atlas agares

INSTITUTO TECNOLOGICO DE MAZATLAN

ING. BIOQUIMICA

SEXTO SEMESTRE

MICROBIOLOGIA

M.C. IRMA LORENA SANCHEZ HUMARAN

ATLAS DE AGARES BATERCIOLOGICOS

EQUIPO 5

Carnero Lerma Tania Ernestina

Carvajal Portillo Jocelyn Pamela

Figueroa Daz Carmen Liliana

Franco Torres Amayrani

Lizarraga Duarte Izamary

Zepeda Mediana Ana Karen

Mazatln Sin., 19 de Febrero del 2015

1

CONTENIDO

INTRODUCCION .................................................................................................... 2

CULTIVO DE MICROORGANISMOS .................................................................. 2

MEDIOS DE CULTIVO ........................................................................................ 2

CULTIVO DE MICROORGANISMOS. ................................................................. 2

DESARROLLO ........................................................................................................ 4

AGAR DE BILIS Y ROJO VIOLETA. ............................................................. 4

AGAR DE BILIS VERDE BRILLANTE ........................................................... 6

AGAR DESOXICOLATO ............................................................................... 7

AGAR DEXTROSA ........................................................................................ 9

AGAR DE PAPA Y DEXTROSA (PDA) ....................................................... 11

AGAR ENDO ............................................................................................... 12

AGAR EOSINA AZUL DE METILENO ........................................................ 14

AGAR PARA ESTAFILOCOCOS (NO 110 S-110) ...................................... 16

AGAR PARA INFUSIN DE CEREBRO Y CORAZN (BHI) ..................... 17

AGAR LACTOSA ......................................................................................... 19

AGAR Mc CONKEY .................................................................................... 21

AGAR PARA MTODOS ESTNDAR ........................................................ 22

AGAR NUTRITIVO ...................................................................................... 24

AGAR SALMONELLA SHIGELLA (SS) ....................................................... 26

AGAR BISMUTO SULFITO ......................................................................... 28

AGAR TCBS (TIOSULFATO CITRATO SALES BILIARES SACAROSA) . 30

AGAR XILOSA LISINA DESOXICOLATO (XLD) ......................................... 32

AGAR BAIRD-PARKER .............................................................................. 34

CALDO TETRATIONATO ........................................................................... 36

CALDO ESCHERICHIA COLI ..................................................................... 38

BIBLIOGRAFAS ................................................................................................... 39

2

INTRODUCCION

CULTIVO DE MICROORGANISMOS

El cultivo de microorganismos consiste en proporcionarles las condiciones fsicas,

qumicas y nutritivas adecuadas para que puedan multiplicarse de forma

controlada. En general, podemos distinguir cultivos lquidos y slidos en funcin de

las caractersticas del medio y cultivos discontinuos y continuos en funcin de la

disponibilidad de nutrientes en el medio.

MEDIOS DE CULTIVO

Un microorganismo necesita para crecer nutrientes que le aporten energa y

elementos qumicos para la sntesis de sus constituyentes celulares. Dependiendo

de la fuente de carbono que utilizan, los microorganismos se pueden clasificar en

autotrofos si es el CO2 atmosfrico (microorganismos que fotosintetizan) y

heterotrofos si utilizan carbono orgnico.

La frmula elemental de un microorganismo es, aproximadamente,

C4H7O2N

Lo que supone que los componentes de las clulas son: carbono que representa

alrededor del 50% del peso seco, oxgeno (32%), nitrgeno (14%), fsforo (3%),

azufre (en torno al 1%) y otros elementos traza entre los que se encuentran Fe, K,

Mg, Mn, Co, Mb, Cu y Zn.

La elaboracin de medios de cultivo requiere proporcionar los elementos antes

citados en una forma asimilable. As, por ejemplo, el C debe estar en forma de

carbono orgnico para los heterotrofos y como CO2 para los autotrofos, el N en

forma de NH4, de NO3 - o de NO2 - o en forma de aminocidos a los que se

pueda tomar su grupo amino; el P debe estar en forma de PO4 3-, el S procede de

aminocidos sulfurados o de SO4.

CULTIVO DE MICROORGANISMOS.

3

Los medios de cultivo se pueden clasificar en definidos cuando su composicin

qumica se conoce totalmente y complejos cuando no es el caso porque estn

compuestos por mezclas de extractos de materiales complejos (extracto de

levadura, extracto de carne, etc.).

Por otra parte, los medios de cultivo pueden ser lquidos o slidos si se aade

algn agente solidificante que no sea consumible por los microorganismos

(normalmente agar).

En funcin de los microorganismos que pueden crecer en ellos, los medios

pueden ser generales, selectivos cuando favorecen el crecimiento de ciertos

microorganismos

mientras suprimen el de otros (por ejemplo, el medio SPS para clostridios),

diferenciales cuando alguno de sus componentes permite identificar las colonias

de un tipo de microorganismos (por ejemplo medios con hemates para identificar

colonias de microorganismos hemolticos), selectivo-diferenciales cuando

combinan las dos caractersticas anteriores (por ejemplo, el agar de MacConkey

para identificar Escherichia coli), y medios de enriquecimiento que permiten aislar

un tipo determinado de microorganismo a partir de una mezcla una poblacin

mixta de gran tamao.

4

DESARROLLO

AGAR DE BILIS Y ROJO VIOLETA.

Fundamento

En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aporta los nutrientes

necesarios para el crecimiento bacteriano, las sales biliares y el cristal violeta

inhiben el desarrollo de la flora Gram positiva, la lactosa es el hidrato de carbono

fermentable, y el rojo neutro es el indicador de pH. El agar es el agente

solidificante. Los coliformes son bacterias que fermentan la lactosa, acidifican el

medio y producen un viraje del indicador de pH al color rojo intenso. Debido a

esto, se observan como colonias de color rojo prpura, de 1 a 2 mm de dimetro,

rodeadas, generalmente, de una zona rojiza de bilis precipitada.

Preparacin

Suspender 41,5 g en 1 l de agua destilada; calentar y agitar hasta ebullicin y

hervir durante 1 minuto. Dejar enfriar a 45C y emplear de inmediato.

Se puede esterilizar a 118C durante 15 minutos. No sobrecalentar ni refundir el

medio.

Color de las colonias

Color de las colonias que se desarrollan en el medio de cultivo:

Ingredientes (gr/L)

Extracto de levadura 3.0 gr

Peptona 7.0 gr

Sales biliares 1.5 gr

Lactosa 10.0 gr

Cloruro de sodio 5.0 gr

Rojo neutro 0.03 gr

Cristal violeta 0.002 gr

5

Bacterias que fermentan la lactosa: colonias rojo prpura, rodeadas por un

halo de precipitacin rojizo.

Bacterias que no fermentan la lactosa: colonias del color del medio,

incoloras.

Las cepas de enterococcus: Se pueden desarrollar en este medio de cultivo como

colonias pequeas, puntiformes, rosadas.

Colonias que se desarrollan en el cultivo

Microorganismo Crecimiento

Escherichia coli ATCC

8739

Satisfactorio

Escherichia coli ATCC

25922

satisfactorio

Klebsiella pneumonias

ATCC 700603

Satisfactorio

Salmonella typhimurium

ATCC 14028

satisfactorio

Proteus mirabilis ATCC

43071

satisfactorio

Pseudomonas

aeruginosa ATCC 9027

satisfactorio

Enterococcus faecalis

ATCC 29212

Escaso

Staphylococcus aureus

ATCC 6538

Inhibido

6

AGAR DE BILIS VERDE BRILLANTE

Fundamento

En el medio de cultivo, la peptona aporta los nutrientes necesarios para el

adecuado desarrollo bacteriano, la bilis y el verde brillante son los agentes

selectivos que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas y Gram negativas

a excepcin de coliformes, y la lactosa es el hidrato de carbono fermentable. Es

una propiedad del grupo coliforme, la fermentacin de la lactosa con produccin

de cido y gas.

Ingredientes (gr/L)

Bilis de buey 0.00295 gr

Erioglucina 0.0649 gr

Hierro (III) cloruro 0.0295 gr

Peptona de gelatina 8.25 gr

Sodio sulfito 0.205 gr

Verde brillante 0.0000295 gr

Fuscina bsica 0.0776 gr

Lactosa 1.8 gr

Potasio di-hidrogeno fosfato 0.0153 gr

Preparacin

Suspender 20,6 g en 1 l de agua destilada; calentar y agitar hasta ebullicin y

hervir durante 1 minuto. Distribuir y esterilizar a 121C durante 15 minutos.

El medio preparado es fotosensible por lo que se recomienda almacenarlo al

abrigo de la luz, y prepararlo poco antes de su utilizacin. Incubar a 37C de 18 a

24 horas.

Color y colonias que se desarrollan en el cultivo

Escherichia coli ATCC 25922. Crecimiento entre nulo y moderado, colonias entre amarillas y amarillas verdosas, halo amarillo.

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Enterococcus faecalis ATCC 29212. Crecimiento entre nulo y ligero, colonias amarillas con o sin halo amarillo. Salmonella Abony DSM 4224 Entre 10 y 100 colonias, colonias blanquecinas, halo rojo. Salmonella Typhimurium ATCC 14028. Crecimiento entre bueno y excelente, colonias blanquecinas, halo rojo sin inocular coloracin entre marrn y aceituna.

AGAR DESOXICOLATO

Fundamento

Es un medio altamente selectivo para el aislamiento de patgenos entricos,

particularmente de los gneros Salmonella y Shigella. Como la cantidad de este

carbohidrato es limitada, una vez que estos microorganismos lo consumen,

comienzan a utilizar la lisina lo cual produce la alcalinizacin del medio; este

hecho se evidencia porque el rojo fenol nuevamente vira a un color rojo. En el

caso de los coliformes lisina positiva, para prevenir la alcalizacin del medio por la

utilizacin de la lisina, se incorpora en el medio un exceso de lactosa y sacarosa.

El medio tambin tiene la capacidad de detectar la produccin de H2S, a travs

del sistema indicador tiosufalto de sodio y citrato frrico amonio. Cuando el

microorganismo produce H2S se observan colonias con el centro negro. Los

microorganismos no patgenos productores de H2S no descarboxilan la lisina;

8

cuando estn presentes estos microorganismos la reaccin cida producida por la

utilizacin de los carbohidratos previene en ennegrecimiento de las colonias. El

desoxicolato de sodio es utilizado como un inhibidor de los microorganismos Gram

positivos.

Ingredientes (gr/L)

Infusin de carne de porcino 330,0

Proteosa peptona 10,0

Lactosa 10,0

Citrato de sodio 20,0

Citrato amnico frrico 2,0

Desoxicolato de sodio 5,0

Agar 13,5

Rojo neutro 20,0 mg

Agua destilada 1.000 mL

PH final 7.5 +/- 0.2

Preparacin

Suspender los ingredientes en el agua destilada. Calentar hasta ebullicin con

agitacin suave y frecuente hasta disolver completamente los ingredientes. Enfriar

entre 45C y 50C, colocar 20 mL de medio por cada placa y dejar solidificar. El

medio en las placas debe utilizarse el mismo da de su preparacin.


Microorganismos Resultados del crecimiento

E. coli

Colonias grandes, planas, de color rosa o rojo

con una zona de precipitacin biliar.

Enterobacter/Klebsiella

Colonias grandes, mucoides, de color rosa.

Proteus Colonias incoloras o rojas dependiendo de la

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especie.

Salmonella/Shigella

Colonias incoloras o de color anaranjado plido.

Pseudomonas

Colonias desde incoloras hasta marrn o verde.

Vibrio cholerae

Colonias de incoloras a rojas.

Bacterias gram-positivas

Crecimiento nulo o escaso.

AGAR DEXTROSA

Fundamento

Este medio de cultivo es utilizado para cultivo de mohos y levaduras patgenas y

no patgenas. El bajo pH del medio resulta favorable para el crecimiento de los

hongos y ligeramente inhibitorio para las bacterias. En caso de requerirse un

incremento en la inhibicin del crecimiento de bacterias, se recomienda aadir

agentes antimicrobianos como la gentamicina que inhibe el crecimiento de los

microorganismos gram negativos o el cloramfenicol que tiene un amplio espectro

de accin.

10

Preparacin

Suspender 65 g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitacin

suave hasta su completa disolucin y hervir durante un minuto. Evitar el

sobrecalentamiento. Esterilizar en autoclave a 121C (15 libras de presin)

durante 15 minutos. Dejar enfriar a una temperatura entre 45-50C y vaciar en

placas de Petri estriles.


Microorganismos Color

T. mentagrophytes Blanco a blanco grisceo/marrn claro.

A. brasili Marrn a negro.

Candida albicans Blanco a blanco grisceo.

Ingredientes (gr/L)

Dextrosa 40 g

Peptona de Casena 5 g

Digerido Pancretico de Tejido

Animal

5 g

Agar Bacteriolgico 15 g

PH 5.6

0.2

PH 5.6

0.2

11

AGAR DE PAPA Y DEXTROSA (PDA)

Fundamento

Medio de cultivo microbiolgico que se preparan a partir de infusin de papa y

dextrosa (PDA). El agar de papa y dextrosa es el medio ms utilizado para el

crecimiento de hongos y levaduras que atacan a las plantas vivas o materia

vegetal muerta en descomposicin. El agar de papa y dextrosa puede ser

suplementado con antibiticos o cidos para inhibir el crecimiento bacteriano. Este

medio es recomendado para realizar el recuento colonial. Tambin puede ser

utilizado para promover el crecimiento de hongos y levaduras de importancia

clnica. La base del medio es altamente nutritiva y permite la esporulacin y la

produccin de pigmentos en algunos dermatofitos. Algunos procedimientos

sealan bajar el pH del medio a 3.5 0.1 con cido tartrico al 10 %, para inhibir

el crecimiento bacteriano. La infusin de papa promueve un crecimiento

abundante de los hongos y levaduras y el agar es adicionado como agente

solidificante.

Preparacin

La infusin de patata se puede preparar hirviendo 200 g de patatas cortadas en

rodajas sin pelar en ~ 1 litro de agua destilada durante 30 minutos y luego

decantar o filtrar el caldo a travs de una gasa. Se aade agua destilada de

manera que el volumen total de la suspensin es 1 litro. Se aaden 20 g de

dextrosa y agar en polvo (20 g), el medio se esteriliza en una autoclave a 15 psi

(121C) durante 15 minutos.

Ingredientes (gr/L)

Agua Destilada 1 L.

Patatas (cortadas en rodajas sin

pelar)

200 g.

Dextrosa 20 g.

Agar en Polvo 20 g.

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Microorganismos Color

Saccharomyces cervisiae Crema, lisas.

Candida albicans Crema, lisas.

AGAR ENDO

Fundamento

La selectividad del agar Endo se debe a la combinacin de sulfito de sodio y

fucsina bsica que inhibe ligeramente el crecimiento de los microorganismos gram

positivos. Es un medio de cultivo microbiolgico de color rosa plido. Fue

originalmente desarrollado para el aislamiento de Salmonella typhi, pero ahora es

usado mayormente como un medio para coliformes. La mayora de los organismos

gram negativos crecen bien en este medio, mientras que otros organismos gram

positivos son inhibidos.

Ingredientes. (gr/L)

Agar 15.0 gr

Fucsina bsica. 0.5 gr

Fosfato dopotsico. 3.5 gr

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Lactosa 10.0 gr

Peptona de carne 10.0 gr

Sulfito de sodio 2.5 gr

Preparacin

Rehidratar 41.5 g del medio en un litro de agua destilada. Reposar 10 a 15

minutos. Calentar agitando frecuentemente hasta el punto de ebullicin durante 1

minuto para disolverlo por completo. Esterilizar a 121C (15 lbs de presin)

durante 15 minutos. Enfriar aproximadamente a 45C. Vaciar en cajas de Petri

estriles. Conservar en refrigeracin de 2 a 8C.

NOTA: Para una mejor solubilidad de la Fucsina bsica agregar 40 ml de etanol

absoluto por litro de medio y dejarlo reposar 15 durante minutos.


Microorganismo Resultado

Escherichia coli Colonias rojo intenso con brillo metlico de color

verde.

Enterobacter cloacae

Colonias rojo intenso con o sin brillo metlico.

Salmonella typhi Colonias translcidas, rosa plido o del color del

medio.

Shigella flexneri Colonias translcidas, rosa plido o del color del

medio.

Enterococcus faecalis

Inhibicin parcial o colonias puntiformes.

PH 7.4 0.2

14

AGAR EOSINA AZUL DE METILENO

Fundamento

Agar eosina azul de metileno (EMB de Levine) es un medio selectivo diferencial

para bacterias gramnegativas no exigentes. Los colorantes contenidos en el medio

inhiben el crecimiento de las bacterias grampositivas, excepto el del enterococo.

Con ello, se permite la diferenciacin de las enteribacterias fermentadoras de la

lactosa (color violeta intenso) de las no fermentadoras (grisceas). Escherichia coli

aparece violeta, como lactosa positiva, pero con un brillo metlico caracterstico.

Permite el crecimiento de no cardia formando colonias tpicas.

pH = 7.2 0.2

Preparacin

Rehidratar 36 g del medio en un litro de agua destilada. Reposar 10 a 15 minutos.

Calentar agitando frecuentemente hasta el punto de ebullicin durante 1 minuto

para disolverlo por completo. Esterilizar a 121C (15 lbs de presin) durante 15

Ingredientes (gr/L)

Peptona especial. 10 gr

Lactosa 5 gr

Sacarosa 5 gr

Fosfato dipotsico 2 gr

Agar 13.5 gr

Eosina 0.4 gr

Azul de metileno 0.085 gr

15

minutos. Enfriar aproximadamente a 45C. Vaciar en cajas de Petri estriles.

Conservar a temperatura ambiente.



Escherichia coli Colonias grandes, color negro azulado, con

brillo metlico azul verdoso.

Enterococcus faecalis Inhibicin parcial

Salmonella typfhimurium Colonias transparentes, desde incoloras

hasta mbar.

Shigella flexneri Colonias transparentes, desde incoloras

hasta mbar.

Staphylococcus aureus Crecimiento parcialmente inhibido o colonias

puntiformes.

Candida albicans Colonias plumosas, rosa plido atpicas.

Enterobacter/ Kiebsiella Colonias grandes, mucoides, color negro

azulado.

Proteus Colonias incoloras.

Pseudomonas Colonias irregulares, incoloras

Bacterias gram-positivo Crecimiento escaso o nulo

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AGAR PARA ESTAFILOCOCOS (NO 110 S-110)

Fundamento

Staphylococcus aureus es un microorganismo que puede causar intoxicacin

alimentaria, y para su aislamiento, pueden usarse distintos medios slidos

selectivos. En el medio de cultivo, el extracto de levadura y la triptena aportan los

nutrientes para el desarrollo de microorganismos. La gelatina es el sustrato de la

enzima gelatinasa. La lactosa y el manitol son los hidratos de carbono

fermentables. El cloruro de sodio, se encuentra en alta concentracin, para inhibir

el desarrollo de la flora acompaante excepto Staphylococcus spp., logrndose as

un medio selectivo para el desarrollo de estos microorganismos.

Ingredientes (gr/L)

Extracto de levadura 2.5

Triptena 10.0

Gelatina 30.0

Lactosa 2.0

D-Manitol 10.0

Cloruro de sodio 75.0

Fosfato dipotsico 5.0

Agar Bactereologico 15.0

Preparacin

Suspender 149 g del medio en un litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y

mezclar calentando a ebullicin durante 1 o 2 minutos. Esterilizar en autoclave

durante 15 minutos a 121C. Verter en placas y mezclar para dispersar el

precipitado.

Color de las colonias

Los estafilococos positivos a la coagulasa (por ejemplo, Staphylococcus aureus)

producen colonias de color amarillo y un medio circundante de color amarillo,

PH final: 7.0

0.2

17

mientras que los estafilococos negativos a la coagulasa producen colonias de

color rojo y no producen cambio de color en el indicador de rojo fenol.


Microorganismo Pigmento Fermentacin

de manitol

Hidrlisis

de la

gelatina

Prueba de la

coagulasa

S. aureus ATCC

25923

+ + + +

S. aureus ATCC

6538

+ + + +

S. epidermidis ATCC

14990

- - + -

AGAR PARA INFUSIN DE CEREBRO Y CORAZN (BHI)

Fundamento

La infusin de cerebro y corazn ha resultado ser efectiva en el cultivo de una

amplia variedad de microorganismos, incluidos muchos tipos de patgenos. Se ha

utilizado como medio base para las nuevas frmulas de medios de cultivo cuando

se suplementa con sangre o agentes selectivos. Brain Heart Infusion (BHI) Agar

18

sin suplemento se recomienda actualmente como medio universal para

bacteriologa aerobia y para la recuperacin primaria de hongos y Actinomycetales

a partir de muestras clnicas y no clnicas1-5. BD Brain Heart Infusion (BHI) Agar

obtiene los nutrientes de la infusin de cerebro y corazn, la peptona y la glucosa.

Las peptonas y la infusin son fuentes de nitrgeno orgnico, carbono, azufre,

vitaminas y sustancias de traza. La glucosa es la fuente de carbohidratos que los

microorganismos utilizan mediante fermentacin. Se utiliza fosfato disdico como

tampn en el medio.

Ingredientes (gr/L)

Infusin de cerebro de ternera

200.0

Infusin corazn vacuno 250.0

Peptona 10.0


Glucosa 2.0

Fosfato disdico 2.5

Agar 15.0

pH final: 7.4 0.2

Preparacin

Disolver 52 g de polvo en un litro de agua destilada. Calentar a ebullicin hasta su

disolucin total. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121C.

Extender la muestra tan pronto como sea posible despus de recibirla en el

laboratorio, mediante un asa de inoculacin estril para obtener colonias aisladas.

Para el aislamiento de hongos de muestras potencialmente contaminadas, se

debe inocular un medio selectivo junto con uno no selectivo. Incubar las placas a

25 30 C en posicin invertida con humedad aumentada.

Incubar las placas durante 24 48 para bacterias y Candida, y hasta un mximo

de 5 das para Trichophyton. Las bacterias y Candida deben incubarse a una

temperatura de 35 a 37 C, y Trichophyton, a 25 30 C.

Color de las colonias que desarrolla

Incoloro

19


Microorganismos Crecimiento

Aspergillus niger Bueno

Neisseria meningitidis Bueno

Streptococcus pyogenes Bueno

Streptococcus pneumoniae Bueno

AGAR LACTOSA

Fundamento

Es un medio rico en nutrientes y no contiene inhibidores del crecimiento

bacteriano. Permite recuperar clulas injuriadas, diluye sustancias txicas o

inhibitorias y favorece el desarrollo de Salmonella con respecto a otras bacterias.

El extracto de carne y la peptona son la fuente de carbono y nitrgeno mientras

que la lactosa es el hidrato de carbono fermentable. Por la fermentacin de la

lactosa se produce cido y gas (el cual se evidencia al utilizar las campanas

Durham).

En Agar Lactosa, la peptona, el extracto de carne y el extracto de levadura

proporcionan nutrientes. El desoxicolato de sodio, el cristal violeta y el tiosulfato

inhiben las bacterias gram positivas. La diferenciacin de microorganismos

entricos gram negativos en fermentadores de lactosa (color amarillo) y no

20

fermentadores de lactosa (color azul) se logra gracias a la combinacin de lactosa

y el indicador azul de bromotimol.

Preparacin

Suspender 50 g del polvo en 1 litro de agua purificada. Reposar 5 minutos.

Calentar con agitacin frecuente y llevar a ebullicin 1 a 2 minutos hasta disolver

completamente. Distribuir en recipientes apropiados y esterilizar en autoclave a

121C durante 15 minutos.



E. coli, Klebsiella, Enterobacter Colonias amarillas rodeadas de medio Amarillo.

Proteus, Providencia, Hafnia, Salmonella, Serratia,

Alcaligenes, Pseudomonas

Colonias azul grisceas a azul verdosas, medio de azul a azul verdoso.

Enterococci, staphylococci Inhibido

Ingredientes (gr/L)

Peptona 15

Extracto de carne 3

Extracto de levadura 3

Desoxicolato de sodio 1

Tiosulfato sdico 1

Lactosa 15

Cristal violeta 0.005

Azul de bromotimol 0.08

Agar 11

pH final: 7.4 0.2

21

AGAR Mc CONKEY

Fundamento

En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el

desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla

de sales biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el

desarrollo de gran parte de la flora Gram positiva. El agar es el agente

solidificante.

Por fermentacin de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto

produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorcin en las

colonias, y la precipitacin de las sales biliares. Los microorganismos no

fermentadores de lactosa producen colonias incoloras.

Ingredientes (gr/L)

Peptona de carne 1.5 1.5 g

Peptona de gelatina 17.0 17 g

Triptena 1.5 1.5 g

Lactosa 10.0 10 g

Mezcla de sales biliares 1.5

Cloruro de sodio 5.0 5 g

Rojo neutro 0.03 0.03 g

Cristal violeta 0.001 0.001 g

Agar 13.5

pH final: 7.1 0.2

13.5 g

Preparacin

Suspender 50 g del polvo en 1 litro de agua purificada. Reposar 5 minutos.

Calentar con agitacin frecuente y llevar a ebullicin 1 a 2 minutos hasta disolver

completamente. Distribuir en recipientes apropiados y esterilizar en autoclave a

121C durante 15 minutos. En superficie: inocular directamente la muestra por

estria. En profundidad: inocular una alcuota de la muestra directa o de su

22

disolucin. Verter un volumen del medio de cultivo fundido y enfriado a 40 45 C.

Homogeneizar mediante movimientos de vaivn y rotacin. Dejar solidificar.

Incubacin: En aerobiosis, a 35 37 C durante 18 48 horas.


Microorganismos Crecimiento y color

Escherichia coli

Colonias de color rosa

Proteus mirabilis

Colonias de incoloras a color beige,

agrupamiento dinmico inhibido.

Salmonella Typhimurium

Colonias de incoloras a color beige.

Salmonella Abony Colonias de incoloras a color beige.

Shigella flexneri Colonias incoloras.

Enterococcus faecalis Inhibicin de parcial a completa.

Staphylococcus aureus

Inhibicin de parcial a completa.

Sin inocular Rosa claro, ligeramente opalescente.

AGAR PARA MTODOS ESTNDAR

Fundamento

El Agar Mtodos Estandar fue desarrollado por Buchbinder Baris and Goldstein en

1953 como un requerimiento de la American Public Health Association. Este medio

23

se formula con los ingredientes originales. El extracto de levadura y la peptona de

casena han sido utilizados en medios diseados para estudiar la presencia de

microorganismos termoflicos en productos lcteos desde 1928.

La peptona de gelatina y el extracto de levadura proporcionan la fuente de

carbono y nitrgeno. La dextrosa es el carbohidrato fermentable y el agar es

adicionado como agente solidificante.

Ingredientes (gr/L)

Peptona de Casena 5 gr

Extracto de levadura 2.5 gr

Dextrosa 1

Agar bacteriolgico 15

7.0 0.2

Preparacin

Rehidratar 23.5 g del medio en un litro de agua destilada. Reposar 10 a 15

minutos. Calentar agitando frecuentemente hasta el punto de ebullicin durante 1

minuto para disolverlo por completo. Esterilizar en autoclave a 121C (15 lbs de

presin) durante 15 minutos. Enfriar aproximadamente a 45C antes de usarlo.


Microorganismo Crecimiento

Escherichia coli Colonias medianas crema

Staphylococcus aureus Colonias mediana crema

Enterococcus faecalis Colonias pquelas blancas

Lactobacillis casei Colonias pequeas blanco a crema

Salmonella typhimurium Colonias grandes crema.

24

AGAR NUTRITIVO

Fundamento

Medio de cultivo nutritivo no selectivo, en el cual la pluripeptona y el extracto de

carne constituyen la fuente de carbono, nitrgeno y aportan nutrientes para el

desarrollo bacteriano. El agregado de cloruro de sodio mantiene el balance

osmtico y el agar es el agente solidificante. Puede ser suplementado con sangre

ovina desfibrinada estril para favorecer el crecimiento de microorganismos

exigentes en sus requerimientos nutricionales y permite una clara visualizacin de

las reacciones de hemlisis.

Ingredientes (gr/l)

Extracto de carne. 3 gr

Peptona de geletina. 5 gr

Agar. 15 gr

Color de las colonias que se desarrollan

Medio de cultivo color mbar claro. En caso de ser suplementado con sangre

ovina: color rojo cereza.

Preparacin

25

Suspender 23 g en 1 l de agua destilada; calentar y agitar hasta ebullicin y

disolucin total y hervir durante 1 minuto. Esterilizar a 121C durante 15 minutos.

Incubar a 37C de 24 a 48 horas.


Microorganismos Desarrollo

Staphylococcus aureus ATCC 25923 bueno

Escherichia coli ATCC 25922 bueno

Salmonella typhimurium ATCC 14028 bueno

Streptococcus pyogenes ATCC 12344 bueno

Streptococcus pneumoniae ATCC

6301

bueno

Hemlisis alfa: lisis parcial de los glbulos rojos. Se observa un halo de color

verdoso alrededor de la colonia en estudio. Es debido a la oxidacin de la

hemoglobina a metahemoglobina (compuesto de color verdoso) por el perxido de

hidrgeno generado por los microorganismos.

Hemlisis beta: lisis total de los glbulos rojos. Se observa un halo claro, brillante

alrededor de la colonia en estudio.

Hemlisis gamma: ausencia de lisis de los glbulos rojos. El medio de cultivo no

presenta modificaciones de color y aspecto alrededor de la colonia en estudio.

26

AGAR SALMONELLA SHIGELLA (SS)

Fundamento

En el medio de cultivo la pluripeptona y el extracto de carne aportan los nutrientes

para el desarrollo microbiano. Las sales biliares y el verde brillante inhiben el

desarrollo de una amplia variedad de bacterias Gram positivas, de la mayora de

los coliformes y el desarrollo invasor del Proteus spp. La lactosa es el hidrato de

carbono fermentable. El rojo neutro es el indicador de pH y el agar es el agente

solidificante. Los pocos microorganismos fermentadores de lactosa capaces de

desarrollar, acidifican el medio haciendo virar al rojo el indicador de pH,

obtenindose colonias rosadas o rojas sobre un fondo rojizo.

Ingredientes (gr/L)

Pluripeptona 5 g

Extracto de carne 5 g

Lactosa 10 g

Mezcla de sales biliares 8.5 g

Citrato de sodio 8.5 g

Tiosulfato de sodio 8.5 g

Citrato frrico 1 g

Verde brillante 0.00033 g

Rojo neutro 0.025 g

Agar 13.5 g

pH final: 7.0 0.2

Preparacin

Suspender 60 g del polvo en un litro de agua purificada. Reposar 5 minutos y

mezclar hasta homogeneizar. Calentar con agitacin frecuente y llevar a ebullicin

durante un minuto para disolucin total. NO esterilizar en autoclave.

Enfriar y distribuir en placas de Petri estriles.

27


Microorganismos Crecimiento Color de la colonia Produccin de

Salmonella enteritidis

Satisfactorio Incolora +

Salmonella

typhimurium Satisfactorio Incolora +

Shigella flexneri

Satisfactorio Incolora -

Shigella sonnei

Satisfactorio Incolora -

Proteus mirabilis

Satisfactorio Incolora +

Escherichia coli

Inhibicin parcial

o total Rojo-rosada -

Enterococcus faecalis Inhibicin parcial

o total Incolora -

28

AGAR BISMUTO SULFITO

Fundamento

Es una modificacin del Medio Wilson Blair, utilizado para la deteccin de

Salmonella, en particular Salmonella typhi de muestras clnicas. La Peptona y el

Extracto de carne aportan nitrgeno, vitaminas, minerales y amino cidos

esenciales para el crecimiento. La Dextrosa es el carbohidrato fermentable y

provee de carbono y energa. El indicador de Bismuto sulfito y el verde Brillante

son inhibidores de bacterias Gram positivas y de algunas bacterias del grupo

coliformes. El Agar bacteriolgico es el agente solidificante.

El sulfato ferroso se incluye para la produccin de H2S. Cuando el H2S est

presente, el hierro es precipitado dando colonias positivas caractersticas de color

marrn a negro con brillo metlico. Las placas deben ser uniformes, opacas, de

color crema-verde palo. Se recomienda guardar las placas en refrigeracin 4 das

antes de usar para reducir la inhibicin y as poder aislar salmonella de muestras

de heces dbilmente contaminadas.

Ingredientes (gr/L)

Agar 20 gr

Dextrosa 5 gr

Extracto de carne 5gr

Fosfato disdico 4 gr

Indicador de sulfito de bismuto 8 gr

Peptona de carne 5 gr

Peptona de casena 5 gr

Sulfato ferroso 03 gr

Verde brillante 0.025 gr

7.6 0.2 25

Preparacin

Rehidratar 52 g del medio en un litro de agua destilada. Reposar 10 a 15 minutos.

Calentar agitando frecuentemente hasta el punto de ebullicin durante 1 minuto

29

para disolverlo por completo. NO calentarse por tiempo prolongado y evitar as

que pierda su selectividad. NO ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE. Enfriar

aproximadamente a 45C. El precipitado caracterstico del medio se debe

dispersar uniformemente durante el vaciado en las cajas de Petri estriles. Una

vez solidificado presenta un aspecto crema uniforme y gradualmente un color

verde plido. ES IMPORTANTE PROTEGERLO DE LA LUZ y conservarlo en

refrigeracin de 2 a 8C. De lo contrario, el medio de cultivo que est en forma

reducida se va oxidando hasta adquirir un color francamente verde, cuando esto

ocurre se descarta el medio.

Tras abrir el frasco por primera vez, el contenido se puede usar hasta la fecha de

caducidad si se almacena en un lugar seco y firmemente cerrado a una

temperatura de entre 15 y 25 C. Proteger de la luz.


Microorganismo Crecimiento y color

Salmonella typhi Colonias con centro negro, bordes claros, a las

48 horas con halo negro grisceo y brillo

metlico.

Salmonella typhimurium Colonias negras a verdes

Escherichia coli Crecimiento inhibido o colonias marrn-verdes

Proteus mirabilis Colonias pequeas verdes plido o marrones y

a veces mucoides.

Staphylococcus aureus Crecimiento inhibido.

Salmonella enteriditis Colonias de color negro con brillo metlico.

Shigella flexneri Crecimiento de inhibicin parcial o colonias de

color marrn.

Enterococcus faecalis Crecimiento nulo

30

AGAR TCBS (TIOSULFATO CITRATO SALES BILIARES

SACAROSA)

Fundamento

El contenido de peptonas y extracto de levadura proporcionan al medio la

fuente de nutrientes necesarios para el desarrollo de los microorganismos; el

contenido de sales biliares y el colato de sodio inhiben el desarrollo de Gram

positivos sobre todo a los enterococos. La alta concentracin de tiosulfato de

sodio y citrato, as como el elevado pH, inhiben notablemente a las

enterobacterias.

La sacarosa es el carbohidrato fermentable, utilizando como indicador de la

variacin de pH, el azul de bromotimol y el azul de timol, se presenta un vire

amarillo por la produccin de cido incluso en un medio altamente alcalino

como el Agar TCBS. Sembrar en la superficie del medio de cultivo por estra

cruzada con el material en estudio o a partir de un cultivo de enriquecimiento.

Incubar 24 h a 35C.

Ingredientes (gr/L)

Agar 14

Cloruro de sodio 10

Azul de bromotimol 0.04

Colato de sodio 3

Azul de timol 0.04

Extracto de levadura 5

Bilis de buey 5

Polipeptona 10

31

Citrato de hierro 1

Sacarosa 20

Citrato de sodio 10

Tiosulfato de sodio 10

pH 8.6 0.2

Preparacin

Rehidratar 88 g del medio en un litro de agua destilada. Reposar 10 a 15

minutos. Calentar agitando frecuentemente hasta el punto de ebullicin durante

1 minuto para disolverlo por completo. NO ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE.

Enfriar aproximadamente a 45C. Vaciar en cajas de Petri estriles. Conservar

en refrigeracin de 2 a 8C.



Vibrio parahaemolitycus

Bueno, colonias pequeas, centro verde azulado.

Vibrio cholerae

Bueno, colonias amarillas, convexas.

Escherichia coli Inhibicin completa o colonias pequeas transparentes.

Proteus mirabilis Inhibicin parcial, colonias pequeas azul claro.

32

AGAR XILOSA LISINA DESOXICOLATO (XLD)

Fundamento

El agar XLD (Xilosa, Lisina, Desoxicolato) es un medio selectivo diferencial,

utilizado para el aislamiento y diferenciacin de patgenos entricos Gram

negativos, especialmente del gnero Shigella.

La degradacin de los carbohidratos presentes en el medio (xilosa, lactosa y

sacarosa) genera la produccin de cido haciendo virar el indicador (rojo fenol)

de rojo a amarillo. En este medio se incorpora la xilosa porque es

prcticamente fermentada por todas las enterobacterias con excepcin de los

microorganismos pertenecientes al gnero Shigella. La lisina se incluye para

aumentar la diferenciacin de los microorganismos pertenecientes al gnero

Salmonella

El medio tambin tiene la capacidad de detectar la produccin de H2S, a travs

del sistema indicador tiosufalto de sodio y citrato frrico amonio.

Ingredientes (gr/L)

Extracto de levadura 3gr

L-lisina 5gr

Lactosa 7.5 gr

Sacarosa 7.5 gr

Xilosa 3.5 gr

Desoxicolato sdico 2.5 gr

Cloruro sdico 5 gr

Tiosulfato sdico 6.8 gr

Citrato de amonio frrico 0.8 gr

Rojo fenol 0.08 gr

Agar 13.5 gr

7.4 0.2

Preparacin

Homogenice el polvo contenido en el frasco.

Aada 55 gramos de medio deshidratado a un litro de agua destilada estril.

Caliente suavemente, agitando con frecuencia hasta que hierva. Evitar el

33

sobrecalentamiento ya que puede provocar la precipitacin del medio. Este

medio NO se puede esterilizar por autoclave. Transfiera inmediatamente a un

bao mara de 50C para su enfriamiento. Dispense en placas de Petri o

frascos en cuando el medio se haya enfriado suficientemente. NO SOMETER A

AUTOCLAVE.


.

Color MICROORGANISMOS

Colonias opacas amarillas

fermentacin de al menos uno de los

azcares y LDC(-)

Escherichia coli

Enterobacter

Klebsiella

Citrobacter

Proteus

Serratia

Colonias rojas LDC (+) Shigella

Providencia

Salmonella H2S(-)

Colonias rojas con un centro negro

Produccin de H2S

Salmonella

Edwardsiella

34

AGAR BAIRD-PARKER

Fundamento

Es un medio selectivo utilizado para el aislamiento de Staphylococcus Aureus

coagulasa positivo.

Medio altamente nutritivo, en el cual la peptona de casena y el extracto de

carne constituyen la fuente de carbono y nitrgeno, el extracto de levadura

aporta vitaminas del complejo B, la glicina y el piruvato estimulan el

crecimiento de los estafilococos. El agar es el agente solidificante. Permite el

crecimiento selectivo de estafilococos ya que el telurito de potasio y el cloruro

de litio inhiben el desarrollo de la flora acompaante presente en la muestra.

Ingredientes (gr/L)

Peptona de casena 10 g

Extracto de carne 5 g

Extracto de levadura 1 g

Cloruro de litio 5 g

Glicina 12 g

Piruvato de sodio 10 g

Agar 17 g 17 g

PH final : 6.8 0.2

Preparacin

Suspender 60 g del polvo en 940 ml de agua purificada. Dejar en reposo 5 a 10

minutos. Calentar agitando frecuentemente y hervir durante 1 minuto, hasta

disolucin total. Distribuir en recipientes apropiados y esterilizar en autoclave a

121C durante 15 minutos. Enfriar a 45-50C y agregar 50 ml de emulsin de

yema de huevo y 10 ml de la solucin de telurito (Emulsin Yema de Huevo

con Telurito). Homogeneizar y distribuir en placas de Petri estriles.

Color y colonias que se desarrollan en el medio de cultivo

Microorganismo

s

Crecimient

o

Actividad

Lecitinsic

Reducci

n de

Caracterstica

s de las

35

a Telurito

de Potasio

Colonias

Staphylococcus

aureus

Satisfactorio Positiva Positiva

Colonias

negras con

borde incoloro,

convexas,

rodeadas de

una zona

opaca, con una

zona clara

externa.

Staphylococcus

aureus

Satisfactorio Positiva Positiva

Colonias

negras con

borde incoloro,

convexas,

rodeadas de

una zona

opaca, con una

zona clara

externa.

Staphylococcus

epidermidis

Regular-

Satisfactorio Negativa Positiva

Colonias

negras, de

tamao

irregular. Zona

opaca

alrededor

de la colonia

(no hay zona

clara).

Escherichia coli

Total o

parcialmente

inhibido

Negativa Negativa ----

Proteus mirabilis Total o Negativa Positiva Colonias

36

parcialmente

inhibido

marrones sin

zona clara u

opaca

alrededor.

CALDO TETRATIONATO

Fundamento

El medio de cultivo contiene peptona que provee los nutrientes necesarios para

el desarrollo bacteriano, y carbonato de calcio que neutraliza y adsorbe

metabolitos txicos. La selectividad est dada por la presencia de sales biliares

y tetrationato (compuesto generado en el medio de cultivo al reaccionar el

tiosulfato de sodio con la solucin iodo-iodurada) que inhiben el desarrollo de

microorganismos Gram positivos y algunas enterobacterias. Salmonella spp.

contiene la enzima tetrationato reductasa y puede crecer satisfactoriamente en

el medio de cultivo debido a que no la afecta la toxicidad del tetrationato.

Para evitar la proliferacin de especies de Proteus spp., se recomienda agregar

40 mg/l de Novobiocina previo al agregado de la solucin iodo iodurada.

Ingredientes (gr/L)

Peptona 5.0

Sales biliares 1.0

Carbonato de calcio 10.0

37

Tiosulfato de sodio 30.0

pH final: 8.4 0.2

Solucin iodo iodurada

Iodo 6.0

Ioduro de potasio 5.0

Agua 20.0

Preparacin

Suspender 46 g en 1 l de agua destilada; calentar y agitar hasta ebullicin. NO

ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE. Si se va a utilizar el mismo da, aadir

aspticamente 20 ml de solucin yodo-yodurada por litro de medio, o

proporcionalmente a la cantidad usada. Eventualmente puede aadirse 10 ml/l

de una solucin al 0,1% de Verde Brillante, as como Novobiocina a razn de

0,04 g/l, ambos esterilizados por filtracin. Al distribuir el Caldo repartir

homogneamente el precipitado existente. No recalentar el medio.

Sembrar el medio con el inculo e incubar entre 352C de 18 a 24 horas.

Pasado este tiempo sembrar en medios selectivos.

Color y colonias que se desarrollan en el medio de cultivo


Salmonella typhimurium Satisfactorio, incoloras.

Salmonella enteritidis Satisfactorio, incoloras.

Salmonella typhi Satisfactorio, incoloras

Escherichia coli Escaso-nulo, color rosada roja

38

CALDO ESCHERICHIA COLI

Fundamento

Medio recomendado por Hajna y Perry y por el Standard Methods for the

Examination of Water and Wastewater para el recuento de coliformes en

alimentos.

En el medio de cultivo la triptena es la fuente de pptidos, aminocidos y

nitrgeno. La lactosa es el hidrato de carbono fermentable y favorece el

desarrollo de bacterias coliformes, las sales biliares inhiben el crecimiento de la

flora acompaante Gram positiva, las sales fosfato constituyen un sistema

buffer que impide que los productos cidos originados por la fermentacin de

lactosa afecten el crecimiento microbiano y el cloruro de sodio mantiene el

balance osmtico.

Ingredientes (gr/L)

Triptena 20.0

Lactosa 5.0

Sales biliares N 3 1.9

Fosfato dipotsico 4.0

Fosfato monopotsico 1.5


pH final: 6.9 0.2

Preparacin

Suspender 37,4 g del medio en un litro de agua destilada. Calentar hasta su

total disolucin. Distribuir en tubos de ensayo que contengan campanitas de

Durham. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121C.

Colonias que se desarrollan en el medio de cultivo:

Microorganismos Crecimiento Produccin de gas

Enterobacter aerogenes Bueno a excelente

+

Escherichia coli ATCC 25922 Bueno a excelente

+

Salmonella typhimurium ATCC 14028

Bueno a excelente

-

Staphylococcus aureus ATCC 25923

Inhibido Inhibido

39

Color de las colonias a desarrollar

Medio de cultivo deshidratado: color beige claro, homogneo, libre

deslizamiento.

Medio de cultivo preparado: color mbar claro.

BIBLIOGRAFAS

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arSabouraudDextrosa.pdf


arEndo.pdf


ar_XLD.pdf

Microbiologa General, Tema 2.- Cultivo de microorganismos.

atlas agares

Documents

agar desoxicolato

agar dextrosa

agar de papa

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agar endo

agar lactosa

agar nutritivo

agar bismuto sulfito