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Aus dem
Institut für Hygiene und Mikrobiologie
der Ruhr-Universität Bochum
Direktor: Prof. Dr. med. Sören G. Gatermann
Bakterielle Kontamination von
Thrombozytenkonzentraten und Screeningmethoden
zur Reduktion des Risikos bakteriell bedingter
Transfusionsreaktionen
Inaugural Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum
Vorgelegt von
Jens Asmus
aus Bochum
2011
Dekan: Prof. Dr. med. K. Überla
Referent: Prof. Dr. med. Sören G. Gatermann
Korreferent: Prof. Dr. med. Jürgen Bux
Tag der mündlichen Prüfung: 05.06.2012
Abstract
Jens Asmus
Bakterielle Kontamination von Thrombozytenkonzentraten und Screeningmethoden zur Reduktion
des Risikos bakteriell bedingter Transfusionsreaktionen
Problem:
Thrombozytenkonzentrate (TK) bergen von allen Blutkomponenten das höchste Risiko einer
transfusionsassoziierten Sepsis. Das Screening von TK auf bakterielle Kontamination mit
Kultivierungsmethoden ist in einigen Ländern etabliert, um die Transfusion kontaminierter TK zu
verhindern. In Deutschland liegen Daten zur Prävalenz von Bakterien in TK aus verschiedenen
Herstellungsmethoden und Erfahrungen mit dem Bakterienscreening von TK nicht vor.
Methode:
In einer prospektiven Multicenterstudie wurden 52.243 TK (15.198 Apherese-TK, 37.045 Pool-TK) in
aerober und anaerober Kultur (BacT/ALERT, bio Mérieux) untersucht und bei positivem Testergebnis
von der Transfusion ausgeschlossen. An einer Teilmenge der TK wurden mehrere
Detektionsmethoden für Bakterien eingesetzt und verglichen. Über ein Monitoring der klinischen
Verträglichkeit der TK sollten Zeichen transfusionsassoziierter Nebenwirkungen erfasst und zur
Ursachenabklärung sollten Nachuntersuchungen erfolgen.
Ergebnisse:
In 135 TK (0,26%) konnten Bakterien in der 1. Kultur nachgewiesen werden, bei 37 TK (0,07%) wurde
die Kontamination in einer 2. Kultur bestätigt. Apherese- und Pool-TK zeigten keinen Unterschied.
Keime der Hautflora waren die häufigsten Kontaminanten. Aufgrund eines späten Kultursignals
konnten 66% der kontaminierten TK nicht von der Transfusion ausgeschlossen werden. Das klinische
Follow up deckte 6 Fälle mit febrilen Transfusionsreaktionen (TR) auf, die nicht weiter untersucht
wurden. 2 Einheiten eines als negativ getesteten Apherese-TK verursachten
schwerwiegende/tödliche septische TR. Der Methodenvergleich mehrerer Detektionsverfahren
bestätigte BacT/ALERT als sensitivste Methode
Diskussion:
Das Screening von TK auf bakterielle Kontamination ist nur bedingt geeignet, die Transfusion
kontaminierter TK zu verhindern. Es ist begleitet von dem Risiko falsch-negativer Testergebnisse. Die
Bevorzugung von Apherese-TK gegenüber Pool-TK aus 4 Vollblutspenden senkt das Risiko septischer
TR nicht. Transfundierende Ärzte müssen auch milde TR melden und einer Aufklärung der Ursache
zuführen. Mit dem Screening kann das Risiko der Bakterienübertragung zwar gesenkt, aber nicht
beseitigt werden.
- 5 -
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung - 10 -
1.1. Historischer Überblick - 10 -
1.2. Inzidenz transfusionsassoziierter septischer Reaktionen - 18 -
1.3. Ursachen der bakteriellen Kontamination von Blutkomponenten - 23 -
1.4. Strategien zur Reduktion des Kontaminationsrisikos - 26 -
1.5. Vorgaben zur Risikobeschränkung in Deutschland - 31 -
1.6. Screening von Thrombozytenkonzentraten auf bakterielle
Kontamination vor der Abgabe zur Anwendung - 32 -
2. Fragestellung - 35 -
3. Material und Methoden - 36 -
3.1. Material - 38 -
3.1.1. Leukozytendepletiertes Pool-Thrombozytenkonzentrat mit
Plasma (Plasma-PTK) - 38 -
3.1.2. Leukozytendepletiertes Pool-Thrombozytenkonzentrat mit
Thrombozytenlagerlösung T-Sol (T-Sol-PTK) - 39 -
3.1.3. Apherese-Thrombozytenkonzentrat (ATK) - 39 -
3.1.4. Art und Anzahl der getesteten Thrombozytenkonzentrate - 40 -
3.2. Methoden - 40 -
3.2.1. Blutspenderauswahl und Vollblutspende - 40 -
3.2.2. Präparation von Pool-Thrombozytenkonzentraten - 44 -
3.2.3. Herstellung von Apherese-Thrombozytenkonzentraten - 46 -
3.3. Teste auf bakterielle Kontamination, Keimbestimmung,
Keimdifferenzierung - 47 -
3.3.1. Probenziehung und Verimpfung - 47 -
3.3.2. BacT/ALERT-Testung - 48 -
3.3.3. Testung mittels Scansystem™ - 51 -
3.3.4. Testung mittels PALL eBDS - 56 -
3.4. Vorgehen bei positiven Testergebnissen - 59 -
3.4.1. Positive Ergebnisse im BacT/ALERT-System - 59 -
3.4.2. Positive Ergebnisse im Scansystem™ - 60 -
3.4.3. Positive Ergebnisse im PALL eBDS - 60 -
3.4.4. Testung der verbundenen Erythrozytenkonzentrate bei
positiven Ergebnissen - 61 -
3.5. Fragebogen zur klinischen Verträglichkeit der Thrombozytenkonzentrate - 61 -
- 6 -
3.6. Mikrobiologische Untersuchungen - 62 -
3.7. Datenerfassung und Auswertung - 62 -
4. Ergebnisse - 64 -
4.1. Bakterielle Kontaminationsraten in der BacT/ALERT-Testung - 64 -
4.1.1. Bakterienspezies - 68 -
4.1.2. Testergebnisse verbundener Erythrozytenkonzentrate - 69 -
4.1.3. Bakterienspezies in potentiell positiven Thrombozytenkonzentraten,
transfundierte Einheiten und klinischer Follow up - 70 -
4.1.4. Bakterienspezies in bestätigt positiven Thrombozytenkonzentraten,
transfundierte Einheiten und klinischer Follow up - 72 -
4.2. Septische Transfusionsreaktionen bei falsch negativ getesteten
Thrombozytenkonzentraten - 73 -
4.3. Vergleich von Keimisolaten aus unterschiedlichen Proben - 74 -
4.4. Ergebnisse der Testung mit dem ScansystemTM und dem PALL eBDS - 76 -
4.4.1. Sensitivität und Spezifität - 78 -
5. Diskussion - 80 -
5.1. Kontaminationsraten von Thrombozytenkonzentraten - 80 -
5.2. Bakterienspezies und ihre klinische Bedeutung - 87 -
5.3. Wirksamkeit des Bakterienscreenings zur Vermeidung der Transfusion
kontaminierter Thrombozytenkonzentrate - 89 -
5.4. Klinischer Follow up kontaminierter Thrombozytenkonzentrate - 91 -
5.5. Zum Risiko septischer Transfusionsreaktionen bei falsch
negativen Testergebnissen - 93 -
5.6. Zum Vergleich von Keimisolaten aus unterschiedlichen Proben - 94 -
5.7. Bewertung des Vergleiches von BacT/ALERT, ScansystemTM und PALL eBDS - 95 -
5.8. Aussichten und Empfehlungen - 97 -
6. Zusammenfassung - 101 -
7. Literaturverzeichnis - 103 -
- 7 -
Verzeichnis der Abkürzungen
TK Thrombozytenkonzentrat
PTK Pool-Thrombozytenkonzentrat
Plasma-TK Pool-TK mit Plasma
T-Sol-TK Pool-TK mit Thrombozytenlagerlösung T-Sol
ATK Apherese-Thrombozytenkonzentrat
EK Erythrozytenkonzentrat
BC Buffy-Coat
TR Transfusionsreaktion
DRK Deutsches Rotes Kreuz
BRK Bayrisches Rotes Kreuz
ARC Amerikanisches Rotes Kreuz
AABB American Association of Blood Banks
FDA Food and Drug Administration (USA)
BPAC Blood Products Advisory Committee der FDA
CDC Centers for Disease Control (USA)
DoD Department of Defense (USA)
SHOT Serious Hazards of Transfusion (UK)
CFU/ml Colony Forming Units per Milliliter
- 8 -
Verzeichnis Tabellen
Tabelle 1: Übersicht der Gesamtzahl an TK, Seite 37
Herstellungsort, Herstellungsart und mit
welchem Verfahren getestet
Tabelle 2: Anzahl der TK in der Paralleltestung mit den Seite 37
verschiedenen Testverfahren
Tabelle 3: Zeitabstände zwischen den Arbeitsschritten Seite 48
Präparation und Probenziehung bzw. Inkubation
Tabelle 4: Resultate der Sterilitätstestung der TK Seite 65
Tabelle 5: Positive Testresultate in aerober/anaerober Seite 66
Kultur
Tabelle 6: Zeitabstand zwischen Abschluss der Testung Seite 67
und erstem positiven Signal
Tabelle 7: Bakterienspezies in potentiell und bestätigt Seite 68
positiven TK
Tabelle 8: Potentiell positive TK: Bakterienspezies, Inku- Seite 71
bationszeit bis zum ersten positiven Signal,
transfundierte TK und klinisches Follow-up
Tabelle 9: Bestätigt positive TK: Bakterienspezies, Inku- Seite 72
bationszeit bis zum ersten positiven Signal,
transfundierte TK und klinisches Follow-up
Tabelle 10: RAPD-PCR Ergebnisse: Propionibakterien Seite 75
Isolate aus bestätigt positiven Pool-TK
und assoziierten EK
Tabelle 11: Pulsfeld-Gelelektrophorese: Typisierung von Seite 76
Staphylokokken Subspezies
- 9 -
Tabelle 12: Vergleich von BacT/ALERT, ScansystemTM Seite 78
und PALL eBDS
Tabelle 13: Überblick über Methoden und Ergebnisse Seite 82
von Studien zum BacT/ALERT-Screening von
Thrombozytenkonzentraten
Verzeichnis Abbildungen
Abbildung 1: Ablauf des Spendevorgangs Seite 43
Abbildung 2: 4 Buffy-Coats und 1 zugehöriges Plasma Seite 45
Abbildung 3: Poolen der 4 BC und des Plasmas Seite 45
Abbildung 4: Herstellung von Pool-TK (Schema) Seite 46
Abbildung 5: Verimpfungsnadel wird an den Seite 49
TK-Probenbeutelangeschweißt
Abbildung 6: Zeitschema BacT/ALERT Seite 51
Abbildung 7: ScansystemTM Thrombozyten-Kit Seite 52
Abbildung 8: Membranvalidierung des ScansystemTM Seite 54
Abbildung 9: Zeitschema ScansystemTM Seite 55
Abbildung 10: PALL eBDS-Probenbeutel Seite 56
Abbildung 11: PALL eBDS Analyzer Seite 57
Abbildung 12: Zeitschema PALL eBDS Seite 58
Abbildung 13: Definition der Testresultate des Seite 64
BacT/ALERT-Screenings
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1. Einleitung
1.1. Historischer Überblick
Die Übertragung von Bakterien durch Bluttransfusionen ist ein lange
bestehendes Problem und stellt das älteste transfusionsassoziierte
Infektionsrisiko dar. Während bemerkenswerte Fortschritte bei der
Spenderauswahl und den Laboruntersuchungen an Blutspenden zu
einer massiven Reduzierung der Übertragung hauptsächlich viraler
Infektionserregern führten, ist die bakterielle Kontamination von
Blutkomponenten und damit die Übertragung von Bakterien auf den
Empfänger als potentiell schwerwiegendes Transfusionsrisiko in den
Vordergrund getreten.
Bereits aus den Anfangszeiten der Therapie mit Blutpräparaten zu
Beginn des 20. Jahrhunderts liegen Berichte der Übertragung von
bakteriellen Infektionskrankheiten vor. Damals wurde das Blut dem
Empfänger mittels vaskulärer Anastomosen direkt vom Spender
transfundiert (Schmidt, 2001). 1915 wurde zum ersten Mal von einer
direkten Übertragung der Syphilis durch Bluttransfusion berichtet
(Orton, 2001). Die Infektionskrankheit war damals weit verbreitet und
aufgrund des Fehlens verlässlicher Nachweisverfahren war das Risiko
der Übertragung sehr hoch. Als die Technik Fortschritte machte, Blut
außerhalb des menschlichen Körpers für bestimmte Zeit gekühlt
gelagert werden konnte, die antibiotische Therapie die Prävalenz der
Syphilis radikal senkte und 1940 das Spenderblut mit neuen
Nachweismethoden untersucht werden konnte, wurde das Problem der
transfusionsassoziierten Übertragung der Syphilis-Erreger weitgehend
beseitigt (Dood RY, 2001). In der ersten Auflage der Standards der
- 11 -
American Association of Blood Banks wurde bereits ein akzeptabler
serologischer Test auf Syphilis für die Spenderblute gefordert
(Standards for a blood transfusion service, 1958). Das Blut sollte nicht
zur Transfusion verwendet werden, bevor dieser Test nicht negativ
ausgefallen war.
Mit steigender Bedeutung der Blutpräparate als therapeutisches Mittel
wurde das Problem der Übertragung von anderen Bakterien registriert.
1939 veröffentlichte Novak im Journal of the American Medical
Association einen Artikel über das Problem der bakteriellen
Kontamination (Novak, 1939). Er machte darauf aufmerksam, dass Blut
ein Nährmedium für Bakterien sei und schätzte, dass 5% der
Blutprodukte, welche für 10 Tage in Glasflaschen gelagert wurden,
massiv kontaminiert seien. Er vermutete, dass der Vorgang der
Blutspende die hauptsächliche Quelle für das Eindringen von Bakterien
in das gesammelte Blut ist. Novak war sich bewusst, dass die komplette
Sterilisation der Haut vor der Phlebotomie unmöglich ist und immer
einige Bakterien der antiseptischen Behandlung entkommen. Bei der
Punktion der Haut kann somit die Nadel Bakterien aufnehmen und
diese gelangen mit hoher Wahrscheinlichkeit mit dem Blut in die
Flasche. Außerdem merkte er an, dass der Nachweis der Bakterien
speziell nach kurzer Lagerungszeit, wenn die Anzahl der Bakterien
gering ist, eine unsichere Prozedur sei.
Der erste Bericht über eine Transfusionsreaktion im Zusammenhang mit
bakterieller Kontamination wurde 1941 von Strumia und McGraw
erstellt (Strumia und McGraw, 1941). Sie berichteten über 4 Patienten,
die nach der Transfusionen von gepooltem flüssigem Plasma, in dem
später eine große Anzahl gram-positiver Bakterien nachgewiesen
- 12 -
wurde, schweres Fieber entwickelten. Die Autoren befürworteten im
Wissen um das Risiko der bakteriellen Kontamination für die Lagerung,
das Plasma einzufrieren oder zu lyophilisieren. Im folgenden Jahr
erschien der erste Bericht über eine Transfusionsreaktion im
Zusammenhang mit der bakteriellen Kontamination von Vollblut, bei
der der Empfänger starb und verschiedene Mikroorganismen aus dem
verwendeten Blut isoliert wurden (Officer, 1942).
1945 beschäftigte sich das Biologics Control Laboratory des US Public
Health Service mit dem Problem der bakteriellen Kontamination (Proby
und Pittman, 1945). In einer Studie wurden 28 verschiedene
Mikroorganismen, die aus kontaminiertem Spenderblut und Plasma
isoliert wurden, in Kaninchen verimpft, um ihre Pyogenität zu
untersuchen. Wurden gram-negative Organismen in einer Anzahl von
2x10³ bis 5x10³ verimpft, löste dies einen leichten Temperaturanstieg
bei den Tieren aus. Verimpfte man aber höhere Anzahl an Bakterien, so
fiel der Temperaturanstieg wesentlich deutlicher aus. Gram-positive
Organismen, speziell Kokken, führten zum geringsten
Temperaturanstieg, der häufig erst mit 2-3 Stunden Verzögerung
auftrat. In einigen Fällen war der Gipfel des Temperaturanstiegs nach 6
Stunden noch nicht erreicht. Dies war die erste Studie zur
Epidemiologie der bakteriellen Kontamination von Blutprodukten, die
die Differenzierung des Typus der kontaminierenden Organismen nach
gram-positiv vs. gram-negativ und Stäbchen vs. Kokken zur Grundlage
hatte und auch eine Korrelation zwischen der Anzahl der
kontaminierenden Organismen und den pathophysiologischen Effekten
untersuchte.
- 13 -
Im folgenden Jahr untersuchten Braude und Mitarbeiter die Häufigkeit
und das potentielle klinische Risiko der bakteriellen Kontamination von
Vollblut (Braude et al., 1951). Sie kultivierten 1697 fortlaufende
Blutflaschen nach einer Lagerungszeit von 24 Stunden bei 4°C und
fanden eine Kontaminationsrate von 2,2%. Sie bemerkten die
Limitierung der bakteriellen Kontamination durch Kühlung ebenso wie
durch natürlich vorkommende schützende Eigenschaften des Blutes. In
36 Fällen wurde je ein Produkt angewendet, welches sich retrospektiv
als bakteriell kontaminiert herausstellte und zu einer verzögerten
septischen Reaktion beim Empfänger führte.
Die Untersuchungen von Gibson und Norris an Phlebotomienadeln
zeigte, dass ein kleines Stück Haut beladen mit einer kleinen Anzahl an
Bakterien in das gespendete Blut gelangen kann. Somit wurde ihre
Annahme, die ubiquitäre natürliche Hautflora könne die häufigste
Quelle für bakterielle Kontaminationen sein, gestützt (Gibson und
Norris, 1958).
Ein im Jahr 1953 veröffentlichter Bericht des Laboratory of Biologics
Control von Pittman erfasste 18 Fälle von schweren und tödlichen
Transfusionsreaktionen (Pittman, 1953). Diese Reaktionen ereigneten
sich in der Zeitspanne zwischen den Jahren 1944 bis 1952; eine nach
der Gabe von Serum, 15 Reaktionen nach der Gabe von Vollblut und
zwei Reaktionen nach der Gabe von roten Blutzellen. In all diesen Fällen
wurden gram-negative Organismen nachgewiesen. Pittman vermutete,
dass diese 18 Berichte nur ein Teil der tatsächlichen Ereignisse waren.
Er glaubte, die Kontamination mit gram-positiven Organismen sei
häufiger als die Kontamination mit gram-negativen, die klinischen
- 14 -
Reaktionen würden jedoch bei gram-positiven Bakterien deutlich milder
ausfallen und somit nicht beachtet oder nicht in einen Zusammenhang
mit der Transfusion gesetzt werden.
Im Bemühen um ein besseres Verständnis für die klinische Relevanz der
bakteriellen Kontamination, haben Geller und Jawetz als erste das
Wachstumsverhalten von Bakterien untersucht (Geller und Jawetz,
1954). Gefolgt von einer initialen Reduktion der Bakterienzahl stellten
sich vier verschiedene Formen des Wachstums heraus – eine mit direkt
folgendem exponentiellem Wachstum (log-Phase); eine, welche mit
verlangsamten log-Phasen Wachstum einhergeht; eine mit langer
Latenz-Phase (lag-Phase) gefolgt vom log-Phasen-Wachstum und eine
mit kurzer lag-Phase, der ein log-Phasen-Wachstum folgt. Weiterhin
konnten die Autoren zeigen, dass je kleiner die initiale Kontamination
ist, desto größer die Wahrscheinlichkeit für eine verlängerte lag-Phase
ist.
Im Jahr 1954 beschrieb Gardner eine Methode zur Verwendung von
Plastikmaterialien, die sterilisierbar sind und eine bestimmte Zeit steril
gehalten werden können (Gardner et al., 1954). Dies führte in den
nächsten zwei Dekaden zu einer Verbesserung von Methoden,
Thrombozytenkonzentrate (TK) als eigenständiges Therapeutikum zu
entwickeln. Auch löste die Verwendung von Plastikbeuteln das Problem
der Sterilisation von Glasflaschen, die, wenn sie insuffizient oder
unvollständig war, ein hohes Potential für die Verunreinigung von
gelagertem Spenderblut enthielt. Nach dem Wechsel von Glasflaschen
auf Plastikbeutel verlagerte sich das Interesse der bakteriellen
- 15 -
Kontaminationen vornehmlich auf Thrombozytenkonzentrate
(Blajchman, 1994).
Anfangs erfolgte die Transfusion von TK möglichst zeitnah zur Spende.
Auch die gekühlte Lagerung wurde getestet, es stellte sich jedoch
schnell heraus, dass die Thrombozytenfunktion unter
Lagerungsbedingungen bei 4°C rapide abnimmt. Murphy und Gardner
revolutionierten die Verwendung von TK in dem sie zeigten, dass die
Thrombozytenfunktion unter Lagerung bei Raumtemperatur über
mehrere Tage erhalten bleibt (Murphy und Gardner, 1969). Sie
beachteten auch die Möglichkeit der bakteriellen Kontamination,
glaubten jedoch, dass dies durch Verwendung kleiner Einheiten nicht zu
einem klinischen Problem werden würde.
Das Potential für ein ernstes Problem durch die bakterielle
Kontamination von TK wurde 1971 durch die Arbeit von Buchholz et al.
hervorgehoben (Buchholz et al., 1971). Sie berichteten über 2 Patienten
die im Juli und August 1970 nach der Transfusion von TK an einer Sepsis
durch Enterobacter cloacae erkrankten. In einer Pilotstudie zur
Abschätzung der Häufigkeit der bakteriellen Kontamination von TK
kultivierten sie Proben von 258 Pools aus TK, wobei insgesamt 2188
Einzelspenden erfasst wurden. Sie erhielten eine Kontaminationsrate
von 2,5%. Da die Patienten, die bei Raumtemperatur gelagerte TK
erhielten, überwiegend solche mit Immundefiziten waren und somit
eine Risikogruppe für Infektionen darstellen, warnten die Autoren, TK
mit Vorsicht anzuwenden.
Eine weitere Studie von Buchholz et al. zum quantitativen Ausmaß der
bakteriellen Kontamination von TK zeigte, dass 45 Proben (1,4%) von
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3251 Einheiten auf mindestens einem Medium bakterielles Wachstum
zeigten (Buchholz et al., 1973). Interessant an dieser Untersuchung war
die Beobachtung, dass die Prozentzahl an positiv identifizierten
Einheiten mit der Länge der Lagerungszeit vor der Untersuchung
korrelierte. Dies deutete erstmals darauf hin, dass Bakterien zum
Zeitpunkt der Phlebotomie in kleiner Zahl in die Bluteinheit gelangen
und während der Lagerung proliferieren. Obwohl in den frühen 70er
Jahren das fortbestehende Problem der bakteriellen Kontamination und
die Korrelation mit der Lagerungsdauer erkannt waren, veranlassten
logistische Überlegungen die Hersteller zur Entwicklung neuer
Beutelfolien, die die Lagerungszeit von TK verlängern sollten. So wurde
1982 die Lagerungsdauer für TK bei Raumtemperatur von 3 auf 5 Tage,
1984 auf 7 Tage verlängert. Dazu merkte Dr. Fratantoni bei einem
Treffen des Blood Products Advisory Committee (BPAC) der Food and
Drug Administration (FDA) am 13. Februar 1986 an, dass sich die
Möglichkeit der Verlängerung der Lagerungszeit auf 7 Tage auf die
funktionelle Qualität der Thrombozyten bezog, über das Problem der
Sterilität zu diesem Zeitpunkt jedoch noch nicht ausreichend diskutiert
wäre (Fratantoni, 1986). Aufgrund der steigenden Anzahl von Berichten
über bakterielle Kontaminationen von TK und damit verbundenen
Transfusionszwischenfällen, mit Prädilektion auf die am längsten
gelagerten Einheiten, votierte das FDA BPAC für die Reduzierung der
Lagerungszeit bei Raumtemperatur für alle TK auf 5 Tage. Es wurde
angemerkt, dass mehr Daten benötigt würden, um das Ausmaß des
Problems abschätzen zu können.
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1992 empfahl das Center of Disease Control (CDC) wegen anhaltender
Berichte über die bakterielle Kontaminationen, alle TK, die bei
Transfusionszwischenfällen eine Rolle spielten, auf die Verunreinigung
durch Bakterien zu untersuchen, um über die Inzidenz genauere
Auskunft zu erhalten (US Centers of Disease Control, 1992; Zaza et al.,
1994).
Diese Strategie des CDC führte zur BaCon-Studie, deren Ergebnisse
später dargestellt werden (Kuehnert et al., 2001; Roth et al., 2001).
Bei drei weiteren Workshops des FDA, am 27. September 1995, am 24.
September 1999 und am 7. August 2002, ging es weiterhin
hauptsächlich um das Problem der bakteriellen Kontamination von TK
(Klein et al., 1997; US Food and Drug Administration, 1999; US Food and
Drug Administration, 2002). Hier wurden viele Informationen von
nationalen und internationalen Forschungsgruppen vorgestellt, welche
das Ausmaß des Problems der bakteriellen Kontamination
betrachteten. Zusätzlich präsentierten Vertreter der Industrie und der
Hersteller verschiedene Strategien zur Reduktion, zum Nachweis und zu
Möglichkeiten der Eradikation von Bakterien. Tatsächlich gab die FDA
im Februar und Oktober 2002 den BacT/ALERT Kulturflaschen
(bioMérieux Inc., Durham, NC) und dem PALL Bacterial Detection
System (BDS, PALL Corporation, East Hill, NY), zwei Systemen zum
Bakteriennachweis in TK, die Zulassung für Qualitätskontrollen und für
Sterilitätstestungen von TK.
Die Entwicklung von Vorgaben zur Erkennung einer bakteriellen
Kontamination von TK vor der Transfusion erweist sich als schwierig
angesichts der kurzen Haltbarkeitsfrist von TK und der Unsicherheit
über die Sensitivität der Nachweismethoden. Der schwierigste Teil war
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die bakterielle Kontamination rechtzeitig und zuverlässig nachzuweisen
und gleichzeitig den Anforderungen der Klinik gerecht zu werden und
den Bedarf zu decken. Die 22te Ausgabe des AABB Standards of Blood
Banks and Transfusion Services beinhaltet einen Standard, der sich mit
dem Thema auseinandersetzt (Fridey, 2003). Dieser Standard, der am 1.
März 2004 in den USA verbindlich wurde, fordert Methoden zur
Begrenzung der bakteriellen Kontamination und zur Prüfung auf
Bakterien bei allen zur Transfusion vorgesehenen TK.
1.2. Inzidenz transfusionsassoziierter septischer Reaktionen
Die Angaben in der Literatur zur Inzidenz bakteriell bedingter
Transfusionsreaktionen variieren stark. Verschiedene Studien kamen zu
sehr unterschiedlichen Ergebnissen. Dies liegt zum einen an
unterschiedlichen Studiendesigns, ob z.B. eine Reihe produzierter TK
getestet wurde oder ob TK nach einem Transfusionszwischenfall
hinsichtlich vorhandener Bakterien untersucht wurden.
Transfusionszwischenfälle, die im Zusammenhang mit Bakterien stehen,
können übersehen werden oder werden nicht als solche bewertet,
wenn das Krankheitsbild der Patienten andere Ursachen vermuten
lässt.
In einigen Ländern wurden Institutionen etabliert, die Daten zu
Transfusionszwischenfällen systematisch sammeln und die Ursachen
von Transfusionsreaktionen untersuchen. In Frankreich hat das
Hemovigilance Network von April 1994 bis Dezember 1998 730 Fälle
erfasst, die unter dem Verdacht der bakteriellen Kontamination
gemeldet wurden (Andreu et al., 2002). Nach genauer Analyse wurden
195 Zwischenfälle auf Bakterien zurückgeführt, 18 mit tödlichem
- 19 -
Ausgang. Von den insgesamt 82 gemeldeten letalen TR waren 22% auf
eine bakterielle Kontamination der beteiligten Blutpräparate
zurückzuführen. Betrachtet man nun die verschiedenen beteiligten
Produkte so ergibt sich, dass für 37,3% aller Transfusionszwischenfälle
im Zusammenhang mit bakterieller Kontamination TK verantwortlich
waren. Erythrozytenkonzentrate (EK) waren in 62,7% der Fälle
verwickelt und bei der Verwendung von gefrorenen Frischplasma (FFP)
ist nicht ein einziger Fall registriert worden. Durch die Anzahl der
angewendeten Einheiten lässt sich auf die Inzidenz der septischen
Komplikationen bei den einzelnen Blutprodukten schließen. Sie lag bei
36 auf 10 Millionen transfundierte EK, bei 56 auf 1 Millionen TK aus
Vollblut und bei 38 auf 1 Millionen Apherese-TK.
Das Serious Hazards of Transfusion-Programm im Vereinigten
Königreich (SHOT) erfasst und untersucht Transfusionszwischenfälle
ähnlich wie das Hemovigilance Network in Frankreich. Die Berichte von
SHOT werden jedes Jahr veröffentlicht (Stainsby et al., 2003). Zwischen
dem 01.10.2001 und dem 31.12.2002 wurden von den Blutbanken 34
Fälle (England, Wales und Nordirland 28, Schottland 6) von bakteriell
bedingten TR gemeldet, trotz einer längeren Periode 20,9% weniger als
in der vorherigen Periode (1.10.2000 bis 30.9.2001). 5 der 34 Fälle
(15%) wurden als gesichert durch Bakterien ausgelöst bewertet. 4 Fälle
wurden im Jahr 2001 registriert, ein Fall im ganzen Jahr 2002. Die
anderen Fälle konnten nicht gesichert als durch die Transfusion
ausgelöst eingeordnet werden. Alle Reaktionen waren durch TK
ausgelöst worden, in 4 Fällen durch 5 Tage alte und in einem Fall durch
ein 3 Tage altes TK. In 3 der 5 Fälle wurden Staphylococcus epidermidis
als der kontaminierende Keim identifiziert, als dessen Herkunft in 2
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Fällen die Spenderhaut identifiziert werden konnte. Im dritten Fall war
eine Herkunft nicht zu bestimmen. Einmal war Morganella morganii der
im Empfängerblut und im Rest der Konserve identifizierte Keim und im
letzten Fall Streptokokken der Gruppe B. In beiden Fällen konnte die
Quelle nicht identifiziert werden. Alle betroffenen Patienten hatten ein
schweres Grundleiden, aber keiner der Patienten starb durch die
transfusionsassoziierte Infektion.
Da es in den USA nur Schätzungen zur Rate der bakteriellen
Kontamination von Blutpräparaten gab, entwickelten die American
Association of Blood Banks (AABB), das American Red Cross (ARC), das
Center for Disease Control (CDC) und das Department of Defense (DoD)
1997 ein Programm, um genauere Informationen über die Problematik
zu erhalten, und führten vom 1. Januar 1999 bis zum 31. Dezember
2000 die BaCon-Studie durch (Kuehnert et al., 2001). Die „Assessment
of the Frequency of Blood Component Bacterial Contamination
Associated with Transfusion Reaction Study“ (BaCon) sollte folgende
Informationen liefern: a) die nationale Rate der
transfusionsübertragenen Bakteriämien, b) die Identifizierung der
Krankheitserreger und assoziierter Risikofaktoren, und c) die
Identifizierung vorhersehbarer Faktoren der Sterblichkeit der
Empfänger. Mitarbeiter von AABB, ARC, CDC und DoD entwickelten im
August 1997 Fallkriterien, Definitionen und standardisierte
Berichtsformulare für bakterielle Infektionen, die im Verdacht standen,
transfusionsübertragen zu sein. Als klinisches Kriterium für den
Verdacht auf einen transfusionsübertragenen Infektionsfall wurde das
Vorhandensein eines der folgenden Zeichen oder Symptoms innerhalb
von 4 Stunden nach der Transfusion verwendet: Fieber ≥39°C oder eine
- 21 -
Veränderung ≥2°C gegenüber dem Wert vor der Transfusion, Rigor,
Tachykardie ≥120 Schläge pro Minute oder eine Veränderung ≥40
Schläge pro Minute gegenüber dem Wert vor der Transfusion, oder ein
Anstieg oder Absinken des systolischen Blutdrucks um ≥30 mmHg. Bei
Patienten, die diese Kriterien erfüllten, sollte das Klinikpersonal eine
Bericht über die aufgetretene Transfusionsreaktion schreiben, die
involvierten Blutkomponenten sichern und Blut vom Patienten zur
Kultivierung abnehmen. Wenn in den Kulturen des Blutbeutels und in
dem Patientenblut dieselben Organismen angezüchtet werden konnten,
sollten Proben und die involvierten Blutbeutel zum CDC gebracht
werden. Wenn die Organismen aus Blutbeutel und Empfängerblut in
der Pulsfeld-Gelelektrophorese identisch waren, so wurde das Ereignis
als bestätigter Fall gewertet.
In den 94 beteiligten Blutbanken wurden in dem Zeitraum der Studie
23.711.169 EK, 1.804.725 Einzelspender-TK und 1.033.671 Pool-TK (PPC)
hergestellt, was ungefähr 60-70% der Produktion in den USA entsprach.
Es wurden 56 Berichte über Patienten angefertigt, bei denen eins oder
mehrere der genannten Kriterien auftraten. Nach den Untersuchungen
wurden 34 Fälle als bestätigte Fälle gewertet. Die beobachteten Zeichen
und Symptome variierten bei den Patienten, aber Rigor (30 Fälle/88%),
Fieber (27 Fälle/79%) und Tachykardien (24 Fälle/75%) waren die
dominierenden Symptome. Die in die 34 Fälle involvierten
Blutkomponenten setzten sich aus 18 Einzelspender-TK, 11 Pool-TK und
5 EK zusammen. Im Zusammenhang mit Thrombozytenkonzentraten
war das Risiko einer transfusionsübertragenen Bakteriämie und einer
Reaktion mit letalem Ausgang gegenüber EK signifikant erhöht.
- 22 -
Von den 34 Krankheitserregern waren 20 (59%) gram-positiv und 14
(41%) gram-negativ. Die verwendeten Produkte waren im Mittel 4 Tage
bei TK und 22 Tage bei EK gelagert.
Neun (27%) der 34 Zwischenfälle hatten einen tödlichen Ausgang, bei 3
wurden EK, bei 6 TK verwendet. Tödliche Ausgänge waren mit gram-
negativen Organismen, einem höheren Empfängeralter, einem
kleineren Transfusionsvolumen, einer kürzeren Zeitspanne zwischen
Transfusionsbeginn und auftretenden Symptomen und bei TK mit einer
längeren Lagerungszeit vor der Transfusion assoziiert. Der gemessene
Endotoxingehalt in den Präparaten unterschied sich zwischen tödlichen
und nicht tödlichen Fällen nicht signifikant.
Kuehnert et al. schätzten die Rate einer transfusionsübertragenen
Bakteriämie auf 1 auf 100.000 TK und 1 auf 5 Millionen EK (30). Die
Letalität wurde auf 1 auf 500.000 TK und 1 auf 8 Millionen für EK
geschätzt. Der Vergleich mit dem Risiko der Virusübertragung, das 1996
für das Hepatitis-B-Virus auf < 1 auf 100.000 Blutpräparate und für das
HIV auf < 1 auf 2 Millionen Präparate geschätzt wurde, zeigte, dass die
Übertragung von Bakterien speziell durch TK ein beachtliches Risiko
darstellte (Schreiber et al., 1996).
Die meisten TK, die zu letalen Reaktionen durch Infektionen führten,
waren mit gram-negativen Organismen kontaminiert und wurden
innerhalb der ersten 3 Tage der Haltbarkeitsfrist transfundiert,
wohingegen nichtletale Reaktionen größtenteils durch gram-positive
Keime ausgelöst wurden und die Lagerungszeit der TK vor der
Anwendung bei 5 Tagen lag, also der maximalen Verwendbarkeitsfrist.
Die Präsenz von Endotoxinen, welche innerhalb von Stunden bis zum
ersten Tag nach der Spende in gram-negativ kontaminierten TK rapide
- 23 -
ansteigt, ist eine Erklärung für den Zusammenhang zwischen gram-
negativen Organismen und tödlichen Verläufen (Arduino et al., 1989).
Für Deutschland liegen für die in den Zeiträumen in Frankreich, den USA
und dem Vereinigten Königreich erhobenen Daten keine publizierten
Vergleichsdaten vor, sodass die Einschätzung der Inzidenz von bakteriell
bedingten TR nicht möglich ist.
1.3. Ursachen der bakteriellen Kontamination von Blutkomponenten
Die bakterielle Kontamination kann während der Blutspende durch die
Phlebotomie, durch eine asymptomatische Bakteriämie beim Spender
zum Zeitpunkt der Spende oder durch verunreinigtes Spendeequipment
entstehen. Ebenso können Bakterien während der nachfolgenden
Präparationsschritte oder durch Mikroläsionen der Beutelfolie Zugang
zu den Präparaten erhalten.
Eine asymptomatische Bakteriämie zum Zeitpunkt der Blutspende ist
praktisch nicht detektierbar, sodass Spender auf diesem Weg mit ihrem
Blut Bakterien in den Sammelbeutel übertragen können. In der Literatur
sind rund 30 Fälle von Yersinia enterocolitica-Septitiden im
Zusammenhang mit der Transfusion von Erythrozytenkonzentraten
beschrieben (US Department of Health and Human Services, 1997;
Theakstone et al., 1997; Beresford, 1995). Symptome einer Infektion
mit Y. enterocolitica sind eine Enterocolitis mit Diarrhoen, Fieber und
abdominellen Schmerzen. Die Symptome sind meist sehr mild und auch
komplett asymptomatische Fälle sind beschrieben. Nach einer
Inkubationszeit von 1 bis 11 Tagen entwickelt sich die Erkrankung mit
einer Dauer 5 bis 14 Tagen, sie kann aber auch über Monate
persistieren. Bei den Fällen, die durch eine Transfusion übertragen
- 24 -
wurden, konnte das CDC in ca. 75% der Fälle retrospektiv bei den
Spendern in den Tagen vor oder nach der Spende eine Diarrhoe
erfragen (US Department of Health and Human Services, 1997).
Ebenso konnten Posttransfusionsinfektionen durch andere
enteropathogene Bakterien wie z.B. Campylobacter jejuni und
Salmonella Heidelberg auf eine Bakteriämie der Spender zurückgeführt
werden (Goldman und Blajchman, 1991; Sazama, 1990; Wagner et al.,
1994). Auch während der Inkubationszeit anderer Infektionen, z.B. der
oberen Atemwege können nicht erkannte Bakteriämien auftreten.
Spender mit chronischen Infektionen wie Osteomyelitis oder Ulzera an
der unteren Extremität müssen ebenfalls als potentielle Quelle der
bakteriellen Kontamination beachtet werden (Goldman und Blajchman,
1991; Duncan et al., 1994). Bakteriämien von kurzer Dauer sind nach
zahnärztlicher Manipulation wie einer Zahnextraktion, aber auch nach
dem Zähneputzen zu erwarten. Eine Übertragung von Staphylococcus
aureus durch ein TK wurde auf eine zahnärztliche Behandlung des
Spenders zurückgeführt, die 3 Stunden vor der Spende stattfand
(Goldman und Blajchman, 1991).
Die Kontamination zum Zeitpunkt der Blutspende stellt die
bedeutendste Quelle der bakteriellen Kontamination von TK dar. Die
Mehrzahl der in Kultivierungsstudien und in Fallberichten über
transfusionsübertragene septische Reaktionen gefundenen Organismen
sind Bestandteil der normalen Hautflora. Da es unmöglich ist, die Haut
des Spenders vollkommen bakterienfrei zu bekommen, ist hier eine
wichtige Quelle für bakterielle Kontaminationen. Neuere Studien, bei
denen Proben aus Spenderblut kultiviert wurden, zeigen, dass bei
- 25 -
Spendern, bei denen eine Bakteriämie ausgeschlossen worden war, die
Inzidenz von Bakterien im gespendeten Blut zwischen 2 und 6% liegt
(Schifman und Pindur 1993). Auch das Eindringen eines kleinen Stückes
Haut, welches bei der Punktion durch die Phlebotomienadel
herausgestanzt wird, wurde postuliert. Somit würden auch tiefere
Hautschichten, die sich einer adäquaten Desinfektion entziehen, in den
Beutel gelangen und die sie besiedelnden Bakterien mitbringen (Gibson
und Norris, 1958). Auch Organismen, die nicht zu normalen Hautflora
gehören, können diese besiedeln und für septische
Transfusionsreaktionen verantwortlich sein (McDonald et al., 1998).
Einer tödlichen Reaktion, ausgelöst durch Clostridium perfringens,
wurde als Quelle ein Spender zugeordnet, der regelmäßig die Windeln
seiner Kinder wechselte. Diese Bakterien, ebenso wie andere
Organismen der normalen Darmflora, konnten durch einen Abstrich
vom Arm des betroffenen Spenders kultiviert werden.
Auch Materialien, die zur Desinfektion der Spenderhaut verwendet
werden, wie in Alkohol und Jod getränkte Tupfer, können eine Quelle
darstellen. So wurde ein Desinfektionskit eines großen amerikanischen
Herstellers zurückgerufen, nachdem eine bakterielle Kontamination der
Desinfektionsmittel mit Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas
maltophilia und koagulasenegativen Staphylokokken bekannt wurde
(US Food and Drug Administration, 2000).
1991 entwickelten 6 Patienten in Dänemark und Schweden eine Sepsis
mit Serratia marcescens, nachdem sie EK oder TK transfundiert
bekommen hatten (Heltberg et al., 1993; Högman et al., 1993). Der
Ausbruch konnte zurückgeführt werden auf eine massive
- 26 -
Kontamination der Außenhülle der Sammelbeutel, die in einer
Herstellungsanlage in Belgien produziert worden waren. Der gleiche
Ribotyp von S.marcescens wurde aus Proben der Empfänger, dem
transfundierten Produkt, 0,73% der Sammelbeutel der gleichen Charge
und aus dem Herstellungsbereich der Beutel isoliert. Da man keine
Notwendigkeit für die Sterilisierung der äußeren Hülle der Beutel sah,
wurde postuliert, dass auf der Außenseite der Beutel während der
Lagerung vor der Blutspende ein Wachstum der Bakterien möglich war.
Die Bakterien könnten dann zum Zeitpunkt der Blutspende durch die
Nadel angesaugt oder durch die Hände des Phlebotomisten in den
Beutel gelangt sein. Auch Mikroläsionen der Beutelfolie als
Bakterieneintrittspforte wurden diskutiert.
Undichten Verschlüssen, beschädigten Schläuchen oder Mikrolöchern in
den Sammelbeuteln wurden einige Fälle von bakterieller Kontamination
mit S.marcescens zugeschrieben (Högman und Engstrand, 1998). Im
Jahr 1995 wurden von der National Blood Authority in England 7000
Blutbeutel wegen fehlerhafter Verschlüsse bei einigen der Beutel
zurückgerufen (Dyer, 1995).
1.4. Strategien zur Reduktion des Kontaminationsrisikos
Die Richtlinie zur Gewinnung von Blut und Blutbestandteilen und zur
Anwendung von Blutprodukten des Wissenschaftlichen Beirats der
Bundesärztekammer und des Paul-Ehrlich Instituts führt aus: „Jeder
Spender muss sich nach ärztlicher Beurteilung in einem
gesundheitlichen Zustand befinden, der eine Blutspende ohne
Bedenken zulässt. Dies gilt sowohl im Hinblick auf den
Gesundheitsschutz des Spenders, als auch für die Herstellung von
- 27 -
möglichst risikoarmen Blutkomponenten und Plasmaderivaten“
(Wissenschftlicher Beirat der Bundesärtzekammer und vom Paul-
Ehrlich-Institut, 2005). Daraus ergibt sich, dass bei der Spenderauswahl
ein hohes Maß an Verantwortung für den Arzt und den Spender selbst
besteht. Durch die konsequente Durchführung der Anamnese, den
Ausschluss von Spendern, die die hohen Ansprüche nicht erfüllen und
das Labor-Screening der Spenden ist es gelungen, die Übertragung
viraler Infektionen nahezu auszuschließen. Bei der Kontamination von
Blutkomponenten durch Bakterien ist die Problematik jedoch deutlich
komplexer. Vor allem die asymptomatische Bakteriämie beim Spender
und das ubiquitäre Vorkommen von Bakterien auf der Spenderhaut und
in deren tieferen Schichten stellen ein kaum lösbares Problem dar. Eine
multivariante Analyse der Faktoren der bakteriellen Kontamination von
Vollblutspenden führten Perez et al. von März bis Dezember 1997 in
vier französischen Blutbanken durch (Perez et al., 2002). Die Spender
wurden nach den in Frankreich geltenden Regeln zur Spenderauswahl
selektioniert. Neben den von den Spendeteams bestimmten Faktoren
(Spende in der Blutbank, im Spendebus oder in öffentlichen
Spenderäumen; der Art und Weise der Hautdesinfektion) wurden auch
spenderbedingte Faktoren ermittelt. Diese waren das Geschlecht, das
Alter und der Zeitraum seit der letzten Mahlzeit. Das Spendeteam sollte
die Haut um die Phlebotomiestelle inspizieren und das Vorhandensein
von Haaren, Läsionen und Narben vermerken. Nachdem die Spenden
am Morgen gesammelt wurden, wurden direkt am Nachmittag aus den
Sammelbeuteln Proben in BacT/ALERT Flaschen überführt. Diese
wurden für 7 Tage bei 37°C inkubiert. Bei positiven Proben wurde eine
Subkultur zur Keimdifferenzierung angelegt. Interessant ist, dass das
- 28 -
Alter des Spenders anscheinend einen Einfluss auf die Inzidenz der
bakteriellen Kontamination des gespendeten Blutes hat. Perez et al.
teilten die Spender in 2 Gruppen ein. Die Gruppe >35 Jahre hatte eine
doppelt so hohe Inzidenz wie die Gruppe <35 Jahre. Dies wird von den
Autoren durch die altersbedingten Hautveränderungen und
Narbengewebe durch vorherige Spenden erklärt. Das Vorhandensein
von Haaren, Läsionen und Narben lässt die Inzidenz ansteigen. Bei den
Haaren sind es vor allem die Follikel, die sich, von Bakterien besiedelt,
der oberflächlichen Hautdesinfektion entziehen. Narbengewebe und
Läsionen scheinen für das Auftreten von Bakterien prädisponiert zu
sein, da sie sich der Desinfektion entziehen und körpereigene
Mechanismen zur Eradizierung hier nicht zu funktionieren scheinen.
Da in allen Studien Bakterien der transienten und residenten Hautflora
den Großteil der Kontaminanten von Blutkomponenten ausmachten,
kommt der antiseptischen Hautdesinfektion vor der Spende eine hohe
Bedeutung zu. McDonald et al. untersuchten die Reduktion der
Bakterienanzahl auf der Haut von Spendern durch verschiedene
Desinfektionslösungen und verschiedene Methoden von deren
Anwendung (MCDonald und Lowe et al., 2001). Im ersten
Probendurchgang wurden drei verschiedene Desinfektionsmethoden
untersucht. Keine der drei untersuchten Methoden erreichte das
gewünschte Resultat einer Reduktion der Bakterienzahl von >90%. In
einer zweiten Testreihe wurden 9 verschiedene Desinfektionstechniken
getestet. Insgesamt wurde das beste Ergebnis durch die Medi-Flex
Adapted Methode (Insight Biotechnology, Wembley Middlesex,
UK/Medi-Flex) erzielt. Die Desinfektionslösungen werden in zwei
Schritten aufgetragen. Die Bewegung schient einen deutlichen Einfluss
- 29 -
auf die Reduktion zu haben, da die ebenfalls getestete Medi-Flex
Standard Methode den gleichen Ablauf hat, nur die Jodtinktur statt in
einer vertikalen in einer Spiralbewegung aufgetragen wurde. Hierbei
wurden jedoch schlechtere Ergebnisse erzielt. Bei der Medi-Flex
Adapted Methode wurde bereits bei einmaliger Anwendung eine
durchschnittliche Reduktion der Bakterienzahl um 99,75% erzielt. Alle
Testpersonen hatten nach der Desinfektion <100 CFU/Platte, bei mehr
als 90% wurde die Anzahl der Bakterien auf unter 10 CFU/Platte
reduziert und bei 79% wurden überhaupt keine Bakterien in der Fossa
antecubitalis der Spender nachgewiesen.
Da die kontaminierenden Bakterien überwiegend von der Haut der
Spender stammen, gilt es alle Möglichkeiten auszuschöpfen diese
Kontamination zu reduzieren. Es wurde schon früh postuliert, dass mit
den ersten Millilitern einer Blutspende ein Stück Haut, welches durch
die Nadel aus der Haut gestanzt wird, in den Sammelbeutel gelangt und
die Spende somit kontaminiert (Gibson und Norris, 1958;
Blajchman,1998). Olthuis et al. waren die ersten die zeigten, dass die
ersten 10ml einer Apheresespende eine höhere Rate an bakterieller
Kontamination aufweisen, als die folgenden zweiten 10ml (Olthuis et
al., 1995). In einem In-vitro-Modell bestätigten Wagner et al. die
Effektivität der Reduzierung von Bakterien durch die Entfernung der
ersten Milliliter einer Blutspende (Wagner et al., 2000). Bruneau et al.
untersuchten in einer groß angelegten Studie in vier französischen
Blutbanken den Einfluss des als Predonation Samplings bezeichneten
Verfahrens auf die Häufigkeit der bakteriellen Kontamination in
Vollblutspenden (Bruneau et al., 2001). Durch ein speziell für diese
Studie entwickeltes Beutelsystem war es möglich, unter aseptischen
- 30 -
Bedingungen die ersten 30ml einer Blutspende in zwei Probenbeutel zu
überführen. Im Probenbeutel S1 wurden die ersten 15ml, in dem
Probenbeutel S2 die nächsten 15ml einer Blutspende separat
gesammelt. Von diesen Proben wurden dann aerobe und anaerobe
Kulturen im BacT/ALERT-System angelegt. Von einer als positive
detektierten Kultur wurden Subkulturen angelegt. Wurde bei den
Subkulturen ein bakterielles Wachstum beobachtet, so wurden die
Bakterien mit mikrobiologischen Standardmethoden identifiziert.
Wurde kein Wachstum erreicht, so wurde die Probe als falsch-positiv
bewertet. Die EK und das Plasma der zugehörigen Spende wurden bei
positiven Proben nach Möglichkeit ebenfalls kultiviert und auf das
Vorhandensein von Bakterien hin untersucht. Insgesamt wurden 3385
Spenden im Zeitraum von März bis September 1997 untersucht. In 76
Fällen (2,2%) wurden in den Proben S1 oder S2 Bakterien gefunden. In
21 Fällen war S2, unabhängig des Ergebnisses in S1, als bakteriell
kontaminiert identifiziert. Somit wurde das Risiko der bakteriellen
Kontamination durch die Entfernung der ersten 15ml um 72.4%
reduziert. Durch die neue Spendentechnik konnte die bakterielle
Kontamination der Vollblutspende signifikant reduziert werden. Die
Ergebnisse der Studie führten dazu, dass das Verfahren des Predonation
Sampling in Frankreich und anderen Ländern eingeführt wurde, wobei
das Volumen des initial abgetrennten Blutes auf 30ml erhöht wurde
und für die Laboruntersuchungen des Spenderblutes genutzt wird.
Als eine weitere Option zur Reduktion der bakteriellen Kontamination
wurde die Leukozytendepletion von Spenderblut untersucht. Högman
et al. und auch Sanz et al. konnten zeigen, dass Bakterien von
Leukozyten während der Vollblutlagerungsphase phagozytiert werden
- 31 -
und anschließend durch die Leukozytenentfernung mittels Filtration
eliminiert werden (Högman et al., 1991; Sanz et al., 1997). Allerdings ist
dieser Effekt beschränkt und konnte insbesondere für TK nicht bestätigt
werden (McDonald und Roy et al., 2001; Wagner und Robinette, 1998;
Wenz et al., 1993; Brecher et al., 1993; Sherburne ei al., 1991).
1.5. Vorgaben zur Risikobeschränkung in Deutschland
In allen transfusionsmedizinischen Einrichtungen gilt seit 1997 eine
Vorgabe zur Sterilitätstestung einer definierten Stichprobe von
hergestellten Blutkomponenten mittels Kulturmethode am Ende der
Haltbarkeitsfrist als Teil der Routinequalitätskontrolle (Arbeitskreis Blut,
1997). Sterile Schlauchschweißverbindungen, die bei der
Komponentenpräparation benötigt werden, müssen jeweils mit einem
Drucktest auf ihre Dichtigkeit überprüft werden (Arbeitskreis Blut,
1999).
Die Richtlinien zur Gewinnung von Blut und Blutbestandteilen und zur
Anwendung von Blutprodukten (Hämotherapie) wurden im Jahr 2000
mit einer detaillierten Vorgabe zu den Blutspenderauswahlkriterien
ergänzt, die das Risiko der Bakteriämie als Ausschlussgrund von der
Blutspende erfassen sollen. Ferner wurde das Verfahren der
Hautdesinfektion mit einem lizensierten Desinfektionsmittel in einer 2-
Phasentechnik unter strikter Beachtung der Einwirkzeit präzisiert
(Wissenschaftlicher Beirat der Bundesärtzekammer und vom Paul-
Ehrlich-Institut, 2000, 2005, Ergänzungen 2007). Die generelle
Leukozytendepletion von zellulären Blutkomponenten wurde von
Oktober 2001 an vorgeschrieben (Arbeitskreis Blut, 2001). Mit einer
einjährigen Übergangsperiode wurde 2002 die Abtrennung des initialen
- 32 -
Blutvolumens bei der Blutspende als so genanntes Predonation
Sampling als weiter Maßnahme vorgeschrieben (Arbeitskreis Blut,
2002).
1.6. Screening von Thrombozytenkonzentraten auf bakterielle
Kontamination vor der Abgabe zur Anwendung
Eine Reihe von Studien berichtet über die Ergebnisse des Screenings
von TK mit dem BacT/ALERT-System (Munksgaard et al., 2004; Larsen et
al., 2005; Fang et al., 2005; Te Boekhorst et al., 2005). Dabei handelt es
sich um ein automatisiertes Blutkultursystem, welches das von
Bakterien produzierte CO2 detektiert. Die Detektionsgrenze liegt bei 1
koloniebildender Einheit pro Milliliter (CFU/ml).
Das Prinzip des Screenings bestand darin, kurz nach der Herstellung
eine Probe aus dem TK zu entnehmen und zu kultivieren. Bei der
Ausgabe an der Blutbank wurde der Kulturstatus überprüft und nur bei
negativem Kulturstatus erfolgte die Ausgabe im Sinne eines negative-to-
date-Konzeptes. Nach der Ausgabe positiv gemeldete Kulturen führten
zum Rückruf der betroffenen TK. War das Präparat bereits
transfundiert, wurde der behandelnde Arzt informiert und aufgefordert
zu prüfen, ob der Patient Zeichen einer bakteriell bedingten TR zeigte.
Die detektierten Bakterien gehörten überwiegend der physiologischen
Hautflora an: Staphylococcus epidermidis, Bacillus spp.,
Propionibakterien und Corynebakterien. Gram-negative Keime wie
Klebsiellen, Serratien und Colibakterien wurden besonders in Apherese-
TK gefunden (Fang et al., 2005). Die Zeitspanne bis zu einem positiven
Kultursignal lag zwischen 7 bis 166 Stunden. Es zeigte sich, dass die
- 33 -
Wachstumskinetik der Bakterien die Chance des Ausschlusses des
kontaminierten TK von der Transfusion entscheidend beeinflusst. Da bei
Patienten, die TK mit einem positiven Kultursignal und nachgewiesener
Kontamination transfundiert bekamen, keine septischen Reaktionen
auftraten, wurde der Schluss gezogen, dass langsam sich vermehrende
Bakterien mit einem späten positiven Kultursignal von geringer
Pathogenität sind.
Die Grenzen des Screenings mit BacT/ALERT wurden dadurch deutlich,
dass eine Reihe von TR bei TK mit falsch negativem Kulturergebnis
beobachtet wurden (Fang et al., 2005; Te Boekhorst et al., 2005). Bei
der frühen Probenziehung kurz nach der Herstellung wurden aufgrund
ihrer geringen Anzahl im TK Bakterien mit der Untersuchungsprobe
nicht erfasst.
Weitere Methoden für das Screening von TK auf Bakterien sind in der
Entwicklung. Das PALL eBDS (eBDS, PALL Corp.) misst den
Sauerstoffgehalt in der Luft einer Probe aus TK und wertet den
Sauerstoffverbrauch als Zeichen der metabolischen Aktivität und des
Wachstums von Bakterien. Holme et al. testeten 118.067 TK und fanden
23 bestätigt kontaminierte Präparate (Holme ez al., 2005). Auch in einer
Kontaminationsstudie konnte die Fähigkeit des PALL eBDS zum
Bakteriennachweis belegt werden (McDonald und Pearce et al., 2005).
In Frankreich wurde das Scansystem™ (Hemosystem, Marseille,
Frankreich) entwickelt, mit dem Bakterien mit einer Fluoreszenz-
Zytometrie-Technik nachgewiesen werden. Spiking-Studien zeigten eine
Nachweisgrenze in TK von 103 CFU/ml (Schmidt et al., 2005; McDonald
et al., 2005).
- 34 -
Die Sensitivität einer PCR-Technik, basierend auf dem Nachweis von
bakterieller 16S rDNA, wurde ebenfalls in Spiking-Studien untersucht
(Mohammadi et al., Transfusion 2005 und Vox Sanguinis 2005). Auch
geringgradige Kontaminationen konnten innerhalb von 24 Stunden nach
der TK-Herstellung nachgewiesen werden. Bisher liegen nur
experimentelle Daten vor.
- 35 -
2. Fragestellung
In einer prospektiven multizentrischen Studie integriert in die
Arbeitsroutine der beteiligten Zentren wurde eine systematische
Prüfung von Thrombozytenkonzentraten auf eine bakterielle
Kontamination mit verschiedenen Testverfahren durchgeführt.
Primäres Ziel der Studie war es, die Kontaminationsraten von TK aus
verschiedenen Herstellungsverfahren festzustellen. Durch die Testung
einer großen Anzahl von TK sollte die Kontaminationsrate zuverlässig
bestimmt werden. Als positiv getestete TK sollten möglichst von der
Abgabe zur Transfusion ausgeschlossen werden.
Bei als positiv getesteten Pool-TK, welche aus insgesamt 4 Blutspenden
hergestellt werden, sollten die verbundenen Erythrozytenkonzentrate
getestet werden, um das kontaminierende Ausgangsvollblut zu
ermitteln. Auch Kontaminationsraten unter aeroben und anaeroben
Kulturbedingungen sollten verglichen werden.
An einer Teilmenge von TK sollten mehrere Detektionsmethoden
(BacT/Alert, ScansystemTM, PALL eBDS) für Bakterien eingesetzt
werden, um die Spezifität und Sensitivität der Methoden zu
vergleichen.
Des Weiteren sollte ein Monitoring über die klinische Verträglichkeit
der auf Sterilität geprüften TK mit einem Begleitschein für die
Anwender zur Protokollierung der Transfusion durchgeführt werden.
TK, bei denen Zeichen einer transfusionsbedingten Nebenwirkung
registriert wurden, sollten einer Nachuntersuchung zugeführt werden.
- 36 -
3. Material und Methoden
Die Studie wurde in der Produktionsroutine von 9
transfusionsmedizinischen Instituten des Deutsche Roten Kreuzes (DRK)
integriert. Es nahmen folgende Einrichtungen teil: DRK-
Blutspendedienst (BSD) West mit den Zentren Breitscheid und Münster,
DRK-BSD Baden-Württemberg-Hessen und Ost mit den Zentren
Dresden, Frankfurt und Ulm, DRK-BSD NSTOB mir den Zentren Springe
und Oldenburg und Bayrisches Rotes Kreuz-BSD mit den Zentren
München und Nürnberg.
Die Testung und Analysen erfolgten im Zeitraum von Januar 2004 bis
Februar 2006.
Die Steuerung der Studiengruppe und deren Koordination erfolgte
durch die Studienleitung bestehend aus Frau Dr. Gabriele Walther-
Wenke (DRK-BSD West, Münster), Herrn PD Dr. Thomas Müller (DRK-
BSD NSTOB, Springe) Herrn Dr. Franz Weinauer (BRK-BSD, München)
und Frau Dr. Adelheid Younis (DRK-BSD West, Breitscheid). Als
Doktorand war ich im Zentrum für Transfusionsmedizin Münster und im
Institut für Medizinische Mikrobiologie der Ruhr-Universität Bochum an
der Präparateherstellung, Testung, Ergebniserstellung, Dateneingabe,
Auswertung der Ergebnisse und den bakteriologischen Untersuchungen
beteiligt. Ferner war ich in die Studiengruppe integriert, die sich im
Studienzeitraum regelmäßig zur Besprechung der Ergebnisse traf.
In den Tabellen 1 und 2 ist dargestellt, welche Thrombozytenpräparate
mit welchen Untersuchungsmethoden in den 9 beteiligten Zentren
untersucht wurden.
- 37 -
Tabelle 1: Übersicht der Gesamtzahl an TK, Herstellungsort und Herstellungsart Herstellungs-ort
Plasma-Pool-TK
T-Sol-Pool-TK
Apherese-TK Gesamt
Springe 8109
8109
Breitscheid 5104
685 5789
Münster 8831
8831
Ulm
9000 1105 10105 Frankfurt a.M.
6001
6001
Oldenburg
2860 2860
München
3977 3977
Nürnberg
2696 2696
Chemnitz
1195 1195
Dresden
2024 2024
Plauen
656 656
Gesamt 22044 15001 15198 52243
Tabelle 2: Anzahl der TK in der Paralleltestung mit den verschiedenen Testverfahren Produkt Gesamt BacT/ALERT PALL eBDS ScansystemTM
Apherese-TK
4730
Breitscheid 2000 2000
München 2730 2730
Pool-TK 6307
Münster 4732 4732 4732
Breitscheid 1575 1575 1575
Die Studiengruppe beschloss im Rahmen der Studienvorbereitung
Maßnahmen zur Qualitätssicherung. Die Herstellungsvorgänge von der
Spenderauswahl über die Hautdesinfektion, die Präparation bis zur
Lagerung wurden auf für die Fragestellung der Studie relevante
Unterschiede überprüft und ggf. vereinheitlicht. Um eine einheitliche
Vorgehensweis bei den Untersuchungen auf Sterilität sicher zu stellen,
wurden verbindliche Arbeitsanweisungen erarbeitet.
- 38 -
3.1. Material
Es wurden Sterilitätskontrollen an den in der Routine produzierten TK
der beteiligten Zentren vorgenommen. Diese Produkte waren zur
Therapie vorgesehene Blutkomponenten aus humanem Vollblut bzw.
durch Apherese gewonnen TK in entsprechenden Blutbeuteln. Alle
getesteten Produkte waren Arzneimittel im Sinne des §2
Arzneimittelgesetzes und vom Paul-Ehrlich-Institut zugelassen
(Arbeitskreis Blut, 1997).
TK werden bei angeborenen oder erworbenen Thrombozyten-
bildungsstörungen oder akutem Thrombozytenverlust, z.B. durch eine
starke Blutung, eingesetzt. Der arzneilich wirksame Bestandteil sind
Thrombozyten, die im Zusammenspiel mit Gerinnungsfaktoren und den
Gefäßwänden die Blutstillung gewährleisten.
3.1.1. Leukozytendepletiertes Pool-Thrombozytenkonzentrat mit
Plasma (Plasma-PTK)
Durch die Zentrifugation von Vollblut und anschließender Abtrennung
von Plasma und Erythrozyten erhält man als Rest den Buffy-Coat, der
den größten Teil der Thrombozyten aus dem Vollblut enthält. Zum
Erreichen einer therapeutischen Standarddosis für Erwachsene von
200-500 x 109 werden im funktionell geschlossenen Systeme 4 Buffy-
Coats mit einem zugehörigen Plasma zu einem Pool zusammengeführt
und erneut zentrifugiert. Im anschließenden Abpressvorgang wird der
Überstand als TK durch einen Filter leukozytendepletiert
(Restleukozyten <1x106 in der gepoolten Einheit). PTK sind bei einer
Lagerungstemperatur von 22°C± 2°C unter ständiger Agitation maximal
- 39 -
5 Tage nach der Spende verwendbar (Wissenschftlicher Beirat der
Bundesärtzekammer und vom Paul-Ehrlich-Institut, 2005).
3.1.2. Leukozytendepletiertes Pool-Thrombozytenkonzentrat mit
Thrombozytenlagerlösung T-Sol (T-Sol-PTK)
Die Herstellung T-Sol-gepoolter TK entspricht weitestgehend der
Herstellung von mit Plasma gepoolten TK. Zum Zusammenbringen der
Buffy-Coats wird bei dieser Methode jedoch nicht ein zugehöriges
Plasma verwendet, sondern eine additive Lösung, das T-Sol. Diese
Lösung soll hinsichtlich der Funktionserhaltung der Thrombozyten dem
Plasma überlegen sein. Auch T-Sol-gepoolte TK werden
leukozytendepletiert und sind bei einer Lagerungstemperatur von 22°C±
2°C unter ständiger Agitation maximal 5 Tage nach der Spende
verwendbar.
3.1.3. Apherese-Thrombozytenkonzentrat (ATK)
Die Herstellung erfolgt durch eine Apherese, mittels einer
Apheresemaschine. Die Leukozytendepletion ist in das
Aphereseverfahren integriert. ATK sind bei einer Lagerungstemperatur
von 22°C± 2°C unter ständiger Agitation maximal 5 Tage nach der
Spende verwendbar (Wissenschftlicher Beirat der Bundesärtzekammer
und vom Paul-Ehrlich-Institut, 2005). Es wurden Einfach-Apheresen mit
1 TK als Ergebnis und Zweifach-Apheresen mit der anschließenden
Aufteilung in 2 therapeutische Einheiten durchgeführt.
- 40 -
3.1.4. Art und Anzahl der getesteten Thrombozytenkonzentrate
Es wurden an 3 Standorten insgesamt 22.044 Plasma-PTK getestet. An 2
Standorten erfolgte die Testung von insgesamt 15.001 T-Sol-PTK. An 6
Standorten wurden ATK hergestellt. Aus 3.376 Apheresen wurde jeweils
1 TK hergestellt, aus 11.822 Apheresen entstanden durch Teilung
jeweils 2 therapeutische Einheiten. Somit wurden 15.198 Apheresen
mit 27.020 ATK durchgeführt.
3.2. Methoden
Vollblutspenden und Apheresen wurden nach schriftlichen
Verfahrensanweisungen hergestellt. Der Herstellungsbeginn jedes
Blutproduktes ist mit dem Zeitpunkt der Punktion gleichzusetzen. Die
Blutspenden wurden von gesunden Blutspendern auf Außenterminen
oder in den institutseigenen Entnahmeräumen entnommen.
3.2.1. Blutspenderauswahl und Vollblutspende
Die Spenderauswahl orientiert sich an den Richtlinien des
Wissenschaftlichen Beirats der Bundesärztekammer des Paul-Ehrlich-
Instituts (Wissenschftlicher Beirat der Bundesärtzekammer und vom
Paul-Ehrlich-Institut, 2005). Hiernach muss sich jeder Blutspender in
einem gesundheitlichen Zustand befinden, der eine Blutspende ohne
Bedenken zulässt. Dies gilt sowohl im Hinblick auf den
Gesundheitszustand des Spenders als auch auf die Herstellung von
möglichst risikoarmen Blutkomponenten. Durch eine schriftliche
Anamneseerhebung und anschließende ärztliche Zulassung zur Spende
ist eine sorgfältige Spenderauswahl gewährleistet, die Spenderwillige
mit akuten Erkrankungen von der Entnahme ausschließt. Insbesondere
- 41 -
wird jeder Spender nach Fieber, Zahnbehandlungen, invasiven
diagnostischen und therapeutischen Eingriffen sowie Durchfällen
gefragt, die auf eine unerkannte Bakteriämie hinweisen könnten. Durch
eine Temperaturmessung wird sichergestellt, dass der Spenderwillige
nur mit einer Temperatur von <37,5°C zugelassen wird.
Die Hautdesinfektion der Punktionsstelle dient der möglichst
vollständigen Entfernung der Bakterien von der Hautoberfläche und der
Reduzierung der in tieferen Hautschichten befindlichen Bakterien. Die
Desinfektion erfolgt mit einem DGHM-gelisteten
Hautdesinfektionsmitteln nach genauer Vorschrift und ist eine der
wichtigsten Tätigkeiten zur Vermeidung bakterieller Kontamination bei
der Blutgewinnung. Es wird eine gebrauchsfertige alkoholische Lösung
in Sprühflaschen verwendet. Der Punktierende muss sicherstellen, dass
die Punktionsstelle in der Ellenbeuge des Spenders vollständig benetzt
ist und die Einwirkzeit mindestens eine Minute beträgt. Nach Inspektion
und Palpation erfolgt eine erneute Desinfektion, anschließend die
Punktion.
Die Vollblutentnahme erfolgt mit einem funktionell geschlossenen
Beutelsystem, welches aus einem Entnahmeschlauch, einem PDS-Beutel
zur Abtrennung der ersten Milliliter der Vollblutspende, einem
Entnahmebeutel und einer Nadel besteht. Ferner sind weitere Beutel
für die Herstellungsschritte in das System integriert.
Vor der Entfernung der Schutzkappe der Punktionsnadel, die eine
Belüftung des Beutelsystems verhindert, ist es notwendig das
Beutelsystem durch Abklemmen des Entnahmeschlauchs zu
verschließen. Dies wird durch eine aufgesetzte Klemme oder die
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Abklemmeinrichtung einer automatischen Mischwaage gewährleistet.
Zudem wird eine lockere Schlaufe in den Entnahmeschlauch gelegt.
Nach erfolgter Punktion und Fixierung der Nadel mit Heftpflaster wird
das Brechventil zum Predonation-Sampling-Beutel (PDS-Beutel)
geöffnet und ein für die Befüllung der Probenröhrchen ausreichendes
Volumen (von 30-40 ml) in den PDS-Beutel überführt. Dann wird die
irreversible Klemme am PDS-Schlauch geschlossen, die reversible
Klemme am Entnahmeschlauch geöffnet und die Mischwaage gestartet.
Im Anschluss können die Proberöhrchen aus dem PDS-Beutel gefüllt
werden. Nach Erreichen des Sollgewichts (500-555g 475-525ml
Vollblut) wird der Entnahmeschlauch durch eine Klemme möglichst
nahe an der Punktionsstelle temporär verschlossen. Die vorgelegte
Schlaufe des Entnahmeschlauches wird zugezogen, bis eine
Weißfärbung des Knotens eintritt. Zwischen Klemme und Knoten wird
der Entnahmeschlauch durchtrennt (Abb.1).
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Verschluss des Predonation-Sampling-Beutels
Ausfüllen des Spenderfragebogens
Arztgespräch
Temperaturmessung < 37,5°C
Hämoglobingehalt >12,5 g/dl Frauen; >13,5 g/dl Männer
Keine Rückstellungsgründe
Spenderidentifizierung
Hautdesinfektion
Punktion
Füllen des Predonation-Sampling-Beutels
Spenderauswahl
Transport zur Weiterverarbeitung in den BSD
Steriler Verschluss des Beutelsystems
Lagerung zwischen Butardiolplatten
Füllen des Spendebeutelsystems
Abbildung 1: Ablauf des Spendevorgangs
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3.2.2. Präparation von Pool-Thrombozytenkonzentraten
Die Vollblutkonserven, die zur Fraktionierung in
Erythrozytenkonzentrat, Plasma und Thrombozytenkonzentrat
vorgesehen sind, werden nach Übergabe durch die Entnahmeteams an
das verarbeitende Institut bei 22°C±2°C über Nacht gelagert.
Ein Teil der bei Spendeterminen gewonnenen Vollblutspenden werden
für die Herstellung von Pool-TK ausgewählt. Nach einer ersten
Zentrifugation werden Plasma und Erythrozyten getrennt, während der
Buffy-Coat (BC) im Entnahmebeutel verbleibt. Aus vier BC und 220-
250ml Plasma wird ein gefiltertes TK hergestellt (Abb. 2). Jeder BC-
Vierergruppe wird ein Plasma zugeordnet, wobei es sich um das Plasma
eines Spenders handeln muss, dessen BC bereits der Vierergruppe
angehört. Die vier BC der Gruppe und das zugeordnete Plasma werden
mittels steriler Schlauchverbindungen kettengliederartig verbunden
und gepoolt (Abb.3). Anschließend erfolgt eine zweite Zentrifugation.
An das zentrifugierte Zwischenprodukt wird mittels Konnektion der
Leukozytenfilter mit dem Thrombozytenlagerungsbeutel angeschlossen.
Anschließend wird das thrombozytenreiche Überstandsplasma durch
den Leukozytenfilter in den Lagerungsbeutel überführt (Abb.4).
Die Herstellung von T-Sol-Pool-TK und dessen zeitlicher Ablauf
entsprechen dem der Herstellung von Plasma-PTK. Lediglich das Plasma
wird bei diesem Produkt zu 70% durch eine additive Lösung, das T-Sol,
ersetzt. Das eingesparte Plasma kann anderen Verwendungszwecken
zugeführt werden.
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Abbildung 2: Vier Buffy-Coats und ein zugehöriges Plasma
Abbildung 3: Poolen der 4 BC und des Plasmas, der Pool wird dann erneut zentrifugiert und das thrombozytenreiche Überstandsplasma abgepresst
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3.2.3. Herstellung von Apherese-Thrombozytenkonzentraten
Thrombozytapherese ist definiert als die Herstellung eines
standardisierten Präparates mit mindestens 200 x 109 Thrombozyten in
ca. 200 – 300 ml Plasma mittels einer Apheresemaschine direkt aus dem
Blutkreislauf eines Spenders. Während der Blutentnahme erfolgt eine
gleichmäßige Durchmischung des Blutes mit einer Stabilisatorlösung
unmittelbar hinter der Entnahmenadel. Das entnommene Blut enthält
alle Blutbestandteile. Mittels extrakorporaler Zirkulation und
Lagerung des TK bei +22°C unter Agitation
einwandfrei
Zuordnung zur Produktlinie Pool-TK
Erste Zentrifugation (4000g, 13 min.)
Abpressen von Erythrozyten und Plasma
Buff-Coat (BC) verbleibt im Beutel
Poolen von 4 BC und einem zugehörigem Plasma/T-Sol
Zweite Zentrifugation (540g, 10 min.)
Abpressen durch Leukozytenfilter
in den TK-Beutel
Eingangskontrolle
Abbildung 4: Herstellung von Pool-TK (Schema)
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Zentrifugation im Apheresegerät werden die Thrombozyten von den
anderen Bestandteilen getrennt und das TK hergestellt. Es können
mittels Thrombozytapherese simultan 2 standardisierte Präparate
hergestellt werden, indem der Inhalt eines Sammelbeutels auf 2 Beutel
aufgeteilt wird.
3.3. Teste auf bakterielle Kontamination, Keimbestimmung,
Keimdifferenzierung
3.3.1. Probenziehung und Verimpfung
Die zu testenden Proben mit einem Volumen von 50 ml wurden aus den
Entlüftungsbeuteln der TK, der nach Abschluss der Herstellung der TK
vom Endprodukt getrennt wurde, entnommen. Am Tag der
Probenziehung wurden je 7,5ml der Probe in aerobe und anaerobe
BacT-Alert-Flaschen überführt, die dann für maximal 7 Tage nach der
Herstellung im automatischen BacT/Alert-System inkubiert wurden
(Tab.3). Die Probenbeutel wurden dann unter den
Lagerungsbedingungen der TK bei 22°C bis zum Abschluss der Testung
gelagert.
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Tabelle 3: Zeitabstände zwischen den verschiedenen Arbeitschritten
Präparat Median Mittelwert Minimum Maximum
Zeit zwischen Ende der Präparation und Probenziehung (min)
ATK 436 672 40 1999
Plasma-PTK 180 123 5 330
T-Sol-PTK 60 72 60 90
Zeit zwischen Ende der Präparation und Inkubation (min)
ATK 1256 1140 60 2983
Plasma-PTK 220 174 15 360
T-Sol-PTK 80 156 80 270
3.3.2. BacT/ALERT-Testung
Das BacT/ALERT-System (bioMerieux) ist das derzeitig am häufigsten
genutzte System für den Nachweis von Bakterien. Zwei Flaschen, eine
aerobe und eine anaerobe, werden mit Proben einer zu
untersuchenden Flüssigkeit beimpft. Diese Flaschen kommen zur
Inkubation bei 35° in den dafür vorgesehenen BacT/ALERT-Inkubator,
wo sie für 7 Tage inkubiert werden. Am Flaschenboden befindet sich ein
grauer Indikator für CO2, der mit steigendem CO2-Gehalt seine Farbe ins
Gelbe ändert. Im Inkubator wird jeder Flaschenboden mit einer LED
beleuchtet und über eine Photodiode das reflektierte Licht
aufgenommen und ausgewertet. Über die Änderung der Farbe durch
den CO2-Anstieg kann mittels der Kontrolleinheit eine Wachstumskurve
aufgezeichnet werden. Die automatische Analyse der Wachstumskurve
gibt an die Kontrolleinheit ein positives Signal, d.h. Bakterien sind in der
Probe nachweisbar, wenn eine logarithmische Wachstumskurve
entsteht. Durch eine integrierte, automatische Qualitätskontrolle ist das
- 49 -
BacT/ALERT-System derzeit die Methode mit der niedrigsten Rate an
falsch positiven Ergebnissen.
Zur Testung wurden die Probenbeutel mit den Etiketten der aeroben
und anaeroben Flasche markiert. Die Flaschen wurden mit den
Präparatenummern der Proben versehen. Danach wurde ein
Entnahmeschlauch mit Verimpfungsnadel (Donafix-System, B. Braun
Melsungen AG, Melsung, Deutschland) an den Probenbeutel
angeschweißt (Abb. 5).
An einem Arbeitsplatz mit Lamina-Air-Flow wurden dann jeweils 7,5ml
der Probe in eine anaerobe und eine aerobe BacT-ALERT-Flasche
überführt. Der beimpfende Mitarbeiter trug dabei eine Kopfhaube,
einen Mundschutz und sterile Handschuhe, um eine sekundäre
Kontamination der Proben zu vermeiden. Zum Verimpfen wurden die
Abbildung 5: Verimpfungsnadel wir an den TK-Probenbeutel
angeschweißt
- 50 -
Deckel der Flaschen entfernt und der Einfüllstopfen mit
Desinfektionslösung eingesprüht. Dann wurde die Schweißverbindung
zwischen Probenbeutel und Entnahmeschlauch geöffnet, und der
Entnahmeschlauch durch Füllen mit der Probe entlüftet. Anschließend
wurde, nach minimal 30 Sekunden, die Desinfektionslösung mittels
eines sterilen Tupfers vom Einfüllstopfen gewischt. Dann wurde zuerst
die anaerobe Flasche mit 7,5ml der Probe beimpft, danach die aerobe
Flasche. Nach dem Beimpfen wurde der Entnahmeschlauch samt Nadel
von dem Probenbeutel abgeschweißt, und verworfen. Anschließend
wurden die Flaschen ins BacT/ALERT-System überführt. Hierzu wurden
der Code der Flasche und der Code der zu testenden Probe als
Identifizierungsnummer eingescannt. Die Proben wurden bis zum
Zeitpunkt eines positiven Ergebnisses inkubiert oder nach einer
maximalen Inkubationszeit von 7 Tagen als negativ gewertet (Abb.6).
Das Detektionslimit der BacT/ALERT-Testung liegt bei 1 CFU/ml.
- 51 -
3.3.3. Testung mittels Scansystem™
Das Scansystem™ (Hemosystem SA, Marseille, Frankreich) benutzt zum
Bakteriennachweis den fluoreszierenden Farbstoff Picogreen, der
speziell die Doppelstrang-DNA von lebenden und abgetöteten Bakterien
sowie Bakteriensporen markiert.
Die Testung mit Scansystem startete 30 Stunden nach der Blutspende.
Steriles Überführen der Proben
in die BacT/ALERT-Flaschen
Herstellung des PC
Überführung der Probe in den Entlüftugsbeutels
Zuordnung der Spendennummer
Anschweißen des Donafix-Verbindungssystems
Bekleben der BacT/ALERT-Flaschen und
der Satellitenbeutel mit entsprechenden Etiketten
Desinfektion und Abwischen des Anstechstopfens
Entlüftung des Donafix-Systems
Vollblutentnahme am Spendetag
Inkubation bei 35° bis zu einem positiven Signal,
max. 7 Tage
Überführen der Flaschen
in den BacT/ALERT-Inkubator
1.Tag
2.Tag
7 Tage
Abbildung 6: Zeitschema BacT/ALERT
- 52 -
Für die Testung wurden je 3ml Probenvolumen von drei Pool-TK
gepoolt. Dafür wurden mittels des Thrombozyten-Kits je 3 ml Probe in
eine Spritze überführt (Abb.7). Diese enthält ein Thrombozyten-
Aggregationsmittel und den DNA-bindenden, fluoreszierenden
Markierungsfarbstoff. Während einer 40 minütigen Inkubationszeit
unter konstanter Agitation bindet dieser an die DNA, während die
Thrombozyten agglutinieren. Durch die anschließende Pressung durch
einen Filter (5 µm) wird die Probe von den Thrombozytenagglutinaten
befreit, während die Bakterien diesen passieren können.
Im angeschlossenen Beutel mit thrombozytolytischer Lösung verbleibt
die Probe für weitere 10 Minuten, um die restlichen Thrombozyten
aufzulösen. Außerdem dringt die Lösung auch in die
Bakterienmembran, um die Aufnahme des fluoreszierenden Farbstoffes
Abbildung 7: Scansystem Thrombozyten-Kit mit Spritze
(rechts),Thrombozyten- Filter (grün), thrombolytischer
Lösung im Beutel und 0,4µm-Membran (in der Kappe links)
- 53 -
zu fördern, bevor die Probe über eine Vakuumpumpe durch eine 0,4
µm-Membran abgesaugt wird. Diese Membran dient der Rückhaltung
der markierten Bakterien und zum darauf folgenden Transfer zur
Analyse im Scansystem-Analysator.
Zur Analyse wird die Membran auf einen Metallträger gelegt, dieser
wird dann in die Schublade des Analyse-Scannermoduls gelegt. Im
Scanner wird der Fluorophor-Farbstoff durch einen Argon-Laser (488
nm) angeregt und gibt Signale der Wellenlänge 515 nm ab. Diese
Signale werden während des Scan-Vorgangs erkannt. Da die Signalform
bei Partikelrückständen und Bakterien völlig unterschiedlich ist, kann
der Computer die Signale analysieren und zwischen Bakterien und
Partikelrückständen unterscheiden.
Nach dem Scannen muss innerhalb von fünf Minuten die
Membranvalidierung mit dem Mikroskop durch einen Laboranten
erfolgen. Dazu wird der Membran-Metallträger auf den
Mikroskopschlitten gelegt und mithilfe der Software die Validierung
gestartet. Das Mikroskop bewegt sich automatisch zum ersten
gescannten Fleck und der Laborant begutachtet diesen visuell durch das
Mikroskop und validiert das Signal mittels der Validierungstastatur
(Abb.8). Über diese gibt der Laborant ein, ob es sich um einen
Mikroorganismus oder einen Partikelrückstand handelt.
Nachdem 50 Signale validiert wurden, errechnet die Software
automatisch die Verhältniszahl R (Anzahl der bestätigten Bakterien
geteilt durch die Anzahl der validierten fluoreszierenden Signale). Ist
R<0,2 ist der Test negativ, d.h. die Probe ist nicht bakteriell
kontaminiert, ist R≥0,2 so ist der Test positiv und die Software erfasst
die Probe als bakteriell kontaminiert.
- 54 -
Die Daten der Proben werden durch die Software auf der Festplatte
gespeichert und einmal wöchentlich auf einer CD-ROM gesichert.
Im Fall eines positiven Testergebnisses bei einer Probe aus drei
gepoolten Proben, muss der Test einzeln für jedes der drei beteiligten
PCs wiederholt werden (Abb. 9).
Der Testhersteller gibt als Detektionslimit 1000 CFU/ml an.
Abbildung 8: Membranvalidierung des Scansystem, die Laborantin
validiert über eine Tastatur ob die von der Software ausgewählten
Punkte Mikroorganismen oder Partikelrückstände sind
- 55 -
Thrombolyse und Erhöhung der Permeabilität der Bakterienmembran für Farbstoff
Herstellung des Pool-TK
Überführung des Entlüftugsbeutels in die zuständige Abteilung
Probenentnahme BacT/ALERT (sieh Abb.3)
Lagerung des Entlüftungsbeutels bis zum nächsten Morgen
Poolen von 3ml von je 3 Proben im Thrombozyten-Kit
Aggregation der Thrombozyten und Markierung der Bakterien DNA
Abpressen durch 5µm-Membran
Vollblutentnahme am Spendetag
Scannen der Membran im Scannermodul
Absaugen der Probe durch 0,4µm-Membran
1.Tag
2.Tag
Mikroskopische Validierung durch Laboranten
Berechnung von R; Auswertung durch Computer
3.Tag
40 min
10 min
Abbildung 9: Zeitschema Scansystem
- 56 -
3.3.4. Testung mittels PALL eBDS
Das PALL enhanced Bacterial Detection System verwendet die Abnahme
der Sauerstoffkonzentration in der Untersuchungsprobe als Marker für
bakterielles Wachstum. Potenzielle Hintergrundstörungen werden
vermieden, indem die Thrombozyten, die ebenfalls Sauerstoff
verbrauchen, herausgefiltert werden. Das PALL eBDS ermöglicht eine
Probenentnahme im geschlossenen System und es werden keine
zusätzlichen Reagenzien benötigt.
Am Tag der TK-Herstellung werden 2 ml der TK-Probe mittels steriler
Konnektion über einen Filter in den PALL eBDS-Probenbeutel gepresst
(Abb.10). Nach der Abtrennung wird der Probenbeutel für minimal 24
Stunden, maximal 30 Stunden auf einem horizontalen Schüttelblech bei
35°C inkubiert.
Abbildung 10: PALL eBDS-Probenbeutel
- 57 -
Nach der Inkubation erfolgt die Messung der O2-Utilisation mit dem
PALL eBDS Oxygen Analyzer (Abb. 11). Zur Probenmessung wird die
PALL eBDS-ID (Lot Nr.) auf der Etikettenlasche des Probenbeutels und
die TK-Pool-Identitätsnummer gescannt. Der Messfühler wird durch die
Membran in der Mitte des Detektionsports am PALL eBDS-Probenbeutel
bis zum Kanülenende eingeführt. Durch Drücken der Taste „Enter“ wird
der Messvorgang gestartet. Nach dem Beenden der Messung wird der
Messfühler in die Halterung am Analyzer gesteckt, um einen
Referenzwert (O2 % in atmosphärischer Luft, 21%) zu messen. Im
Anschluss erscheint im Display bei einer O2-Konzentration in der Probe
von >19,5% das Ergebnis „Bestanden“ oder bei einer Konzentration
≤19,5% „Nicht-Bestanden“. Die Probenmesswerte werden im Computer
gespeichert und am Ende des Tages wird eine aktuelle Liste der
Ergebnisse ausgedruckt (Abb. 12).
Abbildung 11: Der PALL eBDS Analyzer misst die O2-Konzen-
tration in der Luft des Probenbeutels
- 58 -
Die Nachweisgrenze für Bakterien wird vom Hersteller mit 1 bis 100
CFU/ml, in Abhängigkeit der Wachstumskinetik der Bakterien,
angegeben.
Analyser gibt Ergebnis Bestanden (>19,5%) oder Nicht Bestanden (<19,5%)
Herstellung des Pool-TK
Überführung des Entlüftugsbeutels in die zuständige Abteilung
Probenentnahme BacT/ALERT (sieh Abb.3)
Überführen von 2ml in PALL eBDS-Probenbeutel und gleichzeitige Thrombozytenentfernung mittels Filter
Inkubation bei 35°C unter Aggitation für mindestens 24h, max. 30h
Messung des O2-Gehaltes im Beutel
Messung des O2-Referenzwertes (Raumluft 21%)
Vollblutentnahme am Spendetag 1.Tag
2.Tag
3.Tag
Abbildung 12: Zeitschema PALL eBDS
- 59 -
3.4. Vorgehen bei positiven Testergebnissen
Es erfolgte eine kontinuierliche Überwachung der BacT/ALERT-
Inkubatoren, um bei positivem Testsignal sofort reagieren zu können.
3.4.1. Positive Ergebnisse im BacT/ALERT-System
Im Falle eines positiven Signals wurden die Flaschen frühestens 6
Stunden nach Auftreten des Signals aus dem Inkubator genommen und
diese zur Keimdifferenzierung an die Institute für Medizinische
Mikrobiologie Bochum oder Frankfurt gesandt. Proben die ein eindeutig
exponentielles Bild in der Wachstumskurve zeigten, wurden direkt
entnommen.
War nur eine der beiden Flaschen positiv, so wurde die Flasche ohne
positives Signal bis zu einem positiven Signal oder bis zum Ablauf der
maximalen Inkubationszeit weiter im BacT/ALERT-Inkubator belassen.
Das zugehörige TK einer positiven Probe wurde über das hausinterne
EDV-Programm umgehend gesperrt. Erfolgte bereits die Auslieferung,
wurde ein Protokoll zur Rückrufaktion an den Vertrieb weitergeleitet,
der sofort den Rückruf startete.
Aus dem zurückgestellten Entlüftungsbeutel des entsprechenden TK
und falls noch vorhanden aus dem TK selbst, erfolgte eine zeitnahe
zweite Probenverimpfung und Überprüfung auf Keimwachstum mit
dem BacT/ALERT-System.
Bei einem positiven Ausfall des Zweitansatzes, beimpft aus dem
Restmaterial des Entlüftungsbeutels bzw. des Hauptpräparates, erfolgte
eine Einsendung der entsprechenden Kulturflasche zur
Keimdifferenzierung an die Institute für Medizinische Mikrobiologie
Bochum oder Frankfurt.
- 60 -
Die Inkubation wurde bei negativem Testergebnis nach 7 Tagen
beendet.
3.4.2. Positive Ergebnisse im Scansystem™
Mittels des Scansystems wurden Proben aus 3 PTK gleichzeitig getestet.
Sollte das Ergebnis in der Probe positiv sein, so musste jedes beteiligte
Produkt einzeln einer zweiten Testung unterzogen werden, um zu
bestimmen, welches der beteiligten Produkte kontaminiert war. Die als
kontaminiert identifizierte Probe wurde an das Institut für medizinische
Mikrobiologie Bochum zur Keimdifferenzierung eingesandt. Falls
vorhanden wurde aus dem gelagerten Entlüftungsbeutel eine Probe in
der BacT/ALERT-Methode untersucht. Eine Quarantänelagerung bzw.
Rückholung und Nachtestung assoziierter Präparate erfolgte nach
Einzelfallentscheidung der Studienleitung.
Bei positivem Ausfall einer BacT/ALERT-Nachtestung erfolgte eine
Einsendung an das Institut für Medizinische Mikrobiologie Bochum.
3.4.3. Positive Ergebnisse im PALL eBDS
Im Falle einer positiven Reaktion im PALL eBDS-Test wurde der positiv
getestete PALL eBDS-Probenbeutel zur Keimdifferenzierung an das
Institut für medizinische Mikrobiologie Bochum eingesandt. Aus der
gelagerten Entlüftungsbeutelprobe der entsprechenden TK wurde eine
Wiederholungstestung mit der BacT/ALERT-Methode eingeleitet. Falls
noch asservierbar, wurde eine Nachtestung aus dem Original-TK in der
BacT/ALERT-Methode durchgeführt.
- 61 -
Eine Quarantänelagerung bzw. Rückholung und Nachtestung
assoziierter Präparate erfolgte nach Einzelfallentscheidung der
Studienleitung.
Bei positivem Ausfall einer BacT/ALERT-Nachtestung erfolgte eine
Einsendung der Kulturflaschen an das Institut für medizinische
Mikrobiologie.
3.4.4. Testung der verbundenen Erythrozytenkonzentrate bei
positiven Ergebnissen
Im Falle eines positiven Signals in einem der Pool-TK sollten auch die
assoziierten EK einer Sterilitätstestung unterzogen werden. Einem PTK
sind 4 EK zugeordnet. Aus diesen sollte, falls noch nicht ausgeliefert
bzw. transfundiert, eine aerobe und anaerobe Kultur im BacT/Alert-
System angelegt werden. Nach diesem Prinzip wurde mit allen EK
verfahren, die noch nicht ausgeliefert waren. Ausgelieferte EK wurden
zurückgeholt und ebenfalls getestet, soweit sie noch nicht transfundiert
waren.
3.5. Fragebogen zur klinischen Verträglichkeit der
Thrombozytenkonzentrate
Mit jedem TK wurde an den Anwender ein Fragebogen ausgegeben, mit
dem Daten bezüglich der Verträglichkeit der getesteten TK erfasst
werden sollten. Auf dem Fragebogen der TK wurden
Herstellungsdatum, Konservennummer und der Zeitpunkt der Abgabe
der TK ausgewiesen. Vom Anwender sollten mögliche relevante Daten
des TK-Empfängers (Diagnose, Größe, Gewicht, Alter, Geschlecht,
Transfusionszeitpunkt, Thrombozytenzahl vor und nach Transfusion),
- 62 -
Angaben bezüglich der Verträglichkeit (ohne/mit Nebenwirkungen,
Beginn der Symptomatik, welche Symptome) und weitere klinische
Angaben (Fieber, Blutungen, Antibiotikatherapie, Zytostatika,
Hypersplenismus, DIC, HIT, HLA/HPA-Antikörper) gemacht werden.
3.6. Mikrobiologische Untersuchungen
Die mikrobiologischen Untersuchungen zur Identifizierung der
kontaminierenden Bakterien wurden vom Institut für Medizinische
Mikrobiologie Bochum und vom Institut für Mikrobiologie der
Universität Frankfurt/Main durchgeführt. Dabei kamen
Standardmethoden wie Gramfärbung und Subkultivierung auf festen
Medien zum Einsatz. Es wurde Schokoladen-Agar, McConkey-Agar,
Sabouraud-Dextrose-Agar und bei anaerober Inkubation Columbia-Agar
verwendet. Die Bakteriendifferenzierung wurde mit biochemischen
Standardmethoden und molekularen Verfahren wie 16S-rDNA-
Sequenzierung oder sodA-Sequenzierung durchgeführt.
Weiter Untersuchungen wurden ausschließlich im Institut für
Medizinische Mikrobiologie Bochum vorgenommen. Die Typisierung
von Staphylokokken erfolgte mittels Pulsfeld-Gelelektrophorese. Die
Vergleiche von Propionibakterienstämmen erfolgte mittels Random-
Amplifikation polymorpher DNA (RAPD-PCR) mit dem Primer OLP-05
(Rossi et al., 1998; Goering et al.,1992).
3.7. Datenerfassung und Auswertung
Die Daten und Ergebnisse zu den untersuchten TK wurden in den
beteiligten Zentren in vorgegebener tabellarischer Form im Programm
Excel 2003 (Microsoft Corporation, USA) erfasst.
- 63 -
Folgende Daten wurden eingegeben:
Konservennummer, Art des TK, Entnahmedatum, Herstellungsdatum,
Zeitpunkt der Probenziehung, Zeitpunkt des Inkubationsbeginns,
Ergebnisse der aerobe und anaeroben Kulturen, ggf. Ergebnis der
Keimdifferenzierung, ggf. Datum der Ausgabe, Testergebnisse
verbundener EK.
Die statistische Auswertung erfolgte in Zusammenarbeit mit dem
Zentrum für Biomedizinische Methoden der Abteilung für Medizinische
Informatik, Biometrie und Epidemiologie der Ruhr-Universität Bochum.
Primäre Endpunkte waren Unterschiede zwischen den
Kontaminationsraten der verschiedenen Thrombozytenpräparationen.
Unterschiede wurden mittels Chi-Quadrattest auf ihre Signifikanz
überprüft und p-Werte <0,05 als signifikant gewertet. Die statistischen
Analysen wurden mit der Software SAS, Version 8.02 (SAS Inc.,
Chicago, Il.) und NCSS, Version 2001 (NCSS, Kaysville, UT) durchgeführt.
- 64 -
4. Ergebnisse
4.1. Bakterielle Kontaminationsraten in der BacT/ALERT-Testung
Nach Abschluss der Untersuchungen erfolgte für alle getesteten TK die
Zuordnung zu einem Testergebnis. Abbildung 6 gibt einen Überblick
hierzu.
1. Kultur
kein positives Signal
1. Kultur
positives Signal, kein Bakteriennachweis in der Kulturflasche
1. Kultur
positives Signal, Bakteriennachweis und Identifikation der Spezies
1. Kultur
positives Signal, Bakteriennachweis und Identifikation der Spezies
Negativ
2. Kultur
durchgeführt, negatives Ergebnis
Falsch positiv
2. Kultur
durchgeführt, negatives Ergebnis, oder positiv, aber keine Bestätigung der 1. pos. Kultur
Potentiell positiv
2. Kultur
positives Signal, Bakteriennachweis und Identifikation identischer Spezies
Bestätigt positiv
Abbildung 13: Definition der Testresultate des BacT/ALERT-
Screenings
- 65 -
Insgesamt wurden an 52.243 TK 282 positive Testergebnisse beobachtet
(Tab.4). Von diesen waren 98 TK potentiell positiv. Dabei zeigten die
Apherese-TK mit 0,32% eine signifikant höhere Rate als Plasma-PTK mit
0,12% und T-Sol-PTK mit 0,16% (p<0,001). Die Rate bestätigt positiver
TK aus den verschiedenen Herstellungsmethoden unterschieden sich
nicht signifikant.
Tabelle 4 : Resultate der Sterilitätstestung der TK
Endergebnisse
Produktart Anzahl der getesteten
TK
Anzahl der TK mit pos Signal
aerob und/oder anaerob
Falsch positiv
Potentiell positiv
Bestätigt positiv
n % n % n % n %
Apherese-TK1
15.198 115 0,76 54 0,36 48 0,32c 13 0,09
Plasma-PTK 22.044 96 0,44 54 0,24 26 0,12a,c 16 0,07
T-Sol PTK 15.001 71 0,47 39 0,26 24 0,16b,c 8 0,05
Total 52.243 282 0,54 147 0,28 98 0,19 37 0,07
1 Anzahl der Apherese-Prozeduren: Aus 11.822 Apheresen wurden zwei Einheiten hergestellt, aus 3.376 eine Einheit.
Die Gesamtzahl der Apherese-TK ist 27.020.
a: p=0,001 Plasms-PTK vs Apherese-TK
b: p=0,02 T-Sol-PTK vs Apherese-TK
C: p<0,001 Plasma-PTK und T-Sol-PTK vs Apherese-TK
Falsch positive Resultate fanden sich bei insgesamt 147 untersuchten
Produkten. Die Raten der einzelnen Produkte, ATK mit 0,35% (n=54),
- 66 -
Plasma-PTK mit 0,25% (n=54) und T-Sol-PTK mit 0,26% (n=39) falsch
positiven Ergebnissen, unterschieden sich nicht signifikant voneinander.
Zu Beginn der BacT/ALERT-Testung zeigte sich, dass die Ursache von
falsch positiven Testresultaten in der Fehlfunktion von
Inkubationszellen zu suchen war (GERMS Group, 2005). Bei der
Herstellung der Inkubationsflaschen verwendete der Hersteller jetzt
Kunststoffe statt Glas, zusätzlich kam ein veränderter colometrischer
Sensor zum Einsatz. Ein Teil der zu Beginn gefundenen falsch positiven
Testresultate konnte auf eine fehlerhafte Kalibrierung der Messzellen
im BacT/Alert-Automaten zurückgeführt werden. Der Ersatz
entsprechender Module beseitigte das Problem. Die falsch positiven
Testergebnisse werden hier nicht weiter betrachtet.
Der größte Anteil positiver Kulturergebnisse entfiel auf die anaeroben
Kulturflaschen. Tabelle 5 zeigt, dass 66% der potentiell positiven
Ergebnisse und mehr als 80% der bestätigt positiven Ergebnisse in
anaerober Kultur erzielt wurden.
Tabelle 5: Positive Testresultate in aerober/anaerober Kultur
Potentiell
positiv anaerob positiv
aerob positiv
anaerob und aerob positiv
98 65 66,3% 31 31,6% 2 2,0%
Bestätigt positiv anaerob positiv
aerob positiv
anaerob und aerob positiv
37 30 81,1% 3 8,1% 4 10,8%
Der Zeitabstand zwischen Abschluss der Präparateherstellung und dem
ersten positiven Kultursignal entschied darüber, ob die entsprechenden
TK zur Transfusion gelangten oder nicht. Tabelle 6 zeigt, dass bis 48
- 67 -
Stunden nach der Herstellung bereits 66% der insgesamt hergestellten
TK zur Transfusion abgegeben waren. Bei einem späten positiven
Kultursignal bestand somit kaum eine Chance, die Abgabe eines
möglicherweise bakteriell kontaminierten TK zu verhindern.
Tabelle 6: Zeitabstand zwischen Abschluss der Herstellung und erstem pos. Signal
Positive Signale
Gesamt 0 - 24 h 24 - 48 h 48 - 72 h 72 - 96 h > 96 h
282 28 81 30 42 101
Anteil der zu diesem Zeitpunkt abgegebenen TK aus der Gesamtproduktion
~ 40% ~ 66% ~ 87% ~ 99%
Von den 282 TK mit falsch positivem, potentiell positivem oder bestätigt
positivem Testergebnis waren 155 (55%) vor dem ersten positiven
Signal ausgegeben. Der Rückruf war nur bei einem potentiell positiven
ATK (Bacillus circulans) und einem bestätigt positiven PTK
(Staphylococcus saccharolyticus) erfolgreich.
- 68 -
4.1.1. Bakterienspezies
Das Bakterienspektrum, das in potentiell und bestätigt positiven TK
identifiziert wurde, ist in Tabelle 7 dargestellt.
Tabelle 7: Bakterienspezies in potentiell und bestätigt positiven TK
Präparateart
Spezies ATK Plasma-PTK T-Sol-PTK Gesamt
A: Bakterienspezies in 98 potentiell positiven TK
P. acnes 21 14 10 45
S. epidermidis 5 1 2 8
andere koagulase-negative 6* 6 2 14
Staphylokokken/Mikrokokken †
Bacillus-Familie ‡ 7 3 4 14
anaerobe Staphylokokken § 2
3 5
Coryneforme Bakterien ‽ 4
1 5
S. aureus
1
1
Bacteroides capillosus
1
1
Clostridium bifermentans
1 1
Peptostreptococcus prevotii
1 1
S. lugdunensis 1
1
Andere ∏ 2
2
Total 48 26 24 98
B: Bakterien in 37 bestätigt positiven TK
P. acnes 10 6 4 20
S. epidermidis 1 5 2 8
S. capitis 1 2
3
S. saccharolyticus
2 2 4
S. aureus 1
1
S. marcescens
1
1
Total 13 16 8 37
* Bei einem ATK mit S.capitis in der aeroben Kultur, wurde P. acnes aus der anaeroben Kultur isoliert.
† Staphylpcoccus capitis, S. cohnii, S. warneri, Micrococcus luteus.
‡ Bacillus circulans, B. endophyticus, B. firmus, B. licheniformis, B. pumilus, B. simplex, B. stearothermophilus, B. subtilis, Bacillus spp., Brevibacillus thermoruber, Paenibacillus turicensis.
§ Staphylococcus (Peptococcus) saccharolyticus.
‽ Brevibacterium casei, Corynebacterium afermentans, C. coyleae, C. imitans, Rothia dentocariosa.
∏ Nicht kultiviertes β-Proteobakterium, Nicht kultiviertes Soil Bakterium.
- 69 -
In den potentiell positiven TK fanden sich zu 46% Propionibakterien und
zu 30% Staphylokokken. Der Anteil der Propionibakterien in den
bestätigt positiven TK liegt mit 54% noch höher. Als Keime mit der
höchsten Pathogenität müssen Serratia marcescens und S.aureus
gelten, die in einem potentiell positiven und zwei bestätigt positiven TK
gefunden wurden. Bei diesen TK führten frühe positive Kultursignale
nach 9 bzw. 13 Stunden zu deren Ausschluss von der Transfusion.
Der hohe Anteil von Propionibakterien als Kontaminante erklären den
hohen Anteil an positiven anaeroben Kulturen, denn Propionibakterien
sind obligate Anaerobier. Aufgrund ihrer langsamen Vermehrung
erklären sie auch den hohen Anteil spät positiver Signale.
Die kontaminierenden Bakterienspezies unterschieden sich bei den
verschiedenen Präparatearten nicht voneinander.
4.1.2. Testergebnisse verbundener Erythrozytenkonzentrate
Für 50 potentiell positive TK wurden 200 verbunden EK identifiziert, von
welchen 147 (73,5%) als steril getestet wurden. 25 EK waren
transfundiert worden, ohne dass eine Transfusionsreaktion beobachtet
wurde, wie durch eine gezielte telefonische Befragung der zuständigen
Ärzte festgestellt wurde. 21 EK wurden vernichtet. In 7 EK konnte
Propionibacterium acnes in anaeroben Kulturen identifiziert werden.
Derselbe Keim war in den korrespondierenden TK entdeckt worden.
96 EK waren mit bestätigt positiven TK verbunden. Davon wurden 79 EK
(82,3%) negativ getestet, 6 (6,2%) wurden ohne eine TR verabreicht und
1 EK wurde vernichtet. Bei 10 der 24 bestätigt positiven TK konnte 1
kontaminiertes EK mit identischen Bakterien identifiziert werden.
- 70 -
Propionibakterien wurden in 9 Fällen entdeckt und Staphylococcus
captitis in einem Fall.
Bei den TK-Kontaminationen mit S. marcescens und S. aureus zeigten
die verbundenen EK kein Wachstum.
4.1.3. Bakterienspezies in potentiell positiven Thrombozyten-
konzentraten, transfundierte Einheiten und klinischer Follow up
Da der Rücklauf der Präparate-Begleitscheine aus den
transfundierenden Einrichtungen gering war, wurde nach Abschluss der
Testung beschlossen, zu allen Präparaten mit potentiell und bestätigt
positiven Testergebnissen eine telefonische Befragung der
verantwortlichen Ärzte durchzuführen.
Tabelle 8 zeigt zu den potentiell positiven TK die Bakterienspezies, die
Inkubationsdauer bis zum ersten positiven Kultursignal, die
transfundierten TK und das Ergebnis der klinischen Einschätzung.
Insgesamt wurden 74 ATK, welche aus 48 Apheresen gewonnen worden
waren, als potentiell positiv eingestuft. Von diesen wurden 55 ATK aus
35 Apheresen transfundiert. Bei den PTK wurden 29 Einheiten von 50
potentiell positiven PTK transfundiert.
Bei der Befragung wurden 4 Fälle berichtet, bei denen die Patienten in
zeitlichem Zusammenhang mit der TK-Transfusion einen
Temperaturanstieg zeigten, bzw. eine Sepsis entwickelten. Ein
Kausalzusammenhang mit der Transfusion wurde in allen Fällen
verneint. Weitergehende Untersuchungen unterblieben und als
Erklärung wurden andere Gründe vermutet.
- 71 -
Tabelle 8: Potentiell positive TK: Bakterienspezies, Inkubationszeit bis zum ersten positiven Signal, transfundierte TK und klinisches Follow-up
Spezies Anzahl und Art der TK
Inkuba-tionszeit bis zum ersten pos. Signal
Anzahl und Art d. transfun-dierten TK
Klinisches Follow-up/ Transfusionsreaktionen (TR)
Propionibacterium acnes 21 ATK, 4,9 Tage 37 ATK aus 1x Temperaturanstieg, vom Arzt nicht als TR eingestuft
38 Einh.
(3,7-6,3) 21 Apheresen
24 PTK 5,4 Tage 14 PTK 1x vorübergehender Temperaturanstieg, rückläufig unter Antibiotikagabe, vom Arzt nicht als TR eingestuft
(3,7-5,7)
1x multimorbider Pat. mit Sepsis und Neutropenie nach Knochenmarkstransplantation, Pat. verstarb, vom Arzt nicht als TR eingestuft
Staphylococcus 2 ATK, 2x2,7 Tage 1 ATK aus Keine TR
saccharolyticus
3 Einh.
1 Apherese
3 PTK 3,3 Tage 3 PTK Keine TR
(2,3-4,2)
Staphylococcus 5 ATK, 1,1 Tage 2 ATK aus Keine TR
epidermidis
7 Einh.
(0,6-2,0) 2 Apheresen
3 PTK 20,3 Stunden
- -
(20,0-20,9)
Bacillus circulans, B. endophyticus, 7 ATK, 1,9 Tage 4 ATK aus Keine TR
B. firmus, B. licheniformis, B. pumilus, B.simplex, B. stearothermophilus, B. subtilis, Bacilus spp., Brevibacillus thermoruber, Paenibacillus turicensis
9 Einh.
(0,8-3,6) 2 Apheresen
7 PTK 1,8 Tage 3 PTK 1x Temperaturanstieg bis 39°C, Pat. mit Neutropenie, vom Arzt nicht als TR eingestuft (Bacillus firmus)
(0,8-6,8)
Staphylococcus capits‡, S. cohnii, 5 ATK, 1,5 Tage 3 ATK aus Keine TR
S. hominis, S. warneri, S. lugdunensis
6 Einh.
(0,6-4,0) 2 Apheresen
1 PTK 19 Stunden - -
Corynebacterium afermentans, 4 ATK, 2,1 Tage 5 ATK aus Keine TR
C. coyleae, C. imitans, Rothia dentocariosa, Brevibacterium casei
5 Einh.
(1,5-3,6) 4 Apheresen
1 PTK 1,2 Tage 1 PTK Keine TR
Mikrococcus luteus 1 ATK 3,3 Tage 1 ATK Keine TR
7 PTK 2,7 Tage 5 PTK Keine TR
(1,5-5,6)
Staphylococcus lugdunensis 1 ATK 1,2 Tage -
Staphylococcus aureus 1 PTK 22,1 Stunden
-
Bacteroides capillosus 1 PTK 1,6 Tage 1 PTK
Clostridium bifermentans 1 PTK 4,5 Tage 1 PTK
Peptostretococcus prevotii 1 PTK 4,5 Tage 1 PTK
Nichtkultiviertes β-Proteobakterium 1 ATK, 1,4 Tage 1 ATK aus
2 Einh.
1 Apheresen
Nichtkultiviertes Soil Bakterium 1 ATK, 1,2 Tage 1 ATK aus
2 Einh.
1 Apheresen
Gesamt 48 ATK,
35 ATK aus
74 Einh.
Apheresen mit 55 Einh.
50 PTK 29 PTK
ATK Apherese-Thrombozytenkonzentrate, PTK gepoolte Thrombozytenkonznetrate, TR Transfusionsreaktion
‡ In einem ATK S.capitis und P. acnes
- 72 -
4.1.4. Bakterienspezies in bestätigt positiven Thrombozyten-
konzentraten, transfundierte Einheiten und klinischer Follow up
Von 29 transfundierten TK waren 25 mit Propionibakterien
kontaminiert. Tabelle 9 zeigt, dass die Transfusion aufgrund der langen
Zeitphase zwischen Inkubationsbeginn und positiven Signal Ursache
dafür ist, dass die Anwendung nicht verhindert werden konnte.
Tabelle 9: Bestätigt positive TK: Bakterienspezies, Inkubationszeit bis zum ersten positiven Signal, transfundierte TK und klinisches Follow-up
Spezies Anzahl und Art der TK
Inkuba-tionszeit bis zum ersten pos. Signal
Anzahl und Art d. transfun-dierten TK
Klinisches Follow-up/ Transfusionsreaktionen (TR)
Propionibacterium acnes 10 ATK, 4,5 Tage 17 ATK aus 1x Pat. dem beide Einheiten einer Apherese transfundiert wurden, febrile Reaktion, klinisch keine schwere TR, vom Arzt nicht als TR eingestuft
17 Einh.
(3,6-6,4) 10 Apheresen
10 PTK 4,3 Tage 8 PTK 1x Temperaturanstieg bei Pat. mit
akuter myeloischer Leukämie, unter Antibiotikagabe schnell rückläufig, vom Arzt nicht als TR eingestuft
(3,4-5,8)
Staphylococcus 1 ATK, 15,7 Stunden 1 ATK aus Keine TR, Pat. unter antibiotischer Therapie
epidermidis
2 Einh.
1 Apherese
7 PTK 20,2 Stunden - -
(17,6-24,5)
Staphylococcus 4 PTK 2,7 Tage 2 PTK Keine TR
saccharolyticus
(2,3-3,1)
Staphylococcus 1 ATK 15,1 Stunden 1 ATK Keine TR
capitis 2 PTK 18,9 und -
-
26 Stunden
Staphylococcus 1 ATK 9,1 Stunden -
-
aureus
Serratia 1 PTK 12,8 Stunden -
-
marcescens
Gesamt 13 ATK,
12 ATK aus
24 Einh.
Apheresen mit 19 Einh.
50 PTK 10 PTK
ATK Apherese-Thrombozytenkonzentrate, PTK gepoolte Thrombozytenkonznetrate, TR Transfusionsreaktion
- 73 -
Spontanberichte zu TR bei den bestätigt positiven TK gingen nicht ein.
Die nachträgliche Befragung der transfundierenden Ärzte deckte 2 Fälle
mit Propionibakterien auf, bei denen die Patienten Fieberepisoden
hatten. Diese wurden von den Ärzten jedoch als nicht
transfusionsassoziiert und als nicht bakteriell bedingt eingeordnet.
Daher erfolgten keine weiteren Untersuchungen.
4.2. Septische Transfusionsreaktionen bei falsch negativ getesteten
Thrombozytenkonzentraten
Zu einem Apherese-TK, welches in zwei therapeutische Einheiten
aufgeteilt und in der Sterilitätstestung als negativ befundet wurde,
kamen Meldungen über schwerwiegende Transfusionsreaktionen. In
einem Fall war eine Patientin mit der Diagnose Non-Hodgkin-Lymphom
betroffen, welche nach myeloablativer Radiochemotherapie zur
Vorbereitung auf eine Knochenmarktransplantation eine Einheit 4,1
Tage nach Herstellung transfundiert bekam. Nach der Transfusion
entwickelte die Patientin eine respiratorische Insuffizienz und
Kreislaufinstabilität. Trotz sofortiger antibiotischer Therapie entwickelte
die Patientin ein septisches Krankheitsbild mit Multiorganversagen,
woran sie 10 Tage später verstarb. In der angelegten Blutkultur der
Patientin konnte ebenso wie im Restmaterial aus dem TK-Beutels
Klebsiella pneumoniae nachgewiesen werden.
Eine zweite Patientin mit der Diagnose einer akuten myeloischen
Leukämie erhielt die zweite Einheit aus derselben Apherese 4,2 Tage
nach Herstellung. Sie reagierte mit Fieber und Kreislaufinstabilität. Nach
notwendiger Katecholamingabe und einer Antibiotikatherapie
stabilisierte sich der Zustand. In der Blutkultur und dem Restmaterial
- 74 -
aus dem TK-Beutel konnte ebenfalls Klebsiella pneumoniae
nachgewiesen werden.
Die Probe für die BacT/ALERT-Testung wurde 20 Stunden nach der
Herstellung, vor der Teilung in 2 Einheiten, gezogen. Aus der Probe
wurde ebenfalls Material für die Testung im PALL eBDS gezogen. In
beiden Testsystemen lautete das Ergebnis negativ. Die
Nachuntersuchung des Spenders, der primär gezogenen
Untersuchungsprobe und der weiteren Materialien ergab keinen Anhalt
für eine Kontaminationsquelle mit K. pneumoniae.
4.3. Vergleich von Keimisolaten aus unterschiedlichen Proben
Bei sieben der neun bestätigt positiven Pool-TK, bei denen ein
assoziiertes EK ebenfalls mit Propionibakterien kontaminiert war,
wurde ein Vergleich der Keimisolate mittels RAPD-PCR durchgeführt. In
allen Fällen konnte eine klonale Beziehung zwischen den Isolaten aus
den Pool-TK und den EK nachgewiesen werden. Hierdurch konnte als
Quelle für die Kontamination die Vollblutspende in allen Fällen
identifiziert werden. Tabelle 10 gibt einen Überblick über die Herkunft
der untersuchten Proben und die Ergebnisse der RAPD-PCR.
- 75 -
Tabelle 10: RAPD-PCR Ergebnisse: Propionibakterien Isolate aus bestätigt positiven Pool-TK und assoziierter EK ID Nummer
Kulturergebnis der EK Herkunft der Probe Testergebnis: klonale Beziehung
479 3 EK negativ PTKa Sammelbeutel, EK bestätigt
1 EK: Propionibacterium acnes
671 3 EK negativ PTKb Sammelbeutel, PTK, EK bestätigt
1 EK: Propionibacterium acnes
1373 3 EK negativ PTKa Sammelbeutel, EK bestätigt
1 EK: Propionibacterium acnes
5466 3 EK negativ PTKa Sammelbeutel, EK bestätigt
1 EK: Propionibacterium acnes
5716 3 EK negativ PTKb Sammelbeutel, PTK, EK bestätigt
1 EK: Propionibacterium acnes
6306 3 EK negativ PTKa Sammelbeutel, EK bestätigt
1 EK: Propionibacterium acnes
7158 3 EK negativ PTKa Sammelbeutel, EK bestätigt
1 EK: Propionibacterium acnes
a PTK transfundiert, keine Transfusionsreaktion
b PTK nicht ausgegebnen
Staphylokokkus-Arten, welche in 2 Apherese-TK und 5 Pool-TK
detektiert wurden, wurden in der Pulsfeld-Gel-Elektrophorese
verglichen. Tabelle 11 zeigt die Herkunft der untersuchten Proben und
die Testergebnisse. In 6 Fällen handelte es sich um identische Isolate, in
einem Fall um verwandte Isolate.
- 76 -
Tabelle 11: Pulsfeld-Gelelektrophorese: Typisierung von Staphylokokken ID Nummer
Art des PC
Spezies Kulturergebnis EK
Herkunft der Probe Testergebnis
656 ATKa Staphylococcus
aureus ATK Sammelbeutel,
zweite Kulturflasche, ATK
Identische Isolate
2576 ATKb Staphylococcus
capitis ATK Sammelbeutel,
erste Kulturflasche, Rest aus ATK nach Transfusion
Identische Isolate
1198 PTKa Staphylococcus 1 EK: S. capitis Erste Kulturflasche,
PTK, EK Identische Isolate capitis 3 EK: negativ
802 PTKa Staphylococcus
epidermidis 4 EK: negativ PTK Sammelbeutel,
PTK Verwandte Isolate
2772 PTKa Staphylococcus
capitis 4 EK: negativ Erste Kulturflasche,
PTK Identische Isolate
4516 PTKa Staphylococcus
epidermidis 4 EK: negativ Erste Kulturflasche,
PTK Sammelbeutel, PTK
Identische Isolate
5339 PTKa Staphylococcus
epidermidis 4 EK: negativ PTK Sammelbeutel,
PTK Identische Isolate
a TK nicht ausgegeben
b TK transfundiert, keine Transfusionsreaktion
4.4. Ergebnisse der Testung mit dem Scansystem und dem PALL
eBDS
Parallel wurden 6307 Plasma-PTK im BacT/ALERT, Scansystem und PALL
eBDS getestet. Von den Apherese-TK wurden 4730 Präparate im
BacT/ALERT und im PALL eBDS untersucht. Alle Proben ohne eine
positive Reaktion in allen drei Testmethoden wurden als negativ
bezeichnet. Proben mit einem positiven Signal in einem der Tests
wurden als initial reaktiv bewertet. Wurde in der Probe, die ein
positives Signal zeigte, ein Bakterienstamm nachgewiesen, so wurde
diese Probe als potentiell positiv bezeichnet. Konnte bei einer potentiell
positiven Probe dasselbe Bakterium in einem zweiten Test aus dem
- 77 -
Satellitenbeutel, dem TK oder im Falle von PTK aus einem zugehörigen
EK nachgewiesen werden, so wurde diese Probe als bestätigt positiv
bewertet.
Wie in Tabelle 12 dargestellt, zeigten 25 PTK im BacT/ALERT ein initial
reaktives Ergebnis. In 13 dieser Proben wurden Bakterien identifiziert.
Nur 1 PTK zeigte ein bestätigt positives Ergebnis mit S. saccharolyticus.
Keine dieser Proben war im Scansystem oder PALL eBDS positiv. Nur 3
PTK waren initial reaktiv im PALL eBDS, die 2. Untersuchung fiel negativ
aus, ebenso die BacT/ALERT-Testung diese Präparate.
Bei den Apherese-TK waren im BacT/ALERT 39 Proben initial reaktiv, in
23 davon waren Bakterien nachweisbar. Bestätigt positiv waren 3 ATK,
die im PALL eBDS negative Ergebnisse zeigten. In einem ATK, das im
PALL eBDS potentiell positiv war, konnten in der Probe S. hominis und S.
epidermidis nachgewiesen werden. Die Wiederholungsuntersuchungen
fielen negativ aus. Wie zuvor unter 4.2 bereits beschrieben fiel die
Testung einer mit K. pneumoniae kontaminierten ATK im BacT/ALERT
und im PALL eBDS negativ aus.
- 78 -
Tabelle 12: Vergleich von BacT/ALERT, Scansystem und PALL eBDS
BacT/ALERT Scansystem PALL eBDS
Initial reaktiv Potentiell positiv
Bestätigt positiv
Initial reaktiv
Potentiell positiv
Bestätigt positiv
Initial reaktiv
Potentiell positiv
Bestätigt positiv
Produkt Gesamt
Aer
ob
e
Flas
che
An
aero
be
Flas
che
Aer
ob
e
Flas
che
An
aero
be
Flas
che
Aer
ob
e
Flas
che
An
aero
be
Flas
che
PTK 6307 7 19 6 8 1a 1a 0 0 0 3 0 0
PTK 6307 Gesamt: 25
Gesamt: 13
Gesamt: 1
ATK 4730 10 29 6 17 0 3
c NT NT NT 1 1
b 0
ATK 4730 Gesamt: 39
Gesamt: 23
Gesamt: 3
Total 11037 64 36 4 0 0 0 4 1 0
Pool-TK (PTK) wurden parallel mit BacT/ALERT, Scansytsem und PALL eBDS getestet. Apherese-TK wurden mit BacT/ALERT und PALL eBDS getestet.
Alle Proben mit einem positiven Signal wurden mikrobiologisch untersucht. Initial reaktive Proben waren nur im Screening positiv. Bakterien wurden bei initial positiven und bestätigt positiven Proben gefunden. Bei bestätigt positiven Proben wurde in der zweiten Probe dasselbe Bakterium nachgewiesen. a Staphylococcus saccharolyticus
b Staphylococcus hominis und Staphylococcus epidermidis
c Propionibacterium acnes
Ein ATK, welches mit Klebsiella pneumoniae kontaminiert war, wurde im BacT/ALERT und PALL eBDS negativ getestet.
NT = nicht getestet
4.4.1. Sensitivität und Spezifität
Die Rate falsch positiver Testergebnisse bei PTK lag für das BacT/ALERT
bei 0,25% (28 von 11037). Für das PALL eBDS lag die Rate mit 0,03% (3
von 11037) deutlich niedriger. Das Scansystem zeigte in 6307 Testen
kein reaktives oder positives Resultat. Damit zeigten das PALL eBDS und
das Scansystem gegenüber BacT/ALERT eine höhere Spezifität.
Da die tatsächliche Anzahl der positiven Proben als unbekannt gelten
musste, wurde die Sensitivität der drei Methoden kalkuliert. Hierzu
wurde die Anzahl der mit dem jeweiligen Verfahren entdeckten
potentiell positiven Proben durch die Anzahl der potentiell positiven
Proben in den drei Messverfahren geteilt.
- 79 -
Bei den PTK wurden mit dem BacT/ALERT 13 potentiell positive Proben
entdeckt (13/13). Die Sensitivität beträgt 100%. Keine dieser Proben
wurde im Scansystem (0/13, Sensitivität 0%) und im PALL eBDS (0/13,
Sensitivität 0%) erkannt.
Bei den ATK wurden mit dem BacT/ALERT 23 potentiell positive Proben
gefunden. Eine Probe wurde nicht als positiv erkannt, die im PALL eBDS
Bakterien nachwies.
Für die Untersuchungen aller Prodkte (PTK und ATK) war die Sensitivität
des BacT/ALERT (36/37 Proben, Sensitivität 93,7%) am höchsten,
gefolgt vom PALL eBDS (1/37 Proben, Sensitivität 2,7%) und dem
Scansystem (0/13 Proben, Sensitivität 0%)
- 80 -
5. Diskussion
5.1. Kontaminationsraten von Thrombozytenkonzentraten
Die Kontaminationsraten von TK, über die in der Literatur berichtet
werden, variieren erheblich. Ursache ist die Heterogenität der Studien.
Eine Reihe von Studien berichtet über BacT/ALERT-Screening.
Methodische Unterschiede liegen vor allem im Zeitpunkt der
Probenziehung aus den TK, dem Inokulumvolumen und der
Kulturmethode (nur aerob oder aerob und anaerob). Das Predonation
Sampling wurde nur teilweise eingesetzt. Die Herstellungsmethoden
der TK variieren von der Gewinnung mittels Apherese über Konzentrate
aus einem Vollblut, Poolherstellung aus 4 bis 6 Einzelkonzentraten im
funktionell geschlossenen System bis hin zu TK aus zuvor gepoolten
Buffy-Coats mit Plasma oder Thrombozytenlagerlösung.
In unserer Studie wurden 52.243 TK aus der Herstellung der neun
teilnehmenden Zentren der DRK-Blutspendedienste an einer
Präparateprobe auf Sterilität getestet. In die Testung wurden drei
verschiedene Produktionslinien einbezogen: 15.198 Apherese-TK mit
insgesamt 27.020 therapeutischen Einheiten, 15.001 Pool-TK mit der
Thrombozytenlagerlösung T-Sol und 22.044 Pool-TK mit Plasma, jeweils
hergestellt aus 4 Buffy coats.
Bei den 52.243 getesteten TK wurden insgesamt 282 (0,54%) positive
Kulturergebnisse in der ersten Kultivierung erzielt. 147 (0,28%) falsch
positive Resultate, ohne Keimnacheis in der ersten und zweiten
Kultivierung, zeigten sich insbesondere in der Anfangsphase der Studie
als technisches Problem mit Fehlfunktionen der BacT/Alert-
- 81 -
Inkubationszellen (GERMS, 2005). Bei 98 (0,19%) der TK konnte die
zweite Kultivierung das positive Ergebnis der ersten nicht bestätigen, sie
wurden als potentiell positiv bewertet. Die Rate der potentiell positiven
Apherese-TK (0,32%) war im Vergleich zu Pool-TK (0,13%) signifikant
höher (p<0,001). Durch einen Bakteriennachweis und die Identifikation
identischer Spezies in der ersten und zweiten Kultivierung konnten 37
(0,07%) der TK als bestätigt positiv bewertet werden. Der Vergleich der
bestätigt positiver Testergebnisse zeigte keinen signifikanten
Unterschied zwischen den Apherese-TK und Pool-TK.
Eine Studie des amerikanischen Roten Kreuzes (ARC) berichtet über die
BacT/ALERT-Testung von 350.658 Apherese-TK (Fang et al., 2005). Mit
einem Probenvolumen von 4 ml, gezogen spätestens 4 Stunden nach
Abschluss der Herstellung, inkubiert in aerober Kultur zeigte die Studie
eine Rate von 0,019% bestätigt positiven Ergebnissen. In unserer Studie
wurde ein Probenvolumen von mindestens je 7,5 ml in aerober und
anaerober Kulturflasche untersucht. Würde man nur die bestätigt
positiven TK aus der aeroben Kultur zum Vergleich heranziehen, läge
die Kontaminationsrate von Pool-TK bei 0,011% (1 auf 9.261) und von
Apherese-TK bei 0,019% (1 auf 5.066) und wäre mit der Rate der Studie
des ARC vergleichbar. Einen Überblick über Methoden und Ergebnisse
von Studien zum BacT/ALERT-Screening von TK zeigt Tabelle 13.
Brecher et al. berichten über eine Kontaminationsrate von 0,29% bei
2.397 Apherese-TK, die aerober und anaerober Kultur nach
Probenziehung an Tag 2 und am Ende der Haltbarkeitsfrist (Tag 5)
untersucht wurden (Brecher et al., 2003).
- 82 -
Tabelle 13: Überblick über Methoden und Ergebnisse von Studien zum BacT/ALERT-Screening von Thrombozytenkonzentraten Referenz/Land Methode Anzahl und Art
der getesteten TK Testergebnisse Klinische
Angaben
Brecher et al., 2003 USA
• 4ml aerob und 4 ml anaerob
• 2.397 Apherese-TK • 7 (0,29%) bestätigt positiv
• 4 TK mit Propionibakterien transfundiert
• Probenziehung an Tag 2 der Haltberkeitsfrist und bei Abgabe bzw. am Verfallsdatum
• 5 Tage Haltbarkeitsfrist
• keine TR
• kein Predonation Sampling
Macauley et al., 2003 Nordirland
• 5-7 ml aerob • 3.285 Pool-TK aus 4 Buffy coats • 1.600 Apherese-TK
• 12 (0,36%) bestätigt positiv • 1 (0,06%) bestätigt positiv
• 1 TK mit Propionibakterien transfundiert
• Probenziehung an Tag 2 der Haltberkeitsfrist
• kein Predonation Sampling
• 5 Tage Haltbarkeitsfrist
• keine TR
Munksgaard et al., 2004 Dänemark
• 10 ml aerob • 20.761 Pool-TK aus 4 Buffy coats • 1.296 Apherese-TK
• 70 (0,32%) bestätigt positiv • 0 bestätigt positiv
• 26 TK mit Propionibakterien und Corynebakterien transfundiert • keine TR
• Probenziehung 3-30 Stunden nach Venenpunktion
• kein Predonation Sampling
• 7 Tage Haltbarkeitsfrist
Larsen et al., 2005 Norwegen
• 5-10 ml aerob • 30.993 Pool-TK aus 4 Buffy coats • 5.903 Apherese-TK
• 12 (0,03%) bestätigt positiv • 29 TK (0,08%) mit positiver 1. Kultur nicht nachgetestet
• keine TR
• Probenziehung 24 Stunden nach Entnahme
• kein Predonation Sampling
• 6,5 Tage Haltbarkeitsfrist
Fang et al., 2005 USA
• 4 ml aerob • 350.658 Apherese-TK
• 68 (0,019%) bestätigt positiv
• kein TK mit bestätigt positiver Kultur transfundiert
• Probenziehung bis spätestens 4 Stunden nach Herstellung
• 5 Tage Haltbarkeitsfrist
• 12 Stunden TK-Quarantäne nach Inkubations-beginn
• 3 septische TR durch negativ getestete TK mit S. lugdunensis, S.epidermidis, koagulase negative Staphylokokken
• kein Predonation Sampling
Te Boekhorst et al., 2005 Niederlande
• 5-10 ml in aerober und anaerober Kultur
• 28.104 Pool-TK aus 5 Vollbluten mit Additivlösung
• 185 (0,65%) Kulturen mit Keimnachweis, keine Untersuchung in 2. Kultur
• 113 TK mit positivem Kulturergebnis transfundiert, ohne TR
• Probenziehung 2 Stunden nach Herstellung
• 5 Tage Haltbarkeitsfrist
• 2 septische TR durch negativ getestete TK mit Bacillus cereus
• kein Predonation Sampling
- 83 -
Referenz/Land Methode Anzahl und Art der getesteten TK
Testergebnisse Klinische Angaben
Kleinman et al., 2006 USA
• 4 ml in arober Kultur • 122.971 Apherese-TK • 13.579 Pool-TK, Proben aus Vollblut vor Pooling gezogen
• 21 (0,017%) bestätigt positiv • 1 (0,007%) bestätigt positiv
• Abgabe von nur 1 TK mit bestätigt positiver Kultur
• Probenziehung 24 Stunden nach Herstellung
• keine TR
• Predonation Sampling bei einer Teilmenge der Apherese
• 5 Tage Haltbarkeitsfrist
• 24 Stunden TK-Quarantäne nach Inkubations-beginn
de Korte et al., 2006 Niederlande
• 5-10 ml in aerober und anaerober Kultur
• 113.093 Pool-TK aus 5 Buffy coats • 8000 Apherese-TK
• 835 (0,74%) bestätigt positiv • 18 (0,23%) bestätigt positiv
• 40% der TK mit positivem Kultursignal transfundiert • 2 Fälle mit Fieber nach Transfusion • 2 septische TR durch negativ getestete TK mit Bacillus cereus (bereits von Te Boekhorst berichtet)
• Probenziehung 2-12 Stunden nach Herstellung
• 5 Tage Haltbarkeitsfrist
• bei Teilmenge mit Predonation Sampling 0,32% bestätigt positiv, ohne Predonation Sampling 0,78% bestätigt positiv
• Predonation Sampling bei Teilmenge
Ramirez-Arcos et al., 2007 Kanada
• 3,5-10 ml in aerober Kultur
• 82.004 Apherese-TK
• 6 (0,0073%) bestätigt positiv
• bestätigt positive TK nicht transfundiert
• Probenziehung 14-30 Stunden nach Herstellung
• 5 Tage Haltbarkeitsfrist
• 2 schwerwiegende septische TR durch negativ getestete TK mit Serratia marcescens/Salmonella sp.
• kein Predonation Sampling
methodische Unterschiede zwischen den Testeinrichtungen
Eder et al., 2007 USA
• 4-5 ml in aerober Kultur
• 1.496.134 Apherese-TK
186 (0,018%) bestätigt positiv
• 1 bestätigt positives TK transfundiert ohne TR • Im Testzeitraum 20 Fälle mit transfusionsassoziierter Sepsis, davon 3 tödliche Verläufe mit negativ getesteten TK durch S.lugdunensis, S.aureus (2) alle an Tag 5 der Haltbarkeitsfrist
• Probenziehung spätestens 24 Stunden nach Herstellung
• 5 Tage Haltbarkeitsfrist
• 12 Stunden TK-Quarantäne nach Inkubations-beginn
• Predonation Sampling
TK=Thrombozytenkonzentrat, TR=Transfusionsreaktion
- 84 -
Macauley et al. untersuchten 3.285 Pool-TK mit 5-7 ml Probenvolumen
in aerober und anaerober Kultur und fanden 0,36% bestätigt positiv
(Macauley et al., 2003). Bei 1.600 Apherese-TK fanden sie eine deutlich
niedrigere Rate von 0,06%, die der in unserer Studie festgestellten Rate
entspricht.
Munksgaard et al. fanden eine Rate von 0,32% bestätigt positiver Pool-
TK bei einem Probenvolumen von 10 ml in aerober Kultur (Munksgaard
et al., 2004). Die Blutspenden erfolgten ohne Predonation Sampling.
Dagegen stellten Larsen et al. unter aeroben Kulturbedingungen an
36.896 TK (84% Pool-TK, 16% Apherese-TK) eine Rate von 0,03%
bestätigt positiven TK fest (Larsen et al., 2005). Allerdings wurden in
dieser Studie 0,08% der Präparate mit positiver erster Kultur nicht
nachgetestet.
Aus den Niederlanden berichten te Boekhorst et al. über die Testung
von 28.104 Pool-TK in aerober und anaerober Kultur (Te Boekhorst et
al., 2005). Die Kontaminationsrate von 0,65% umfasst alle Kulturen mit
Keimnachweis, eine Bestätigungsuntersuchung in zweiter Kultur
erfolgte nicht.
Kleinman et al. berichten über die BacT/ALERT-Testung von 122.971
Apherese-TK in aerober Kultur mit einer Kontaminationsrate von
0,017% (Kleinmann et al., 2006).
Ebenfalls aus den Niederlanden stammen die Daten von de Korte et al.
über das Screening von 8.000 Apherese-TK und 113.093 Pool-TK in
aerober und anaerober Kultur. Bei den Pool-TK wurde eine Teilmenge
mit Predonation Sampling gewonnen und zeigte eine
- 85 -
Kontaminationsrate von 0,32% im zu TK ohne PDS mit einer Rate von
0,78% (de Korte et al., 2006).
Eine kanadische Studie von Ramirez-Arcos et al. fand bei Apherese-TK
eine bestätigte Kontaminationsrate von 0,0073%, allerdings nur in
aerober Kultur untersucht (Ramirez-Arcos et al., 2007). Eder et al.
berichten über eine große Anzahl von Apherese-TK, die einem
Bakterien-Screening im BacT/ALERT mit aerober Kultur untersucht
wurden, davon waren 0,018% bestätigt positiv (Eder et al., 2007).
Nicht nur die Kulturverfahren (aerob/anaerob) werden das Ergebnis der
BacT/ALERT-Testung beeinflussen, sondern auch der Zeitpunkt der
Probenziehung aus dem Präparat. Die zuvor zitierten Studien
unterschieden sich darin beträchtlich. So wurden bei den Pool-TK die
Proben zwischen 3 und 30 Stunden nach der Venenpunktion oder 0 bis
24 Stunden nach Abschluss der Präparation gezogen. Aus den
Apherese-TK wurden die Proben zwischen 2 und 24 Stunden nach der
Herstellung gezogen. Ein optimaler Zeitpunkt für die Probenziehung ist
somit nicht definiert und sollte Gegenstand weiterer Studien sein.
Ein weiterer wesentlicher Faktor scheint das Predonation Sampling zu
sein, dessen Wirksamkeit bezüglich der Reduktion des
Bakterieneintrags in das gespendete Blut durch Wagner et al. gezeigt
werden konnte (Wagner et al., 2000). In der Studie wurde an einem in
vitro Modell gezeigt, dass die Entfernung der ersten 21 bis 42 ml einer
Blutspende den Eintrag an Bakterien um eine 10er Potenz reduzieren
kann. In einer Studie an Blutspenden teilten Bruneau et al. das
Blutvolumen des Predonation Samplings in zwei Teile, S1 und S2 mit je
15ml, auf und untersuchten beide Proben im BacT/ALERT-System.
- 86 -
(Bruneau et al., 2001). Von den untersuchten 3385 Spenden waren 76
in S1 und/oder S2 positiv. Um die Effektivität des Predonation
Samplings darzustellen, verglichen sie das Verhältnis von in S2
negativen Proben, welche in S1 positiv waren. Hier konnte gezeigt
werden, dass in 75% der Fälle nur die ersten 15 ml (S1) ein positives
Ergebnis zeigten, während in den zweite 15 ml (S2) kein bakterielles
Wachstum nachgewiesen werden konnte. Die Abtrennung der ersten
30 bis 40 ml Blut bei der Spende wurde in den an dieser Studie
beteiligten Zentren in 2003 eingeführt, sodass die TK hiervon profitieren
konnten.
Im Gegensatz zu anderen Studien konnten wir beim Screening einer
großen Anzahl an Pool-TK und Apherese-TK keinen Unterschied in den
Kontaminationsraten der Präparate feststellen. Ness et al. postulierten,
dass die ausschließliche Transfusion von Einzel-TK aus Apherese das
Risiko der transfusionsassoziierten Sepsis reduziere, da ihre
Kontaminationsrate niedriger sei, als die von Pool-TK (Ness et al., 2001).
Pool- und Apherese-TK sind bei der Anwendung der für Deutschland
festgelegten Standards bei der Herstellung nach unseren Ergebnissen
nicht mit unterschiedlichen Risiken bezüglich der Belastung mit
Bakterien behaftet.
Für den Vergleich der Kontaminationsraten von TK können nur
Testresultate herangezogen werden, die mit denselben Methoden
geprüft und zuvor unter vergleichbaren Bedingungen hergestellt
wurden.
- 87 -
Insgesamt erwies sich die zeitnah zur Herstellung begonnene Testung
von Proben aus TK mit BacT/ALERT als durchführbar in der
Blutbankroutine.
5.2. Bakterienspezies und ihre klinische Bedeutung
Das Spektrum der detektierten Bakterien stammt überwiegend aus der
transienten und residenten Hautflora und zeigt die Grenzen der
Hautdesinfektion auf (de Korte et al., 2006). Das mikrobielle Spektrum
ist vergleichbar mit anderen Studien, die ebenfalls mit aeroben und
anaeroben Kulturen durchgeführt wurden. (Te Boekhorst et al., 2005;
Brecher et al., 2003; Macauley et al., 2003; de Korte et al., 2006).
Auffällig ist der hohe Anteil an TK, die mit Propionibakterien belastet
sind. Propionibakterien residieren in Haarfollikeln und Schweißdrüsen-
ausführungsgängen und können sich somit der Hautdesinfektion an der
Oberfläche entziehen. Propionibakterien gelten als geringgradig
pathogen. Störmer et al. berichten über 6 Fälle von Transfusionen mit
TK, die mit Propionibakterien kontaminiert waren (Störmer et al., 2008).
Sie stellten keine Transfusionsreaktion fest. Die Autoren untersuchten
das Wachstumsverhalten von Propionibakterien in TK und folgerten,
dass aufgrund der langsamen Vermehrung relevante Bakterienzahlen
nicht erreicht werden. Andererseits sind Berichte über febrile Episoden
bei immunsupprimierten Patienten publiziert, die TK erhielten, die mit
Propionibakterien kontaminiert waren (Schneider et al., 2000).
Kunishima et al. berichten über transiente febrile Episoden auch bei
immunkompetenten Transfusionsempfängern (Kunishima et al., 2001).
Koopman et al. untersuchten retrospektiv 158 Patienten, die TK
transfundiert bekamen, welche nachträglich im bakteriellen Monitoring
- 88 -
ein positives Signal zeigten (Koopman et al., 2009). Zwei dieser
Patienten entwickelten Reaktionen im Zusammenhang mit der
Transfusion. In beiden transfundierten TK konnten Propionibakterien
nachgewiesen werden. Eine der Reaktionen mit Entwicklung einer
Urtikaria wurde als allergische Reaktion gewertet. Der andere Patient
wurde mit einer septischen Reaktion und auf die Intensivstation verlegt.
Die anderen 156 Patienten zeigten im Zusammenhang mit der
Transfusion keine Auffälligkeiten.
Propionibakterien sind als Verursacher von Endokarditis, Arthritis,
Lungeninfektionen und Abszessen in der Milz und im Gehirn
beschrieben (Clayton et al., 2006; Perry und Lambert, 2006). Darüber
hinaus können sie klinisch stumme Infektionen von Endoprothesen
verursachen (Zeller et al, 2007). Daher sind Propionibakterien
keineswegs als klinisch unbedeutend einzuordnen. Ob zwischen den
febrilen Reaktionen von 5 Patienten in unserer Studie, die potentiell
oder bestätigt mit Propionibakterien kontaminierte TK erhielten, ein
kausaler Zusammenhang mit der Transfusion besteht, muss offen
bleiben.
Staphylokokken repräsentieren eine weitere wichtige Gruppe von
Keimen, die als Kontaminanten von Blutkomponenten und als
Verursacher von TR bekannt sind (Hillyer et al., 2003). Insbesondere bei
hämato-onkologischen Patienten spielen Staphylokokken eine wichtige
Rolle als Auslöser von Katheterinfektionen und nachfolgenden
septischen Komplikationen (Wolff et al., 2008). Gerade diese
Patientengruppe benötigt im Rahmen von Chemotherapie
Thrombozytentransfusionen. Eine Reihe von potentiell und bestätigt
- 89 -
mit Staphylokokken kontaminierten TK in unserer Studie wurden nach
Angaben der zuständigen Kliniker von den Patienten reaktionslos
vertragen. Die Mehrheit der S. epidermidis, S. capitis und S.
saccharolyticus kontaminierten TK wurden nicht transfundiert. Auch 2
bestätigte Kontaminationen mit S. aureus und Serratia marcescens
fielen frühzeitig auf, sodass eine Transfusion dieser mit hochgradig
pathogenen Keimen kontaminierten TK nicht erfolgte.
Ob neben dem Eintrag von Bakterien von der Spenderhaut passagere
Bakteriämien bei ansonsten gesunden Spendern als
Kontaminationsquelle infrage kommt, kann werder bestätigt noch
ausgeschlossen werden.
5.3. Wirksamkeit des Bakterienscreenings zur Vermeidung der
Transfusion kontaminierter Thrombozytenkonzentrate
Mit der Überprüfung des Kulturstatus zum Zeitpunkt der Abgabe der TK
sollte möglichst die Transfusion bakteriell kontaminierter TK verhindert
werden. Dieses als negative to date-Konzept bezeichnete Vorgehen
erwies sich nur sehr beschränkt als geeignet, da 67% der potentiell oder
bestätigt positiven TK ausgeliefert und transfundiert waren, als das
positive Kultursignal auftrat. Eine Ursache ist die frühzeitige
Auslieferung an den Tagen 2 und 3 der Haltbarkeitsfrist und die dazu
zeitnahe Transfusion. Rückrufe waren nur bei 2 TK erfolgreich.
Hauptursache jedoch ist ein zu spätes positives Kultursignal, das im
Mittel nach 3,7 Tagen auftrat. Propionibakterien in anaeroben Kulturen
mit einem positiven Kultursignal nach mehr als 4 Tagen Inkubation
machen den größten Anteil aus. Es gab aber auch mit Staphylokokken
- 90 -
kontaminierte TK, die bereits nach 15 Stunden Inkubationsfrist
transfundiert waren.
In den zuvor bereits zitierten Studien zeigten sich dieselben
Einschränkungen des negative to date-Konzeptes. Te Boekhorst et al.
berichten, dass 68% der positiven Kulturen der Pool-TK erst nach 48
Stunden ein positives Signal zeigten und dass 56% der positiven TK ohne
Reaktion transfundiert wurden (Te Boekhorst et al., 2005). De Korte et
al. berichten, dass 40% der TK mit positivem Kultursignal bereits
transfundiert waren, als das Signal auftrat (de Korte et al., 2006).
Einige Untersucher legten eine 12 bis 24 Stunden dauernde
Quarantänefrist zwischen den Inkubationsstart und die Auslieferung der
TK (Fang et al., 2005; Kleinmann et al., 2006; Eder et al., 2007). Diese
Vorgehensweise reduzierte den Anteil bereits transfundierter TK. Folge
ist allerdings ein höheres Alter der TK bei Anwendung und eine kürzere
Zeit für die Präparatelogistik. Auch wurden in den genannten Studien
nur aerobe Kulturen verwendet, die Propionibakterien in der Regel
nicht erfassen.
Fuller et al. verglichen retrospektiv die Anzahl der septischen
Transfusionreaktionen vor und nach der Einführung eines bakteriellen
Screenings der produzierten TK in ihrem Krankenhaus (Fuller et al.,
2009). Sie konnten zeigen, dass die Rate an septischen
Transfusionsreaktionen nach Einführung des Screenings um 69,7%
abnahm (p=0,41). Obwohl die Raten sich nicht signifikant
unterschieden, deuten sie doch an, dass eine Reduktion der septischen
Transfusionsreaktion mittels des Screenings möglich ist.
- 91 -
Zwischen 2003 und 2010 untersuchten Pearce el al. 54828 TK mittels
aerober und anaerober Kultur im BacT/ALERT-System. Hier wurden 35
(0,06%) als bestätigt positive gewertet (Pearce et al., 2010). 6438 nicht
transfundierte TK wurden nach Ablauf der Haltbarkeitsfrist erneut auf
bakterielle Kontamination untersucht. Dabei fanden sich 6 (0,09%)
bestätigt positive Kontaminationen, welche im ersten Screening nicht
gefunden wurden. Aus der Analyse der Daten schätzten sie die
Sensitivität auf 40%.
Sowohl Fuller als auch Pearce zeigten in ihren Studien, dass eine
Erhöhung des Probenvolumen von 4ml auf 8ml, bzw. von 8ml auf 10ml
pro Kulturflasche Raten der bestätigt positiven Proben erhöht (Fuller et
al., 2009; Pearce et al., 2010). Die führen beide auf die kleine Anzahl
Bakterien zum Zeitpunkt der Probenziehung am Beginn der
Haltbarkeitsfrist zurück.
Zweifelsfrei konnten während unserer Studie mit der rechtzeitigen
Sperrung von 2 TK mit bestätigt positivem Ergebnis potentiell
schwerwiegende Transfusionsreaktionen verhindert werden. In einem
Fall fiel die Kultur nach 9,1 Stunden positiv aus (S. aureus), im anderen
Fall nach 12,8 Stunden (Serratia marcescens).
5.4. Klinischer Follow up kontaminierter Thrombozytenkonzentrate
Die Nachforschung zur Verträglichkeit der potentiell und bestätigt
positiven TK und der mit Pool-TK verbundenen EK deckte insgesamt 6
Fälle auf, bei denen Patienten febrile Reaktionen zeigten. Zu keinem
dieser Fälle wurde von den behandelnden Ärzten spontan Bericht
erstattet. 80 Patienten erhielten potentiell positive TK transfundiert und
- 92 -
26 Patienten erhielten bestätigt positive TK. In keinem dieser Fälle
wurden Transfusionsreaktionen registriert. In der Mehrzahl der
Screening-Studien wurde bei Patienten, die TK mit positiven Kulturen
erhielten, keine Transfusionsreaktion beobachtet (Brecher et al., 2003;
Macauley et al., 2003; Munksgaard et al., 2004; Kleinmann et al., 2006;
Ramirez-Arcos et al., 2007; Eder et al., 2007). Lediglich deKorte
berichtet 2 Fälle mit Fieber nach der Transfusion (de Korte et al., 2006).
Bemerkenswert ist, dass die zuvor genannten 6 Fälle mit
Transfusionsreaktionen nicht aktiv gemeldet wurden, sondern erst auf
gezielte Nachfrage von den behandelnden Ärzten angegeben wurden.
Dies deutet darauf, dass die Meldeverpflichtung von transfundierenden
Ärzten nicht im gewünschten Maße wahrgenommen wurde. Daher
erscheint es wichtig, transfundierende Ärzte auf ihre Verantwortung bei
der Beobachtung und Meldung von Transfusionsreaktionen
hinzuweisen. Thrombozytopenische Patienten, insbesondere solche mit
begleitender Neutropenie, haben häufiger febrile Episoden.
Die Transfusion verkeimter TK kann als mögliche Ursache in Betracht
gezogen werden und bedarf der Aufklärung über entsprechende
Untersuchungen der Restpräparate und der Patienten. Auch können
weitere Blutkomponenten wie z.B. verbundene EK oder ein zweites
Apherese-TK mit betroffen sein. Bei einem Verdachtsfall mit Meldung
an die Blutbank können entsprechende Komponenten gesperrt werden,
um weiteren Schaden an anderen Patienten zu vermeiden.
- 93 -
5.5. Zum Risiko septischer Transfusionsreaktionen bei falsch
negativen Testergebnissen
Im Studienzeitraum ereigneten sich 2 schwerwiegende septische
Transfusionsreaktionen mit einem in 2 Einheiten geteilten Apherese-TK.
Diese war im BacT/ALERT und PALL eBDS negativ getestet worden,
erwies sich aber in der Nachuntersuchung als mit Klebsiella pneumoniae
kontaminiert.
In einem Fall war eine Patientin nach myeloablativer
Radiochemotherapie zu Verbereitung auf eine
Knochenmarktransplantation bei Non-Hodgkin-Lymphom betroffen.
Nach Transfusion eines 4,1 Tage alten ATK entwickelte die Patientin
eine septische Transfusionsreaktion mit respiratorischer Insuffizienz
und Kreislaufinstabilität. Trotz sofortiger antibiotischer Therapie und
intensivmedizinischer Versorgung verstarb die Patientin 10 Tage später
im Multiorganversagen. In der angelegten Blutkultur der Patientin
konnte ebenso wie im Restmaterial aus dem TK-Beutel Klebsiella
pneumoniae nachgewiesen werden.
Im zweiten Fall wurde einer Patientin mit akuter myeloischer Leukamie
ein TK aus derselben Apherese 4,2 Tage nach Herstellung transfundiert.
Sie reagierte mit Fieber und Kreislaufinstabilität. Nach notwendiger
Katecholamingabe und einer Antibiotikatherapie stabilisierte sich ihr
Zustand. In der Blutkultur der Patientin und dem Restmaterial aus dem
TK-Beutel konnte ebenfalls Klebsiella pneumoniae nachgewiesen
werden.
Septische Transfusionsreaktionen mit falsch-negativ getesteten TK
wurden in einer Reihe von Studien beobachtet, die sich mit dem
- 94 -
BacT/ALERT-Screening von TK befassten. Fang et al. berichten über 3
Fälle mit negativ getesteten TK, die sich im Nachhinein als mit S.
lugdunensis, S. epidermidis und koagulase-negativen Staphylokokken
kontaminiert erwiesen (Fang et al., 2005). Te Boekhorst et al. sahen 2
septische Ereignisse mit Bacillus cereus (Te Boekhorst et al., 2005).
Ramirez-Arcos et al. beschrieben 2 schwerwiegende
Transfusionsreaktionen durch TK mit Serratia marcescens und
Salmonella Spezies (Ramirez-Arcos et al., 2007). In der mit 1 Millionen
getesteten TK sehr umfangreichen Studie von Eder et al. wurden im
Testzeitraum 20 Fälle mit transfusionsassoziierten Septitiden
beobachtet, 3 dieser Patienten verstarben (Eder et al., 2007). In einem
Fall war die Kontaminante S. lugdunensis, in 2 Fällen S. aureus.
Somit liegt eine wesentliche Beschränkung des BacT/ALERT-Screenings
zeitnah zur Präparateherstellung darin, dass bei der Probenziehung aus
dem Präparat kontaminierende Bakterien verpasst werden, mit dem
Ergebnis eines falsch-negativen Testresultats. Eine frühe Probenziehung
und ein relativ kleines Probenvolumen erhöhen dieses Risiko. Benjamin
kalkulierte das Risiko der septischen Transfusionsreaktion aufgrund
falsch-negativer Testresultate im BacT/ALERT-Screening auf 1 zu 45.000
Thrombozytentransfusionen (Benjamin, 2008).
5.6. Zum Vergleich von Keimisolaten aus unterschiedlichen Proben
Der Vergleich von Keimisolaten aus verschiedenen Proben der gleichen
Spende mittels RAPD-PCR zeigte die klonale Verwandtschaft der Keime.
Da bei der Gewinnung und Verimpfung von Untersuchungsproben eine
akzidentelle Kontamination durch die Untersucher nicht auszuschließen
ist und da für kontaminierte Pool-TK die Ausgangsvollblutspende
- 95 -
eindeutig identifiziert werden sollte, untersuchten wir
Propionibakterien Isolate aus 9 TK, Probenbeuteln und verbundenen
EK. In allen Fällen wurde die klonale Verwandtschaft bestätigt. Damit
konnten die Ausgangsvollblutspenden eindeutig als
Kontaminationsquelle identifiziert werden.
Auch mit der Untersuchung von Staphylokokken-Isolaten aus 2
Apherese-TK und 5 Pool-TK sowie Kulturflaschen und Probenbeuteln
konnte mittels Pulsfeld-Gelelektrophorese die Übereinstimmung der
Isolate belegt werden. Es gab keinen Anhalt für
Sekundärkontaminationen.
5.7. Bewertung des Vergleiches von BacT/ALERT, Scansystem und
PALL eBDS
Die verglichene Methoden beruhen auf der Kultivierung von Bakterien
(BacT/ALERT und PALL eBDS) und auf den schnellen Direktnachweis von
Bakterien (Scansystem). In Studien mit der artifiziellen Kontamination
von TK ist die Eignung der Methoden beschrieben (Jakobs et la., 2005;
Schmidt et al., 2005; Ortolano GA et al., 2003; McDonald und Pearce et
al., 2005; Brecher et al., 2002).
Die Sensitivität war für das BacT/ALERT am höchsten. Das PALL eBDS
verpasste 4 von 4 im BacT/ALERT positive Proben, wobei zumindest
teilweise die Ursache darin lag, dass es sich um anaerobe Bakterien
handelte. Das PALL eBDS fokussiert auf aerobe Keime. Im Scansystem
wurde eine im BacT/ALERT positive Probe verpasst. Ursache kann die
vom Hersteller mit 1000 CFU/ml angegebene Sensitivität sein.
Verglichen damit liegt diese für das BacT/ALERT bei 1 CFU/ml. Bei
- 96 -
langsamer Keimvermehrung und geringem initialem Keimeintrag kann
das Detektionslimit des Scansystems unterschritten werden. Eine
möglichst späte Probenziehung erlaubt die Vermehrung von Bakterien
in kontaminierten Präparaten, erhöht die Chance bei der
Probenziehung Bakterien mitzunehmen und reduziert das Risiko des
falsch-negativen Testergebnisses. Somit würden alle eingesetzten
Testmethoden von der späten Probenziehung mit einer erhöhten
Sensitivität profitieren. Allerdings kollidiert diese Überlegung mit der
Notwendigkeit der möglichst frühen Abgabe von TK zur Transfusion.
Bei ansonsten gleichen Testbedingungen variierten Eder et al. nur das
das zur Verimpfung in BacT/Alert-Flaschen vorgesehene
Probenvolumen (Eder et al., 2009). Ein Vergleich der
Kontaminationsraten zeigte, dass ein größeres Probenvolumen mit
einer höheren Kontaminationsrate einhergeht. Hier wird postuliert,
dass bei einer niedrigen bakteriellen Kontamination die
Wahrscheinlichkeit, Bakterien in einer Probe nachzuweisen, mit dem
Volumen der gezogenen Probe steigt. Ähnliche Ergebnisse zeigen auch
die Studien von Fuller und Pearce, die bei einer Vergrößerung des
gezogenen Probenvolumen höhere Raten an positiven
Kulturergebnissen fanden (Fuller et al., 2009; Pearce et al., 2010).
Beim Vergleich der Testergebnisse unter Beachtung des
Untersuchungsziels erscheint die höhere Sensitivität des BacT/ALERT-
Systems als wichtiger Vorteil, wenn auch damit das Risiko der falsch-
positiven Resultate einhergeht. Eine geringere Spezifität des
BacT/ALERT gegenüber den anderen beiden Testmethoden löst in der
Folge mehr Fehlalarme aus, die zur Sperrung oder zum Rückruf von
- 97 -
Präparaten führen. Dieser Nachteil gefährdet allerdings keine Patienten,
wie dies falsch-negative Testresultate einer zwar spezifischeren, aber
weniger sensitiven Methode würden.
Insgesamt ist keines der verglichenen Testsysteme zufriedenstellend.
Das BacT/ALERT ist ein sensitiver Screeningtest, benötigt aber 7 Tage bis
zum Testende bei einer Haltbarkeitsfrist von 5 Tagen bei TK. PALL eBDS
detektiert nur aerobe Bakterien, während der größte Teil der in TK
nachgewiesenen Keime anaerob ist. Das Scansystem hat eine geringere
Sensitivität als die Kultivierungsmethoden.
5.8. Aussichten und Empfehlungen
Insgesamt kann das Screening der produzierten TK, mit den zurzeit zu
Verfügung stehenden Methoden, das Risiko der transfusions-
assoziierten Sepsis zwar reduzieren, die Sterilität der zur Transfusion
abgegebenen TK jedoch nicht garantieren. Dies zeigte sich in dieser
Studie auch im Fall einer mit Klebsiella pneumoniae kontaminierten
Apherese, aus welcher zwei ATK hergestellt wurden. Beide wurden
negativ getestet, führten jedoch retrospektiv betrachtet zu septischen
Transfusionsreaktionen, von welchen eine tödlich verlief. Zu
vergleichbaren Ergebnissen kommt auch ein Bericht von Wood über das
Screening von Blutprodukten des Australian Red Cross Blood Service
(Wood, 2010). In Australien werden seit April 2008 alle TK einem
Routinescreening auf bakterielle Kontamination unterzogen, wobei
aerobe und anaerobe Kulturen im BacT/ALERT-System angelegt
werden. Die TK werden nach dem negative-to-date Prinzip abgegeben,
im Falle eines späteren positiven Signals, wurden die
Transfusionsverläufe nachträglich auf eine mögliche
- 98 -
Transfusionsreaktion hin untersucht. Auch wenn in Australien bei den
bestätigt positiven, transfundierten TK kein septischer Verlauf
beobachtet werden konnte, warnte auch Wood, dass das Risiko der
transfusionsassoziierten Sepsis zwar reduziert, aber nicht gänzlich
ausgeschlossen werden kann.
Für die Zukunft ist eine Weiterentwicklung der Screening-Methoden zur
Kontaminationstestung zu erwarten, um dem Risiko der bakteriellen
Transfusionsreaktion im Sinne des Vorsorgeprinzips zu begegnen. Es
konnte gezeigt werden, dass Methoden die eine Kultivierung der
Proben verlangen, die höchste Sensitivität für bakterielle Kontamination
aufweisen und TK, die mit schnell wachsenden Keimspezies
kontaminiert waren, von der Transfusion ausschließen konnten.
Langsame Vermehrung der kontaminierenden Bakterien führten jedoch
zu einem späten Signal in den Nachweismethoden, so dass ein Teil der
TK zu diesem Zeitpunkt nach dem negative-to-date Prinzip schon
abgegeben und transfundiert waren. Optimal wären Schnellmethoden
zur Bakteriendetektion, die zeitnah zur Transfusion einsetzbar sind. Bis
zu deren Verfügbarkeit muss über eine Verkürzung der Haltbarkeitsfrist
von TK nachgedacht werden, die die berichteten Sepsisfälle zumindest
teilweise verhindert hätte. Allerdings sind mit einer kürzeren
Haltbarkeitsfrist erhebliche logostische Anstrengungen verbunden, um
die Patientenversorgung nicht zu gefährden. Eine diskutierte
Verlängerung der Haltbarkeitsfrist von TK über die 5 Tage hinaus ist
unter den genannten Testbedingungen nicht vertretbar. Dies wird auch
durch eine Studie von Dumont et al. gestützt, bei der
nichttransfundierte ATK am Ende der Haltbarkeit von 7 Tagen erneut
hinsichtlich der bakteriellen Kontamination untersucht wurden
- 99 -
(Dumont et al., 2010). Bei den an Tag eins gezogenen Proben fanden 76
von 388.903 (195/106) Proben bestätigt positiv, bei den achten Tag von
4 von 6039 (662/106) bestätigt positiven Proben. Aufgrund der hohen
Rate an positiven Proben am Ende der Haltbarkeit wurde die Studie
abgebrochen, und eine Beschränkung der Haltbarkeitsfrist auf wieder 5
Tage empfohlen.
Auch bei der Transfusionsvorbereitung, Durchführung sowie der
Registrierung und Aufklärung von Transfusionsreaktionen ist eine Reihe
von qualitätssichernden Maßnahmen zu beachten, die das Risiko der
bakteriell bedingten Transfusionsreaktion reduzieren können. Hier kann
einer besseren Koordination von Beschaffung und Bedarf an TK, mit
dem Ziel der Begrenzung der Lagerungsdauer bis zur Anwendung, eine
hohe Bedeutung zukommen. Maßnahmen, die das Ziel haben TK,
welche möglicherweise kontaminiert sind, von der Transfusion
auszuschließen, sollten an den Anwender weitergegeben bzw. stärker
zu Bewusstsein geführt werden. Hier gilt eine visuelle Kontrolle direkt
vor der Transfusion durch den Anwender auf Leckage, Verfärbung,
Gerinnsel oder Trübung. Diese sollte den Anwender von der Transfusion
eines TK abhalten. Cawley et al. berichten über eine Fall mit Bakterien
kontaminierter ATK, welche bei der visuellen Kontrolle durch
Verfärbung einer Einheit auffielen (Cawley et al., 2010). Die Apherese
wurde in eine Einheit für Erwachsene und vier pädiatrische Einheiten
aufgeteilt. Die Einheit für Erwachsene und drei der pädiatrischen
Einheiten wurden transfundiert, bevor die Verfärbung der vierten
pädiatrischen Einheit auffiel. In dieser konnte eine massive
Kontamination mit S. pneumoniae nachgewiesen werden. Bei dem
erwachsenen Patienten und dem Kind, welches die drei pädiatrischen
- 100 -
Einheiten erhielt, konnten in einer Nachuntersuchung febrile
Reaktionen um die Transfusion registriert werden. Nur in der Blutkultur
des erwachsenen Patienten konnte S. pneumoniae nachgewiesen
werden. Durch molekulare Analyse der beiden gefunden Streptokokken
konnten diese als identisch identifiiert werden. Hier zeigt sich, dass
neben neuerer Screeningmethoden auch länger bestehende
Kontrollmechanismen, wie die visuelle Kontrolle der TK vor Ausgabe
und direkt vor der Transfusion Hinweise auf bakterielle Kontamination
liefern können, auch wenn in diesem Fall eine Transfusion der
assoziierten Einheiten nicht verhindert werden konnte.
Aber auch das aseptische Arbeiten, das Einführen des
Transfusionsbesteckes erst kurz vor der Transfusion und die
Beschränkung des Gebrauchs von Transfusionsbestecken auf maximal 6
Stunden, sollten beachtet werde.
Leitlinien zur Erkennung, Untersuchung und Kausalitätsbewältigung
bakteriell bedingter Transfusionsreaktion sollten weiterentwickelt
werden und konsequent zu Anwendung kommen. U.a. gilt es, den
Patienten engmaschig zu überwachen, die Transfusion frühzeitig bei
Zeichen der Unverträglichkeit abzubrechen und eine aufklärende
Diagnostik einzuleiten. Bei Verdacht auf eine bakteriell bedingte
Transfusionsreaktion sollten Blutkulturen des Patienten und Proben aus
den beteiligten Blutbeuteln angelegt und untersucht werden.
Verdachtsfälle sollten umgehend gemäß den einschlägigen Vorgaben
gemeldet werden, da insbesondere die umfassende Analyse von
septischen Transfusionsreaktionen dazu beitragen kann, präventive
Strategien weiterzuentwickeln und deren Wirksamkeit einzuschätzen.
- 101 -
6. Zusammenfassung
Das Screening von Thrombozytenkonzentraten (TK) auf bakterielle
Kontamination an einer zeitnah zur Präparateherstellung gezogenen
Probe mit der BacT/ALERT-Methode zeigte, dass Apherese-TK und Pool-
TK mit Plasma oder Lagerlösung keine Unterschiede der
Kontaminationsrate aufweisen. Bei einem frühen positiven Kultursignal
mit einer Kultivierungszeit < 24 Stunden gelang der Ausschluss von
kontaminierten TK zumindest teilweise. Aufgrund eines späten
positiven Kultursignals kombiniert mit im Regelfall früher Abgabe der TK
zur Transfusion an Tag 2 oder 3 der Haltbarkeitsfrist konnten 67% der
Präparate mit potentiell oder bestätigt positivem Testergebnis nicht von
der Anwendung ausgeschlossen werden.
Die detektierten Keime entstammen überwiegend der Hautflora, die
häufigsten waren Propionibakterien. Zu den transfundierten TK, die
potentiell oder bestätigt positiv waren, erfolgte keine Spontanmeldung
von bakteriell bedingten Transfusionsreaktionen. Die klinische
Nachverfolgung der TK deckte 6 Fälle mit febrilen
Transfusionsreaktionen auf, die weder gemeldet noch nachuntersucht
wurden. Ob ein Kausalzusammenhang mit der bakteriellen
Kontamination bestand, muss offen bleiben.
Die Wirksamkeit des Bakterienscreenings wird erheblich dadurch
beeinträchtigt, dass falsch-negativ getestete TK zu schwerwiegenden
und tödlichen Transfusionsreaktionen führen können. Die frühe
Probenziehung aus dem Präparat bei niedriger Keimzahl zu diesem
Zeitpunkt ist hierfür die Ursache.
- 102 -
Der Vergleich der eingesetzten Screeningverfahren an einer Teilmenge
der Präparate belegt die hohe Sensitivität der BacT/ALERT-Methode.
Insgesamt erweist sich das Screening von TK auf Bakterien als
durchführbar. Allerdings wird damit das Problem der
transfusionsassoziierten Sepsis zwar reduziert, die Sterilität der zur
Transfusion bereitgestellten TK kann aber nicht garantiert werden.
- 103 -
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Danksagung
An die Studiengruppe, auch für die Überlassung der Daten aus den acht
anderen Zentren.
An Fr. Dr. Walther-Wenke, die mich in all den Jahren nicht vergessen
hat.
An die Mitarbeiter im ZTM Münster.
An Fr. Dr. Geis.
An meine Frau, für all Ihre Geduld.
Lebenslauf
Persönliche Daten
Geburtsdatum 01.11.1976
Geburtsort Bochum
Familienstand Verheiratet
Staatangehörigkeit deutsch
Religion evangelisch
Ausbildung
1983-1987 Hüllberg-Grundschule, Witten
1987-1996 Albert-Martmöller-Gymnasium, Witten
1997-1998 Zivildienst im EVK-Witten
1998-2006 Studium der Humanmedizin an der
Ruhruniversität Bochum
Praktisches Jahr
Augusta-Kranken-Anstalt Bochum Mitte (Chirurgie, Innere Medizin, Anästhesie)
Mai 2006 3.Staatsexamen
Seit 2006 Assistenzarzt Augusta-Kranken-Anstalt Bochum
Abteilung für Anästhesie und Intensivmedizin