aula dna-extraction-purification emanuel-20_11_12.ppt-11(1)
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Isolamento DNA e Análises Gené2cas
Agradecimento Especial: Maribel Funes-‐Huacca, PhD
CFBio – Isol. & Pur. Biomoleculas
Tipos de DNA
• Eucariontes; Ø DNA nuclear; Ø DNA mitocondrial;
Ø DNA cloroplasto;
• Procariontes; Ø DNA bacterial; Ø DNA plasmidial;
Estrutura de DNA
• DNA = Acido Desoxyrribonucleico
• Carrega informação genética • Presente ao longo do
cromossomo • Hélice Dupla fita • ConsJtuído de nucleoLdeos
• Molécula açúcar • Grupo fosfato • Base nitrogenada
Alfabeto do DNA
Quatro Bases: A = Adenina G = Guanina C = Citosina T = Timina
Pares de bases complementares:
A = T G ≡ C
DNA Mitocondrial
• Mitocôndria – Localizada for a do núcleo; – >100,000 em cada célula;
• mtDNA análise – Quando o DNA nuclear não é disponível; – Mais sensível, maior tempo de análise e custo; – Duas regiões altamente variáveis são analisadas:
• HV1 e HV2
mtDNA
Vantagem: UJliza pequenas quanJdades de DNA existe tanto mtDNA quanto mais do que uma cópia por célula;
Desvantagens: Herança Materna, onde a mãe e todos os filhos terão perfis próximos;
Degradação de DNA
Principal ponto de degradação (depurinação); Degradação oxidaJva; Degradação hidrolíJca;
• Hidrólise química; • Hidrólise enzimáJca; ü Exonucleases (terminais 5’, 3’); ü Endonucleases (DNAse I)
ESTRUTURA DO RNA
Ø Fita única de ácido ribonucléico. Ø As unidades monoméricas são consJtuídas de:
• Uma base: Adenina, Citosina, Guanina e URACILA;
• Um açúcar: RIBOSE;
• Um grupo fosfato.
Fundamentos de Extração de DNA
• Aplicações de DNA
Ø DiagnósJco; Ø Medicina (estudo de câncer; idenJficação doenças); Ø Processos evoluJvos (filogenias, estudos populacionais); Ø Genoma; Ø InvesJgações forenses, paternidade
Extração de DNA
• Passos principais: Ø Lise das membranas plasmáJcas e nucleares; Ø Degradação de proteínas; Ø Purificação do DNA
Extração de DNA
• Lise de membranas e degradação de proteínas Ø A lise é através de tampão de extração, contendo SDS, EDTA, DTT, e mais agentes tamponantes. O uso da Proteinase K para degradação das Proteínas (rapidamente inaJva as nucleases, que degradam o DNA);
Ø A membrana é solubilizada por agentes que rompam associações hidrofóbicas, destruindo a bicamada lipídica e desnaturando as proteínas;
Extração de DNA
• Extração em solventes orgânicos; • Purificação de DNA (eliminação de resíduos orgânicos); Molécula de DNA não é solúvel em álcool (isopropanol ou etanol), precipitando em meio alcoólico e peleJzado por centrifugação;
Ressuspenção de DNA em tampão pH=7,4, contendo RNAse para degradar o RNA;
• Conservação de DNA Estocagem de DNA a temperaturas menores de -‐20 °C, evitando descongelamentos sucessivos;
Métodos de Extração
• Fenol / clorofórmio; • Chelex; • IsoJocianato de Guanidina; • Minicolumnas ; • Kits Comerciais com sílica;
Extração de DNA
• Pre-‐tratamento de Amostras: Ø Material Vegetal (calos, folha, plântula): trituração em N2 liquido, digestão em tampão CTAB, β-‐mercaptoetanol, EDTA;
Ø Tecido animal e fluído biológico: digestão em tampão Tris-‐EDTA, SDS, NaCl, DTT e proteinase K;
Ø Osso e dente: trituração em N2 liquido, descalcificação e lavagem com EDTA 0,5M, digestão em SDS, NaCl, DTT e proteinase K;
Ø Microorganismos: Lavar e centrifugar em tampão PBS 1X antes da digestão em tampão de extração (Tris-‐EDTA, SDS, NaCl, e proteinase K);
Extração Orgânica de DNA
• Fenol: desnaturação das proteínas de maneira eficiente, remove as partes orgânicas;
• Fenol:Clorofórmio: eficiente para desproteinizar e sua ação se fundamenta na propriedade hidrofóbica das proteínas que apresentam afinidade por solventes orgânicos;
• Clorofórmio: reJra resíduos de fenol;
Extração Orgânica de RNA
• A principal preocupação na extração de RNA consiste na sua degradação por ribonucleases (RNAses), que são enzimas extremamente resistentes a vários tratamentos, inclusive térmicos (fervura, autoclavagem etc.);
• DEPC (dieJlpirocarbonato): diminuir a contaminação com RNAses das soluções, equipamentos, vidrarias e reagentes; Bons cuidados: pipetas, vidraria, luvas.
• Extração usa: TRIZOL consiste num reagente pronto para o uso no isolamento de RNA total de células e tecidos;
• DNAse I; O RNA total é livre de contaminações por DNA ou proteínas
Extração de DNA em amostras forenses
• Tipos de amostra de DNA Ø Sangue/saliva, Urina Ø Sêmen Ø Tecido Ø Osso Ø Cabelo Ø Marcas e pontas de cigarro; Ø Impressões em armas de fogo;
Coleta e Preservação de Evidencias de DNA
• Antes de qualquer coleta; Ø Anotações, rotular, fotografias;
• Uso de Luvas de látex!!
• Não sacolas de plásJco!! Sacos de papel ou mini-‐sacolas com boa circulação de ar;
• Luz e calor são inimigos dos DNA! Refrigerar amostras.
Exemplo de extração de DNA em resíduos de sangue
• Mancha de sangue (3mm x 3mm) colocada em microtubo 2mL;
1. Acrescentar tampão de extração:
(10mMTris,0,1MNaCl, 40mM DTT, 10mM EDTA, 2% SDS);
2. Sais e detergentes ajudam solubilizar os componentes da célula; DTT reduz e quebra ligações disulfeto (entre cisteínas na proteína);
3. Digerir proteínas com proteinase K
Extracão de DNA
7) Proteínas são separadas na interfase;
8) Fase aquosa é removida e o DNA isolado por microcolunas (microcon) ou precipitação em etanol;
9) Estocagem em água ou tampão TE;
4. Fenol/Clorofórmio/Álcool isoamílico (25/24/1) até formar uma solução turva;
5. Centrifugar até formar duas fases (13000rpm); 6. Fase aquosa conterá DNA-‐proteínas, lipídeos;
e outros interferentes hidrofóbicos ficarão na fase orgânica;
Fase aquosa (DNA)
Interfase (proteínas) Fase Orgânica (lipídeos)
Extracão em Chelex® 100 Ø Chelex é uma resina de intercâmbio caJônico uJlizado para análise de PCR. Testes demonstraram ter rendimento elevado em 6 X do que a extração fenol-‐clorofórmio; Ø Procedimento onde não são realizadas digestão de proteínas e extração de DNA;
Chelex ® 100
• Resina Chelex é um copolímero divinilbenzeno esJreno contendo pares iônicos iminodiacetatos; • SeleJvidade por cáJons divalentes são muito mais altos do que cáJons monovalentes (~5000 a 1); • Suspensão 5% tem pH entre 10 e 11.
Vantagens do Chelex: • Processo simples realizado só em um microtubo; • Combinação de suspensão alcalina e ebulição quebra a membrana celular liberando o DNA; • Os metais fortemente quelantes os removem da suspensão celular . Removendo inibidores hemo e também outros cá2ons divalentes, os quais catalisam a quebra enzimá2ca;
Extracão Chelex Procedimento: 1. Amostra (sangue) suspendida em Chelex 5% e incubar por 30min a 56 °C; 2. Levar a ebulição por 8min, este procedimento lisa as células e precipita hemoglobina; 3. Centrifugar amostra, e uma alíquota do sobrenadante é uJlizada para analise de PCR, 4. As esferas de intercambio iônico, proteínas desnaturadas e outros interferentes serão precipitados.
Suspensão de Chelex Ebulição de amostra em Chelex
Método de Extração em Fase Solida • Esferas de vidro ou sílica inseridas em membranas Ø IsoJocianato de guanidina e Cl-‐, NaI ou NaClO4
Ø Altas concentrações são usadas sob condições ácidas para quebrar ligações entre moléculas de água & DNA;
Ø O DNA é absorvido no vidro ou membrana;
Ø Teor do sal é reduzido , e em meio alcalino, o DNA é liberado do vidro e se tornando negaJvo;
Membrana de sílica
Extração AutomaJzada de DNA
• Nova tecnologia com parLculas magnéJcas (DNA IQ® Promega) para amostras forenses;
• Lise de células com agentes caotrópicos; • DNA se liga à super~cie de parLculas magnéJcas de sílica; • Separação do lisado via magnéJca; • Lavagem; • Liberação do DNA das parLculas magnéJcas; • Eluição;
pH < 6.5 + +
H2O
Lavagem
pH > 8.5
ChargeSwitch™ Purificação
-
Extração com ChargeSwitch® (Invitrogen)
• Ácido nucléico ionizado se liga a esferas magnéJcas; • Carga é trocada via o pH do meio; • Três passos do processo: ligação, lavagem, eluição; • Reagentes aquosos;
Comparações
• Maxwell 16 Ø 1-‐16 amostras Ø Equipamento: $24.500 Ø $5 por amostra Ø 30-‐45 min Ø Não manipulação de líquidos
Ø Preparação de amostra Ø Sais caotrópicas
• iPrep Ø 1-‐13 amostras Ø Equipamento: $29.500 Ø $5,62 por amostra Ø 20 min Ø Manipulação de líquidos Ø Pouca preparação de amostra
Ø Reagentes baseados em água
http://www.fabcousa.net/catalog/rapekit.htm
Swab Vaginal
Extração Diferencial: Swab vaginal / resíduos de sêmem
Células epiteliais e espermatozóides
Proteinase K SDS Incubar
Ø Amostra swab é removido e colocado em um microtubo;
1. Sais, tampão, EDTA e detergente SDS (dodecil sulfato de sódio) são acrescentados para digestão; 2. Incubar com Proteinase K a 37 °C por 2 h; 3. Centrifugar com um filtro em formato de cesto inserido no microtubo, e depois remover o swab;
Centrifugar Separar Lavar o pellet de esperma
Fração de célula de sêmem
DNA de células epiteliais
4. Remover cuidadosamente o sobrenadante deixando qualquer material pellet no microtubo; § A solução sobrenadante é a fração feminina; § O pellet precipitado no tubo será as células de esperma;
5. Lavar o pellet e ressuspender em tampão (10mM Tris-‐EDTA, 50mM NaCl e SDS 2%;
6. Agitar, centrifugar e lavar o pellet 4X;
DTT Proteinase K SDS Incubar
Fração de células de sêmem
7. Digerir as paredes das células de espermatozóides no tampão: Tris-‐EDTA, NaCl, SDS, DTT (quebra as proteínas com grupos disulfeto, comum em parede celular de esperma) e Proteinase K;
8. Agitar vigorosamente e centrifugar; 9. Incubar novamente o pellet no tampão a 37 °C por 2-‐5 h;
DNA de sêmem
Separação Microfluídica de células de esperma
(Técnica futura)
Células epiteliais são separadas e filtradas antes do teste http://pubs.acs.org/cgi-bin/jcen?ancham/asap/html/ac0486239.html
Separação de Células em disposiJvos microfabricados
Esperma mobilizado depois de 5min. Fluxo (1µL/h) induzido por 5µL tampão PBS. Microcanal (2,5 cm × 50 µm × 90 µm). A micrografía de processo de separação. B tempo de separação das células dentro e fora dos reservatórios e microcanal.
QuanJficação de DNA
• Qualidade da Extração (espectrofotômetro); Ø Determinação da quanJdade de DNA extraído; Ø NucleoLdeos podem ser detectado por espectrofotometria 260nm;
Ø Razão 260/280; para esJmar a contaminação de proteínas; Ø 1,7 a 2,0 amostra de DNA com pureza adequada. Valores inferiores indica contaminação com proteína. Um valor superior indica contaminação com RNA;
Separação de DNA
• Eletroforese: Ø É um método simples e muito eficiente para separar para idenJficar e para purificar fragmentos de DNA, RNA e de proteínas; Ø Ela consiste na separação de moléculas ionizadas de acordo com sua carga elétrica e seu peso molecular; Ø Moléculas com carga negaJva migram para o pólo posiJvo e moléculas com carga posiJva migram para o pólo negaJvo;
Eletroforese
Existem dois modelos básicos de eletroforese para separação de DNA:
Gel de Poliacrilamida
Gel de Agarose
Eletroforese
Fatores que afetam a migração de fragmento de DNA em géis:
Ø Tamanho do DNA; Ø Concentração; Ø Conformação do DNA;
Eletroforese em gel de Agarose
• Ágar-‐ágar (ágar ou agarose); • É um hidrocolóide componente da parede celular, extraído de diversas algas marinhas vermelhas da classe Rodophyta; • Insolúvel em água fria, dissolve em água quente formando um gel não absorvível e não fermentável; • Concentrações de 0,5% -‐ 2,5%; • Diluídos no tampão TBE ou TAE (Tris-‐borato EDTA ou Tris-‐acetato EDTA
Eletroforese em gel de Poliacrilamida
• UJlizado para DNA, RNA e Proteínas; • Composto por Acrilamida e Bisacrilamida;
Marcador de migração: (Glicerol, ficol, azul de bromofenol) aumentar a densidade da amostra, adiciona cor às amostras e permite acompanhar a corrida;
Brometo de EYdeo: § Intercala entre as fitas de ácidos nucléicos; § Fluorescente na luz ultravioleta;
Prata: Maior sensibilidade
DNA de marcadores moleculares
DNA genômicos e DNA genômico degradado
1,6: Marcador DNA 10Kbp; 2,4: DNA plasmideo não digerido; 3,5: DNA plasmideo digerido com enzimas de restrição
QUANTIFICAÇÃO E DETECÇÃO DO RNA
• Espectrofotometria a A260nm/ A 280nm (1,8 – 1,9);
• RNA total íntegro: eletroforese em gel de agarose;
23S
16S
Eletroforese em gel de agarose
Aplicações de Análise de IdenJdade Humana
• Resolver crime: estabelecer compa2bilidade entre suspeito e evidencia.. • ViJmas de Acidentes– acidente de avião… • Soldados da guerra – quem é o soldado “desconhecido”… • Provas de Paternidade – quem é o pai … • Reclamação de herança– quem obtém o dinheiro … • InvesJgações de pessoas desaparecidas – de quem é o corpo… • Base de dados de ofensores convictos – resolver casos arquivados
Como é realizada a análise de DNA?
Comparar perfis genéticos de possíveis pessoas
Extração/Purificação DNA
Material Biológico
Quantificação DNA
Amplificação/ PCR
Separação e Detecção
Determinação Genotípica
Conceitos Básicos
PCR (reação em cadeia da polimerase) – método de amplificar regiões específicas do genoma – desde 1 até mais de um bilhão de cópias em 2-‐3 horas; Locus: região do genoma a ser examinada; Alelo: é o estado de variação genéJca sendo examinada;
STRs = repeJções curtas consecuJvas; SNPs = seqüência de bases no lugar;
Cromossomos são pareados por tanto: Homozigoto – Alelos são idênJcos em cada cromossomo Heterozigoto -‐ Alelos diferentes em cada cromossomo
Replicação DNA
• Polymerase Chain ReacJon (PCR) Ø Uma técnica para replicação o copia de uma porção de uma fita de DNA . Esta técnica produz milhões de copias da fita de DNA.
Kary Mullis, inventor da PCR
Premio Nobel em Química, 1993
Reação em Cadeia da Polimerase
• PCR Mix: § DNA alvo § dNTPs § Primers § Taq DNA polimerase
• Termociclador § Desnaturação (92 °C) § Pareamento de primers (55 °C) § Extensão da fita (72 °C)
• Envolve síntese enzimáJca de várias cópias de DNA; • UJliza um par de primers e enzima Taq-‐DNA polimerase.
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Mul2plex PCR
• Aproximadamente 10 marcadores podem ser copiados ao mesmo tempo;
• Sensibilidade a níveis menores de 1 ng de DNA;
• Habilidade para manipular amostras misturadas e degradadas;
• Diferentes corantes Fluorescentes para disJnguir alelos STR;
Short Tandem Repeats (STRs)
RepeJções curtas consecuJvas pode variar entre os indivíduos
AATG
7 repetições
8 repetições
AATG AATG
Posição dos primers define o tamanho do produto
Corante Fluorescente
Marcador STR uJlizado em Tipagem de DNA
Ø Produtos de tamanho pequeno são geralmente compaJveis com DNA degradado e a PCR permite a recuperação da informação de mínimas quanJdade de material;
Ø Amplificação “mulJplex’” com detecção por fluorescência permite um alto poder de discriminação em uma só prova;
Ø Disponíveis comercialmente kit de STR de fácil manipulação; Ø Grupo uniforme de STRs fornece a capacidade para comparJlhar
através de base de dados, perfis criminais de DNA a nível nacional e internacional;
Posições de Marcadores Forenses de STR em Cromossomos Humanos
O FBI tem selecionado 13 locus de STR os quais devem ser corridos em toda análise de DNA para poder fornecer um sistema comum de perfis de DNA
Slide courtesy of Jim Schumm, Bode Technology Group
P 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 P
Avaliação de Marcador Penta nucleoLdeo (altamente heterozigoto em 24 amostras de diferentes indivíduos)
Resultado de STR MulJplex no ABI 310 CE (ABI COfiler kit)
D3S1358 D16S539
amelogenin
TH01 TPOX
CSF1PO
D7S820
GS350-ROX
gender ID
A
B
C
D
E F G
H I J
gender ID
A
B C D E F
G
H I
J
DNA Size (base pairs)
Análise simultâneo de 11 STRs
DNA Mulher
DNA Homem
D3S1358 vWA FGA suspect
Victim
Crime Scene
Victim
Suspect
Scene
Análise de Misturas com Marcadores STR
AMEL
D3
TH01 TPOX
Penta D Penta E
FGA D21 D18
CSF D16
D7
D13 D5 VWA D8
PCR com kit STR Fluorescene Separação/CE
Análise STR de DNA Humano
Genotipagem por Comparação a padrão alélico
Amplificação STR de DNA naturalmente Degradados
Recuperação de perfis de DNA de restos humanos deixados na super~cie (University of Tennessee’s Forensic Anthropology Center). Amostras amplificadas com PowerPlex 16.
Comparação de STR na degradação de DNA (PowerPlex16 kit)
DNA Control 500pg
DNA 500pg / DNAseI
DNA 500pg / H2O2