e , D . V . & W i r z - J u s t i c e , A . ( 1 9 6 9 ) J . C h e m . S o c .C 5 4 1 - 5 4 9B a n t h o r p e , D . V . , M a n n , J . & T u r n b u l l , K . W. ( 1 9 7 0 )

J . C h e m . S o c . C 2 6 8 9 - 2 6 9 3B a n t h o r p e , D . V . , C h a r l w o o d , B . V . & F r a n c i s , M. J . 0 .

( 1 9 7 2 a ) C h e m . R e v . 7 2 , 1 1 5 - 1 5 5

B a n t h o r p e , D . V . , L e P a t o u r e l , G . N . J . & F r a n c i s ,M. J . 0 . ( 1 9 7 2 b ) B i o c h e m . J . 1 3 0 , 1 0 4 5 - 1 0 5 4

B o r o w i e c k i , L . & C h r 6 t i e n - B e s s i e r e , Y . ( 1 9 6 7 ) B u l l . S o c .

C h i m . F r . 2 3 6 4 - 2 3 6 9B u e s s , C . M . , Y i a n n i o s , C . N . & F i t z g e r a l d , W. T . ( 1 9 5 7 )

J . O r g . C h e m . 2 2 , 1 9 7 - 2 0 0C r o t e a u , R . E . & L o o m i s , W. D . ( 1 9 7 2 ) P h y t o c h e m i s t r y

1 1 , 1 0 5 5 - 1 0 6 6

D u p o n t , C . ( 1 9 2 3 ) A n n . C h i m . ( F r a n c e ) 1 9 , 1 8 6 - 2 0 1F l a s c h k a , H . & B a r n a r d , A . J . ( 1 9 6 0 ) A d v a n . A n a l . C h e m .I n s t r u m . 1 , 1 - 1 1 7

G o u g h , D . P . & H e m m i n g , F . W. ( 1 9 6 7 ) B i o c h e m . J .1 0 5 , l O c - 1 2 c

G o u g h , D . P . & H e m m i n g , F . W. ( 1 9 7 0 ) B i o c h e m . J .1 1 7 , 3 0 9 - 3 1 7

H a n a c k , M. & H d h n l e , R . ( 1 9 6 2 ) C h e m . B e r . 9 5 , 1 9 1 -1 9 4

H e d r i c k , G . W. ( 1 9 5 9 ) U . S . P a t e n t 3 0 0 5 8 4 2 ; c i t e d i nC h e m . A b s t r . ( 1 9 6 2 ) 5 6 , 2 3 5 0

K h a r a s c h , N . ( 1 9 5 6 ) J . C h e m . E d u c . 3 3 , 5 8 5 - 5 9 1K i n n o r y , D . S . , T a k e d a , Y . & G r e e n b e r g , D . M. ( 1 9 5 5 )

J . B i o l . C h e m . 2 1 2 , 3 7 9 - 3 8 5

K o v a t s , E . S z . ( 1 9 6 3 ) H e l v . C h i m . A c t a 4 6 , 2 7 0 5 -2 7 3 1

K u g l e r , E . & K o v a t s , E . S z . ( 1 9 6 3 ) H e l v . C h i m . A c t a 4 6 ,1 4 8 0 - 1 5 1 3

L o o m i s , W. D . ( 1 9 6 7 ) i n T e r p e n o i d s i n P l a n t s ( P r i d h a m ,J . B . , e d . ) , p p . 5 9 - 8 2 , A c a d e m i c P r e s s , L o n d o n

N o r i n , T . & W e s t f e l t , L . ( 1 9 6 3 ) A c t a C h e m . S c a n d . 1 7 ,1 8 2 8 - 1 8 3 0

P o t t y , V . H . , M o s h o n a s , M. G . & B r u e m m e r , J . H . ( 1 9 7 0 )A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 1 3 8 , 3 5 0 - 3 5 2

R i c h a r d s , J . H . & H e n d r i c k s o n , J . B . ( 1 9 6 4 ) T h e B i o -

s y n t h e s i s o f S t e r o i d s , T e r p e n e s a n d A c e t o g e n i n s , p . 2 1 8 ,B e n j a m i n , New Y o r k

R u z i c k a , L . ( 1 9 5 3 ) E x p e r i e n t i a 9 , 3 5 7 - 3 6 7

S a n d e r m a n n , W. & S c h w e e r s , W. ( 1 9 6 2 ) T e t r a h e d r o n L e t t .2 5 7 - 2 5 8

1 9 7 2



BIOSYNTHESIS OF o c - P I N E N E 1 0 6 1

S a n d e r m a n n , W . , S c h w e e r s , W . , B r u n s , K . , S t o c k m a n n ,H . & B e i n h o f f , 0 . ( 1 9 6 8 ) B u l l . N a t . I n s t . S c i . I n d i a3 7 , 1 6 8 - 1 7 8

S i m o n s e n , J . L . ( 1 9 5 7 ) T h e T e r p e n e s , 2 n d . e d n . , v o l . 2 ,p p . 1 0 0 - 3 4 1 , C a m b r i d g e U n i v e r s i t y P r e s s , L o n d o n

S t a n l e y , R . G . ( 1 9 5 8 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 1 8 2 , 7 3 8 - 7 3 9

S t o n e , K . J .&

H e m m i n g , F . W. ( 1 9 6 7 ) B i o c h e m . J .1 0 4 , 4 3 - 5 6

S u t h e r l a n d , M. D . & W e l l s , J . W. ( 1 9 5 6 ) J . O r g . C h e m . 2 1 ,1 2 7 2 - 1 2 7 5

T h u r b e r , F . H . & T h i e l k e , R . C . ( 1 9 3 1 ) J . A m e r . C h e m .S o c . 5 1 , 1 0 3 2 - 1 0 3 6

V a l e n z u e l a , P . , C o r i , 0 . & Y u d e l e v i c h , A . ( 1 9 6 6 ) P h y t o -c h e m i s t r y 5 , 1 0 0 5 - 1 0 1 1

W o l f f , H . ( 1 9 4 6 ) O r g . R e a c t . 3 , 3 0 7 - 3 3 6Z a v a r i n , E . ( 1 9 7 0 ) P h y t o c h e m i s t r y 9 , 1 0 4 9 - 1 0 6 3

V o l . 1 3 0 3 4

biochemj00616-0162 a pinene synthesis

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