OPTIMALISATIE EN VALIDATIE VAN

MEERDERE REAL-TIME PCRS VOOR

DE DETECTIE EN DISCRIMINATIE

VAN BARTONELLA HENSELAE EN

BARTONELLA QUINTANA

Aantal woorden: 27.941

Lisa Van Reeth Stamnummer: 01270050

Promotor: Prof. dr. A. Van Landschoot

Copromotoren: Dr. M. Reynders

Dr. sc. P. Descheemaeker

Masterproef voorgelegd voor het behalen van de graad master in de richting Master of Science

in de industriële wetenschappen: biochemie

Academiejaar: 2016 - 2017

OPTIMALISATIE EN VALIDATIE VAN

MEERDERE REAL-TIME PCRS VOOR

DE DETECTIE EN DISCRIMINATIE

VAN BARTONELLA HENSELAE EN

BARTONELLA QUINTANA

Aantal woorden: 27.941

Lisa Van Reeth Stamnummer: 01270050

Promotor: Prof. dr. A. Van Landschoot

Copromotoren: Dr. M. Reynders

Dr. sc. P. Descheemaeker

Masterproef voorgelegd voor het behalen van de graad master in de richting Master of Science

in de industriële wetenschappen: biochemie

Academiejaar: 2016 - 2017

“De auteur en de promotoren geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te

stellen en delen van de scriptie te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt

onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting

de bron uitdrukkelijk te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie.”

“The author and the promoters give the permission to use this thesis for consultation and to

copy parts of it for personal use. Every other use is subject to the copyright laws, more

specifically the source must be extensively specified when using the results from this thesis.”

9 juni 2017

Auteur

Lisa Van Reeth

Copromotor

Dr. sc. P. Descheemaeker

Promotor

Prof. dr. A. Van Landschoot

Copromotor

Dr. M. Reynders

Voorwoord

Vanaf het begin, toen de aard van dit onderzoek werd geschetst, werd mijn interesse in het

moleculair werk meteen opgewekt. De afgelegde weg heb ik als zeer leerrijk en boeiend

ervaren. Enkele mensen speelden een cruciale rol gedurende het volledige proces, door mij

keer op keer zowel emotioneel als mentaal bij te staan. Graag zou ik van de gelegenheid

gebruik willen maken om hen te bedanken.

In de eerste plaats dr. sc. Patrick Descheemaeker, wiens inzicht en raadgevingen dit werk tot

een goed einde hebben gebracht. Hij begeleidde mij in het AZ Sint-Jan te Brugge en ik kon

telkens op hem rekenen als ik een probleem had.

Ook dank aan mijn interne promotor prof. dr. Anita Van Landschoot voor de vele aanwijzingen

en hulp bij het vervolledigen van deze masterproef.

Hartelijk dank aan dr. Marijke Reynders die, als onuitputtelijke bron van kennis en

enthousiasme, het mogelijk maakte om dit thesisonderzoek uit te voeren. Bedankt ook aan de

mensen van het labo moleculaire diagnostiek, met name Thomas Van Landschoot, Laurien

Hoornaert, Sofie Maton, Ellen Van Neder, Charlotte Vercamer en Rani Goderis, die veel tips

gaven en geduld hadden om een nieuweling op te leiden. Iedere dag zorgden ze voor een

goede sfeer tijdens het praktisch werk en stelden ze mij op mijn gemak door hun vriendelijkheid

en behulpzaamheid.

Tot slot wil ik mijn ouders, familie en vrienden bedanken om mij te steunen tijdens het volledige

proces. Ze geloofden in mij en hadden veel geduld en begrip maar gaven mij vooral de moed

om tot het uiterste te gaan. Ze hebben elk op hun manier een steentje bijgedragen aan het

eindresultaat.

Abstract

Bartonellose wordt veroorzaakt door Bartonella species en kent een wereldwijde verspreiding.

De kattenkrabziekte of cat scratch disease is de meest voorkomende ziekte en wordt

veroorzaakt door Bartonella henselae. Het typisch humane ziektebeeld bestaat uit huidletsels

en lymfadenopathie, maar er kunnen zich ook atypische ziektebeelden voordoen met een

waaier aan symptomen. Een ander species is Bartonella quintana die de verwekker is van de

loopgravenkoorts of trench fever. Er bestaat zowel een acute als chronische vorm van de

ziekte. Vroegtijdige vaststelling aan de hand van serologische testen blijft voor beide species

een uitdaging.

Het doel van dit onderzoek is het ontwikkelen en valideren van een in-huis dual-target detectie-

en differentiatiemethode aan de hand van een multiplex real-time polymerase chain reaction.

Initieel worden functionaliteit en specificiteit van in silico ontwikkelde primers geëvalueerd

a.d.h.v. smeltcurveanalyse met de SYBR® Select Mastermix en vervolgens worden de

bijkomende probes geëvalueerd in een real-time PCR met de TaqMan® Fast Virus 1-Step

Mastermix. Met oog op hogere detectiesnelheid wordt de gevoeligste en meest specifieke

multiplexsamenstelling per organisme geselecteerd en onderworpen aan een validatieplan. In

dit onderzoek werd geopteerd om twee duplex RT-PCRs toe te passen, nl. een generische

PCR voor de genus-specifieke Bartonella detectie op basis van het 16S rRNA gen

gecombineerd met Phocine herpesvirus-1 als interne extractie- en amplificatiecontrole en een

species-specifieke PCR voor de differentiatie tussen de twee meest voorkomende species B.

henselae en B. quintana op basis van de respectievelijke targetgenen pap31 en yopP.

Uit de validatie kon geconcludeerd worden dat een correcte staalname van uitermate groot

belang is, en het meest gevoelige staaltype voor Bartonella selectie door middel van

moleculaire techniek bleek klierbioptie of abcespunctaat te betreffen, idealiter in e-

swabmedium (Liquid Amies). Zeer etterige stalen kunnen resulteren in een iets lagere

gevoeligheid van de species-specifieke test terwijl de generische test gebaseerd op 16S rRNA

gen gevoeliger blijft. Beide duplex PCRs samen geven aldus aanleiding tot een goede

Bartonella diagnose met simultane speciesconfirmatie. Aanvullend confirmeerde 16S rRNA

sequentieanalyse de correcte speciesidentificatie.

Kernwoorden: Bartonella spp., real-time polymerase chain reaction, validatie, typering

English abstract

Bartonellosis is caused by Bartonella species and is spread worldwide. Cat scratch disease is

the most common disease and is caused by Bartonella henselae. The typical human symptoms

are skin lesions and lymphadenopathy, but atypical symptoms with clinical variation may also

occur. Another species is Bartonella quintana which is the cause of trench fever that occurs

both in an acute and chronic form. Early diagnosis with serological testing remains a challenge

for detection of both species.

The purpose of this research is to develop and validate an in-house dual-target detection and

differentiation method using a multiplex real-time polymerase chain reaction. Initially,

functionality and specificity of in silico developed primers are evaluated with the SYBR® Select

Mastermix for a melting curve analysis and subsequently the additional probes are evaluated

in a real-time PCR using the TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix. To achieve higher

detection rates, the most sensitive and most specific multiplex composition for each organism

is selected and validated according to plan. In this study, two duplex RT-PCRs were used, i.e.

a generic PCR for the genus-specific Bartonella detection based on the 16S rRNA gene

combined with Phocine herpesvirus-1 as internal extraction and amplification control and a

species-specific PCR for the differentiation between the most common species B. henselae

and B. Quintana based on the respective target genes pap31 and yopP.

From the results of the validation, it could be concluded that correct sampling is of utmost

importance and the most sensitive sample type appeared to be a ganglion biopsy or punction,

preferentially in e-swab medium (Liquid Amies). Samples with a lot of pus may result in a

slightly lower sensitivity of the species-specific test while the generic assay based on 16S rRNA

gene stays more sensitive. Both duplex PCRs cause a good Bartonella diagnosis with

simultaneous species confirmation. In addition, 16S rRNA sequence analysis confirmed the

correct species identification.

Keywords: Bartonella spp., real-time polymerase chain reaction, validation, typing

8

Inhoudsopgave Inleiding ................................................................................................................................14

1. Bartonella species .........................................................................................................15

1.1. Classificatie ............................................................................................................15

2. Bartonella henselae .......................................................................................................16

2.1. Kenmerken en eigenschappen ...............................................................................16

2.2. Epidemiologie .........................................................................................................18

2.3. Humaan ziektebeeld ...............................................................................................20

2.4. Behandeling en preventie .......................................................................................23

3. Bartonella quintana .......................................................................................................24

3.1. Kernmerken en eigenschappen ..............................................................................24

3.2. Epidemiologie .........................................................................................................25

3.3. Pathogenese ..........................................................................................................26

3.4. Therapie .................................................................................................................26

4. Moleculaire diagnostiek .................................................................................................28

4.1. Polymerase chain reaction .....................................................................................28

4.2. Real-time PCR .......................................................................................................29

4.2.1. Primers en probes ...........................................................................................30

4.2.2. Principe van fluorescentie ...............................................................................31

4.2.3. Niet-specifieke labels ......................................................................................32

4.2.4. Specifiek gelabelde probes .............................................................................33

4.2.5. Fluorescentie detectie .....................................................................................35

4.2.6. Interpretatie ruwe data ....................................................................................36

4.3. Sanger sequencing ................................................................................................38

4.3.1. 16S rRNA sequenering ...................................................................................39

5. Materiaal en methoden ..................................................................................................40

5.1. AmpliRun® Bartonella DNA-controles .....................................................................40

5.2. Extractieprotocol ....................................................................................................40

5.3. Ontwikkeling van specifieke primers en probes ......................................................40

5.4. Klinische stalen ......................................................................................................42

5.5. Real-time PCR .......................................................................................................42

5.5.1. SYBR® Select Mastermix ................................................................................42

5.5.2. TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix ............................................................43

5.6. Validatiecriteria .......................................................................................................46

5.6.1. Limit of detection (LOD) ..................................................................................46

5.6.2. Herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid .......................................................46

9

5.6.3. Juistheid ..........................................................................................................46

5.6.4. Interferentiestudie ...........................................................................................47

5.6.5. Bewaarcondities monstermateriaal ..................................................................48

5.7. Sanger sequencing ................................................................................................48

5.7.1. PCR-amplificatie .............................................................................................49

5.7.2. Agarosegelelektroforese .................................................................................50

5.7.3. DNA-sequentiebepaling ..................................................................................51

6. Resultaten en bespreking ..............................................................................................53

6.1. Selectie primers en probes .....................................................................................53

6.1.1. Bartonella spp. ................................................................................................53

6.1.2. Bartonella quintana .........................................................................................53

6.1.3. Bartonella henselae.........................................................................................53

6.2. Optimalisatie primers en probes aan de hand van uniplex PCR .............................53

6.2.1. Functionaliteit primers .....................................................................................53

6.2.2. PCR-efficiëntie ................................................................................................55

6.2.3. Smeltcurveanalyse ..........................................................................................57

6.2.4. Specificiteitscontrole........................................................................................58

6.2.5. Functionaliteit probe ........................................................................................59

6.2.6. Specificiteit probe ............................................................................................61

6.2.7. Primer/probeselectie .......................................................................................62

6.3. Multiplex PCR ........................................................................................................63

6.3.1. Efficiëntievergelijking .......................................................................................63

6.4. Validatie duplex PT-PCR ........................................................................................64

6.4.1. Limit of detection (LOD) ..................................................................................64

6.4.2. Herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid .......................................................65

6.4.3. Juistheid ..........................................................................................................67

6.4.4. Klinische stalen ...............................................................................................68

6.4.5. Specificiteit ......................................................................................................69

6.4.6. Bewaarcondities monstermateriaal ..................................................................70

6.5. Sanger sequencing ................................................................................................70

6.5.1. Identificatie m.b.v. 16S rRNA sequenering ......................................................71

Algemeen besluit ..................................................................................................................73

Bibliografische lijst ................................................................................................................75

Bijlagen ................................................................................................................................81

10

Lijst met afkortingen

A Adenine

BHQ Black-hole quencher

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

Bp Basenparen

C Cytosine

CCD Charge-coupled device

CT Threshold cycle

DNA Desoxyribonucleïnezuur

dNTP Deoxyribonucleotide trifosfaat

dsDNA Dubbelstrengig DNA (double-stranded DNA)

ELISA Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay

FRET Fluorescence resonance energy transfer

G Guanine

Hbp Hemin-bindende proteïnen

IFA Immunofluorescence assay

IgG Immunoglobuline G

IgM Immunoglobuline M

MGB Minor groove binder

NCBI National Center for Biotechnology Information

NFQ Nonfluorescent quencher

PCR Polymerase chain reaction

PhHV-1 Phocine herpesvirus-1

QCMD Quality Control for Molecular Diagnostics

qPCR Quantitative polymerase chain reaction

RBC Rode bloedcel

RFU Relatieve fluorescentie-eenheid

Rn Normalized reporter

RNA Ribonucleïnezuur

Rnase Ribonuclease

RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction

SHV Seal Herpesvirus

ssDNA Enkelstrengig DNA (single-stranded DNA)

T Thymine

Tm Smelttemperatuur (melting temperature)

UNG Uracil N-glycosylase

ΔG Gibbsvrije energie

11

Lijst met figuren

Figuur 1: Fylogenetische boom van de belangrijkste en meest bekende Bartonella species.

Figuur 2: Verloop van bartonellose in zoogdier als reservoirgastheer.

Figuur 3: Relatie tussen het voorkomen van B. henselae in katten en ouderdom van de kat.

Figuur 4: Klassieke symptomen van kattenkrabziekte bij de mens.

Figuur 5: Seropositiviteit (IgM en IgG) in relatie tot duur van het ziektebeeld veroorzaakt door

B. henselae bepaalt met (a) immunofluorescence assay (IFA) en (b) Enzyme-Linked Immuno

Sorbent Assay (ELISA) (n=44).

Figuur 6: Pediculus humanus corporis, de lichaamsluis (x120).

Figuur 7: Principe van polymerase chain reaction.

Figuur 8: Principe van fluorescentie (Thermo Fisher Scientific, 2015b).

Figuur 9: Werking SYBR® Green I (Global Health, 2014).

Figuur 10: Smeltcurven met bijhorende smeltpieken.

Figuur 11: Overzicht van de reporterdyes.

Figuur 12: Werking TaqMan® probe.

Figuur 13: Schematische weergave werking charge-coupled device (CCD) camera.

Figuur 14: Amplificatie plot met bijhorende termen.

Figuur 15: Voorstelling dNTPs en ddNTPs.

Figuur 16: Runprotocol voor een RT-PCR reactie met SYBR® Select Mastermix uitgevoerd op

het Applied Biosystems® ViiA™ 7 Real-Time PCR System (Life Technologies).

Figuur 17: Runprotocol voor een RT-PCR reactie met TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix

uitgevoerd op het Applied Biosystems® ViiA™ 7 Real-Time PCR System (Life Technologies).

Figuur 18: Schematisch overzicht van de stappen die werden gevolgd volgens de reeds

beschreven SOP om het 774 bp fragment van het 16S rRNA gen van stalen te sequeneren en

het betrokken micro-organisme te identificeren.

Figuur 19: Amplificatie plot van alle primerparen na toepassing van SYBR® Select Mastermix

op Vircell AmpliRun® Bartonella quintana.

Figuur 20: Amplificatie plot van primerpaar pap31 na toepassing van SYBR® Select Mastermix

op zesvoudige verdunning van Vircell AmpliRun® Bartonella henselae.

Figuur 21: Smeltcurve van primerpaar pap31 na toepassing van SYBR® Select Mastermix op

zesvoudige verdunning van Vircell AmpliRun® Bartonella henselae.

Figuur 22: Verschil tussen de amplificatie plot van 16S rRNA gene op mix 1 en 3 en positieve

Vircellcontrole.

Figuur 23: Multicomponent plot van de target 16S rRNA gene op de positieve Vircellcontrole,

negatieve controle en bacteriële mix 1-3.

Figuur 24: Verschil tussen de amplificatie plot en de multicomponent plot van beide duplex RT-

PCRs voor adenovirus en positieve controle Bartonella-plasmide (105).

Figuur 25: Controle PCR-amplificatie via agarosegelelektroforese.

Figuur 26: Het voorvallen van een dNTP-piek, grote roze piek, tijdens het sequeneren.

Figuur 27: Resultaat deel van het piekenpatroon van Vircell AmpliRun® Bartonella henselae

DNA-controle na uitvoering op het softwareprogramma SeqMan Pro (DNAstar).

file:///C:/Users/USER/Documents/Masterproef/Thesis/Masterproef_Lisa%20Van%20Reeth_volledige%20versie.docx%23_Toc483757356file:///C:/Users/USER/Documents/Masterproef/Thesis/Masterproef_Lisa%20Van%20Reeth_volledige%20versie.docx%23_Toc483757359

12

Lijst met tabellen

Tabel 1: Overzicht van de virulentiefactoren bij B. henselae, hun betekenis en omschrijving

van hun werking.

Tabel 2: Lijst van klinische abnormaliteiten veroorzaakt door B. henselae.

Tabel 3: Gehanteerde ontwikkelingscriteria voor primers.

Tabel 4: Gehanteerde ontwikkelingscriteria voor probes.

Tabel 5: Evaluatieparameters van RT-PCR.

Tabel 6: AmpliRun® Bartonella DNA-controles aangeschaft via de firma Vircell.

Tabel 7: Geselecteerde primers en probes specifiek voor de verschillende targetorganismen.

Tabel 8: Samenstelling mix voor één RT-PCR reactie met SYBR® Select Mastermix.

Tabel 9: Samenstelling mix voor één RT-PCR reactie met TaqMan® Fast Virus 1-Step

Mastermix.

Tabel 10: Samenstelling mix voor één duplex RT-PCR reactie met 16S rRNA gene en SHV

met TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix.

Tabel 11: Samenstelling mix voor één duplex RT-PCR reactie met yopP met pap31 met

TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix.

Tabel 12: Schema voor de verdunning van de mix gemaakt uit verschillende klinische stalen

positief voor B. henselae.

Tabel 13: De verschillende virussen en bacteriën die getest zijn om interferentie met de nieuwe

methode te onderzoeken.

Tabel 14: Overzicht timemanagement bewaarcondities voor validatie.

Tabel 15: Samenstelling van de AmpliTaq Gold PCR-mix voor één PCR-amplificatiereactie.

Tabel 16: Runprotocol om PCR-amplificatie uit te voeren met AmpliTaq Gold DNA polymerase.

Tabel 17: Runprotocol voor ExoSAP-IT voor de opzuivering van de PCR-producten.

Tabel 18: Samenstelling mastermix voor één sequentiereactie.

Tabel 19: Programma thermocycler voor de DNA-sequentiereactie.

Tabel 20: Efficiëntie van ieder primerpaar voor de respectievelijke Vircell AmpliRun® DNA-

controle.

Tabel 21: CT-waarden en efficiëntie van de overgebleven primerparen, één voor ieder

organisme, op het Bartonella-plasmide.

Tabel 22: Efficiëntie van ieder primers/probe voor de respectievelijke Vircell AmpliRun® DNA-

controle.

Tabel 23: Gemiddelde CT-waarden en efficiëntie van de primers/probe, één voor ieder

organisme, op het Bartonella-plasmide.

Tabel 24: Efficiëntie van zowel de duplex RT-PCRs als de primers/probe, één voor ieder

organisme uitgevoerd met TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix op het Bartonella-plasmide.

Tabel 25: Grove bepaling LOD.

Tabel 26: Herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid bepaald a. d. h. v. de variatiecoëfficiënt

(%CV).

Tabel 27: Overzicht BLAST-analyse van de finale sequentie van de stalen en positieve

controle.

13

Tabel 28: Overzicht klinische monsters en DNA-extracten AZ Sint-Lucas (Gent) als

referentiemateriaal met het resultaat van zowel AZ Sint-Lucas (Gent) als de nieuwe methode

met de beide duplex RT-PCRs van AZ Sint-Jan te Brugge.

Tabel 29: Overzicht klinische stalen AZ Sint-Jan (Brugge) met klinische vaststelling en

respectievelijke conclusie van de beide duplex RT-PCRs.

Tabel 30: Ruwe data (CT-waarden) RT-PCR-reactie met SYBR® Select Mastermix op beide

Vircell AmpliRun® DNA-controle in tweevoud.

Tabel 31: Ruwe data (CT-waarden) RT-PCR-reactie met SYBR® Select Mastermix op de

verdunningsreeks van Vircell AmpliRun® Bartonella quintana DNA-controle.

Tabel 32: Ruwe data (CT-waarden) RT-PCR-reactie met SYBR® Select Mastermix op de

verdunningsreeks van Vircell AmpliRun® Bartonella henselae DNA-controle.

Tabel 33: Ruwe data specificiteitscontrole (CT-waarden) RT-PCR-reactie met SYBR® Select

Mastermix op bacteriële mixen.

Tabel 34: Ruwe data (CT-waarden) RT-PCR-reactie met TaqMan® Fast Virus 1-Step

Mastermix op de verdunningsreeks van Vircell AmpliRun® Bartonella quintana DNA-controle.

Tabel 35: Ruwe data (CT-waarden) RT-PCR-reactie met TaqMan® Fast Virus 1-Step

Mastermix op de verdunningsreeks van Vircell AmpliRun® Bartonella henselae DNA-controle

en tweemaal op negatieve controle.

Tabel 36: Ruwe data specificiteitscontrole (CT-waarden) RT-PCR-reactie met TaqMan® Fast

Virus 1-Step Mastermix op bacteriële mixen.

Tabel 37: CT-waarden voor de efficiëntieberekening van de duplex RT-PCRs.

Tabel 38: Ruwe data (CT-waarden) van de beide duplex RT-PCR voor de bepaling van

herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid.

Tabel 39: CT-waarden van alle matrixen inclusief de referentie (1xTE-buffer) en de absolute

waarde van het verschil in CT-waarden tussen de referentie en de verschillende klinische

matrixen op de generische RT-PCR.

Tabel 40: CT-waarden van alle matrixen inclusief de referentie (1xTE-buffer) en de absolute

waarde van het verschil in CT-waarden tussen de referentie en de verschillende klinische

matrixen op de species-specifieke RT-PCR.

Tabel 41: Ruwe data (CT-waarden) specificiteitscontrole van de beide duplex RT-PCRs met

TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix op organismen aanwezig in klinische stalen en de

bacteriële mixen.

Tabel 42: Verder onderzoek voor de interferentiestudie op de bacteriële mixen, de bacteriële

culturen apart en het Human herpesvirus 6 (HHV-6).

Tabel 43: Resultaten CT-waarden onderzoek van de meest voorkomende bewaarcondities van

de staalflow binnen het AZ Sint-Jan te Brugge.

14

Inleiding

Bartonellose is een infectieziekte veroorzaakt door bacteriën van het geslacht Bartonella. De

bacterie kent een wereldwijde verspreiding en omvat een groot aantal species. Ze zijn elk op

zich, al dan niet accidenteel, veroorzakers van verschillende symptomen en ziektes bij zowel

mens als andere gastheren. De kattenkrabziekte, trench fever, de ziekte van Carrión,

endocarditis en lymfadenopathie zijn enkele voorbeelden van zo’n ziektes. Bartonella spp. zijn

facultatief intracellulaire bacteriën waarbij langdurige bacteriemie in hun reservoirgastheer

veelal het geval is. De bacteriële transmissie verloopt via een vector. Bij Bartonella spp. nemen

bloedzuigende insecten de rol van deze transmissie op zich (Jacomo et al., 2002; Müller et al.,

2016; Simard, 2015).

De kattenkrabziekte of cat scratch disease is veruit de meest voorkomende humane ziekte

gelinkt aan Bartonella, specifiek veroorzaakt door Bartonella henselae. Hoofdzakelijk worden

katten aangeduid als het reservoir voor de bacterie, zonder enige klinische en pathologische

aspecten te vertonen. Ook honden en hun vlooien, de kattenvlo, teken en andere

geleedpotigen kunnen een rol spelen in de epidemiologie. Huidletsels ter hoogte van de

handen en opzwellen van klieren zijn typische symptomen die gepaard gaan met de ziekte. Er

kunnen zich ook atypische ziektebeelden voordoen die sterkt variëren op klinisch vlak (Chomel

et al., 2006).

Bartonella quintana is een ander species van het overkoepelend geslacht Bartonella en is de

verwekker van de loopgravenkoorts of trench fever. Tot nog toe is enkel de mens aangeduid

als reservoir/gastheer voor deze bacterie. De lichaamsluis is aangewezen als vector voor de

transmissie van mens op mens. Er bestaat zowel een acute als chronische vorm van de ziekte,

elk met hun pathofysiologie (Rolain et al., 2004).

Vroegtijdig vaststellen van de ziekte blijft een uitdaging, maar door de ontwikkeling van

moleculaire detectiemethoden wordt de diagnose vergemakkelijkt. In het kader van deze

thesis werden moleculaire detectiemethodes voor de opsporing van B. henselae en B.

quintana gevalideerd en uitvoerig besproken. Het doel van het onderzoek is het ontwikkelen

van een brede en gevoelige in-huis methode voor het opsporen van Bartonella henselae en

Bartonella quintana in verschillende matrices.

De primers worden als eerste geoptimaliseerd met de SYBR® Select Mastermix. Daarna

worden de probes geoptimaliseerd en mogelijke samenstellingen uitgeprobeerd met de

TaqMan® Fast Virus 1-Step Mastermix. Uit deze resultaten zal de gevoeligste

multiplexsamenstelling per organisme geselecteerd worden. Tot slot wordt een

speciesconfirmatie van de bacterie uitgevoerd aan de hand van 16S rRNA sequenering.

Deze scriptie omvat verschillende hoofdstukken. Als eerste worden Bartonella spp., B.

henselae en B. quintana aangehaald waarbij een korte achtergrond wordt geschetst. Ook de

moleculaire methoden gehanteerd tijdens het praktisch werk worden nader toegelicht. In een

volgend hoofdstuk worden de gebuikte materialen en de gevolgde methoden behandeld.

Hierna volgen de resultaten van de optimalisatie, validatie en typering. Tot slot kan een

algemeen besluit gevormd worden betreffende de nieuw ontwikkelde methode.

15

1. Bartonella species

In volgend citaat van Robert Koch (1878) wordt vermeld dat er in normaal steriele sites geen

bacteriën gedetecteerd kunnen worden in gezonde personen of dieren. “I have, on many

occasions, examined normal blood and normal tissues using methods that ensure that such

organisms are not overlooked, and I have never, in a single instance, found bacteria. I therefore

conclude that bacteria do not occur in the blood or tissues of healthy animals or humans”.

Bartonella blijkt echter een uitzondering te zijn op deze regel. Er werden gevallen

waargenomen in zowel mensen als dieren zonder enige klinische symptomen waarbij

Bartonella toch aanwezig was. Voorbeelden zijn stammen van B. henselae en B. quintana die

in erythrocyten van respectievelijk katten en mensen werden teruggevonden (Jacomo et al.,

2002).

Bartonella species worden wereldwijd verspreid gevonden en sommigen van hen worden

gezien als opkomende en verontrustende (“emerging”) ziekteverwekkers. Mensen worden

grotendeels accidenteel besmet aangezien de bacterie vooral in reservoirgastheren zoals

honden en katten wordt teruggevonden. Dit zijn huisdieren die dicht bij de mens staan maar

die vaak zelf geen symptomen vertonen. Dit is een unieke eigenschap van Bartonella. De

bacteriën gebruiken een groot aantal zoogdieren als reservoirgastheren en diverse

geleedpotigen, zoals vlooien, luizen, mijten en teken, als vectoren (Jacomo et al., 2002; Müller

et al., 2016).

1.1. Classificatie

Alle Bartonella species zijn aeroob, Gramnegatief, facultatief intracellulair, staafvormige

bacteriën die zowel ziektes bij mens als dier veroorzaken. Ze behoren tot de klasse van de

alphaproteobacteria onder de orde Rhizobiales en tot de familie Bartonellaceae. Momenteel

zijn 31 soorten Bartonella beschreven waarvan ten minste 13 pathogeen zijn voor mensen

(Kaiser et al., 2011).

Figuur 1 geeft de fylogenese weer van de belangrijkste Bartonella spp. (Simard, 2015). Alle

species zijn nauw verwant met meer dan 98% homologe sequenties in het 16S rRNA en leiden

doorgaans tot aanhoudende en terugkerende bacteriemie (Jacomo et al., 2002). Hoofdzakelijk

zijn zoogdieren de reservoirgastheren en kan transmissie plaatsvinden door bloedzuigende

geleedpotigen. Incidentele besmetting kan door contact met de besmette geleedpotige, hun

uitwerpselen of met het besmette dier zelf. De twee meest prominente soorten in Europa zijn

Bartonella henselae, verwekker van de kattenkrabziekte, en Bartonella quintana, gekend voor

de loopgravenkoorts of 5-dagenkoorts (Müller et al., 2016). Daarom zullen deze twee species

uitvoerig besproken worden.

16

Figuur 1: Fylogenetische boom van de belangrijkste en meest bekende Bartonella species. Deze fylogenetische boom,

volgens Engel et al. (2011), is gebaseerd op de sequentie van 478 genoomgenen en vier house-keeping genes nl., rpoB, gltA,

ribC en groEL (aangepast uit Pulliainen & Dehio, 2012).

2. Bartonella henselae

Bartonella henselae is wereldwijd gekend als de verwekker van cat scratch disease of

kattenkrabziekte. In 1950 werd in Frankrijk de ziekte voor het eerst beschreven door Debré en

zijn collega’s maar pas in 1992 werd de bacterie, toen nog Rochalimaea henselae genoemd,

serologisch gelinkt aan de kattenkrabziekte. In dat jaar isoleerden Regnery et al. (1992) tot

tweemaal toe B. henselae uit het bloed van klinisch gezonde katten. Hierdoor werd snel een

link gelegd tussen het voorkomen van de ziekte en de kat als hoofdreservoir. Bij het toepassen

van immunofluorescence assay (IFA) werden door Regnery en zijn team antilichamen tegen

B. henselae gevonden in 88% van vermoedelijk geïnfecteerde patiënten. In 1993 isoleerden

Dolan et al. de verwekker van de ziekte uit de lymfeklieren van een patiënt (Chomel et al.,

2006; Margileth, 2000).

2.1. Kenmerken en eigenschappen

Pas in 1983 werd de bacterie voor het eerst microscopisch aangetoond. B. henselae behoort

tot de alphaproteobacteria en is een aerobe, oxidase-negatieve, traag groeiende, licht

gebogen, Gramnegatieve staaf. De gemiddelde lengte is 2 µm en 0,5-0,6 µm in breedte. De

bacterie beschikt niet over flagellen om zich voort te bewegen maar beschikt over pili die

bewegelijkheid verschaffen en aanhechting aan doelwitcellen mogelijk maken (Müller et al.,

2016). B. henselae heeft een onvolledige glycolyse waardoor glucose niet gebruikt kan worden

als energiebron. Ter compensatie worden aminozuren afgebroken om energie te verkrijgen

met verbruik van zuurstof en vorming van koolstofdioxide (Chenoweth et al., 2004). Het

17

kweken van de bacterie is niet eenvoudig ten gevolge van de traag groeiende eigenschap. Dit

bemoeilijkt het onderzoek (Margileth, 2000).

Binnen het species B. henselae worden minstens twee genotypen geïdentificeerd nl., Houston

1 en Marseille, elk dominant in een verschillende kattenpopulatie. Het eerste type wordt vooral

teruggevonden in Azië, vooral in Japan en de Filipijnen. Het voorkomen van het tweede type

is in Australië, het westen van de Verenigde Staten en West-Europa. Echter het

overheersende type kan ook variëren binnen eenzelfde kattenpopulatie. Zo zijn in Australië en

West-Europa het Marseille type dominant maar wordt ook het andere type frequent

gerapporteerd als oorzaak van kattenkrabziekte. Er wordt gesuggereerd dat stammen van het

type Houston 1 virulenter zijn voor de mens dan het Marseille type (Chomel et al., 2006). Van

Houston 1 zijn er twee stammen gedeponeerd in de ATTC-bank namelijk B. henselae Houston

1 ATCC 49882 en gemodificeerde Bartonella adhesine A-negatieve stam B. henselae Houston

1 ATCC 49882. Het Marseille genotype heeft enkel de referentiestam URLLY8 verkregen bij

het Instituut voor Medische Microbiologie en Infectiecontrole (Müller et al., 2016).

B. henselae scheidt verschillende virulentiefactoren af (Tabel 1) waardoor de bacterie

ziekteverwekkend wordt voor de mens. Deze helpen ook mee om te ontsnappen aan het

immuunsysteem van de gastheer. Anderzijds wordt de bacterie voorzien van nutriënten via de

gastheer. B. henselae beschikt over mechanismen om die bepaalde voedingsstoffen te

verkrijgen en zo zijn metabolisme in stand te houden (Pulliainen & Dehio, 2012).

Tabel 1: Overzicht van de virulentiefactoren bij B. henselae, hun betekenis en omschrijving van hun werking (Kaiser et

al., 2011; Pulliainen & Dehio, 2012; Simard, 2015).

Virulentiefactor Betekenis Omschrijving

BadA Bartonella adhesine

A

Onderdeel van de trimerische

autotransporter adhesines (TAA). Centrale

functie is adhesie aan gastheercellen.

Veroorzaken auto-aggregatie, binding aan

extracellulaire matrix en celoppervlak.

BepA-G Bartonella

effectorproteïne

BepC, BepF en BepG reorganiseren het

actinenetwerk waardoor de bacterie in

endotheelcel wordt opgenomen. BepA

inhibeert apoptose van endotheelcel.

Deformine Deformatiefactor Hydrofobe molecule betrokken bij de

invasie van RBC door het induceren van

kanalen in het membraan van RBC.

HbpB-E Hemine-bindende

proteïne B-E

Rol bij ijzerwinning.

IalA/ialB Invasiegeassocieerde

locusproteïne A en B

Buitenste membraancomponent betrokken

bij invasie van RBC. IalA is een nucleoside

fosfaathydrolase.

18

LPS Lipopolysaccharide Essentieel buitenste membraancomponent

met zeer lage endotoxiciteit. Zwakke

herkenning door toll-like receptor 4 (TLR4).

OMP43 Buitenste

membraanproteïne

Staat in voor de binding aan

endotheelcellen.

Pap31 Fibronectine-

bindende adhesine

Bindt BadA aan fibronectine en staat in

voor de ijzerwinning. Ook hemine-bindende

proteïne A (hbpA) genoemd.

Trw-T4SS complex Type IV

secretiesysteem

(T4SS)

Draagt bij tot de binding aan RBC en

endotheelcellen.

VirB/D4 T4SS Type IV

secretiesysteem

Zorgt voor de opname van de bacterie in

de endotheelcellen en remming van

apoptose van de endotheelcellen.

2.2. Epidemiologie

Kattenkrabziekte, ook al doet de naam anders vermoeden, wordt niet enkel door katten en

katachtigen veroorzaakt. Er zijn gevallen waarbij honden, en zeer zelden ook konijnen of

andere knaagdieren de bacteriële infectie overbrengen op de mens. DNA van B. henselae

werd gedetecteerd in enkele zieke honden die klinische abnormaliteiten vertoonden. Meestal

worden honden accidenteel besmet met B. henselae waardoor ze ook een infectiebron voor

mensen kunnen zijn (Chomel et al., 2006; Kaiser et al., 2011). Er wordt gesuggereerd dat de

bacterie ook via teken overgedragen kan worden aangezien het DNA van B. henselae

gedetecteerd werd tijdens het onderzoeken van teken uit Noord-Amerika, Oost- en Centraal-

Europa (Kaiser et al., 2011).

Besmetting met B. henselae gebeurt doorgaans door een intra- of subcutane inoculatie van

vlooienfaeces via kattenklauwen. Daarna zal een lag-fase plaatsvinden waar de bacterie zich

aanpast aan de gastheer en zich vermenigvuldigt. Enkele dagen na de infectie zal de bacterie

zich vanuit de primaire niche naar de bloedbaan verspreiden. De tijdspanne van verspreiding

kan een verklaring bieden aan het laat detecteren van de bacterie in het bloed. Kenmerkend

is een sterke stijging van het aantal bacteriën in de rode bloedcel na enkele dagen. Het

precieze migratieverloop is nog niet volledig onderzocht maar zou bestaan uit drie stappen nl.,

adhesie, invasie en intravacuolaire vermenigvuldiging (Figuur 2). Het prolifereren binnen de

rode bloedcel zal een plateau bereiken waarna de rode bloedcel afsterft. Tijdens een

bloedmaal kan de vector besmet raken en vervolgend een andere reservoirgastheer infecteren

(Simard, 2015).

19

Figuur 2: Verloop van bartonellose in zoogdier als reservoirgastheer. Na de eerste inoculatie door vlooienfaeces via krassen

van een kattenklauw in de huid, verblijft de bacterie in een tot nog toe raadselachtige primaire niche. Deze toestand vertaalt zich

in de lag fase (lag phase). Na enkele dagen is een snelle stijging van het aantal bacteriën in de bloedbaan vast te stellen (1).

Hierbij vindt er adhesie plaats van de bacterie aan RBC gevolgd door invasie of binnendringen in RBC. De bacterie vermeerdert

in de RBC tot een stationair aantal wordt bekomen. Dit herhaalt zich verschillende malen (2-4) tot het moment dat een specifieke

antilichaamrespons de invasie in RBC blokkeert en zo ook de infectie tegenwerkt. Na een slapende fase van enkele weken tot

maanden (dormant phase) is het mogelijk dat de bacterie zich opnieuw manifesteert met een nieuwe bacteriële piek als resultaat

(5). Vermoedelijk komt dit door een klonale expansie van antigeen en/of fasevarianten die in de bloedbaan aanwezig zijn onder

de vorm van de primaire niche. Tijdens het verloop is transmissie van de ene naar de andere gastheer mogelijk via bloedzuigende

geleedpotigen, voornamelijk vlooien (Pulliainen & Dehio, 2012).

De kat wordt gezien als het hoofdreservoir voor B. henselae en is de belangrijkste verwekker

van het ziektebeeld bij de mens. De kat zelf ondervindt geen last van de bacterie die zich heeft

aangepast zodat ze kan overleven in de gastheer, en aldaar kolonisatie geeft. Door dit

commensalisme zal de langdurige bacteriële infectie niet merkbaar zijn bij de geïnfecteerde

kat. Doorgaans zijn katten slechts een week tot een maand besmettelijk maar volgens Chomel

et al. (2006) zijn er gevallen gerapporteerd waarbij een periode van langer dan één jaar wordt

aangehaald. Vaak speelt de leeftijd van de kat een rol in het risico op besmetting (Margileth,

2000). Een infectie oplopen door een krab of beet van jonge katten, jonger dan één jaar, is

meer waarschijnlijk dan door oudere katten (Figuur 3). In Nederland bijvoorbeeld wordt de helft

van de katten, meestal in de eerst 6 levensmaanden, besmet met de bacterie (Bergmans et

al., 1997). Ook de levenswijze van de kat is een aspect waar rekening mee moet gehouden

worden. Straatkatten zijn vaak een grotere bron van infectie dan huiskatten. Aangezien de

eerste groep geen adequate verzorging krijgt is de kans op het hebben van vlooien groter en

dus ook de kans op besmetting met B. henselae (Chomel et al., 2006). De bacteriële infectie

kan niet overgedragen worden door geslachtsgemeenschap noch verticaal door

zwangerschap. Andere katachtigen zoals cheeta, poema, panter en leeuw, testten positief

voor B. henselae (Jacomo et al., 2002).

20

Figuur 3: Relatie tussen het voorkomen van B. henselae in katten en ouderdom van de kat (Azzag et al., 2012). Er is een

duidelijk verband tussen de leeftijd van de kat en de kans op besmetting. Katten jonger dan één jaar dragen meer bij tot

bacteriemie dan oudere katten. Als de kat de leeftijd van 36 maanden en ouder heeft bereikt, is er geen spoor meer van B.

henselae. M.a.w. hoe jonger de kat, hoe groter de kans op een bacteriële infectie met B. henselae. Er is nooit een verband

gevonden tussen de aanwezigheid van de bacterie in de kat en het geslacht of fysiologische status van de kat.

B. henselae wordt onderling tussen katten overgedragen door een vector nl., de kattenvlo

(Ctenocephalides felis). Vermoedelijk wordt een huidwonde van de kat met besmette

vlooienfaeces geïnfecteerd. Deze kat kan door middel van een kattenklauw de bacterie

overdragen naar de mens en bartonellose bewerkstelligen. Ook kan rechtstreeks contact van

bloed van de gastheer met die van de vlo een mogelijke infectiemanier zijn. Een intra- of

subcutane inoculatie door een bloedzuigende vector wordt soms beschouwd als een

natuurlijke transmissieweg. B. henselae kan aanwezig zijn in de speekselklieren van C. felis

die tijdens een bloedmaal een infectie in de hand werkt, maar werd nog niet aangetoond.

Contaminatie van de op dat moment aanwezige huidwonde met vlooienfaeces is eerder te

begrijpen (Simard, 2015). Het direct overdragen van de ziekte via de vlo op de mens via

vlooienbeten is nooit experimenteel aangetoond en wordt vooral hypothetisch gestaafd

(Chomel et al., 2006).

In tegenstelling tot de kat, ondervindt de hond als gastheer een waaier aan klinische en

pathologische aspecten. De symptomen zijn te vergelijken met het menselijke ziektebeeld

voornamelijk, granulomateuze hepatitis, peliosis hepatitis van de lever en epistaxis

(neusbloeding) (Chomel et al., 2006).

Teken voeden zich met het bloed van mens en dier waardoor bacteriële besmetting kan

optreden. Dietrich et al. (2010) toonden aan dat in vier regio’s van Europa het DNA van B.

henselae in 40% van de tekenpopulatie aanwezig was. De link tussen een tekenbeet en het

optreden van de bacteriële infectie in mens en dier werd snel gelegd (Kaiser et al., 2011).

2.3. Humaan ziektebeeld

Meest voorkomend bij kattenkrabziekte is het ontstaan van een gering aantal rode papels 3

tot 10 dagen na de besmetting met B. henselae. Deze huidknobbeltjes kunnen overgaan in

vesikels die binnen 3 weken tot enkele maanden volledig verdwijnen zonder littekenweefsel.

21

Ze komen dikwijls voor op de handen aangezien de kattenkrab/-beet meestal op die plaats

gebeurt. Typerend is lymfadenopathie gekenmerkt door een nabije lymfeklierzwelling die

doorgaans 1 tot 3 weken na de inoculatie optreedt (Figuur 4). De klieren zijn meestal pijnloos

en 1 tot 5 cm groot. Soms kan de zwelling oplopen tot een grootte van 12 cm gepaard met

ettervorming. De locatie is meestal beperkt tot één regio nl., de plaats van besmetting. In het

algemeen verdwijnt de lymfadenitis binnen de 1 tot 4 maanden, uitzonderingen zijn gevallen

van 1 tot 3 jaar (Florin et al., 2008; Vermeulen et al., 2009).

Figuur 4: Klassieke symptomen van kattenkrabziekte bij de mens (Centers for Disease Control and Prevention, 2014).

Voornamelijk de handen komen in contact met de kat, de plaats waar de meeste huidknobbels worden vastgesteld. In een verder

stadium is lymfadenopathie of lymfeklierzwelling zeer typerend voor de ziekte en dit is een broeiplaats van B. henselae.

Atypische manifestaties worden bij circa 10% van de patiënten vastgesteld. De bacterie heeft

zich verspreid naar andere delen van het lichaam, vooral naar het orgaansysteem. In het

bijzonder worden de lever, de milt, het oog en centraal zenuwstelsel aangetast. Enkele

afwijkende symptomen staan opgelijst in Tabel 2. Na afweging van zowel klinische

bevindingen als een voorgeschiedenis met kattencontact, uitvoeren van specifieke

serologische testen, al dan niet aangevuld met PCR, kan een diagnose gesteld worden.

Mensen met zowel typische als atypische symptomen dienen niet in quarantaine gebracht te

worden aangezien de ziekte niet overdraagbaar is van mens op mens.

22

Tabel 2: Lijst van klinische abnormaliteiten veroorzaakt door B. henselae (Chomel et al., 2006; Vermeulen et al., 2009).

Symptoom

aanhoudende koorts van onbekende oorsprong

bacillaire angiomatosis (huidnodules)

peliosis hepatis (met bloed gevulde holtes in de lever)

granulomateuze hepatitis

hepatosplenomegalie (lever- en miltvergroting)

uveitis (inwendige oogontsteking)

neuroretinitis (ontsteking oogzenuw)

erytheem (roodheid)

glomerulonefritis (nierfilterontsteking)

endocarditis (ontsteking hartkleppen)

pneumonie (longontsteking)

hemolytische anemie

artritis of artralgie (ontsteking of pijnlijke gewrichten)

osteomyelitis (infectie van bot of beenmerg)

Het ziektebeeld veroorzaakt door B. henselae is afhankelijk van de onderliggende

immuunstatus van de gastheer. Deze status kan onderverdeeld worden in twee groepen nl.,

immunocompetente en immuungecompromitteerde patiënten.

In de eerste groep is de gastheer in staat om antistoffen aan te maken tegen de bacterie. De

infectie wordt dan meestal beperkt tot de huid en het goedaardig zwellen van de lymfeklieren,

lymfadenopathie genaamd. De huidzwelling (al dan niet met etter) ontwikkelt zich 3 tot 10

dagen na de aanvaring met de kat. Het opzetten van de lymfeklieren kan 1 tot 3 weken later

zichtbaar zijn en kan enkele weken tot maanden aanhouden. Frequent voorkomende

symptomen zijn verhoogde temperatuur, pijn, vermoeidheid en een onwel gevoel (Chomel et

al., 2006). Serologie toont aan dat er productie van IgM en IgG optreedt als respons op de

infectie met B. henselae (Figuur 5). Eerst wordt IgM geproduceerd dat gewoonlijk binnen 100

dagen verdwijnt. IgG zal iets later een stijging tonen maar kan tot 2 jaar of langer meetbaar

blijven. Zo blijkt dat B. henselae een levenslange immuniteit kan teweegbrengen (Vermeulen

et al., 2009).

23

Figuur 5: Seropositiviteit (IgM en IgG) in relatie tot duur van het ziektebeeld veroorzaakt door B. henselae bepaalt met

(a) immunofluorescence assay (IFA) en (b) Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) (n=44). De datum van de eerste

klinische symptomen van 41 patiënten (44 sera) is gekend zodat de duur van het ziektebeeld opgevolgd kan worden. Ondanks

de kleine aantallen kan er een bepaald patroon in serologische positiviteit opgesteld worden. Bij IFA neem de IgM af na 8 weken

terwijl voor IgG er een piek werd vastgesteld op 6-8 weken. Dit patroon is niet terug te vinden bij ELISA voornamelijk te wijten aan

de lage gevoeligheid voor IgG (Vermeulen et al., 2007).

Bij immuungecompromitteerde patiënten heeft de gastheer een verzwakt immuunsysteem met

een grotere kans op infecties met vaak een ernstiger verloop. De bacteriële infectie beperkt

zich niet enkel tot de huid en lymfeklieren maar ook atypische symptomen kunnen zich

voordoen (Tabel 2). B. henselae is de oorzaak van langdurige koorts en/of aanhoudende

bacteriemie en systemische infectie met aantasting van diverse orgaansystemen vindt plaats

(Chomel et al., 2006; Vermeulen et al., 2009).

2.4. Behandeling en preventie

Bij patiënten met de klassieke knobbelvorming of lymfadenitis verdwijnen de symptomen

gewoonlijk zonder behandeling. Er werden verscheidene studies uitgevoerd om antibiotica als

therapie toe te passen en het effect te bestuderen. De meeste studies concludeerden dat B.

henselae niet adequaat reageert op de antibiotica maar enkelen gaven toch in vivo een effect

weer. Margileth (1992) testte de duur van de symptomen bij 268 patiënten met

kattenkrabziekte. De gemiddelde duur bij met antibiotica behandelde en niet behandelde

patiënten is respectievelijk 2,8 weken en 14,5 weken, dus toch significant verschillend. Tijdens

de studie werden verschillende antibiotica onderzocht waaruit rifampicine, ciprofloxacine,

gentamicine en trimethoprim-sulfamethoxazol (TMP-SMX) effectief bleken te werken tegen de

kattenkrabziekte met een range van 58% tot 87%. De niet behandelde patiënten werden in

iedere studie een placebo toegediend om een vergelijking te kunnen uitvoeren met de

behandelde patiënten. Een andere studie (Arisoy et al., 1999) toonde het verschil aan tussen

het gebruik van rifampicine, eventueel in combinatie met andere antibiotica, en gentamicine of

TMP-SMX. Bij de eerste groep van patiënten werd na 1 tot 5 dagen na de inname verbetering

van het ziektebeeld vastgesteld. Bij de tweede groep, met gentamicine of TMP-SMX, werd de

verbetering na 3 tot 4 dagen opgemerkt. Opmerkelijk is dat de aanbevolen behandeling met

azithromycine in één enkele studie (Rolain et al., 2004) wordt geëvalueerd als zijnde een

goede therapie. Er kan gesteld worden dat de keuze van de juiste (combinatie van) antibiotica

voor de behandeling van B. henselae voor ieder individu verschillend is, wat het vaak voor de

behandelende clinicus erg moeilijk maakt, naast het feit dat het geduld op de proef wordt

24

gesteld alvorens opklaring van de symptomen. Vaak reageren immuungecompromitteerde

patiënten onverwacht zeer goed op de antibiotica in vergelijking met de immunocompetente

mensen (Florin et al., 2008; Prutsky et al., 2013).

Het onder controle houden van vlooien op zowel katten als honden is een goede preventie

tegen kattenkrabziekte. Het verwijderen van de klauwen of regelmatig knippen van nagels van

jonge katten wordt ook voorgesteld. Andere mogelijke maatregelen zijn katten niet buiten laten,

vlooiencontrole, wassen van handen na contact met katten voornamelijk kittens, correcte

handeling van de kattenbak en na beten of krabben de wonde schoonmaken met water en

zeep (Margileth, 2000).

3. Bartonella quintana

Bartonella quintana is algemeen gekend als de verwekker van de loopgravenkoorts of trench

fever. Naast deze acute vorm van infectie met B. quintana bestaat ook een tweede, chronische

vorm die gedetecteerd werd bij immunocompetente personen. Tot nog toe is de mens het

enige reservoir voor de bacterie en de lichaamsluis, Pediculus humanus corporis, zorgt voor

het overdragen van patiënt op patiënt (Rolain et al., 2004).

DNA van B. quintana werd gedetecteerd in de pulpa van een 4000 jaar oude man (Drancourt

et al., 2005). In Litouwen identificeerden Raoult et al. (2006) het DNA van de bacterie in luizen

gevonden in graven van soldaten van Napoleon. Hierdoor werd gesuggereerd dat vele

soldaten geïnfecteerd waren met B. quintana. De naam van de acute vorm van de ziekte,

namelijk loopgravenkoorts, kwam er toen tijdens de Eerste Wereldoorlog zowel geallieerden

als Duitse troepen getroffen waren door de ziekte. Tijdens de twee wereldoorlogen, met name

in Rusland en op de Oost-, Midden- en West-Europese fronten, wordt geschat dat wereldwijd

enkele miljoenen mensen leden aan de ziekte. Na Wereldoorlog II namen incidenten van de

loopgravenkoorts steeds meer af. Tot in 1990 de ziekte terug de kop kwam opsteken vooral

bij dakloze mensen in ontwikkelde landen, die geconfronteerd worden met extreme armoede,

gebrek aan hygiëne én extreem lage temperaturen. De ziekte werd één van de belangrijkste

opduikende infectieziekten van de vroege jaren ’90 (Badiaga & Brouqui, 2012).

3.1. Kernmerken en eigenschappen

Bartonella quintana behoort, zoals B. henselae, tot de alphaproteobacteria en werd vroeger

Rochalimaea quintana genoemd. Het is een facultatief, intracellulaire, Gramnegatieve bacillus

die 0,3 tot 0,5 µm breed is en 1 tot 1,7 µm lang. Zowel katalase als oxidase is negatief

gebleken. De bacterie beschikt niet over flagellen maar wel over fimbria. Deze zijn korter en

dunner dan flagellen en zorgen voor de aanhechting aan andere bacteriën en aan dierlijke

cellen. Ze zijn enkel zichtbaar met een elektronenmicroscoop en kunnen recht of gebogen zijn.

Er zijn pili aanwezig die typerende spiertrekkingen veroorzaken voor de voortbeweging en die

zelf-aggregatie verwezenlijken. De bacterie haalt energie uit succinaat, pyruvaat en glutamaat

maar is niet in staat om glucose als energiebron te gebruikten. Net als B. henselae is B.

quintana een traag groeiende bacterie met bijgevolg moeizaam kweekbare kolonies. Slechts

12 tot 14 dagen na enten kunnen primaire isolaties gevonden worden en pas na een

25

incubatieperiode van 45 dagen kunnen isolaten verder gebruikt worden voor verscheidene

technieken. Daarom wordt het kweken van de bacterie niet routinematig toegepast waardoor

verder onderzoek bemoeilijkt wordt (Foucault, 2006; Thamawatanakul, 2010).

Vele bacteriële pathogenen zijn geëvolueerd zodat ze intussen heemverbindingen kunnen

accumuleren om hun ijzervoorraad op te bouwen. Er kan gesteld worden dat rode bloedcellen

of hemine-supplementen vereisten zijn om in vitro te kunnen groeien. De bacterie beschikt

over hemine-bindende proteïnen (Hbp), zoals bij B. henselae, die dienen als hemine-

receptoren (Thamawatanakul, 2010).

3.2. Epidemiologie

Bartonella quintana wordt vooral op de mens overgedragen door de lichaamsluis, Pediculus

humanus corporis (Figuur 6). De mens vormt het natuurlijk reservoir van de bacterie, die

resideert in de rode bloedcellen (Badiaga & Brouqui, 2012).

De lichaamsluis is afkomstig vanuit de hoofdluis, Pediculus humanus capitis, toen mensen

kleren begonnen te dragen. Beide luizentypes zijn eeuwenoude humane parasieten. De

lichaamsluis leeft onrechtstreeks in kleren van de mens en wordt geassocieerd met armoede,

gebrek aan hygiëne en koude weersomstandigheden. Door constant met mensen die luizen

met zich meedragen en hun kleren, wordt een luizenplaag of pediculose veroorzaakt. Dit komt

hoofdzakelijk voor bij de dakloze bevolking in grote steden (Badiaga & Brouqui, 2012), maar

tevens rapporten betreffende B. quintana infecties die prevalent zijn in nieuwe populaties in

het Andesgebergte en in HIV-geïnfecteerden die niet adequaat worden opgevolgd.

Figuur 6: Pediculus humanus corporis, de lichaamsluis (x120) (Foucault, 2006). De luizen zitten op het lichaam van de mens

om zich zo van bloedmaaltijden te voorzien. Ze hechten zich ook vast aan kledij van de persoon in kwestie zodat contact de

verspreiding en het ontstaan van een luizenplaag vergemakkelijkt.

B. quintana vermenigvuldigt zich in de darm van de luis en wordt op de mens overgedragen

door uitwerpselen die door aangetaste huid migreren. Lichaamsluizen voeden zich tot wel

vijfmaal per dag met bloed. Hierbij worden eiwitten geïnjecteerd, waaronder een soort

verdovingsmiddel die een allergische reactie veroorzaakt met jeuk tot gevolg. Het krabben

brengt onvermijdelijk wondjes met zich mee die de fecale transmissie van de bacterie

26

vergemakkelijkt. De aanhoudende bacteriemie wordt bevorderd door voortdurende

verspreiding van de lichaamsluis (Foucault, 2006).

B. quintana werd ook reeds aangetoond in kattenvlooien en patiënten met lymfeklierzwelling

die een kat als huisdier hebben. Dit ligt in dezelfde trend als de transmissie van B. henselae.

Deze bevindingen suggereren dat ook andere vectoren de verspreiding van B. quintana, met

bijhorende symptomen, mogelijk maken (Foucault, 2006; Badiaga & Brouqui, 2012).

3.3. Pathogenese

Als een persoon geïnfecteerd is door B. quintana kan het even duren eer de ziekte tot uiting

komt. Dit door de lange incubatieperiode van 15 tot 25 dagen. De ziekte kan in twee vormen

voorkomen, een acute en chronische vorm (Badiaga & Brouqui, 2012).

De acute vorm, loopgravenkoorts in de volksmond, manifesteert zich door cyclisch

weerkerende hoge koorts (“relapsing fever”) die gewoonlijk 2 tot 4 dagen aanhoudt met

mogelijks terugval om de 4 tot 5 dagen. Ook hoofdpijn, duizeligheid, overgevoeligheid in het

scheenbeen en pijn in de spieren en rug zijn karakteristiek voor een primaire, acute infectie

met B. quintana. Het ziektebeeld kent geen continu verloop en wordt gekoppeld aan een

langdurig herstel tot enkele maanden. Hoewel dodelijke gevallen zeldzaam zijn, kan toch

gesteld worden dat de langdurige koorts secundair hartfalen met zich mee kan brengen

(Badiaga & Brouqui, 2012; Rolain et al., 2004).

Chronische bacteriemie is de andere vorm van infectie met B. quintana. In een studie in

Marseille werd bij 14% van de daklozen chronische B. quintana infectie gediagnostiseerd. Er

werd ook aangetoond dat de bacterie nog tot 8 jaar na infectie aanwezig kan zijn in het bloed

van de patiënt (Kostrzewski, 1949). Foucault et al. (2002) toonden aan dat 16 van de 24

patiënten geen ziekteverschijnselen vertoonden maar dat er wel een chronische bacteriemie

werd gedetecteerd. De ziekte bleef bij één van de patiënten 78 weken aanwezig, bij 2 andere

patiënten 53 en 17 weken en bij de overige 13 werd een range van 1 tot 8 weken vastgesteld.

Het linken van chronische bacteriemie aan endocarditis is nog niet volledig onderbouwd. Wel

werden in recente literatuur 38 van de 48 gevallen van endocarditis als gevolg van

Bartonellose toegeschreven aan B. quintana (Badiaga & Brouqui, 2012; Foucault, 2006).

3.4. Therapie

Vele gevallen van de loopgravenkoorts, voornamelijk de acute vorm, vonden plaats voor het

tijdperk van de antibiotica. De klinische manifestaties hielden 4 tot 6 weken aan gevolgd door

volledige genezing. De beste remedie om de pijn te onderdrukken was aspirine. Tijdens de

Tweede Wereldoorlog werden soldaten met trench fever vanuit ziekenhuizen naar een depot

verplaatst om te herstellen. Daar waren frisse lucht, goed gebalanceerd voedsel en

spierversterkende oefeningen om de zieke soldaten terug aan te sterken zodat ze snel terug

konden keren om hun plicht te vervullen. Ook tijdens Wereldoorlog I konden soldaten met B.

quintana infectie genezen zonder tussenkomst van enige antibioticakuur. Men rekende er toen

op dat een patiënt met loopgravenkoorts gemiddeld een 60-tal dagen ongeschikt zou zijn voor

zijn militaire taken. Na de wereldoorlogen kwamen verscheidene antibiotica ter beschikking en

27

werden deze middelen aan patiënten voorgesteld als therapie, hoewel daar geen specifieke

en overtuigende data van bestaan (Rolain et al., 2004).

Antibioticatherapie tegen de bestrijding van B. quintana blijft een uitdaging. De

voorgeschreven behandeling voor patiënten met chronische bacteriemie bestaat uit een

combinatie van gentamicine (3 mg/kg lichaamsgewicht intraveneus per dag) en doxycycline

(200 mg oraal per dag) gedurende 14 en 28 dagen respectievelijk. Patiënten met endocarditis

wordt een doxycyclinekuur van 42 dagen aangeraden om de genezing te versnellen (Badiaga

& Brouqui, 2012; Rolain et al., 2004).

28

4. Moleculaire diagnostiek

Voor de detectie en identificatie van Bartonella species wordt in dit werk de hieronder kort

beschreven moleculaire diagnostiek toegepast.

4.1. Polymerase chain reaction

Polymerase chain reaction (PCR) is een courante, moleculaire amplificatietechniek ontwikkeld

in 1983 door de Amerikaanse biochemicus Kary Mullis. Door deze techniek kunnen in korte

tijd kleine hoeveelheden DNA vermeerderd worden tot miljoenen kopijen.

Een DNA-doelwitstreng (=template) waaraan primers zijn verbonden dienen als basis voor

DNA-polymerasen om de template te verdubbelen of kopiëren. De te amplificeren sequenties,

targets genaamd, zijn uniek voor een bepaald micro-organisme. Verder dienen

deoxyribonucleotide trifosfaten (dNTPs) aanwezig te zijn die de bouwstenen vormen van het

amplicon. Dit betreft de basen thymine (T), adenine (A), cytosine (C) en guanine (G).

Een PCR-reactie bestaat uit drie specifieke stappen (Figuur 7).

1) Denaturatie

De PCR-mix wordt verwarmd tot 95°C om de waterstofbruggen in de dubbele helix van

het dsDNA te verbreken. Zo wordt enkelstrengig DNA (ssDNA) gevormd waarvan elke

streng op zich geamplificeerd kan worden.

2) Annealing

De annealingstemperatuur is afhankelijk van de smelttemperatuur (Tm) van de primers

(± 50-70°C, ongeveer 5°C onder Tm). Bij deze temperatuur kunnen de primers hechten

aan het complementair deel van het template-DNA.

3) Elongatie

De DNA-polymerase hecht zich op het 3’-uiteinde van de primer/template dubbelstreng

bij een optimale temperatuur van 72°C. De synthese van het amplicon start en verloopt

volgens complementariteit van de basenparen.

Na één cyclus is de targetsequentie verdubbeld. Het meerdere malen herhalen van de cyclus

laat toe het doelwit-DNA exponentieel te vermeerderen. Uiteindelijk bereikt de PCR een

plateau aangezien de activiteit van het polymerase daalt, de dNTPs uitgeput raken en de

reactie geïnhibeerd raakt door een overmaat aan amplicon. Theoretisch worden 2n kopijen van

het target-DNA gevormd, met n het aantal doorlopen cycli (Joshi & Deshpande, 2011; Julin,

2014).

29

Figuur 7: Principe van polymerase chain reaction (Jansma et al., 2014). De eerste stap bestaat uit de denaturatie van dsDNA

tot ssDNA. Vervolgens is de aanhechting van de primers aan de enkelstreng mogelijk bij een welbepaalde temperatuur, afhankelijk

van de gebruikte primers. Als laatste stap vindt er elongatie plaats waarbij DNA-polymerase zorgt voor de verlenging van de

streng zodat dsDNA wordt gevormd. Deze stappen worden een bepaald aantal keer herhaald waardoor een miljoenen kopijen

van het doelwit-DNA worden bekomen.

PCR is een snelle methode met goede gevoeligheid en specificiteit maar deze techniek kent

ook enkele nadelen. Er dienen correcte sequenties gekend te zijn om geschikte primers te

ontwikkelen. Visualisatie en evaluatie gebeurt door middel van gelelektroforese en er is echter

geen echte concentratiebepaling.

4.2. Real-time PCR

Kwantitatieve PCR (qPCR) of real-time PCR maakt het mogelijk om de hoeveelheid DNA of

RNA (na reversed transcriptie) te analyseren door tijdens het amplificatieproces de reactie te

meten. Er worden fluorescente probes of labels gebruikt om fluorescentieveranderingen te

detecteren.

Het verschil met de conventionele PCR ligt in het analyseren van het geamplificeerd DNA. Bij

de conventionele PCR kan pas na het beëindigen van de reactie via gelelektroforese een

beeldanalyse geëvalueerd worden: is er een bandje zichtbaar of niet. Hierdoor kan deze PCR-

methode omschreven worden als een kwalitatieve bepaling. Eventueel kan een semi-

kwantitatieve bepaling bekomen worden door de intensiteit van het bandje op de gel te

bestuderen. Bij real-time PCR is het mogelijk om, naast de kwalitatieve bepaling, ook een

kwantitatieve analyse te bekomen. Dit kan gerealiseerd worden door gebruik te maken van

fluorescente probes of labels. Na iedere cyclus zal het fluorescent signaal toenemen

proportioneel aan de hoeveelheid geamplificeerd product.

Een voordeel aan qPCR is dat zowel detectie als kwantificatie van het doelwit-DNA mogelijk

is in éénzelfde reactie. De verandering in fluorescentiesignaal is evenredig met de hoeveelheid

geamplificeerd product. Ook de accuraatheid en grote detectierange (lineair meetbereik) zijn

voordelen verbonden aan de techniek. Ook de kans op contaminatie door post-PCR-

handelingen kan voorkomen worden (Smith & Osborn, 2009).

Als er gebruik wordt gemaakt van RNA als template wordt de qPCR (RT-PCR) vooraf gegaan

door een reverse transcriptie stap. Deze twee termen worden door elkaar gebruikt. Het RNA

wordt door het enzym reverse transcriptase omgezet naar cDNA om vervolgens een PCR-

30

reactie op uit te voeren. Dit kan op twee verschillende manieren gebeuren met elk hun voor-

en nadelen. De voorafgaande stap kan samen met de qPCR in één en dezelfde reactietube

gebeuren en wordt dan one-step qRT-PCR genoemd. Er worden minder pipetteerstappen

gevergd waardoor een efficiëntere tijdsbesteding mogelijk is en ook is er geen contaminatie

tussen de twee verschillende reactiestappen. Maar doorgaans is deze methode minder

gevoelig. Als er wordt gewerkt in twee gescheiden reactiebuisjes wordt er gesproken van two-

step qRT-PCR. Het is een meer flexibele methode waarbij de keuze van de primers meer

gevarieerd is en er mogelijkheid is tot stockeren van cDNA om meerdere doelwitstrengen te

kwantificeren. Negatief is de invloed van Rnase inhibitoren op de eigenlijke PCR-reactie

(Vandesompele, 2013).

4.2.1. Primers en probes

Een PCR-reactie valt of staat met goed ontworpen primers. Er is zowel een forward als reverse

primer nodig om de amplificatie te vervolledigen. Primers zijn ssDNA oligonucleotiden

complementair aan de begin- en eindsequentie van het targetgenoom. Tijdens het ontwerpen

van het primerpaar, met forward- (fw) en reverse (rv) primer moeten volgende voorwaarden

(Tabel 3) in acht genomen worden.

Tabel 3: Gehanteerde ontwikkelingscriteria voor primers (Pestana et al., 2010; Vandesompele, 2013).

Criterium Uitleg

Kruis homologie Te vermijden, primersequentie moet idealiter uniek zijn voor targettemplate

Lengte 18 tot 25 basen

GC-inhoud 40 tot 60%, verdeeld over de primersequentie

GC klem 2 tot 3 GC-nucleotiden aan 3’-uiteinde van de primer zorgt voor hogere templatebindingsspecificiteit.

Tm 55 tot 60°C, afhankelijk van de nucleotidensequentie Als Tm te hoog, dan is er neiging om secundaire structuren te vormen. Het verschil in Tm tussen fw en rv primer maximaal 5°C, anders bestaat de kans dat er geen amplificatie optreedt.

Secundaire structuren Door intra- of intermoleculaire interacties bij de primers die niet meer (of inefficiënt) aanhechten aan de template. Dit geeft aanleiding tot lagere productopbrengst. Voorbeelden zijn: - Hairpin/loop: complementaire basen in de primer waarbij een lus wordt gevormd - Self-dimer: twee gelijke primers hybridiseren met elkaar (fw-fw / rv-rv) - Cross-dimer: twee verschillende primers hybridiseren met elkaar (fw-rv)

Di-nucleotiderepetities Meer dan vier herhalingen van di-nucleotiden vermijden, bv. CTCTCTCT , gezien verhoogde kans op aspecificiteit

Nucleotiderepetities Meer dan vier herhalingen van gelijke nucleotiden vermijden, bv. AAAAA, gezien verhoogde kans op aspecificiteit

De probes worden gesynthetiseerd op basis van de sequenties die worden afgebakend

door het primerpaar. Ze dienen ook aan bepaalde voorwaarden (Tabel 4) te voldoen

vooraleer de PCR-reactie goed kan verlopen.

31

Tabel 4: Gehanteerde ontwikkelingscriteria voor probes (Pestana et al., 2010; Vandesompele, 2013).

Criterium Uitleg

Lengte 18 tot 30 baseparen Langer dan 30 basen mogelijk, maar dan kan de quencher best in de probe geplaatst worden (en niet aan 3’ einde) op minder dan 18 tot 25 basen van de reporter

%GC 30 tot 80%

Tm 8 tot 10°C hoger dan Tm van de primers

Hybridisatielocatie Probe zo dicht mogelijk bij primers aanhechten, zonder overlap, om snelle detectie mogelijk te maken

Te vermijden - Mismatchen tussen probe en template - Repetities van eenzelfde nucleotide, vooral G - G op het 5’ einde aangezien deze base een quencherfunctie heeft die reporterfluorescentie zal doen afnemen

4.2.2. Principe van fluorescentie

Fluorescentie is een verschijnsel waarbij energie met een bepaalde golflengte door een

molecule wordt geabsorbeerd en terug uitgezonden met een langere golflengte. De excitatie-

energie zal elektronen van grondtoestand laten overgaan naar een schil met hoger

energieniveau. Dit is de aangeslagen of geëxciteerde toestand van een elektron. De stabiliteit

van deze toestand is laag waardoor het elektron terugkeert naar de grondtoestand. Hierbij zal

energie geëmitteerd worden onder de vorm van warmte of licht. In het laatste geval wordt van

fluorochromen gesproken en kan een fluorescentiespectrum ontstaan. Hierbij bestaat het

uitgezonden licht uit verschillende golflengtes als gevolg van de verschillende vibratieniveaus

met verschillende hoeveelheden emissie-energie (Lakowicz, 2013; Valeur & Berberan-Santos,

2012).

Figuur 8: Principe van fluorescentie (Thermo Fisher Scientific, 2015b). De blauwe pijl toont de excitatie-energie die nodig is

om een elektron in aangeslagen toestand te brengen. Na een klein energieverschil valt het elektron terug naar de grondtoestand.

De rode pijl stelt de energie voor die op dat moment nog vrij kan komen onder de vorm van ofwel licht ofwel warmte.

Om de fluorescentieverandering te kunnen meten wordt een fluorescent label of fluorochroom

toegevoegd aan de reactie. De fluorescentietechnieken maken hierin onderscheid tussen niet-

32

specifieke labels en specifieke probes. Voor de kwantitatieve bepaling van het amplicon moet

het te meten fluorescentiesignaal de achtergrond overschrijden (Vandesompele, 2013).

4.2.3. Niet-specifieke labels

Bij niet-specifieke labels wordt geen onderscheid gemaakt tussen target en eventueel

aanwezige aspecifieke amplificatieproducten. Ze binden zich op alle dsDNA sequenties zodat

alle aanwezige dsDNA een signaal genereert. Eén van de meest gebruikte fluorochromen is

SYBR® Green I (Smith & Osborn, 2009; Vandesompele, 2013).

4.2.3.1. SYBR® Green I

SYBR® Green I is een asymmetrische cyanine

kleurstof die bindt in de kleine groef van dsDNA.

De molecule absorbeert blauw licht (λmax = 497

nm) en emitteert groen licht (λmax = 520 nm). De

fluorescentie-intensiteit van de vrije molecule is

lager dan die van het gebonden fluorochroom.

Tijdens de PCR-reactie wordt het target-DNA per

cyclus verdubbeld waardoor steeds meer vrij

SYBR® Green I gebonden kan worden (Figuur 9).

Tot gevolg zal het fluorescent signaal stijgen in

functie van het aanwezige dsDNA.

Voordelen aan deze methode is dat het

goedkoop en makkelijk in gebruik is. Het grootste

nadeel is dat het signaal niet sequentie-specifiek

is. SYBR® Green I bindt met iedere dsDNA-

molecule, ook met eventueel aanwezig

gecontamineerd dsDNA of primer-dimeren. De

controle van contaminatie is mogelijk door

analyse van de smeltpiekcurve. Als meerdere

pieken aanwezig zijn, is er vermoedelijk

aspecifieke amplificatie opgetreden (Smith &

Osborn, 2009).

4.2.3.2. Smeltcurveanalyse

Om te bevestigen dat het gedetecteerd signaal bekomen door SYBR® Green I enkel afkomstig

is van de geamplificeerde doelwit-sequentie, wordt op het einde van de qPCR-cyclus een

smeltcurve analyse uitgevoerd. Dit geeft de verandering in fluorescentie-intensiteit weer in

functie van de temperatuur.

Om een smeltcurveanalyse te kunnen uitvoeren wordt het dubbelstrengig template-DNA verhit

over een temperatuurgradiënt waarbij telkens de fluorescentie wordt gemeten. Door de

opwarming zal dsDNA in het temperatuurgebied rond de smelttemperatuur van het amplicon

denatureren. Hierdoor zal meer gebonden SYBR® Green I vrijkomen met een daling in de

Figuur 9: Werking SYBR® Green I (Global Health, 2014).

SYBR® Green I bindt in de kleine groef van dsDNA.

Naarmate de PCR-reactie vordert zal er meer vrij SYBR®

Green I gebonden kunnen worden. De fluorescentie-

intensiteit stijgt eens de molecule gebonden is.

33

fluorescentie-intensiteit als gevolg. De smelttemperatuur Tm is de temperatuur waarbij 50%

van de dsDNA gedenatureerd is en hangt af van de sequentielengte en het %GC van het

amplicon. Hoe langer de sequentie en hoe hoger het percentage aan nucleotiden G en C, des

te hoger de Tm van de template (Smith & Osborn, 2009).

Ook kunnen smeltpieken voorgesteld worden door de eerste afgeleide van de smeltcurve uit

te zetten in functie van de ingestelde temperatuur. Een ononderbroken, vloeiende smeltcurve

komt overeen met een unieke smeltpiek (Figuur 10 A). Dit wordt verkregen als het doelwit-

DNA bestaat uit één specifieke sequentie met een bepaalde smelttemperatuur Tm. Als

aspecifieke, ongewenste amplificatieproducten en/of primerdimeren aanwezig zijn in het staal

van het gewenste amplicon zullen bijkomende pieken met een afwijkende Tm opduiken.

Hierdoor zal de smeltcurve een discontinue daling vertonen (Figuur 10 B). Primerdimeren

smelten vroeg uit en vertonen een piek rond het temperatuurgebied van 60°C-70°C,

afhankelijk van de primersequentie. Hierdoor is deze piek meestal goed te onderscheiden van

de gewenste piek(en) van het amplicon (Life Technologies Corporation, 2013; Vandesompele,

2013).

Figuur 10: Smeltcurven met bijhorende smeltpieken. A: Verschillende ononderbroken smeltcurven die overeenstemmen met

een unieke smeltpiek (Neuzil et al., 2010). B: Aspecifieke smeltcurve met een duidelijk discontinue daling. Hierdoor zullen

meerdere pieken opduiken in de smeltpiekcurve (Downey, 2014).

4.2.4. Specifiek gelabelde probes

Een sequentie specifieke probe bevat twee moleculen waarbij de emissiegolflengte van de

ene (donor) overeenstemt met de excitatiegolflengte van de andere (acceptor), respectievelijk

reporter en quencher genoemd. De quencher is aanwezig op het 3’-uiteinde en de reporter op

het 5’-uiteinde van de probe. De reporter wordt met licht van een specifieke golflengte

A

B

34

geëxciteerd om vervolgens licht van een hogere golflengte dan de gebruikte excitatiegolflengte

te emitteren. De quencher capteert de uitgezonden energie van de reporter waardoor de

fluorescentie van de reporter wordt onderdrukt. Het vrijgeven van de energie van de quencher

kan enerzijds onder de vorm van licht en wordt fluorescentiequencher genoemd, of anderzijds

onder de vorm van warmte in het geval van een black-hole quencher (BHQ). In het laatste

geval is er geen fluorescentieverschijnsel door de quencher waardoor een beter signal-to-

noise resultaat wordt bekomen. In dit onderzoek werd voornamelijk een BHQ gebruikt omwille

van het feit dat een verlaagd achtergrondsignaal typerend is. De wisselwerking tussen reporter

en quencher kan enkel plaatsvinden als de twee fluorochromen zich in elkaars onmiddellijke

nabijheid bevinden. Eens de te overbruggen afstand te groot is, zal enkel de emissiegolflengte

van de reporter te meten zijn als fluorescentie-intensiteit (en de quencher enkel in het geval

van fluorescerende quencher) (Hussain, 2009; Vandesompele, 2013).

Er zijn verschillende soorten probes die volgens verschillende principes werken, waarbij de

meest gebruikte reporters derivaten zijn van fluoresceïne, rhodamine of cyanine. In dit

onderzoek werden specifiek FAM, Cy5, VIC, ROX (internal reference dye) en ABY gebruikt,

hieronder weergegeven met specifieke golflengteprofiel (Figuur 11).

Figuur 11: Overzicht van de reporterdyes (Thermo Fisher Scientific, 2015a).

Om de amplificatie te volgen d.m.v. specifiek gelabelde probes wordt gebruik gemaakt van het

principe van Förster resonance energy transfer, genoemd naar de Duitse wetenschapper

Theodor Förster, maar veelal wordt de term fluorescence resonance energy transfer (FRET)

gebruikt (Helms, 2008).

35

De TaqMan® probe maakt gebruikt van FRET en

bestaat uit korte DNA-sequenties (15-30 bp)

complementair aan de reporter (5’-uiteinde) en de

quencher (3’-uiteinde) van het te amplificeren

targetgenoom. Tijdens de annealing zal de probe

binden aan de doelwitsequentie waardoor reporter

en quencher nog steeds in elkaars nabijheid

aanwezig zijn. Pas in de elongatiestap zal het Taq-

DNA-polymerase in werking treden en de probe

vanaf het 5’-uiteinde losmaken. Door de 5’-3’

exonuclease activiteit van het enzym wordt de

TaqMan® probe afgebroken waardoor reporter en

quencher zich in oplossing en ver van elkaar

bevinden zodat het fluorescentiesignaal van de

reporter gedetecteerd wordt. Naarmate de PCR

vordert zullen meer TaqMan® probes afgebroken

worden en zal de fluorescentie-intensiteit toenemen

(Figuur 12). Als reporter en quencher worden

respectievelijk FAM en een niet-fluorescerende

(NFQ) of BHQ met een kleine groef-

bindingsmolecule (MGB) gebruikt. De MGB of minor

groove binder verhoogt de stabiliteit van de

quencher zonder de sequentielengte te vergroten,

m.a.w. een kortere probe met behoud van Tm. De afstand tussen de reporter en quencher is

op die manier dusdanig klein dat de fluorescentiegolflengte uitgezonden door de reporter via

FRET opgevangen wordt door de quencher waardoor geen signaal gedetecteerd wordt

(PREMIER Biosoft; Vandesompele, 2013).

4.2.5. Fluorescentie detectie

RT-PCR werd uitgevoerd met het Applied Biosystems® ViiA™ 7 Real-Time PCR System van

Life Technologies dat werkt op basis van fluorescentietechieken. Een Tungsten-halogen lamp

exciteert licht dat via een filterwiel door een excitatiefilter gestuurd wordt en vervolgens door

een dichroïsche beam splitter op de plaat gericht wordt met excitatie van de probes tot gevolg.

Geëmitteerd licht wordt door een reeks van optische lenzen gestuurd met daaraan gekoppeld

de corresponderende emissiefilter. Een charge-coupled device (ccd) camera detecteert de

emissiegolflengte die aan de hand van een foto in beeld gebracht wordt (Figuur 13) (Nollet,

2013).

Figuur 12: Werking TaqMan® probe (Global Health,

2014). De annealingsfase zorgt voor binding van de

probe aan de target. Bij excitatie van de reporter wordt

energie via FRET aan de quencher doorgegeven.

Tijdens de elongatie wordt de probe los gemaakt en

afgebroken tot reporter en quencher in oplossing zijn.

Op dat moment wordt fluorescentie van de reporter

gemeten.

36

Figuur 13: Schematische weergave werking charge-coupled device (CCD) camera (Nollet, 2013).

4.2.6. Interpretatie ruwe data

Tijdens en na de run wordt de fluorescentiedata verwerkt. De output van een qPCR geeft

grafisch de relatieve fluorescentie-eenheid (RFU, Rn of ΔRn) weer t.o.v. de amplificatiecyclus.

Dit wordt eenvoudigweg de amplificatieplot genoemd. Er worden drie fasen onderscheiden nl.,

een lineaire fase als achtergrond, een exponentiële fase waarbij het product per cyclus

verdubbeld wordt en als laatste de plateaufase eens teveel amplicon aanwezig zodat inhibitie

optreedt (Figuur 14). In die laatste fase wordt er geen product meer bijgevormd wat eveneens

het eindpunt van de amplificatie aanduidt. Om meer accurate gegevens te bekomen wordt de

kwantificatie van de real-time PCR in de exponentiële fase uitgevoerd. In deze fase zijn alle

nodige reagentia aanwezig, is de efficiëntie van de polymerase het hoogst en de vorming van

primer-dimeren beperkt.

Een achtergrondsignaal of ruis afkomstig van veranderingen in reactie- en omgevingscondities

beïnvloedt het gemeten fluorescentiesignaal. In het begin van de qPCR, als nog geen

eigenlijke amplificatie gedetecteerd wordt, wordt de ruis omgezet in een baseline die dient als

grens waarboven de fluorescentie niet meer tot de achtergrond wordt gerekend.

De drempelwaarde of threshold ligt iets hoger dan het fluorescentieniveau van de baseline en

is de detectielimiet van het toestel voor iedere staal in eenzelfde qPCR. De threshold cycle of

CT-waarde is het aantal cycli nodig om de drempelwaarde te overschrijden en wordt gebruikt

voor de kwantificering van de template. Grafisch is dit de plaats waar de amplificatiecurve de

threshold snijdt (Figuur 14) (Applied Biosystems, 2008; Life Technologies Corporation, 2012).

37

Figuur 14: Amplificatie plot met bijhorende termen (Ahmed, 2005).

Verder kan een standaardcurve opgesteld worden die de uitvoering van een RT-PCR-reactie

evalueert aan de hand van bepaalde parameters (Tabel 5).

Tabel 5: Evaluatieparameters van RT-PCR (Vandesompele, 2013; Life Technologies Corporation, 2012).

Parameter Definitie

Dynamische range Het bereik van CT-waarden van opeenvolgende

verdunningen. Wordt gebruikt om resultaten te

standaardiseren. Idealiter: 7-8 waarden, minimum: 5

waarden.

Helling (slope) De richtingscoëfficiënt van de standaardcurve over de

dynamische range.

Efficiëntie = 10(-1/slope) -1

100% voor ideale omstandigheden gaat gepaard met een

helling van -3.32. Afwijkingen zorgen voor nuttige

amplificatie-informatie. Lengte, %GC, secundaire structuren

en concentraties zijn factoren die variatie kunnen

veroorzaken.

Ideaal: Eff=10(-1/-3.32) -1=1,00 100%

Correlatiecoëfficiënt (R²) Maat voor hoe goed de gemeten waarden op de ingestelde

standaardcurve liggen. Hoe groter de afwijking van de CT-

waarden, hoe meer de coëfficiënt onder de ideale waarde 1

ligt.

Y-intercept De theoretische detectielimiet. M.a.w. Ct-waarden als één

enkel target voor significante amplificatie zou zorgen.

Gevoeligheid of sensitiviteit De minimale hoeveelheid target te onderscheiden van het

achtergrondsignaal. Hoe lager de detecteerbare Ct-waarden

binnen dezelfde verdunning en omstandigheden, hoe hoger

de sensitiviteit.

Reproduceerbaarheid Het bekomen van eenzelfde resultaat bij het telkens

opnieuw uitvoeren van een PCR-reactie.

38

4.3. Sanger sequencing

De techniek werd de midden jaren ’70 ontwikkeld door Frederick Sanger en laat toe om de

DNA-sequentie te bepalen. De methode wordt ook dideoxy sequencing genoemd aangezien

dideoxynucleotiden (ddNTP) worden gebruikt voor de specifieke terminatie van een DNA-

synthesereactie. In vergelijking tot normale deoxynucleotiden (dNTPs) bevatten de vier

ddNTPs een H-groep op de 3'-plaats in plaats van een OH-groep (Figuur 15). Hierdoor kan

geen fosfodi-esterbinding gevormd worden en