apostila microbiologia alimentos e leite

CENTRO UNIVERSITRIO DO SUL DE MINAS INSTITUTO DE CINCIAS BIOLGICAS E DA SADE

Prof. Dr. Roberto Maciel

Varginha MG

2003

Apostila de Microbiologia de Alimentos Prof. Roberto Maciel

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MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

I - INTRODUO Toda a vida humana vivida em contato com microrganismos. Muitas espcies colonizam o

corpo, o trato digestivo e os orifcios naturais. A microbiota normal do intestino to grande, em

nmero, que perto da metade do peso seco das fezes representada por bactrias. A sade e o

bem-estar humanos so influenciados pela presena ou ausncia de microrganismos no ambiente.

Os alimentos podem ser veculos de transmisso de diversos microrganismos e metablitos

microbianos, alguns deles patgenos para o homem. Segundo sua procedncia mais freqente

possvel agrupar estes microrganismos do seguinte modo: a) de origem endgena estando

presente nos alimentos antes de sua obteno, b) de origem exgena, que chegam aos alimentos

durante sua obteno, transporte, industrializao, conservao, etc..

As primeiras evidncias potenciais da presena de microrganismos em alimentos foram

sugeridas pelas observaes de Kircher, em 1658, que relatou a presena de "vermes" em carnes

decompostas, seguidas pelas experincias de Spallanzani, em 1765, que comprovou que infuso

de carne, aquecida durante 1h e convenientemente cerrada, permanecia pr longo tempo sem se

deteriorar.

Uma notvel contribuio para o avano das tcnicas de preservao de alimentos foi dada

pr Nicholas Appert, um confeiteiro francs que, em 1809, desenvolveu, ainda que de forma

incipiente, os primeiros produtos crneos envasados em garrafas e preservados pelo

aquecimento, por perodos variveis, em gua em ebulio. Embora os trabalhos de Appert

representem um marco no desenvolvimento de tecnologia do enlatamento, no oferecem uma

contribuio direta para a Microbiologia, uma vez que este autor no era propriamente um cientista

e, portanto desconhecia por completo o papel dos microrganismos nos alimentos.

Na verdade, a exemplo do que ocorreu em outras reas da Microbiologia, tambm na de

alimentos, o primeiro pesquisador a apreciar e compreender a presena e papel dos

microrganismos foi Louis Pasteur. Este notvel cientista, em 1837, demonstrou que a acidificao

do leite era provocada por microrganismos e, em 1860, conseguiu assegurar a preservao do

vinho e cerveja por meio de um tratamento trmico suave, processo este que, posteriormente,

passou a denominar-se de pasteurizao.


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A partir das pesquisas pioneiras de Pasteur e, particularmente, nas ltimas dcadas do

sculo atual, o conhecimento na rea de Microbiologia de Alimentos experimentou um avano

muito acentuado.

II - ORIGEM DOS MICRORGANISMOS DOS ALIMENTOS A microbiota de alimentos consiste de microrganismos associados com materiais crus,

queles adquiridos durante manuseio e processamento, e aqueles sobreviventes de tratamentos

de preservao e estocagem.

Visto que os microrganismos no surgem por gerao espontnea, eles contaminam os

alimentos em qualquer estgio de produo, lavagem, manuseio, processamento, estocagem,

distribuio ou preparo para consumo. A maioria dos alimentos est sujeito a numerosas fontes

potenciais de microrganismos.

As fontes potenciais de contaminao so: solo, gua, ar, plantas, raes ou fertilizantes,

animais, seres humanos, guas de esgoto, equipamentos usados em processamento,

ingredientes, produto para produto, e embalagens.

Os microrganismos podem ser trocados entre estas fontes. Por exemplo: animais

contaminam o solo com fezes; a chuva leva os microrganismos para os crregos e rios; a gua

pode ser usada para irrigao e contaminar plantas usadas como alimento. Assim, apesar da

gua ser a portadora dos microrganismos, estes vieram originalmente dos animais.

Em alguns alimentos, difcil determinar quais dos microrganismos da microbiota so

contaminantes e quais so resultantes de multiplicao sobre ou dentro dos alimentos.

1 - SOLO

1.1 - No e tipo de microrganismo - o nmero de microrganismos pode variar de poucos organismos em solos arenosos e desertos a 1010/g em solos frteis. Poucos ambientes, na terra,

fornecem to grande variedade de microrganismos como o solo frtil. Bactrias, fungos, algas,

protozorios e vrus formam esta coleo microscpica, que pode alcanar um total de bilhes de

organismos por grama. A diversidade da microbiota apresenta um problema em qualquer tentativa

de se enumerar a populao total de uma amostra de solo. Os mtodos culturais revelam, apenas,

os tipos fisiolgicos e nutritivos compatveis com o meio cultural. As contagens microscpicas


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diretas permitem, teoricamente, a enumerao de todos os microrganismos, com exceo dos

vrus, mas esta tcnica demonstra limitaes, especialmente ligadas diferenciao entre seres

vivos e mortos.

Sempre que os bacterilogos buscam novas classes de microrganismos ou novas raas

para fins especiais, geralmente o primeiro que investigam o solo. No s contm o solo

numerosas classes de microrganismos, em grande quantidade, e sempre em condies de

contaminar as superfcies das plantas que ali crescem e os animais que ali se movem. O p do

solo arrastado pelas correntes de ar, e as guas podem transportar partculas de terra que so

capazes de chegar aos alimentos. Quase a totalidade dos microrganismos pode proceder do solo.

De especial interesse so as leveduras, os fungos, e as espcies bacterianas seguintes: Bacillus,

Clostridium, Aerobacter, Escherichia, Micrococcus, Alcaligenes, Achromobacter,

Flavobacterium, Chromobacterium, Pseudomonas, Proteus, Streptococcus, Leuconostoc e

Acetobacter. Devido s condies ambientais usualmente pobres, os microrganismos do solo geralmente se encontram em estado de latncia ou em estado de atividade metablica reduzida.

1.2- Crescimento dos microrganismos - O crescimento microbiano no solo limitado a reas de material orgnico. Estas reas incluem razes de plantas, fragmentos de plantas cadas

no solo, carcaas de animais, materiais fecais de animais e microrganismos mortos. O

crescimento dos microrganismos influenciado pela composio qumica dos materiais em

decomposio, a % de decomposio dos constituintes qumicos destas substncias e condies

ambientais. O principal fator que afeta a multiplicao a escassez de nutrientes. Em geral o solo

no um bom meio para o crescimento de microrganismos, entretanto eles tendem a sobreviver.

1.3- Contaminao dos alimentos - os microrganismos do solo podem contaminar tubrculos ou razes por contato direto. A poeira levada pelo vento ou pela chuva caindo no solo

pode contaminar plantas como morangos, feijo, repolho ou ervilhas que crescem prximas ao

nvel do solo. O nmero e tipo de microrganismo das plantas so influenciados pelo grau de

contaminao do solo em que eles crescem. Lavagens mecnicas tm aumentado o volume de

contaminao pelo solo. Assim como a ruptura de frutos e vegetais. Os cereais so contaminados

principalmente durante a lavagem.


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2 - GUA A gua fonte potencial de contaminao microbiana de alimentos. A chuva contm os

microrganismos que so lavados do ar. A maior parte desses germes removida do ar durante as

primeiras etapas da precipitao. Em maior ou menor grau, as guas de lagos, correntes, rios e

oceanos so suscetveis de sofrerem contaminaes peridicas com microrganismos provenientes

da atmosfera (precipitaes), do solo ou de qualquer tipo de dejeto que nelas lanado. As

populaes microbianas variam, de acordo com a fonte hdrica, a composio nutritiva da gua e,

ainda, de conformidade com as condies geogrficas, biolgicas e climticas.

3 - AR A contaminao dos alimentos a partir do ar pode ser importante tanto por razes sanitrias

como econmicas.

3.1 - Origem dos microrganismos do ar - O ar carece de uma microbiota prpria, sendo que todos os seus germes encontram-se ali acidentalmente e, em geral, so encontrados sobre

partculas slidas em suspenso ou em pequenas gotas de gua. Os microrganismos chegam ao

ar por meio do p, terra seca, gotculas das correntes de gua, lagos ou mares, gotculas de

tosse, espirro ou fala, fungos esporulados que crescem em paredes, tetos, solos, alimentos e

ingredientes dos mesmos e a partir de partculas ou pulverizaes procedentes dos produtos

alimentcios ou seus ingredientes.

3.2 - Tipos de microrganismos do ar - Os microrganismos presentes no ar no tem oportunidade de desenvolver-se, unicamente se mantm no mesmo, sendo que as classes mais

resistentes dessecao sero as que mais persistiro. Os esporos de fungos, devido a seu

pequeno tamanho, sua resistncia dessecao e ao grande nmero em que se produzem,

encontram-se habitualmente no ar. Muitos destes esporos no absorvem facilmente a umidade e

por isto sedimentam com mais dificuldades a partir do ar mido que outras partculas que

umedecem facilmente. Qualquer classe de bactrias tem a possibilidade de ser encontrada em

suspenso no ar, especialmente sobre as partculas de p ou gotculas de gua, sendo que alguns

tipos aparecem com mais freqncia que outras. Os cocos, em geral, so mais numerosos que as

formas bacilares, e os esporos bacterianos so relativamente pouco freqentes no ar livre de p.

Em conseqncia, sempre que existam no ar partculas slidas ou lquidas procedentes de


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determinado material, so encontrados germes, prprios do material suspenso: organismos do

solo como o p e terra, da gua com pulverizaes aquosas.

3.3 - Quantidade de microrganismos no ar - O nmero de microrganismos no ar em um dado momento depende de uma srie de fatores, como movimento do mesmo, luz solar, umidade,

situao geogrfica e quantidade de p e gua suspensos. O nmero de bactrias do ar p metro

cbico muito varivel, oscilando entre menos de 30 por m3 em cima das montanhas a vrias

dezenas de milhares no ar muito carregado. O ar seco geralmente contm mais germes que o ar

mido nas mesmas condies. A chuva e neve eliminam do ar grande nmero de microrganismos,

sendo que a chuva forte continuada praticamente elimina todos eles. O ar sobre um campo em

produo possui menos germes que quando aquele se encontra recm arado. O ar sobre o mar

mais pobre em microrganismos que sobre a terra.

4 - PLANTAS E PRODUTOS VEGETAIS A maior parte dos microrganismos citados quando se falou de solo e gua, tambm so

encontrados nas plantas e so provenientes dos mesmos. Por outro lado existem certas bactrias

mais relacionadas com as plantas que com o solo. Pertencem a estas os gneros: Acetobacter,

Aerobacter, Erwinia, Flavobacterium, Kurthia, Lactobacillus, Leuconostoc, Paracolobactrum

e Streptococcus. Entretanto, qualquer dos outros gneros pode ser encontrado nas plantas e produtos vegetais. Entre os mofos, os gneros mais importantes transmitidos pelas plantas so os

que produzem alteraes das frutas e verduras. O gnero mais notvel das leveduras a

Saccharomyces, que pode ser encontrada em muitos produtos vegetais, especialmente frutas.

Outros gneros importantes so Rhodotorula e Torula. 5 - TRATO INTESTINAL DO HOMEM E ANIMAIS Alguns gneros bacterianos so encontrados mais freqentemente neste meio que no solo,

gua e outros lugares. Entre eles: Bacteroides, Escherichia, Proteus, Salmonella, Shigella,

Staphylococcus e Streptococcus. O mais notvel o gnero Escherichia, que tem seu "habitat" natural no intestino do homem e outros mamferos. Outras espcies comuns no trato

intestinal pertencem ao gnero Clostridium, Paracolobactrum e Pseudomonas. Os microrganismos intestinais dos animais chegam diretamente ao solo e gua. A partir do solo

passam as plantas, p, utenslios, etc. Enquanto o gnero Candida encontrado com muita


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freqncia no intestino humano, no se considera importante transmisso destes fungos

leveduriformes por via fecal.

Quando o material cloacal, sem tratamento prvio, destina-se a fertilizao, existe o perigo

de uma contaminao dos vegetais comestveis por bactrias patognicas do homem,

especialmente por bactrias que causam enfermidades gastrointestinais. Alm das bactrias

patognicas, os alimentos podem tambm se contaminar a partir dos produtos cloacais com

bactrias coliformes, anaerbios, enterococos e outras bactrias intestinais. As guas naturais

contaminadas desta forma comunicam esta microbiota aos peixes, mariscos e outros alimentos

marinhos.

6 - MANIPULADORES DE ALIMENTOS Geralmente, a microbiota das mos e vestimentas externas dos manipuladores de

alimentos reflete o meio e hbitos em que se desenvolvem. Com freqncia, esta microbiota

estar composta por organismos que tenham sua origem nos objetos manipulados pelo pessoal,

assim como alguns procedentes do p, gua, solo e gua, etc. Alm disto, existem determinados

gneros bacterianos especificamente relacionados com as mos, fossas nasais e boca. Este

caso dos gneros Kaffkya, Sarcina e Staphylococcus, dos quais este ltimo o mais interessante e se encontra nas mos, braos, fossas nasais, boca e outras partes do corpo.

Enquanto os gneros Salmonella e Shigella fundamentalmente so intestinais, podem chegar aos alimentos e utenslios veiculados pelos manipuladores, se estes no so escrupulosos em

suas praticas higinicas. Alguns mofos e leveduras podem ser encontrados nas mos e roupas

deste pessoal, dependendo, sobretudo de cada indivduo em particular.

7 - EQUIPAMENTOS Os gneros de microrganismos encontrados em equipamentos dependem dos tipos de

alimentos manipulados, do cuidado e conservao dos equipamentos e de outros fatores. Quando

as verduras so manejadas com utenslios no desinfetados fcil deduzir que nestes aparecero

alguns ou todos os microrganismos dos mesmos. Se os utenslios so lavados com gua quente

ou em ebulio, permanecer s a microbiota capaz de resistir aos efeitos deste tratamento. Os

utenslios guardados em locais abertos, sobre os quais depositado o p, logicamente tero

bactrias, leveduras e mofos transmitidos deste p. Os equipamentos podem ser limpos e

sanitizados, o que no significa que sejam estreis. Mesmo aps lavagem e superfcies


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visivelmente limpas, a sobrevivncia e o crescimento das bactrias so possveis. Mesmo as

superfcies visivelmente limpas podem ter depsitos de alimentos ou filmes que criam um

microambiente aceitvel para desenvolvimento e crescimento de microrganismos.

III - FATORES QUE AFETAM O DESENVOLVIMENTO DOS MICRORGANISMOS NOS ALIMENTOS Tanto na natureza como no laboratrio, o crescimento de populaes bacterianas se torna

limitado, seja pela exausto de nutrientes disponveis, seja pelo acmulo de substncias txicas.

Como essas mudanas no ambiente decorrem do crescimento das prprias bactrias, o

desenvolvimento de populaes bacterianas auto-limitado. As culturas crescem

exponencialmente apenas por um curto perodo; eventualmente, o crescimento cessa e a morte da

populao sobrevm.

A histria de qualquer cultura bacteriana reflete a interao entre a populao de clulas em

crescimento e o ambiente, a qual se altera em conseqncia do crescimento bacteriano. O curso

do desenvolvimento de uma da cultura influenciado por fatores como o estado fisiolgico das

clulas utilizadas para o inculo, a composio do meio e as condies de incubao.

1 - Curva de Crescimento Quando os microrganismos chegam aos alimentos, se as condies so favorveis, iniciam

sua multiplicao e crescimento, que passa por uma srie de fases sucessivas. Se realizarmos

contagens microbianas peridicas e expressarmos os resultados como logaritmo do nmero de

microrganismos por mililitro representando graficamente em ordenadas e as unidades de tempo

em abscissas, obtm-se uma curva de crescimento semelhante representada na figura 1. Nesta

curva, observa-se que h um perodo inicial no qual no parece haver crescimento, seguido por

um rpido aumento da populao, que se nivela posteriormente e declina quanto ao nmero de

clulas viveis. Entre cada uma dessas fases h um perodo de transio (poro encurvada),

representando o tempo necessrio para que as clulas entrem em uma nova fase, o que tpico

de todos os organismos que so transferidos para um meio de cultura novo. Observe-se o que

acontece com as clulas bacterianas durante cada um dos citados perodos.


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Figura 1 - Curva de crescimento dos microrganismos

(1) inicial ou fase de latncia ou lag - fase (de A a B), durante a qual no existe crescimento ou inclusive diminui o nmero de germes.

(2) fase de acelerao positiva (de B a C), durante a qual aumenta continuamente a velocidade do crescimento.

(3) fase logartmica ou exponencial (de C a D), durante a qual o ritmo de crescimento mximo e constante.

(4) fase de acelerao positiva (de D a E), onde diminui o ritmo de multiplicao. (5) fase mxima estacionria (de E a F), onde o nmero permanece constante. (6) fase de destruio acelerada (de F a G). (7) fase de destruio final ou fase de declnio, durante a qual o nmero de germes decresce a ritmos constantes.

As fases principais na histria da cultura so a lag-fase, a fase de crescimento exponencial

(fase logartmica), a fase estacionria mxima e a fase de morte.

1.1 - Lag-phase (fase lag) - a adio do inculo a um novo meio de cultura no seguida pela duplicao da populao, de acordo com o tempo de gerao. Em vez disso, a populao

permanece temporariamente inalterada, como se mostra na curva de crescimento normal. Mas, o


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fato no significa que as clulas estejam em repouso ou dormentes; ao contrrio, durante esta

etapa as clulas aumentam de tamanho, alm de suas dimenses normais. So fisiologicamente

muito ativas e esto sintetizando novo protoplasma. As bactrias, no novo meio de cultura, podem

ser deficientes em enzimas ou coenzimas, que devem ser sintetizadas, primeiro, em quantidades

suficientes para o funcionamento timo da maquinaria qumica da clula. Os ajustes relativos ao

ambiente fsico ao redor da clula podem exigir tempo. Os organismos esto metabolizando, mas

h uma fase lag no processo de diviso.

Ao fim da fase lag, cada organismo se divide. No entanto, como nem todos os indivduos

completaram sua etapa lag simultaneamente, ocorre um aumento gradual da populao at o

trmino dessa fase, quando todas as clulas passam a ter capacidade de diviso, em tempos

regulares.

1.2 - Fase logartmica ou exponencial - Durante este perodo as clulas se dividem firmemente, num ritmo constante, e o logaritmo do nmero de clulas relacionado com o tempo,

resulta numa linha reta. Em condies apropriadas, o ritmo de crescimento mximo durante esta

fase. A populao grandemente uniforme, em termos de composio qumica, atividade

metablica e outras caractersticas fisiolgicas.

1.3 - Fase estacionria - A fase do crescimento comea a diminuir depois de vrias horas, outra vez de forma gradual, representada por uma curva de transio entre uma linha reta (fase

logartmica) e outra, que a fase estacionria. Esta tendncia para o fim do crescimento pode ser

atribuda a uma srie de circunstncias, particularmente exausto de alguns nutrientes e, com

menos freqncia, produo de produtos txicos. A populao permanece constante durante um

certo tempo, talvez como resultado do trmino das divises ou do equilbrio entre o ritmo de

reproduo e o equivalente ritmo de morte.

1.4 - Fase de declnio ou morte - Depois do perodo estacionrio, as bactrias podem morrer mais rapidamente do que a produo de novas clulas, se, de fato, algumas bactrias

ainda estiverem reproduzindo-se.

Indubitavelmente, vrias condies contribuem para a morte bacteriana, mas as mais

importantes so a depleo de nutrientes essenciais e o acmulo de substncias inibidoras, tais

como os cidos. Durante a fase de morte, o nmero de clulas viveis decresce geometricamente

(exponencialmente), em essncia, o inverso do crescimento durante a fase log. As bactrias


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morrem em velocidades diferentes, tal como se comportam em relao ao crescimento. Algumas

espcies de cocos Gram-negativos morrem muito rapidamente, de modo que podem restar

algumas poucas bactrias vivas aps 72 horas ou menos de incubao. Outras, porm, morrem

to lentamente que h clulas viveis depois de meses at anos.

2 - Fatores Os microbiologistas de alimentos necessitam conhecer os fatores que influenciam no

crescimento microbiano. So necessrias para a fermentao, enumerao, ou a produo de

protenas unicelulares, condies de crescimento desejveis. Na preservao dos alimentos so

usadas condies no desejveis para o crescimento.

As condies que afetam o metabolismo e a multiplicao dos microrganismos incluem

nutrientes, gua, pH, inibidores, oxignio, luz, temperatura, tempo, etc.. Alguns organismos fazem

parte do ambiente e podem alterar este. Interaes como efeito de um organismo sobre o outro,

so tambm importantes.

Visto que nossos alimentos so de origem vegetal e animal, vale a pena considerar as

caractersticas dos tecidos vegetais e animais que influem no crescimento dos microrganismos.

2.1 - Parmetros intrnsecos Os parmetros que so parte inerente dos tecidos vegetais e animais denominam-se

parmetros intrnsecos. Estes parmetros so: pH, umidade, potencial de oxi-reduo, contedo

de nutrientes, compostos antimicrobianos e estruturas biolgicas.

2.1.1. pH - o pH do alimento um dos principais fatores intrnsecos capazes de determinar o crescimento, sobrevivncia ou destruio dos microrganismos nele presentes. No

estado natural, a maioria dos alimentos, como carnes, pescados e produtos vegetais, so

ligeiramente cidos. A maior parte das frutas so bastante cidas e s alguns alimentos, como a

clara do ovo, por exemplo, so alcalinos.

a - efeito sobre os microrganismos - os microrganismos tem um pH mnimo, timo e mximo para crescimento (Tabela 1). Muitas bactrias mostram um crescimento timo a

pH prximo de 7,0, enquanto outros so favorveis em ambiente cido, provavelmente devido a

inibio de outros organismos, eliminando portanto competio microbiana. As formas cidas

(Lactobacillus e Streptococcus) podem tolerar acidez moderada, enquanto que tipos

proteolticos (Pseudomonas) podem crescer em substratos moderadamente alcalinos. Em geral


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fungos cresce melhor em pH baixo que leveduras, e estas so mais tolerantes que bactrias.

Bactrias usualmente crescem melhor que leveduras em pH neutro ou levemente cido, mas a pH

5,0 ou menos, leveduras podem competir ou superar o crescimento de bactrias.

Os diferentes cidos podem exercer um efeito inibitrio ou letal sobre a clula microbiana.

Sabe-se que em condies timas de substrato, em meios prximos neutralidade, o pH interno

da clula aproximadamente 7,0. No entanto, evidncias experimentais tm demonstrado que o

pH intracelular bastante afetado pelas variaes externas (CORLETT Jr & BROWN, 1980). O

efeito dos cidos na destruio ou inibio microbiana pode ser devido concentrao

hidrogeninica (nvel de H+ livres) ou toxidade do cido no dissociado, a qual, por sua vez, ser

afetada pelo pH (GENIGIORGIS & RIEMANN, 1979). Por outro lado, a acidificao do interior da

clula poder ser devida migrao de ons H+ do meio externo para o interno, ou ento

dissociao das molculas capazes de penetrar atravs das barreiras da membrana celular. O

primeiro passo, que ocorre principalmente no caso de solues cidas fortes, ir depender

fundamentalmente de uma elevada concentrao hidrogeninica externa, afetando

comparativamente muito menos o pH intracelular do que solues de cidos orgnicos fracos.

(CORLETT Jr & BROWN, 1980)

Os cidos orgnicos fracos e lipfilos, na forma no dissociada, so facilmente solveis na

membrana celular, inibindo ou destruindo microrganismos pela interferncia na sua

permeabilidade, afetando o transporte de substratos e a fosforilao oxidativa, bem como gerando

a inibio do sistema de transporte de eltrons e, finalmente, causando acidificao do interior da

clula, provavelmente a causa principal da sua inibio ou destruio.

Tabela 1 - Faixas de pH aproximados para crescimento microbiano

pH

ORGANISMO Mnimo timo Mximo

Bactrias (maioria) 4,5 6,5-7,5 9,0

Acetobacter 4,0 5,4-6,3 -

Bacillus subtilis 4,2-4,5 6,8-7,2 9,4-10,0

Clostridium botulinum 4,8-5,0 6,0-8,0 8,5-8,8

Clostridium perfringens 5,0-5,5 6,0-7,6 8,5

Erwinia catavora 4,6 7,1 9,3

Escherichia coli 4,3-4,4 6,0-8,0 9,0-10,0

Lactobacillus (maioria) 3,0-4,4 5,5-6,0 7,2-8,0


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Leuconostoc cremoris 5,0 5,5-6,0 6,5

Leuconostoc oenos - 4,2-4,8 -

Pediococcus cerevisiae 2,9 4,5-6,5 7,8

Proteus vulgaris 4,4 6,0-7,0 8,4-9,2

Pseudomonas (maioria) 5,6 6,6-7,0 8,0

Salmonella (maioria) 4,5-5,0 6,0-7,5 8,0-9,6

Salmonella typhi 4,0-4,5 6,5-7,2 8,0-9,0

Salmonella choleraesuis 5,0 7,0-7,6 8,2

Staphylococcus aureus 4,0-4,7 6,0-7,0 9,5-9,8

Streptococcus lactis 4,1-4,8 6,4 9,2

Vibrio 5,5-6,0 - 9,0

Vibrio cholerae - 8,6 -

Vibrio parahaemolyticus 4,8-5,0 7,5-8,5 11,0

Leveduras 1,5-3,5 4,0-6,5 8,0-8,5

Hansenula - 4,5-5,5 -

Pichia 1,5 - -

Saccharomyces cerevisiae 2,0-2,4 4,0-5,0 -

Mofos 1,5-3,5 4,5-6,8 8,0-11,0

Aspergillus niger 1,2 3,0-6,0 -

Mucor - 3,0-6,1 9,2

Penicillium 1,9 4,5-6,7 9,3

Alguns cidos, ao se dissociarem no interior das clulas, liberam nions (por exemplo,

lactato e citrato), que podem ser metabolizados, no havendo interferncia com as reaes

produtoras de energia; por outro lado, outros cidos, caso do frmico e actico, so mais txicos,

pelo fato de no apenas liberarem H+ mas tambm pela atividade inibitria dos prprios nions

liberados (CORLETT Jr & BROWN, 1980; HERSOM & HULLAND, 1980).

b - alterao do pH pelos microrganismos - o ambiente influencia no crescimento dos microrganismos, assim como os microrganismos influenciam no ambiente.

Durante o crescimento, produtos metablicos so formados. Estes podem ser tanto cidos como

alcalinos dependendo do substrato, os organismos envolvidos, e do tempo de crescimento. A

reao inicial de muitos organismos de produo de cidos por causa da quebra de carboidratos

e da formao de cidos orgnicos. A alterao do pH pela produo de cidos usada nas

industrias de produtos fermentados. A bactria cido-ltica tende a baixar o pH pela produo de


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cido ltico, enquanto que tipos proteolticos como as Pseudomonas tendem a aumentar o pH

pela produo de amnia ou outras substncias bsicas.

c - sobrevivncia - o pH de crescimento difere do pH para sobrevivncia. Alguns organismos mostram sobrevivncia a pH ao redor de 5,6 - 6,5 e timo crescimento a 6,8-

7,2. Os microrganismos podem sobreviver em pH excessivamente cido ou bsico para

metabolismo e crescimento. O efeito do pH na sobrevivncia durante o aquecimento evidente.

d - pH de alimentos - o pH dos alimentos junto com outros fatores ambientais, pode determinar os tipos de microrganismos que so capazes de crescer e dominar, e

eventualmente causar deteriorao, uma fermentao desejvel, ou uma doena potencial.

Os alimentos podem ser naturalmente cidos, os cidos podem ser adicionados ou os

cidos podem ser produzidos nos alimentos por ao enzimtica com ou sem crescimento

microbiano.

O pH dos alimentos determinado pelo balano da capacidade tamponante e as

substncias cidas ou bsicas que possui. Visto que a protena tem uma alta capacidade

tamponante, alimentos proticos tm maior capacidade tamponante que frutas e vegetais. Isto

muito importante na fermentao cido-ltica onde a produo de pequenos volumes de cido em

processos de fabricao de chucrute e picles, poder abaixar o pH significativamente.

Os valores aproximados de pH de alguns alimentos so citados na tabela 2.

Com base nos valores de pH dos alimentos possvel avaliar o potencial e a provvel

natureza do processo de deteriorao que eles podero vir a sofrer. De acordo com STUMB

(1973), os alimentos poderiam ser divididos em 3 grandes grupos:

Alimentos de baixa acidez - pH superior a 4,5 Alimentos cidos - pH entre 4,5 e 4,0 Alimentos muito cidos - pH abaixo de 4,0

Tabela 2 - Faixas aproximadas de pH de alguns alimentos.

ALIMENTO FAIXA DE pH ALIMENTO FAIXA DE pH

Clara de ovo 7,6-9,5 Alho 5,3-5,8

Camaro 6,8-8,2 Batata doce 5,3-5,6

Caranguejo 6,8-8,0 Repolho 5,2-6,3

Leite 6,3-6,8 Espinafre 5,1-6,8


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Melo 6,2-6,5 Aspargos 5,0-6,1

Tmara 6,2-6,4 Queijos (maioria) 5,0-6,1

Manteiga 6,1-6,4 Queijo Cammbert 6,1-7,0

Mel 6,0-6,8 Cenouras 4,9-6,3

Cogumelos 6,0-6,5 Beterrabas 4,9-5,8

Couve-flor 6,0-6,7 Bananas 4,5-5,2

Alface 6,0-6,4 Suco de tomate 3,9-4,7

Gema de ovo 6,0-6,3 Presunto 3,5-4,0

Milho doce 5,9-6,5 Damasco 3,5-4,0

Ostras 5,9-6,6 Molho de ma 3,4-3,5

Aipo 5,7-6,0 Abacaxi 3,2-4,1

Peras 5,6-6,8 Ameixa 2,8-4,6

Carne de Frango 5,5-6,4 Laranja 2,8-4,0

Batatas 5,4-6,3 Limo 2,2-2,4

Carne bovina 5,3-6,2 Lima 1,8-2,0

Esta classificao, eminentemente prtica, tem no pH 4,5 o valor bsico separando os

alimentos nos quais pode ou no haver crescimento e produo de toxina por Clostridium

botulinum; na verdade, pesquisas tm evidenciado que o pH mnimo para o crescimento e

produo de toxinas por parte desta bactria o de 4,7 (HERSON & HULLAND, 1980); no

entanto, o valor de pH=4,5 ainda continua sendo adotado na separao de produtos de baixa

acidez e cidos, embora, recentemente, nos Estados Unidos, este valor tenha sido elevado par 4,6

(FOOD PROCESSORS INSTITUTE, 1983).

Considerando exclusivamente o pH como fator restritivo ao crescimento microbiano e

mantendo-se timos todos os demais fatores intrnsecos e extrnsecos, podem-se estabelecer as

seguintes condies quanto aos microrganismos capazes de crescimento:

Alimentos de baixa acidez (pH > 4,5) - predominncia de crescimento bacteriano, em face do menor tempo de gerao, envolvendo tanto espcies deterioradoras, como patognicas,

esporognicas ou no, aerbias ou anaerbias, mesfilas ou termfilas.

Alimentos cidos (pH entre 4,5 e 4,0) - predominncia de crescimento de leveduras oxidativas ou fermentativas e de bolores (sob aerobiose). Entre as bactrias esporognicas, possibilidade

de desenvolvimento de Bacillus coagulans e, eventualmente, B. polymyxa, B. macerans, B.

licheniformis, Clostridium pasteurianum e C. butyricum; entre as bactrias no

esporognicas, maior freqncia daquelas na famlia Lactobacillaceae (Lactobacillus) e


16

Streptococcaceae (Streptococcus, Leuconostoc e Pediococcus), sendo menos freqente a

presena de Zymomonas e de bactrias acticas (Acetobacter e Gluconobacter).

Alimentos muito cidos (pH < 4,0) - em valores prximos ao limite, ainda possvel constatar-se a presena de bactrias lticas ou acticas, sendo que Zymomonas no se desenvolve em valores de pH inferiores a 3,7. Portanto, nestes nveis de baixo pH, o desenvolvimento microbiano fica

restrito quase que exclusivamente s leveduras e bolores que, conforme anteriormente

mencionado, apresentam maior tolerncia aos extremos de acidez.

e - efeitos do pH sobre os microrganismos responsveis pela alterao dos alimentos e.1 - bactrias no formadoras de esporos - as bactrias no formadoras de esporos tem um papel proeminente entre os microrganismos associados com a alterao de

alimentos em toda a escala de pH. As carnes com pH relativamente alto (6,2) experimentam

putrefao devida a germes gram-negativos do grupo Pseudomonas-Acinetobacter-Moraxella, durante o armazenamento a temperaturas iguais ou inferiores a 10oC, no crescendo a pHs iguais

ou inferiores a 5,3.

e.2 - bactrias formadoras de esporos - os esporos produzidos durante o crescimento das clulas vegetativas em alimentos processados, podem sobreviver aos processos

de aquecimento mnimo habitualmente usados para destruir as clulas vegetativas. Nos alimentos

enlatados, o tratamento trmico feito com o objetivo de destruir tanto clulas vegetativas como

esporos. Nos casos em que um tratamento mdio no elimina todos os esporos presentes, a

funo do meio especfico criado pelo processador no interior do alimento, para inibir o

crescimento de clulas vegetativas que podero derivar de esporos e dos contaminantes

posteriores ao tratamento. A acidificao usada em conjunto com a adio de sais de cura,

acar ou sal comum, para evitar a germinao ou o crescimento dos esporos germinados, e os

alimentos enlatados so s vezes, classificados em funo de sua acidez.

e.3 - fungos e leveduras - as leveduras e fungos resistem normalmente aos meios cidos e crescem bem abaixo de pH 4,0. Entre eles encontram-se alguns microrganismos

mais marcadamente cido-tolerantes que tem sido encontrado em alimentos.

f - Efeito do pH sobre os microrganismos patgenos - alguns germes patgenos gram-negativos, como as salmonelas, podem ser controlados utilizando pHs inferiores


17

a 4,0, porm para inibir os coliformes, necessitamos pHs inferiores ou combinaes a base de

baixos pHs junto com outros fatores, baixas temperaturas, por exemplo.

Segundo UBOLDI EIROA (1990), a Listeria monocytogenes pode desenvolver-se num amplo intervalo de pH de 5,0 a 9,6. Em algumas ocasies tem sido constatada sobrevivncia do

microrganismo em pH 4,3 e em pH 4,8. Toxina de Bacillus cereus no foi produzida em pH 2,0-5,0 em 4 dias de incubao, e em pH 5,5-10,0 ocorreu produo, sendo o mximo de produo

alcanado em pH 8,0 (SUTHERLAND & LIMOND, 1993).

Acidificao (baixo pH) mundialmente usado para controlar crescimento e produo de

toxina por Clostridium botulinum em produtos alimentcios. Segundo McCLURE et al (1994), foi

dito por um longo tempo, que Clostridium botulinum no poderia crescer e produzir toxina em alimentos com pHs abaixo de 4,6. Entretanto, hoje j existem alguns estudos mostrando que isto

possvel.

2.1.2 - Umidade - os microrganismos requerem a presena de gua, em uma forma disponvel, para que possam crescer e exercer suas funes metablicas. A melhor forma de

medir a disponibilidade de gua mediante a atividade de gua (aw). A aw de um alimento pode

reduzir-se aumentando a concentrao de solutos na fase aquosa dos alimentos mediante a

extrao da gua ou mediante a adio de solutos. Algumas molculas da gua se orientam em

torno das molculas do soluto e outras acabam sendo absorvidas pelos componentes insolveis

dos alimentos. Em ambos os casos, a gua acaba em uma forma menos reativa.

a - crescimento e processos afins - a maioria dos microrganismos, incluindo as bactrias patognicas, crescem mais rapidamente a nveis de aw de 0,995-0,980 ( a aw da

maioria dos meios de cultura utilizados no laboratrio de 0,999-0,990). A valores de aw inferiores

a estes, a velocidade de crescimento e a massa celular final diminui e a fase de latncia aumenta.

A uma aw suficientemente baixa, a qual difcil definir com preciso, a fase de latncia infinita,

ou seja, o crescimento cessa.

O crescimento da maioria das bactrias e fungos ocorre a aw superior a 0,90. Entretanto,

entre os microrganismos que tem uma importncia na conservao dos alimentos existem muitos

que podem multiplicar-se a valores de aw muito mais baixos. Ditos microrganismos denominam-se

de forma variada: halfilos, xerfilos e osmoflicos.

Os halfilos no podem crescer na ausncia de sal e, com freqncia, requerem

quantidades substanciais de cloreto de sdio para sua proliferao. Os xerfilos so organismos


18

que se definem como aqueles que crescem mais rapidamente em condies de baixa aw, ou seja,

so capazes de multiplicar-se a aw inferiores a 0,85. Todos os microrganismos xerfilos

conhecidos so mofos ou leveduras. Os microrganismos osmoflicos so aqueles que crescem em

locais com alta presso osmtica. Este termo se aplica habitualmente a leveduras tolerantes ao

acar e sinnimo de xerfilo.

A tabela 3 mostra os nveis mnimos de aw que permitem o crescimento de numerosos

microrganismos de importncia nos alimentos e nos processos que se aplicam aos mesmos.

Tabela 3 - Nveis mnimos aproximados de atividade de gua que permitem o crescimento dos

microrganismos que se situam a temperaturas prximas tima.

GRUPOS AW

BOLORES Aspergillus flavus 0,78

Aspergillus fumigatus 0,82

Aspergillus terreus 0,78

Penicillium chrysogenum 0,79

Rhizopus nigrificans 0,93

LEVEDURAS

Debaryomyces hansenii 0,83

Saccharomyces bailii 0,80

Saccharomyces cerevisiae 0,90

BACTRIAS

Bacillus cereus 0,95

Bacillus megaterium 0,95

Clostridium botulinum tipo A 0,95

Clostridium botulinum tipo E 0,97

Enterobacter aerogenes 0,94

Escherichia coli 0,95

Lactobacillus plantarum 0,94

Pseudomonas fluorescens 0,97

Salmonella sp. 0,95

Staphylococcus aureus 0,86

Vibrio costicolus 0,86

Vibrio parahaemolyticus 0,94


19

b - sobrevivncia - igual aw do meio que afeta a proliferao, a aw afeta tambm a sobrevivncia. A letalidade se reduz, em temperatura ambiente e refrigerao, ao se

diminuir a aw ou aumentar a concentrao de solutos. Em microbiologia de alimentos, a

sobrevivncia dos microrganismos mais importante no contexto do tratamento trmico. A

sobrevivncia a altas temperaturas menor a altas aw. Para os esporos bacterianos, a proteo

resultante da reduo de aw mxima no intervalo 0,2 - 0,4, quando se aquece na ausncia de

solutos.

c - alteraes

aw de 0,98 e superiores - a maioria dos microrganismos de interesse nos alimentos crescem otimamente a aw superiores a 0,98. A reduo da aw pode ter um marcado efeito sobre a

composio da microbiota de alguns alimentos. A alterao dos alimentos proticos, sobretudo

as carnes e os pescados, conservados sob baixa refrigerao deve-se principalmente a

Pseudomonas spp formando-se no curso das alteraes aminas volteis, sulfetos de hidrognio e steres de cidos orgnicos. A adio de pequenas quantidades de sal na carne

(aprox. 2%), em condies aerbicas suficiente para retardar o crescimento das

pseudomonas cujos limites de aw mais baixos esto prximos de 0,97.

aw entre 0,98 e 0,93 - neste intervalo as bactrias Gram-negativas do lugar s Gram-positivas das famlias Lactobacillaceae, Bacillaceae e Micrococcaceae e os coliformes halotolerantes. Os alimentos ligeiramente salgados, com uma aw de 0,97, como as salsichas so susceptveis

de sofrer alterao por bactrias cido lticas. A aw de guas mais baixas, os micrococos

crescem abundantemente sobre as superfcies, mas tem um escasso efeito adverso na

qualidade das salsichas. O crescimento de mofos constitui um problema no po e em alimentos

com um alto contedo de gua.

aw entre 0,93 e 0,85 - neste intervalo de aw, os microrganismos causadores das alteraes so as bactrias Gram-positivas (sobretudo os cocos), as leveduras e os mofos. Uma grande

variedade de mofos pode crescer sobre a superfcie dos queijos duros dando lugar a

tonalidades e odores anormais.

aw entre 0,85 e 0,60 - os fungos xerfilos e as leveduras osmoflicas so os microrganismos que habitualmente alteram os alimentos com estas aw. Dentro desta categoria os alimentos

mais comuns so as marmeladas e gelias conservadas pela adio de altas quantidades de

sacarose ou acar invertido.

aw inferiores a 0,60 - no crescem microrganismos a menos que se reidratem os alimentos.


20

2.1.3. Potencial de oxi-reduo (Eh) - os processos de oxidao e reduo so definidos em termos de troca de eltrons entre compostos qumicos; na oxidao, h liberao ou

perda de eltrons, ao passo que na reduo, um determinado composto recebe eltrons, cabendo

lembrar que estes processos exigem a necessidade da participao simultnea de dois

compostos, um sendo oxidado (isto liberando eltrons), o outro sendo reduzido (recebendo

eltrons). A determinao do potencial de oxi-reduo em alimentos dificultada pela interao

de uma srie de fatores, entre eles a tenso de oxignio na atmosfera que envolve o alimento e a

presena de substncias que interferem nas eventuais alteraes do potencial, tendendo a mant-

lo em equilbrio.

Os microrganismos so classificados em aerbios, anaerbios facultativos, microaerfilos e

anaerbios, em funo da capacidade de utilizarem ou no o oxignio como receptor final de

eltrons no metabolismo respiratrio. Nestas condies evidente que os microrganismos

aerbios somente se desenvolvem em substratos com potencial de oxirreduo elevado, portanto,

em contacto ntimo com o oxignio atmosfrico, ocorrendo o contrrio no caso dos anaerbios. J

os anaerbios facultativos podem utilizar o oxignio como receptor final de eltrons, mas, na sua

ausncia, desenvolvem um processo, no qual os compostos orgnicos so sucessivamente

oxidados e reduzidos.

Algumas caractersticas dos principais grupos de microrganismos poderiam ser assim

resumidas:

Aerbios - neste grupo esto includos a grande maioria dos bolores, leveduras oxidativas e muitos gneros de bactrias, entre as quais poderiam ser destacadas Pseudomonas,

Acinetobacter, Moraxella, Micrococcus e algumas espcies de Bacillus; o intervalo de crescimento para estes microrganismos oscila entre + 350 a + 500 mV;

Anaerbios facultativos - neste grupo esto includos principalmente representantes da famlia Enterobacteriaceae, ao lado de espcies de Bacillus, Staphylococcus aureus e leveduras fermentativas. Estes microrganismos crescem tanto na presena como na ausncia

de oxignio, evidentemente com alteraes pronunciadas no metabolismo. Em funo deste

comportamento, eles revelam uma capacidade de crescimento em valores mais reduzidos de

potencial de oxirreduo, oscilando entre + 100 a + 350 mV;

Anaerbios - em alimentos, as bactrias no gnero Clostridium e Desulfotomaculum so as de maior importncia. Seu crescimento ocorre melhor em ambientes com potenciais baixos de

oxirreduo, abaixo de - 150mV, ou valores mximos de + 30 a - 250 mV, segundo diferentes


21

autores. Alguns Clostridium spp., caso de C. perfringens, so aerotolerantes, crescendo no intervalo de - 125 a + 287 mV; outros anaerbios no se desenvolvem na presena de oxignio,

mas toleram substratos com potencial de oxirreduo elevado, na caso do C. acetobutyricum, que cresce a + 370 mV na ausncia de oxignio, embora o limite caia para + 100 mV na sua

presena; C. botulinum, C. histolyticum e C. sporogenes no necessitam de potenciais negativos para o crescimento, o qual pode ocorrer em valores variveis de + 85 a + 160 mV.

Estes dados revelam que a presena de oxignio mais inibitria ou letal a estas bactrias do

que propriamente o potencial positivo de oxirreduo. Isto seria explicado pela ausncia, nestas

bactrias, da enzima catalase, responsvel pela decomposio de H2O2 e da enzima

superxido dismutase, que evita o acmulo do radical txico superxido, catalisando sua

converso em O2 e H2O2 (STAINER et al., 1969). A ausncia destas enzimas torna a presena

do oxignio altamente prejudicial em face do acmulo de produtos txicos como o H2O2 e

superxido.

2.1.4. - Contedo de nutrientes - os microrganismos de importncia alimentcia, precisam para o seu desenvolvimento e metabolismo normal os seguintes elementos: gua, fonte

de energia, fonte de nitrognio, vitaminas e outros fatores de crescimento, minerais.

Os microrganismos veiculados pelos alimentos podem utilizar aucares, lcoois e

aminocidos como fonte de energia. Alguns microrganismos so capazes de utilizar como fonte de

energia carboidratos complexos como amidos e celulose, e ter possibilidade de degradar estes

compostos em acares simples. Tambm as gorduras so utilizadas como fontes de energia,

enquanto s um nmero relativamente pequeno de microrganismos so capazes de atacar estes

compostos.

Os aminocidos constituem a fonte primria de nitrognio empregada pelos microrganismos

heterotrficos. Um grande nmero de outros compostos nitrogenados tambm pode cumprir esta

funo em relao com as diversas classes de microrganismos. Por exemplo, certos germes so

capazes de utilizar nucleotdeos e aminocidos livres, enquanto outros empregam peptdeos e

protenas. Em geral a maioria dos organismos utilizam compostos simples, como so os

aminocidos, antes de ter que atacar compostos mais complexos, como as protenas de alto peso

molecular. Este fato igual para polissacardeos e gorduras.

Os microrganismos podem precisar de vitaminas do grupo B em pequenas quantidades e

como a maior parte dos alimentos naturais as possui abundantemente, facilita o crescimento dos


22

microrganismos incapazes de sintetiz-las. Em geral as bactrias gram-positivas tem menos

capacidade sintetizadora. As bactrias Gram-negativas e os fungos podem sintetizar a maior parte

de seus requerimentos. Portanto, estes dois grupos de organismos podem proliferar em alimentos

pobres em vitaminas do grupo B. As frutas tm um contedo em vitaminas do grupo B mais

escasso que as carnes e este fato, junto com se pH habitualmente baixo e seu Eh positivo, nos

explica a mais freqente alterao das frutas por mofos que por bactrias.

2.1.5 - Constituintes antimicrobianos -a estabilidade de certos alimentos frente ao ataque microbiano deve-se a presena nos mesmos de determinadas substncias que tem sido

demonstrado possuir atividades antimicrobianas. Por exemplo: o leite fresco contm lacteninas; a

clara do ovo contm lisozima; o cravo contm o eugenol e a canela contm o aldedo cinmico

que possuem propriedades antimicrobianas.

2.1.6. - Estruturas biolgicas - a cobertura natural de alguns alimentos proporciona uma excelente proteo contra a entrada e subseqente ataque dos organismos produtores de

alteraes. Estruturas deste tipo so as membranas das sementes, a cobertura externa dos

frutos, a casca das nozes, a pele dos animais e a casca dos ovos. No caso das nozes, a casca

suficiente para impedir a entrada de qualquer organismo. Uma vez quebradas os mofos atacam

seu contedo. Se a casca externa e as membranas dos ovos esto intactas, so capazes de

impedir a entrada de quase todos os microrganismos, quando so conservados em condies de

umidade e temperaturas adequadas. As frutas e verduras com as cascas lesadas alteram-se

muito mais rapidamente que as perfeitas. O epitlio externo dos peixes e dos animais se ope

contaminao e deteriorao dos mesmos, em parte ao desidratar-se mais facilmente que as

superfcies recentemente cortadas.

Estes parmetros intrnsecos, considerados simultaneamente, representam outros tantos modos naturais de preservao dos tecidos vegetais e animais. Uma vez determinada sua

extenso em um alimento, possvel determinar as classes de microrganismos que

provavelmente vo se desenvolver e conseqentemente prever a estabilidade geral do alimento

em questo. Sua determinao tambm pode constituir uma ajuda para se saber a idade e

possivelmente a forma que o mesmo tenha sido manipulado.


23

2.2 - Parmetros extrnsecos Os parmetros extrnsecos dos alimentos esto constitudos por aquelas

propriedades do meio ambiente que afetam tanto os alimentos como os microrganismos. As mais

importantes para os microrganismos veiculados por alimentos so: 1 - a temperatura de

armazenamento; 2 - a umidade relativa do meio ambiente e 3 - a presena de concentrao de

fases no meio ambiente.

2.2.1 - Temperatura de armazenamento - os microrganismos multiplicam-se dentro de amplos limites de temperatura. Portanto, interessante considerar os limites de crescimento

em relao temperatura, dos organismos importantes em alimentos para selecionar a

temperatura de conservao apropriada para os diferentes tipos de alimentos.

Cada organismo tem uma temperatura mnima, tima e mxima para crescimento (tabela

4). A temperatura mnima e mxima so aquelas nas quais os microrganismos cessam o

crescimento. A temperatura tima mais difcil de descrever, visto que pode ser tima para

rendimento celular, % de crescimento, % de metabolismo, respirao, ou de produo de alguns

produtos metablicos. Usualmente a temperatura tima est baseada na razo de crescimento.

Tabela 4 - Faixas de temperaturas aproximadas para crescimento de microrganismos.

TEMPERATURA (OC)

GRUPO MNIMA TIMA MXIMA

Termfilos 40 - 45 55 - 75 60 - 90

Mesfilos 5 - 15 30 - 45 35 - 47

Psicrfilos -5 - +5 12 - 15 15 - 20

Psicrotrficos -5 - +5 25 - 30 30 - 35

Psicrfilos e psicrotrficos - existem vrias definies de organismos psicrfilos. Uma definio simples que o psicrfilo cresce bem 0oC. Nesta temperatura eles podem produzir colnias

visveis em sete, dez ou quatorze dias. Esta definio no considera temperaturas timas,

mnimas e mximas. Talvez alguma distino possa ser feita entre aqueles organismos com um

mximo de temperatura de 20oC ou menos e aqueles que podem crescer a mximos maiores.

Todavia persiste certa confuso com respeito ao termo psicrfilo. Utilizando os mesmos critrios

que servem para definir os mesfilos e os termfilos, lgico definir os psicrfilos em termos de

sua temperatura tima de crescimento, que deve ser claramente distinta das dos grupos citados.


24

Muitos autores, entretanto, tem classificado como psicrfilos a todos aqueles

microrganismos que so capazes de crescer 0oC, sem ter em conta sua temperatura tima.

Outros distinguem os microrganismos que toleram as baixas temperaturas em psicrfilos

obrigatrios, com timos inferiores a 20oC e psicrfilos facultativos com temperaturas timas mais

altas (INGRAHAM & STOKES, 1959). As faixas de temperaturas para crescimento de

determinados microrganismos esto listados na tabela 5.

Tabela 5 - Faixas de temperaturas de microrganismos.

TEMPERATURA (C)

Microrganismos Mnimo timo Mximo

BACTRIA

Acetobacter 5 - 42

Aeromonas 0-5 25-30 38-41

Bacillus cereus 10 - 47-50

Clostridium 0-45 - 60

C. botulinum 3-10 30-40 42-45

C. perfringens 15-20 30-40 45-51

Escherichia coli 3-10 37-41 48-50

Lactobacillus 5 30-40 53

Leuconostoc 10 20-30 40

Micrococcus 10 25-30 45

Proteus 10 37 43-45

Pseudomonas -7-4 20-30 31-43

Salmonella 5-10 35-37 46-49

Staphylococcus 5-10 35-40 46-48

S. aureus 5-10 35-39 44-48

Strept. faecalis 5-10 37 49-51

Strept. thermophilus 20 40-45 52

Vibrio - 10-37 -

V. parahaemolyticus 3-13 35-37 42-44

Yersinia enterocolitica 0-4 - 37

FUNGOS

Aspergillus fumigatus - 30-40 -

Botrytis cinerea -1 20 30

Cladosporium -5 - -8 - -

LEVEDURAS


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Candida 0 - 29-48

Hansenula - 37-42 50

Torulopsis 0 17-25 30-35

MORITA (1975) reclama mais consistncia na definio que deveria ser baseada na

temperatura tima; assim denomina-se psicrfilos os microrganismos que tem uma temperatura

tima de crescimento ao redor de ou inferior 15oC e uma mxima ao redor de 20oC ou menos.

Ao se isolar psicrfilos deve-se evitar a exposio a temperaturas superiores 10oC. Em

tecnologia de alimentos os microrganismos psicrfilos so menos importantes que os

psicrotrficos, em virtude de sua maior sensibilidade s temperaturas elevadas.

Aos microrganismos capazes de crescer prximo 0oC, mas no renem os requisitos de

temperaturas tima e mxima para sua classificao como psicrfilos so conhecidos com

psicrotrficos (EDDY, 1960). Como crescem melhores a temperaturas moderadas, podem ser

considerados como um subgrupo dos mesfilos capazes de desenvolver-se a temperaturas

inferiores mnima tolerada pela maioria dos mesfilos. Entre os psicrotrficos incluem-se

bactrias gram positivas e gram negativas; aerbias, anaerbias e anaerbias facultativas; mveis

e no mveis; esporuladas e no esporuladas. O grupo compreende numerosas espcies

pertencentes a no menos de 27 gneros conforme mostra a tabela abaixo.

GNEROS QUE INCLUEM BACTRIAS PSICROTRFICAS

Acinetobacter Clostridium Lactobacillus Serratia

Aeromonas Corynebacterium Leuconostoc Streptomyces

Alcaligenes Enterobacter Microbacterium Streptococcus

Arthrobacter Erwinia Micrococcus Vibrio

Bacillus Escherichia Moraxella Yersinia

Chromobacterium Flavobacterium Proteus Listeria

Citrobacter Klebsiella Pseudomonas

Tambm so encontradas cepas de leveduras psicrotrficas dos gneros Candida,

Torulopsis, Cryptococcus e Rhodotorula. Os mofos psicrotrficos pertencem aos gneros mais

importantes como Penicillium, Cladosporium, Trichothecium e Aspergillus.


26

Mesfilos - os mesfilos so organismos que crescem em uma faixa de temperatura mdia. Podem-se definir mesfilos como aqueles organismos que tem um timo de temperatura de

25oC a 45oC. Existem 2 grupos de organismos na faixa de mesfilos. Os microrganismos

saprfitos que tem um timo de temperatura de 25oC a 30oC, e patgenos em potencial que

tem um timo entre 35 e 45oC.

Termfilos - Estes organismos tem sido definidos como microrganismos que crescem a altas temperaturas, com um timo de 45oC ou mais. Visto que, a temperatura mnima para termfilos

sobrepe a faixa mais alta dos mesfilos, os termfilos tem sido dividido em termfilos

facultativos e obrigatrios. Os termfilos facultativos podem crescer 37oC ou menos, mas os

termfilos obrigatrios no podem crescer 37oC.

2.2.2. Atmosfera envolvendo o alimento - A natureza da atmosfera que envolve um alimento exerce um pronunciado efeito sobre os microrganismos nele presentes, com reflexos

na delimitao das espcies capazes de crescimento e na sua intensidade.

Em princpio, o efeito da atmosfera est estritamente relacionado s caractersticas

metablicas dos diferentes microrganismos; assim, enquanto os aerbios, como a maioria dos

bolores e muitas espcies de bactrias e leveduras, exigem a presena de oxignio para o

crescimento, as formas anaerbias facultativas e anaerbias estritas precedem do mesmo ou, em

alguns casos, como no caso do Clostridium, so totalmente inibidas em presena do oxignio atmosfrico.

Em funo desta caracterstica do comportamento microbiano, o uso de atmosferas

controladas envolvendo os alimentos poder modificar sobremaneira a natureza do processo de

deteriorao, chegando mesmo a retard-lo.

Provavelmente, o CO2 o gs mais estudado e mais aplicado na prtica industrial, no

sentido de retardar a deteriorao de alimentos, particularmente frutas e produtos crneos.

2.2.3. - Umidade relativa do meio ambiente - a umidade relativa (H.R.) do meio em que se realiza o armazenamento importante, tanto do ponto de vista da aw no interior dos

alimentos como do crescimento dos organismos na superfcie. Quando a aw do alimento de 0,60,

interessante armazen-lo em condies que no seja permitido recuperar umidade a partir do ar,

pois assim no seria permitido aumentar sua aw superficial e sub-superficial at um nvel

compatvel com a proliferao microbiana.


27

IV - MICRORGANISMOS INDICADORES

Em 1887, Escherich observou que o microrganismo que hoje conhecemos como

Escherichia coli sempre est presente em fezes humanas. Em 1892, Schardinger, sugeriu que membros desta espcie fossem usados como ndice de poluio fecal, uma vez que poderiam ser

recuperados mais facilmente que espcies de Salmonella. A introduo na primeira edio do

Standard Methods of Water Analysis foi direcionada atravs da recuperao de Escherichia coli; entretanto, em 1914 o Public Health Service alterou o padro, de Escherichia coli para o grupo coliforme. Esta mudana estava baseada na afirmao questionvel que todos os membros

do ltimo grupo possuam igual significncia sanitria. Atualmente para outros produtos sem ser a

gua, o grupo indicador foi limitado a espcies capazes de proliferar a temperaturas mais

elevadas.

Segundo BANWART (1989), muitos organismos ou grupos de organismos tem sido

sugeridos como organismos indicadores. Microrganismos fecais incluem bactrias entricas, vrus

e protozorios. Em geral vrus e protozorios so mais difceis de enumerar do que bactrias.

Bactrias como coliformes, Escherichia coli, Enterobacteriaceae, enterococos, Pseudomonas,

Clostridium spp, Staphylococcus e contagem total de aerbios tem sido sugerido como organismos indicadores.

1 - COLIFORMES

Definio - so bastonetes Gram-negativos, aerbios ou anaerbios facultativas.

- no esporulados e fermentam a lactose com produo de cido e gs, quando

incubados em temperaturas de 36o a 37o C, por 48 horas.

- os coliformes no so patognicos, mas so habitantes do trato intestinal do

homem e dos animais, eliminados nas fezes em grande nmero e fceis de identificar na gua,

alm de no serem encontrados em outro meio, como habitantes normais.

- um grande nmero de coliformes em amostra, indica proporcionalmente um maior

grau de contaminao por material fecal.

- os coliformes so facilmente pesquisveis, exigem meios simples, tem um ciclo

menor que o de outras bactrias.


28

- a ausncia de coliformes uma garantia de que a gua no oferece riscos de

contaminao ou doenas de origem bacteriana.

Obs. 1 - A presena de um grande nmero de microrganismos, mesmo que sejam bactrias coliformes, deixa dvida quanto qualidade da gua e exige outros testes.

2 - Para a indstria de alimentos devem ser pesquisados alm das patognicas, as

espcies causadoras de deteriorao de produtos armazenados.

Esta definio abrange um nmero de espcies de enterobactrias, includas nos gneros

Escherichia, Klebsiella, Citrobacter e Enterobacter.

Meios de cultivo Caldo Lactosado - Caldo Bile Verde Brilhante

Caldo Lauryl Sulfato Triptose (35-37oC) - para coliformes totais - este meio tem

elevada qualidade nitritiva, principalmente pela presena de triptose, assim como o tampo fosfato

includo em sua formula. O contedo do lauryl sulfato (LST) inibe consideravelmente o

crescimento da microbiota acompanhante indesejvel.

Caldo EC (44,5oC/48horas) - para a deteco de coliformes fecais

Eosin Methylene Blue (EMB gar - 37oC/24 horas) - para diferenciao das colnias.

2 - AERBIOS MESFILOS A maioria das bactrias patognicas mesfila. Analisando um alimento e encontrando

elevado nmero de bactrias deste grupo, sinal de que possam existir bactrias patognicas no

meio. Este teste normalmente feito, quando for eliminada a possibilidade de contaminao fecal.

A contagem deste grupo de bactrias inclui os microrganismos que crescem em aerobiose e em

temperaturas de incubao entre 15 e 40oC com uma temperatura mdia de 35oC. Este tipo de

contagem amplamente utilizado em microbiologia de alimentos e atravs dele que se pode

determinar a qualidade bacteriolgica do alimento examinado. A contagem de aerbios mesfilos

funciona na realidade como indicador de qualidade de alimentos. Este tipo de contagem fornece

informaes sobre a eficcia da limpeza no processo de fabricao, o efeito da temperatura de

conservao, o grau de alterao do alimento e, conseqentemente, nos d tambm informaes

sobre a vida til dos alimentos.


29

Meios utilizados para contagem total de microrganismos

- Agar padro ou Plate Count Agar (PCA - 32oC/48horas). tambm conhecido por gar

contagermes e gar peptona de casena glicose-extrato de levedura.

3 - ENTEROCOCOS Os enterococos so membros dos Streptococcus spp, que so cocos Gram- positivos que formam cadeias longas ou curtas, e que se diferenciam dos demais cocos Gram-positivos por

serem catalase negativa. Os enterococos so membros do GRUPO D de Lancefield. Este grupo compreende quatro espcies distintas:

Streptococcus faecalis ( var. zymogenes e var. liquefaciens)

Streptococcus faecium ( var. durans)

S. bovis

S. equinus

Os enterococos de maior importncia correspondem aos tipos S. faecalis e S. faecium, sendo as outras espcies de menor interesse.

Em geral os enterococos tem como habitat o contedo intestinal de animais de vrias

espcies inclusive insetos. Vrias espcies de enterococos so conhecidas pela facilidade com

que se adaptam e crescem em vrios ambientes mesmo sob condies adversas. Muitos so

tolerantes ao sal, so anaerbios facultativos e crescem bem a 45oC. Streptococcus faecium e

Streptococcus faecalis so relativamente termo-resistentes e podem sobreviver em leites

pasteurizados. Dos enterococos somente o Streptococcus bovis e Streptococcus equinus so capazes de crescer a baixas temperaturas (7 a 10oC). A maioria, porm resiste ao congelamento

e como a Escherichia coli, sobrevivem e se multiplicam aps o descongelamento. Os enterococos podem ser identificados tanto por mtodos fisiolgicos como sorolgicos.

Com respeito ao emprego de enterococos como indicadores de poluio na gua, alguns

investigadores tm estudado sua persistncia na gua e comprovado que estes grupos morrem

mais rapidamente que os coliformes, enquanto outros consideram que ocorre o inverso.

Um grande nmero de pesquisadores tem utilizado o ndice de enterococos, considerando-

o superior ao de coliformes como ndice sanitrio, especialmente em alimentos congelados.


30

4 - OUTROS INDICADORES

O Staphylococcus sp. e o Staphylococcus aureus, tem sido proposto como indicadores.

A presena de um grande nmero de S. aureus indicao de um possvel risco sade devido a enterotoxina estafiloccica, assim como sanitizao questionvel, especialmente de processos

envolvendo lavagem de alimentos por humanos.

Clostridium sp. tambm tem sido sugerido, mas eles no so muito especficos de fezes humanas. Visto que eles so formadores de esporos, eles podem persistir nos alimentos quando

a maioria dos organismos entricos estiver morta.

O uso de Pseudomonas aeruginosa como um indicador tem sido sugerido. A presena deste organismo no trato intestinal das pessoas, assim como suas caractersticas fisiolgicas,

levam a um possvel indicador de contaminao fecal.

Bifidobacteria est presente nas fezes de homens e porcos (RESNICK & LEVIN, 1981) e s ocasionalmente em fezes de gado e carneiro (MARA & ORAGUI, 1983). CARRILLO et al

(1985), reportaram que bifidobacteria promete ser um timo indicador de contaminao fecal

recente em guas frescas melhor que Escherichia coli ou coliformes fecais.

V- NORMAS E MTODOS MICROBIOLGICOS DE ANLISE DE ALIMENTOS

1 - INTRODUO A qualidade higinico-sanitria dos alimentos de fundamental importncia para a sade

dos homens e animais. O controle desta qualidade feito atravs de anlises microbiolgicas,

com o intuito de se verificar se os alimentos se enquadram dentro dos padres pr-estabelecidos

pela COMISSO NACIONAL DE NORMAS E PADRES PARA ALIMENTOS.

Nesta apostila so apresentadas algumas tcnicas utilizadas no laboratrio para

determinados tipos de alimentos alm de algumas normas de anlises microbiolgicas.

2 - CONSIDERAES GERAIS 2.1- Normas de higiene e ordem pessoais

usar avental deixar de fora do laboratrio casacos, bolsas, livros, etc. no colocar objetos de uso pessoal em cima da bancada


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no participar dos trabalhos se portador de algum ferimento nas mos lavar sempre as mos ao entrar e antes de sair do laboratrio no fumar, comer ou ingerir lquidos dentro do laboratrio no tocar os olhos, boca ou nariz com as mos no umedecer etiquetas com a lngua no fazer uso de lenos ou avental para limpar objetos ou instrumentos de trabalho tratar os cortes ou arranhes imediatamente, limpando com soluo anti-sptica e cobrindo com

curativos

comunicar imediatamente qualquer suspeita de haver contrado uma enfermidade, como conseqncia de uma infeco no laboratrio.

2.2 - Normas de trabalho microbiolgico

no incio de cada anlise traar um plano de trabalho considerando o tempo necessrio para uma anlise e sua leitura

trabalhar sempre de maneira ordenada, tranqila, constante e metdica, evitando movimentos desnecessrios como trocas de lugar, assento, etc.

limpar e desinfetar a superfcie de mesas e balces antes e depois do trabalho de cada dia efetuar registro de anlise, anotando o tipo de produto, procedncia, dia e hora da entrada no

laboratrio e qualquer outra observao prvia anlise. Na anlise propriamente dita anotar:

mtodo, meio de cultura empregado e resultados obtidos.

identificar as amostras antes de iniciar a anlise e em geral, no descartar at obter os resultados

o material a analisar deve ser tocado exclusivamente com instrumentos estreis e nunca com as mos

evitar salpicar mesas e pisos com gua ou solues corantes no caso de derramamento fortuito de material infectado, desinfetar e esterilizar imediatamente colocar todo o material usado, tais como lminas, pipetas, etc. em recipientes adequados com

soluo desinfetante

o material utilizado deve receber a seguinte seqncia de tratamento : esterilizao, lavagem, secagem, esterilizao e armazenamento

os cultivos aps leitura devem ser esterilizados


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no retirar qualquer cultivo do laboratrio manter registro de controle dirio de temperatura de estufas realizar o controle dirio de contaminao ambiental em cmaras asspticas e fluxos laminares analisar conservas e produtos esterilizados somente em cmaras asspticas ou fluxo laminar

classe II.

2.3 - Normas de colheita de amostras

a colheita de amostras constitui a primeira fase da anlise do produto dentro do conceito de que a anlise comea coma colheita da amostra, o servio de colheita

deve estar bem integrado com o laboratrio, devendo haver sincronismo entre a remessa e a

capacidade do laboratrio em executar as anlises

as amostras para exame bacteriolgico devero ser enviadas separadas daquelas destinadas a exames fsico-qumicos

sempre que possvel, tais amostras devem ser enviadas sem sua embalagem original, para evitar modificaes em suas caractersticas originais. Quando tal procedimento for invivel, em

funo do volume mnimo disponvel para coleta, aceitar-se- fracionamento pela pessoa que a

efetuar, desde que o mesmo seja realizado em condies asspticas, cabendo, nesse caso, ao

fracionador da amostra, toda a responsabilidade pela inoculao da mesma, de microrganismos

estranhos sua microbiota original.

as amostras para exame microbiolgico devero se acondicionadas em recipientes estreis e ntegros (sem perfuraes, rachaduras, etc.) na quantidade mnima de 400 gramas. Quando o

peso unitrio no atingir o mnimo aqui estabelecido, devero ser colhidas tantas unidades

quantas necessrias para se obter aquele quantitativo. Neste caso, cuidados especiais so

necessrios para que todas as unidades pertenam ao mesmo lote, partida, da data de

fabricao, etc., a fim de serem mantidas as caractersticas de homogeneidade da amostra.

em casos especiais, a amostra poder ser acompanhada de relatrio adicional, contendo informaes que possam auxiliar na conduta do seu trabalho

somente sero aceitas pelo laboratrio as amostras que vierem acompanhadas de indicao precisa do (s) tipo (s) de exame (s) a ser (em) realizado (s)

depois de colhidas, as amostras devero ser acondicionadas adequadamente, para evitar qualquer alterao nas mesmas at sua chegada ao laboratrio. Assim, as amostras de

produtos facilmente alterveis devero ser acondicionadas em recipientes isotrmicos, e


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acompanhadas de gelo ou outra substncia refrigerante, cuidando-se sempre para que no

haja contatos deste com a amostra.

providncias especiais devero ser tomadas para que o tempo decorrido entre a colheita da amostra e sua chegada ao laboratrio seja o mais breve possvel, recomendando-se que seja

evitada a utilizao de mecanismos que impliquem em estocagem intermediria entre o ponto

de colheita e o laboratrio

somente sero aceitas para anlise, amostras que houverem sido acondicionadas em embalagem lacrada pela pessoa que efetuou a colheita, sugerindo-se, para tal, a utilizao de

lacre ou outro tipo de fechamento hermtico, que no possa ser violado sem que se torne

evidente. Tal providncia se faz necessria para evitar a substituio ou adulterao da amostra

entre o ponto de colheita e o laboratrio, com reflexos no resultado da anlise.

todas as amostras que chegarem ao laboratrio em condies diferentes das aqui preconizadas, sero recusadas, cabendo ao laboratrio notificar pessoa que realizou a

colheita, as razes de no aceitao.

2.4- Preparo da amostra

produtos esterilizados - cuidados especiais devero ser observados na abertura dos recipientes hermeticamente fechados. Posicionar a lata com a borda no codificada para cima e

costura lateral voltada para o lado oposto ao analista. Colocar sobre o mesmo algodo

embebido em hipoclorito de sdio a 5%. Usando um abridor, previamente esterilizado, abrir um

pequeno orifcio no centro. Mantendo a presso do abridor, retir-lo lentamente. Alargar a

abertura at o tamanho desejado e transferir pores do contedo para os meios de cultivo

indicado

produtos slidos - com o auxlio da pinas, tesouras ou bisturis, cortar e pesar assepticamente 25g representativos da amostra, em copos de homogeneizador ou sacos plsticos, tarados.

Adicionar 225 mL de gua peptonada a 0,1%. Em se tratando de cultivo de microrganismos

haloflicos, substituir a gua peptonada por soluo salina a 3%. Homogeneizar no mximo por

2 minutos a 8000-25000 r.p.m.. No Stomacher 60 segundos so suficientes para dispersar a

maioria dos produtos. Esta a diluio 10-1. Homogeneizar e pipetar 1 mL para tubos contendo

9 mL de mesmo diluente (diluio 10-2). E assim, preparar as diluies desejadas, segundo o

tipo de anlise a ser realizada. Produtos congelados devem ser descongelados em refrigerador

a 2-5oC, por um tempo mximo de 18 horas antes da anlise.


34

produtos em p, granulado, pastoso, etc. - com auxlio de esptula ou colher, pesar assepticamente 25 gramas da amostra em copos de homogeneizador ou sacos plsticos,

tarados. Adicionar 225 mL de gua peptonada a 0,1% ou soluo salina a 3%, quando se tratar

de haloflicos. Homogeneizar e preparar as diluies desejadas.

produtos lquidos e gua - agitar ou inverter o recipiente com a amostra por 25 vezes. No caso do mesmo estar sem espao livre, aspirar 10 vezes com pipeta. Pipetar assepticamente 1

mL da amostra, transferindo para um tubo com 9 mL de gua peptonada a 0,1% (diluio 10-1).

Homogeneizar e pipetar 1 mL para tubo contendo 9 mL do mesmo diluente, (diluio 10-2).

Preparar assim as diluies sucessivas necessrias s anlises a serem efetuadas.

3 - PREPARO DE MEIOS DE CULTURA 3.1- Consideraes gerais O crescimento de uma bactria em laboratrio observado pela semeadura em meios de

cultura.

Quanto ao estado fsico podem ser considerados 3 grupos de meios : lquidos, slidos e

semi-slidos. Os lquidos so obtidos pela dissoluo dos nutrientes em gua. Os meios slidos

so obtidos pela adio de um agente solidificante sendo o gar-gar geralmente preferido. O

gar-gar um polissacardeo obtido de certas algas; no txico para as bactrias. um

composto que apresenta a vantagem de fundir a 80-100oC e solidificar a 40-45oC. Alm disso, a

estrutura fibrosa do gar permite a difuso dos nutrientes mesmo as macromoleculares. A

concentrao do gar-gar nos meios slidos geralmente de 1,5 a 2%, podendo variar

dependendo da pureza do gar empregado.

Os meios de cultura devem conter fontes de carbono, nitrognio, sais inorgnicos e em

certos casos vitaminas ou outros fatores de crescimento.

A composio do meio de cultura varivel segundo as exigncias nutritivas do

microrganismo em estudo. Alguns germes so capazes de proliferar em meios extremamente

simples, como por exemplo, a Escherichia coli que cresce abundantemente em meios contendo

apenas glicose e sulfato de amnio. Por outro lado existem bactrias como Lactobacillus

leichmannii, com reduzida capacidade sinttica sendo necessria a incluso de cerca de 12 nutrientes. Alm da composio qumica preciso se considerar:

1. fornecimento de oxignio (em alguns casos)


35

2. certo grau de umidade

3. reao do meio, ou seja, pH

4. esterilidade; e

5. preveno de contaminao externa do meio j esterilizado

Existem no comrcio, meios de cultura em p, solveis em gua; dissolve-se uma certa

quantidade de p (de acordo com as misturas que acompanham o meio) e esteriliza-se.

Apresentam certas vantagens como economia de tempo e preparao de meios uniformes.

3.2- Provveis causas de erros na preparao de meios de cultura desidratados

Problemas de pH e mudana de cor no meio de cultura (causa provvel): superaquecimento, mistura inadequada, excesso de tempo no esterilizador. Uso de material de

vidro com lcali; recipientes contaminados; gua destilada impura; fuso do meio repetidas

vezes; armazenamento a altas temperaturas; hidrlise dos ingredientes.

Solubilidade incompleta (causa provvel): aquecimento inadequado, mistura incompleta causando superaquecimento de algumas partes do meio; gua destilada de m qualidade,

recipiente muito pequeno, impedindo uma boa homogeneizao do lquido.

NOTA - em alguns casos existe um precipitado depois da esterilizao do meio. Agitar

suavemente o recipiente de vidro antes de coloc-lo nas placas de Petri. Ex: Agar EMB, Agar

Mueller Hinton.

Escurecimento: superaquecimento na dissoluo ou na esterilizao do gar Falta de consistncia do gar: o gar no est em soluo; misturado de forma ineficiente;

peso errado do p desidratado; pH do meio muito cido.

Exemplo: gar extrato de malte com pH muito cido no permite a gelificao do meio; excesso de

inculo no gar tornando-o diludo ou por fuso do gar repetidas vezes.

Perda das propriedades nutricionais ou mudanas nas caracteristicas de crescimento: repetidas fuses do gar; aquecimento prolongado e excessivo; mistura inadequada; material

queimado nas paredes do recipiente; grande quantidade de inculo.


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3.3- Armazenamento de meios de cultura desidratados Os frascos com o p devem ser armazenados em um lugar fresco e seco evitando a luz

direta.

Todos os meios de cultura so higroscpicos: logo que so abertos, tendem a tomar a

umidade do meio ambiente.

particularmente importante fech-los o mais depressa possvel, com uma tampa interior e

outra exterior, apertando bem cada frasco. necessrio tambm no colocar os frascos em

lugares onde se encontram equipamentos de aquecimento, pois isto pode provocar reaes

inexatas e um desenvolvimento inadequado.

4- TCNICAS DE INOCULAO DE BACTRIAS (Ribeiro e Soares, 1993)

Os microrganismos necessitam de um meio de cultura adequado para seu crescimento in

vitro. Mas, alm dos componentes presentes no meio, outros fatores interferem no seu

desenvolvimento: so fatores ambientais como temperaturas (psicrfilas, mesfilas ou termfilas)

e tenso de oxignio (aerbias, anaerbias, microaerfilas ou anaerbias facultativas).

Inoculando um microrganismo em um meio de cultura que possua todos estes requisitos

nutritivos e fatores ambientais favorecidos, o microrganismo inicia seu desenvolvimento neste

meio, passando pelas diversas fases da curva de crescimento, desde a fase de latncia,

logartmica, estacionria, at a fase da morte.

A fase logartmica (exponencial) caracterizada por divises sucessivas, originando a

formao de um grupamento de bactrias da mesma espcie, que denominado colnia. Esta

visualizada sem o auxlio do microscpio, sendo ento considerada como caracterstica

macroscpica das bactrias.

Como cada espcie possui um tipo morfolgico colonial diferente, estas devem ser

analisadas quanto elevao, forma, tamanho, bordas e pigmentao. Em um meio de cultura,

um nico tipo de colnia observado denominado cultura pura; vrios tipos de colnia, cultura

mista. Em microbiologia, h vrias tcnicas de inoculao de microrganismos; algumas so

utilizadas para exames qualitativos e outras para estudos quantitativos (contagem de bactrias),

as quais sero descritas adiante.

Tcnicas de inoculao - indicam-se a realizao de uma bacterioscopia antes da inoculao com o objetivo de uma melhor escolha do meio de cultura a ser semeado.


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Normas utilizadas - as seguintes normas devem ser seguidas nas inoculaes dos meios de cultura: o fio e a ala de platina devem sempre ser flambado antes e depois de qualquer

inoculao, ou seja, devem ser aquecidos ao rubro no cone interno da chama do bico de

Bunsen. Para a coleta de material, devem ser resfriados na parte interna do recipiente com

meio de cultura; os recipientes (tubos de ensaio, placas de Petri, etc.) com meio de cultura

devem sempre ser abertos prximo ao bico de Bunsen; a boca dos tubos de ensaio deve ser

aquecida aps a retirada e antes da colocao da tampa. A tampa nunca deve ser colocada

sobre o balco, sendo retirada e mantida segura pelo dedo mnimo da mo direita durante a

inoculao.

Tcnicas de semeadura em meios lquidos - inocula-se a cultura com o auxlio de ala de platina em meio lquido.

Tcnica de semeadura em meio slido inclinado - inocula-se a cultura da bactria em um meio de cultura inclinado em tubo fazendo estrias na superfcie do gar

Tcnica de semeadura em meio slido em tubo - inocula-se a cultura de bactrias em meio slido utilizando a ala de platina em profundidade de 2/3 do meio e no dever ser mais que

uma nica picada

Tcnica de semeadura em meio slido em placa (tcnica de esgotamento) - a tcnica de esgotamento em placa consiste em depor sobre um ponto da superfcie do meio uma alquota

do material e depois espalh-lo em dois ou trs setores, por meio de ala de platina, sem

recarreg-la, de maneira a obter quantidades progressivamente menores de material. Temos

que obter rarefao suficiente do material, de modo a formar colnias perfeitamente isoladas.

O sucesso da semeadura est em grande nmero de estrias; no perfurar o meio, no voltar a

ala sobre a estria e pegar pequena quantidade de material para semear.

Tcnica de semeadura em placa Pour-Plate - a tcnica pour-plate ou por incorporao pode ser realizada com o objetivo de se obter colnias isoladas (estudo qualitativo) ou para realizar a

contagem de colnias em placa (estudo quantitativo). Aps realizar as diluies, deve ser feito o

plaqueamento, agitando-se e retirando-se 1 mL de cada diluio e transferindo para placas

estreis. Em seguida, colocar 15 a 20 mL de gar fundido em cada uma delas. As placas

devem ser suavemente submetidas a movimentos rotatrios, visando perfeita mistura da cultura

com o gar; esperar solidificar e inverter as placas.

Condies de incubao - aps a inoculao as bactrias devero ser incubadas em ambiente com tenso de oxignio e temperatura ideal para o desenvolvimento pretendido


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(aerbias, anaerbias, psicrfilas, mesfilas, termfilas, etc.). O tempo tambm vai depender do

microrganismo em estudo. Aps os perodos determinados, as colnias se tornaro visveis

macroscopicamente.

5 - ANLISES

5.1 - CONTAGEM TOTAL DE MICRORGANISMOS AERBIOS (mesfilos, psicrfilos ou termfilos) - as contagens de bactrias viveis so baseadas comumente no nmero de bactrias

que se desenvolvem em placas de gar nutritivo que tenham sido previamente inoculadas com

quantidades conhecidas do alimento dilud

apostila microbiologia alimentos e leite

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microrganismos em alimentos

microbiologia de alimentos

presente nos alimentos

origem dos microrganismos

papel dos microrganismos

microrganismos associados

provocada por microrganismos

microrganismos no ambiente