bacterias anaerobias introducciÓn al diagnÓstico microbiolÓgico bioq. mirta litterio...

BACTERIAS ANAEROBIAS

INTRODUCCIÓN AL

DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO

BIOQ. MIRTA [email protected]

MICROBIOLOGIA HOSPITAL J.P.GARRAHANSUBCOMISIÓN DE BACTERIAS ANAEROBIAS-SADEBAC-AAM

Introducción. Anaerobiosis

Implicancia clínicaMicrobiota normalFactores predisponentes del húespedInfecciones

Diagnóstico microbiológico presuntivo a GENERO: POST- aislamientoCaracterísticas orientadoras en la muestraPrueba de tolerancia al oxígeno y coloración de GRAMPatrones de sensibilidad a discos de antibióticos (con carga especial)

Diagnóstico microbiológico a ESPECIE: POST- aislamientoPruebas de uso frecuente en el laboratorio

Clostridium difficileFactores de riesgo para el desarrollo de diarrea asociada a C difficile (DACD)Rango de enfermedad entéricaCepas toxigénicasMetodos de diagnóstico de diarrea asociada a C.difficileTratamiento y Medidas de prevención

Diagnóstico microbiológico: PRE- aislamientoCaracterísticas orientadoras en el huésped Muestra: toma y transporteMedios de cultivo y Sistemas de incubación

0

20

40

60

80

100

H2

N2

CO2

O2

ATMÓSFERASSU COMPOSICIÓN

Aire Lata c/vela Microaero Anaero

O2 CO2 N2 H2

AEROBIO OBLIGADO

++++ ++++ +++ V

AEROBIOµ-AEROFILO

0 +++ ++++ V

ANAEROBIOFACULTATIVO

++++ ++++ ++++ ++++

ANAEROBIOAEROTOLERANTE

+ ++ +++ ++++

ANAEROBIO µ-AEROTOLERANTE

0 0 +++ ++++

ANAEROBIOOBLIGADO

0 0 0 ++++

MICROORGANISMOA

TM

ÓS

FE

RA

0%

20%

40%

60%

80%

PRUEBA DE TOLERANCIA AL O2

PRUEBA DE TOLERANCIA AL O2

AEROBIO….??? ANAEROBIO ….???

AGAR SANGRE ANAEROBIOJARRA ANAEROBIA

CARACTERÍSTICAS ORIENTADORASDE LA PRESENCIA DE ANAEROBIOS

FACTORES PREDISPONENTES DEL HUESPED

TRAUMA

MALA IRRIGACIÓN, HIPOXIA

DAÑO TISULAR, NECROSIS, TEJIDO DESVITALIZADO

MUCOSA DAÑADA

MECANISMOS DE DEFENSA AUSENTES (P/E: REFLEJOS DE DEGLUCIÓN)

ENFERMEDAD DE BASE (P/E: DIABETES)

TOMA Y TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS X ANAEROBIOS

INTOLERANCIA AL O2

MICROBIOTA HABITUAL

CONDICIONADOS POR

Bacilos gram-negativos: Porphyromonas Prevotella, Fusobaterium nucleatum – Cocos gram-positivos, Actinomyces

100:1 (ANA/AER)

Bacilos gram-negativos: Porphyromonas Prevotella bivia-disiens, Cocoss gram-positivos Lactobacillus - Clostridium

Bacilos gram-negativos: Bacteroides grupo fragilis– Cocos gram-positivos - Clostridium, Eubacterium, Bifidobacterium

1000:1 (ANA/AER)

PIEL

Propionibacterium acnes

Peptoniphilus asaccharolyticus

TRACTO GENITAL

FEMENINO

CAVIDAD ORAL Y TRS

COLON

MICROBIOTA NORMAL

TOMA DE MUESTRAS

PUNCION ASPIRACION

CIRUGIA

EVITANDO “FLORA INDIGENA”

TOMA DE MUESTRAS

Decontaminación previa de la zona con alcohol 70%

Aplicación de tintura de yodo (30 segundos) o solución acuosa de yodo (un minuto)

Remoción de la preparación de yodo con alcohol 70%

TRANSPORTE DE LAS MUESTRASMUESTRA

LÍQUIDAS VOLUMENES PEQUEÑOS

MODALIDAD EVITANDO AIREACIÓN TIEMPODE

SOBREVIDAVIAL DE TRANSPORTE(TAB)

8-24 HSA

TEMPERATURAAMBIENTE

RASPADOSHISOPADOSTEJIDOS PEQUEÑOS

TUBOS TUBOS MEDIO STUARTMEDIO STUARTCARY-BLAIRCARY-BLAIRPRE-REDUCIDOPRE-REDUCIDO

TEJIDOS GRANDES

TUBO SECO ESTERILEN BOLSA DE PLASTICOCON GENERADOR DE ANEROBIOSIS

TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS

MUESTRA

LÍQUIDAS

AIREADAS

TIEMPODE SOBREVIDA

TEMPERATURAAMBIENTE

TEJIDOS PEQUEÑOS

TEJIDOS GRANDES

< 1 ml= 1 ml> 2 ml

< 10 min= 30 min> 2-3 hs

<1 cm3 ≤ 30min

2-3 hs>1 cm3

!!!!

SIEMBRA EN ANAEROBIOSIS

NO SELECTIVOS

MEDIOS SOLIDOS

Agar base (Columbia,TSA,BHI, etc)suplementado:sangre lacada, vitamina K, hemina,CO3H-, extracto de levadura, tween 80, piruvato, etc.

SELECTIVOS y/o DIFERENCIALES

FEA, BBE, KVLB, EYA, etc

AGAR SANGRE ANAEROBIO (ASA)

SIEMBRA EN ANAEROBIOSIS

CALDO CEREBRO CORAZÓN CALDO TIOGLICOLATO

MEDIOS LÍQUIDOS

suplementado: vitamina K, hemina,CO3H-, extracto de levadura, tween 80, piruvato, etc

SIN SELLAR COLUMNAS ALTAS

SELLAR VASELINA-PARAFINA (3/2)

INCUBACIÓN EN ANAEROBIOSIS

BOLSAS

JARRA

GENERADORESDE

ANAEROBIOSIS

CÁMARA

PLACAS OXYRASAJARRA

PROCESAMIENTO INICIAL MUESTRA

COLORACIÓN DE GRAM

CALDO ANAEROBIO

AGAR SANGRE ANAEROBIO(ASA)

JARRA ANAEROBIA

INCUBAR 48 HS 37ºC

BOLSAS

MUESTRA

CARACTERÍSTICAS ORIENTADORASDE LA PRESENCIA DE ANAEROBIOS

MUESTRA—MICROSCÓPICAS—COLORACIÓN DE GRAM

MUESTRA--MACROSCÓPICAS

COLOROLORPRESENCIA DE GRANOS

Ef ASOCIACIÓN FUSO ESPIRILAR

HEMOCULTIVOBG(+) “ARAÑITAS”

GANGRENABG(+) RECTANGULARES

EXAMINACIÓN DE LOS CULTIVOS

PLACAS DE SIEMBRA PRIMARIA

CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS del CULTIVO

OLORPIGMENTO (NEGRO-MARRÓN)FORMA Y ASPECTO DE LAS COLONIAS

ASA PIGMENTO NEGRO

ASA BBE/ASA

PLACACON

SIEMBRAPRIMARIA

ASA

ACH

ASA

ESTRIAR (37ºC) 24-48 HS DE INCUBACIÓN

2

3

4

5

1

1 2

3

4

5

12

3

45

2

5

ACH

ASA

13

4

PRUEBA DE TOLERANCIA al O2RESULTADOS

1

3

4

2

5

POR LO MENOS 2 VECES

IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA GÉNERO

ASA

1

4

2

5

CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS DE COLONIAS BORDES PIGMENTO (NEGRO/MARRÓN) CONSISTENCIA (SECA/MUCOSA)

GRAMDE COLONIA3

ASA

13

4

2

5

BGN

CGN

BGPNE

BGPE

CGP

V

5µ

K

1000µ

Co

10µ

B

20%

SPS

5%

MTZ

5µ

0.5 MF

RS V V V S

R S S S

S S R V

S V R S

S V R RS S

ASA


GRAM

DIS

CO

S

BACTEROIDES GRUPO FRAGILISBACTEROIDES GRUPO UREALYTICUSFUSOBACTERIUM SPPPORPHYROMONAS SPPPREVOTELLA SPPOTROS BACTEROIDESOTRAS PREVOTELLA

VEILLONELLA SPP

BACILOS

COCOS

GRAM NEGATIVOS


BACILOS GRAM (-)V

5µ

K

1000µ

Co

10µ

B

20%

Bacteroides grupo fragilis R R R R

B fragilisB distasonis B ovatus B thetaiotaomicronB eggerthiiB stercorisB caccaeB merdaeB uniformisB vulgatusB splanchnicus


NUEVAS spp.*B goldsteinii

B nordiiB salyersiae

V

5µ

K

1000µ

Co

10µ

B

20%

Porphyromonas spp. S R R S

Prevotella spp. R RS V S

PIGMENTO NEGRO / MARRÓN FLUORESCENCIA ROJA UV 365


BACILOS GRAM (-)pigmentados

V

5µ

K

1000µ

Co

10µ

B

20%

Bacteroides grupo ureolyticus like

R S S V

B. ureolyticusCampylobacter gracilisC rectus

Bilophila wadsworthia Suterella wadsworthensis


BACILOS GRAM (-)

V

5µ

K

1000µ

Co

10µ

B

20%

Fusobacterium spp. R S S V

F nucleatumF necrophorumF varium

F mortiferumF ulcerans


BACILOS GRAM (-)

V

5µ

K

1000µ

Co

10µ

B

20%

Prevotella spp. NO PIGMENTADAS R R RS S

Bacteroides spp. R R V S

P buccaeP orisP heparinolyticaP zoogleoformansP dentalisP oralis groupP enoecaP biviaP disiens


BACILOS GRAM (-)

V

5µ

K

1000µ

Co

10µ

B

20%

Veillonella spp. R S S S

Acidaminococcus fermentans R S S S

Megasphera elsdenii R S S S


PENICILINA 10 µg

COCOS GRAM (-)

GRAM POSITIVOS

1 ESPORULADOS CLOSTRIDIOS

2 NO ESPORULADOS LACTOBACILOS, EUBACTERIUM, ACTINOMYCES, PROPIONIBACTERIUM

PEPTOSTREPTOCOCOS, PEPTOCOCOS FINEGOLDIA SP., MICROMONA SP.

BACILOS

COCOS



V

5µ

Co

10µ

MTZ

5µ O2

BG(+)ESPORULADO= CLOSTRIDIOS S R S SR

BG(+)NO ESPORULADO S R V V

BACILOS GRAM (+)

C perfringens C difficile C septicum C sordelli C botulinum C tetani C butyricum C tertium C histolyticum

AEROTOLERANTES

Actinomyces spp. Bifidobacterium spp. Eubacterium spp. Eggerthella sp. Filifactor spp.Lactobacillus sp. Mobiluncus spp.Propionibacterium spp.Rothia sp.

A

IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA GÉNEROV

5µ

Co

10µ

SPS

5%

MTZ

5µ O2

COCOS G (+) S R RS S S

COCOS GRAM (+)

Peptostreptococcus anaerobius Micromonas micros Peptococcus niger Finegoldia magna

Anaerococcus spp.Peptoniphilus spp.Gallicola spp.

SPS = S

IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA GÉNEROV

5µ

Co

10µ

SPS

5%

MTZ

5µ O2

COCOS G (+) S R RS S S

COCOS GRAM (+)

Anaerococcus spp.Grupo IGrupo IGrupo III

SPS = S

Peptostreptococcus anaerobius P.stomatis P.micros Peptococcus niger Finegoldia magna

Tabla 1- Identificación de Anaerobios: patrones de discos de potencia especial

Microorganismo Vc Kn Co Bi SPS MTZ

Gram-negativos R1 V V V

Bacteroides grupo fragilis R R R R

Prevotella spp. R R/S S/R S

Porphyromonas spp. S R R S

Fusobacterium spp.2 R S S S/R

Bacteroides grupo ureolyticus3 R S S S

Veillonella spp. R S S

Gram-positivos S4 V R

Cocos gram-positivos S V R S R5 S

Clostridium spp. S S/R R

1- Porphyromonas spp. son Vc S. 2- Nitrato negativo, 3- incluye Campylobacter spp. 4- Algunas cepas de lactobacilos y la mayoría de Clostridium innocuum son R a Vc (5µg). 5- Peptostreptococcus anaerobius y algunas cepas de Micromonas micros son S. Adaptada de: Jousimies-Somer HR, et al. Anaerobic Bacteriology Manual, 6th edition. 2002

IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA DE ESPECIE

METODOS

CONVENCIONALES

DEPENDIENTES DEL

CRECIMIENTO

INDEPENDIENTES DEL

CRECIMIENTO

LECTURA TARDÍA

LECTURA RÁPIDA

COMERCIALESARTESANALESENZIMAS

PRE-FORMADAS(CONSTITUTIVAS)

SUSTRATOS CROMOGÉNICOS

SUSTRATOS FLUOROGÉNICOS

IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA DE ESPECIE

METODOS CONVENCIONALES-PRUEBAS

REQUERIMIENTO DE FORMATO/FUMARATO

COAGULACIÓN / DIGESTIÓN DE LECHE

CRECIMIENTO CON BILIS AL 20%

FERMENTACIÓN DE AZÚCARES

REDUCCIÓN DE NITRATOS

FLUORESCENCIA

CAMP REVERSA

MOVILIDAD

PYR

PRODUCCIÓN DE

INDOLLIPASALECITINASACATALASADESULFOVIRIDINAFOSFATASA ALCALINAARGININA DIHIDROLASAL-PROLINA AMINOPEPTIDASA

HIDRÓLISIS DE

UREAESCULINAGELATINA

MICROBIOTA NORMAL

COLONIZACIÓN DEL RECIÉN NACIDO

CAVIDAD ORAL

TRACTO INTESTINAL

TRACTO GENITAL

FACTORES PREDISPONENTES DEL HUESPED

GENERALES

• DIABETES• CORTICOSTEROIDES• ENFERMEDADES MALIGNAS• COLAGENOPATIAS• DROGAS CITOTÓXICAS• INMUNOSUPRESIÓN• ESPLENECTOMÍA• NEUTROPENIA• HIPOGAMAGLOBULINEMIA• MECANISMOS DE DEFENSA ALTERADOS (P/E

REFLEJOS DE DEGLUCIÓN)

LOCALES

• BAJO POTENCIAL REDOX• INSUFICIENCIA VASCULAR• ANOXIA TISULAR• DESTRUCCIÓN TISULAR• CUERPO EXTRAÑO

INFECCIONES ASOCIADAS

ENDÓGENASENDÓGENAS

RELACIONADAS A MUCOSASRELACIONADAS A LA MICROBIOTA NORMALPOLIMICROBIANAS

EXÓGENASEXÓGENAS

CLOSTRIDIALES

NO CLOSTRIDIALES

INFECCIONES ASOCIADASSISTEMA NERVIOSO CENTRAL

ABSCESO INTRACRANEANO (EMPIEMA SUBDURAL) (ABSCESO CEREBRAL)ABSCESO EPIDURAL

INFECCIONES EN PACIENTES CON SHUNT VENTRICULO-PERITONEAL

CAVIDAD ORAL

MUCOSITIS

GINGIVITIS

PERIODONTITIS


TRACTO RESPIRATORIO SUPERIOR

OTITIS MEDIA CRÓNICA

COLESTEATOMA

MASTOIDITIS CRÓNICA

SINUSITIS CRÓNICA


TRACTO RESPIRATORIO INFERIOR

NEUMONÍA ASPIRATIVA

ABSCESO PULMONAR

EMPIEMA PLEURAL


ABDOMEN

PERITONITIS

ABSCESOS INTRAABDOMINALES

ENTEROCOLITIS NECROTIZANTE

COLANGITIS


TRACTO URINARIO

ABSCESO PERINEFRÍTICO

ABSCESO INTRARRENAL


PIEL Y PARTES BLANDAS

ABSCESO CUTÁNEO

ONFALITIS

ULCERAS DE DECÚBITO

ABSCESO PILONIDAL

MORDEDURAS


HERIDAS Y TEJIDO NECRÓTICO

CELULITIS

FASCITIS

GANGRENA

COMPARTIMIENTOS

DE LA PIELEPIDERMIS

DERMISCELULAR SUBCUTANEOFASCIA MUSCULAR

FOLÍCULO PILOSO

IMPÉTIGO

ERISIPELA

CELULITIS

FASCITIS

FOLICULITIS


HUESO-ARTICULACIONES

ARTRITIS CRÓNICA

OSTEOMIELITIS CRÓNICA

SECUNDARIAS A TRAUMATISMOS EXTERNOS

APARATO GINECOLÓGICO

SALPINGITIS

ENDOMETRITIS

INFECCIÓN PELVIANA

ABORTO SÉPTICO

VAGINOSIS BACTERIANA

SEPSIS-BACTERIEMIAS

FOCO ABDOMINAL


DIARREA ASOCIADA A C difficile

CAUSA MAS FRECUENTE DE DIARREA NOSOCOMIAL EN PAISES DESARROLLADOS

PREVALENCIA 10-17%

HÁBITAT NATURAL: MEDIO AMBIENTE, SUELO, HECES.

PORTACIÓN: NEONATOS 50% 2 AÑOS < 4%

AMBULATORIO-SANO 3-4% HOSPITALIZADO 1-2 SEM 20%

4 SEM 50%

ASINTOMÁTICA DIARREA (LEVE A SEVERA) COLITIS COLITIS PSEUDOMEMBRANOSA MEGACÓLON TÓXICO PERFORACIÓN INTESTINAL MUERTE

SIGNOS Y SINTOMAS


FACTORES DE RIESGO DACD

ANTIBIOTICOS PREVIOSANTINEOPLASICOSENF DE BASE SEVERA INTUBACIÓN NASOGÁSTRICA INH. DE LA BOMBA DE PROTONESEDAD ≥ 65 AÑOSHOSPITALIZACION PROLONGADAPAC QUIRÚRGICOS > PAC. MÉDICOS


S I DACD NO DACD

CEPA

A= ENTEROTOXINA tcdA B= CITOTOXINA tcdB

A + B +

TOXIGÉNICA

A – B + A – B –

NO TOXIGÉNICA


S I DACD

CEPA

TOXIGÉNICAPREVALENCIA

0.2 % USA

3% UK

12.5% JAPÓN

24.1% ARGENTINA

31% POLONIA

A – B +


CEPA epidemica USA / EUROPA - NAP1

A= ENTEROTOXINA X 16

B= CITOTOXINA X 23 Deleción 18pb en el gen tcdC, gen regulador negativo de los genes de la tox Ay B

CDT=TOXINA BINARIA actin-specific ADP-ribosyltransferasa¿¿¿¿¿¿Asociada a mayor virulencia ?????

R a gatifloxacinaR a moxifloxacina


2002


C difficile

características

TECNICA

PCR***

Ribotipo Toxinotipo

PFGE** REA*

A+ B+ CDT+

Casos fatales Canada

027 III NAP 1 BI

A- B+ 017 VIII CF

Hallado en alimentos humanos y animales

V BK

Brotes hospitalarios en USA + Clinda

O J

*REA Analisis x endonucleasas de restricción (grupos: BI,J,K,G,Y,CF,BK)

**PFGE Electroforesis en gel de campo pulsado

***PCR Reacción en cadena de la polimerasa

EPIDEMICA

Ejemplo de diferentes denominaciones de Cd según tecnica empleada para su caracterización

DE LABORATORIO

DACD: MÉTODOS DIAGNÓSTICOS

DETECCIÓN DE LAS TOXINAS A Y/O B

• DIRECTAMENTE EN MATERIA FECAL.

• DE CEPA AISLADA DE C DIFFICILE POR CULTIVO


DE LABORATORIO


• MATERIA FECAL: FRESCA. • CONSERVACION: HASTA 2 DÍAS 4ºC ≥72 HS -20 / -70ºC

( INACTIVACIÓN PROTEOLÍTICA DE TOXINA )

DETECCIÓN DE LAS TOXINAS A Y/O B


MÉTODO PRODUCTO DETECTADO

TIEMPO CORRELACIÓN CLÍNICA

Cultivo celular

Toxina B 24-48 hs.

Máxima sensibilidad Buena especificidad

Aglutinación con Látex

Glutamato (GDH) deshidrogenasa

30 min.

Baja sensibilidadBaja especificidad

EIE Toxina A A-B+

Toxinas A y B

2-4 hs.

Regular sensibilidad Buena especificidad

Inmunoblot Toxina A A-B+ 30 min.

En estudio

PCR Gen toxina B 2-4 hs.

Buena sensibilidad Regular especificidad


ENSAYO DE CITOTOXICIDAD POSITIVO

MATERIA FECAL o

Clostridium difficile

EXTRACTO + ANTITOXINA EXTRACTO

CULTIVO CELULARFIBROBLASTOS

EFECTOCITOPÁTICO

(+)

EFECTOCITOPÁTICO

(-)

TOXINA B (+)

DACD: MÉTODOS DIAGNÓSTICOSCULTIVO EN LINEA CELULAR = METODO PATRÓN


MUESTRA PARA CULTIVO BACTERIOLÓGICO

SHOCK ETANÓLICO

ETANOL

30 MIN /T AMB.

MATERIAFECAL

DETECCIÓN DE TOXINA

ANAEROBIOSIS24-48HS

CCFA + SANGRE

C difficilerecuperado

TRATAMIENTO DACD

1- PACIENTES COLONIZADOS

NO PROFILAXIS


TRATAMIENTO DACD 2- PACIENTES INFECTADOS:

DISCONTINUAR TRATAMIENTO

ANTIBIÓTICO


TRATAMIENTO DACD 2- PACIENTES INFECTADOS:

ENFERMEDAD

LEVE

S/SINTOMAS SISTÉMICOS

DIARREA LEVEMTZ-4X(250mgVO)X10d

MTZ-3X(500mgVO)X10d

ENFERNEDAD

MODERADA

FIEBRE

LEUCOCITOSIS

DIARREA PROFUSA

DOLOR ABDOMINAL

VANCOMICINA

4X(125-250 mgVO)X10d

ENFERNEDAD

SEVERA

ILEO PARALÍTICO

MEGACOLON TÓXICO

DESHIDRATACIÓN

SÉPSIS

CIRUGIA ?VANCOMICINA INTRALUMINAL

INHABILIDAD

TTO ORAL

VANCOMICINA INTRALUMINAL

CON/SIN MTZ EV


EVOLUCIÓN DACD

MEJORÍA CLÍNICA 1-2 DIAS DE INICIADO TTO

FIEBRE RESUELVE EN 24-48 HS

DIARREA RESUELVE EN 2-5 DIAS

BUENA

NO REPETIR DETECCIÓN DE TOXINAS PARA DEMOSTRAR CURA PORTADOR ASINTOMÁTICO


RECAIDAantes de los 2 meses

REINFECCIÓNdespues de los 2 meses

12-24% PACIENTES DESARROLLAN

UN 2 do E P I S O D I O D E D A C D

+/- 2 MESES DEL DIAGNÓSTICO INICIAL

EVOLUCIÓN DACD


MEDIDAS DE PREVENCIÓN

PERSONA

LAVADO DE MANOSAGUA Y JABÓNGUANTESGUARDAPOLVO

PERSONA

PERSONA

HABITACIONES PRIVADASCOHORTIZAR EN AERAS

DESIGNADASLAVANDINA

MEDIO

AMBIENTE


¡LUCHE!¡LUCHE!

Vaya hasta el fin...

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