Apoptóza a genová terapie

Mgr. Jan Bouchal, PhD.

Laboratoř molekulární patologie LF UP Olomouc

http://lmp.upol.cz, http://ustavpatologie.upol.cz

Funkce nádorového supresoru p53

senescence

transdifferentiate

Cell options

keep working

fuse

hypertrophy

enlarge & divide

apoptosis

stress responses

de-differentiate

shrink

RETREAT OR ADVANCE

Apoptóza neboli programovaná buněčná smrt Apoptóza neboli programovaná buněčná smrt

• Charakterizována kondenzací chromatinu, Charakterizována kondenzací chromatinu, puchýřkovatěním cytoplazmatické membrány puchýřkovatěním cytoplazmatické membrány (budding) a tvorbou apoptotických tělísek(budding) a tvorbou apoptotických tělísek

• Apoptotická tělíska jsou fagocytována a nedochází k Apoptotická tělíska jsou fagocytována a nedochází k zánětlivé reakcizánětlivé reakci

http://en.wikipedia.org/wiki/Apoptosis http://www.celldeath.de/mainfram.htm

Incomplete differentiation in two toes (syndactyly) due to lack of apoptosis

... Growth of Embryo

... Tissue Homeostasis

... Immunology

... Chronic viral diseases

... Neurodegenerative diseases

... Reperfusion injury

... Insuline-dependent Diabetes

... Atherosclerosis

... Myokard Infarction

... AIDS

... Development and Treatment of Malignancies

WHERE can APOPTOSIS be WHERE can APOPTOSIS be ENCOUNTERED ?ENCOUNTERED ?

THE APOPTOTIC PATHWAY

Triggers Modulators Effectors Substrates DEATH

. FADD

. TRADD

. FLIP

. Bcl-2 family

. Cytochrome c

. p53

. Mdm2

. Caspases . Many cellular proteins. DNA

. Growth factor Deprivation. Hypoxia. Loss of adhesion. Death receptors . Radiation . Chemotherapy

Caspázy Caspázy (cysteinyl (cysteinyl aspartate specific aspartate specific proteinases; proteinases; neaktivní neaktivní prekurzory -prekurzory -procaspázy)procaspázy)

Receptory smrtiReceptory smrti

Molekuly v Molekuly v mezimemránovém mezimemránovém prostoru prostoru mitochondrií mitochondrií (nejasné teorie – (nejasné teorie – jednou z nich je jednou z nich je tvorba pórů)tvorba pórů)

Receptorová a mitochondriálnídráha apoptózy

... Growth of Embryo

... Tissue Homeostasis

... Immunology

... Chronic viral diseases

... Neurodegenerative diseases

... Reperfusion injury

... Insuline-dependent Diabetes

... Atherosclerosis

... Myokard Infarction

... AIDS

... Development and Treatment of Malignancies

WHERE can APOPTOSIS be WHERE can APOPTOSIS be ENCOUNTERED ?ENCOUNTERED ?

Metody detekce apoptózy („alespoň dvě“)Světelná, fluorescenční a elektronová mikroskopie (Světelná, fluorescenční a elektronová mikroskopie (morfologiemorfologie))• kondenzace chromatinu, puchýřkovatění membrány (budding), apoptotická kondenzace chromatinu, puchýřkovatění membrány (budding), apoptotická

tělískatělíska• další znaky (viz níže)další znaky (viz níže)

Substráty caspázSubstráty caspáz • Imunohistochemická detekce Imunohistochemická detekce štěpeníštěpení PARP, laminu B, keratinu 18, PARP, laminu B, keratinu 18,

transglutaminázytransglutaminázy

Mitochondriální funkce Mitochondriální funkce • změny membránového potenciálu mitochondriální membrány (rhodamin změny membránového potenciálu mitochondriální membrány (rhodamin

123, Mitotracker) 123, Mitotracker) • uvolňování cytochromu cuvolňování cytochromu c

Změny na cytoplazmatické membráně Změny na cytoplazmatické membráně • expozice fosfatidylserinuexpozice fosfatidylserinu a vazba Annexinu V a vazba Annexinu V • permeabilita membrány a vazba barviv na DNA (propidium iodid, Hoechst, permeabilita membrány a vazba barviv na DNA (propidium iodid, Hoechst,

DAPI) – odlišení od nekrózyDAPI) – odlišení od nekrózy

Změny DNA Změny DNA • Apoptotický DNA žebříkApoptotický DNA žebřík• značení štěpených konců DNA (TUNEL, ISNTA)značení štěpených konců DNA (TUNEL, ISNTA)

Metody detekce apoptózy

Světelná, fluorescenční a elektronová mikroskopie Světelná, fluorescenční a elektronová mikroskopie (morfologie)(morfologie)

kondenzace chromatinu, puchýřkovatění membrány kondenzace chromatinu, puchýřkovatění membrány (budding), apoptotická tělíska(budding), apoptotická tělíska

Metody detekce apoptózy

Substráty kaspáz Substráty kaspáz • detekce štěpení detekce štěpení keratinu 18keratinu 18 (protilátka (protilátka

M30 proti štěpenému fragmentu), M30 proti štěpenému fragmentu), laminu Blaminu B (inverzní průkaz) (inverzní průkaz)

Metody detekce apoptózy

Změny na cytoplazmatické Změny na cytoplazmatické membráně membráně - - expozice fosfatidylserinuexpozice fosfatidylserinu a a vazba Annexinu V vazba Annexinu V

Změny DNA Změny DNA Apoptotický DNA žebříkApoptotický DNA žebřík

Další typy buněčné

smrti

Normální buňka NekrotickáNormální buňka Nekrotická

Apoptotická AutofagickáApoptotická Autofagická

Nekróza

1.1. Pasivní buněčná smrtPasivní buněčná smrt v důsledku v důsledku fyzikálního nebo chemického fyzikálního nebo chemického poškození poškození

2.2. Charakteristická vakuolizace, Charakteristická vakuolizace, permeabilizace cytoplazmatické permeabilizace cytoplazmatické membrány amembrány a vyvolání místní vyvolání místní zánětlivé odpovědi zánětlivé odpovědi (významné (významné během mikrobiálních infekcí)během mikrobiálních infekcí)

Autofagie

1.1. Morfologické znaky podobné s nekrózouMorfologické znaky podobné s nekrózou2.2. Dochází ke strávení části vlastního buněčného materiálu (auto – fagie)Dochází ke strávení části vlastního buněčného materiálu (auto – fagie)3.3. Nejasný významNejasný význam

- buď další forma programované buněčné smrti- buď další forma programované buněčné smrti- nebo - nebo strategie pro přežití v období nedostatku energiestrategie pro přežití v období nedostatku energie

Hlavní znaky

ApoptózaApoptóza• Charakterizována kondenzací chromatinu, puchýřkovatěním Charakterizována kondenzací chromatinu, puchýřkovatěním

cytoplazmatické membrány (budding) a tvorbou apoptotických tělísek, cytoplazmatické membrány (budding) a tvorbou apoptotických tělísek, které jsou následně fagocytoványkteré jsou následně fagocytovány

• ReceptorováReceptorová (receptory smrti, caspáza-8) (receptory smrti, caspáza-8) a mitochondriální dráhaa mitochondriální dráha (rodina (rodina proteinů Bcl2, cytochrom C, caspáza-9)proteinů Bcl2, cytochrom C, caspáza-9)

NekrózaNekróza• Charakteristická vakuolizace, permeabilizace cytoplazmatické membrány aCharakteristická vakuolizace, permeabilizace cytoplazmatické membrány a

vyvolání zánětlivé odpovědivyvolání zánětlivé odpovědi (významné během mikrobiálních infekcí)(významné během mikrobiálních infekcí)

AutofagieAutofagie• PravděpodobněPravděpodobně strategie pro přežitístrategie pro přežití v období nedostatku energiev období nedostatku energie

Genová terapie

• Při zrodu genové terapie se uvažovalo především o léčbě vrozených monogenních chorob (např. ADA - Adenosine Deaminase Deficiency, cystic fibrosis, Huntington's chorea, muscular dystrophy )

• V současné době se většina úsilí orientuje na získané choroby, především zhoubné nádory

• Genová terapie v léčbě nádorů– Je lehčí buňku zničit, než ji opravit (vyvolání

apoptózy, …)– Zpravidla stačí krátká exprese genu (problém

umlčení cizorodých genů, zpravidla metylací)– Vzhledem k povaze onemocnění jsou pacienti

ochotni podstoupit nové postupy

Germ line gene therapyIn the case of germ line gene therapy, germ cells, i.e., sperm or eggs, are modified by the introduction of functional genes, which are ordinarily integrated into their genomes. This option is prohibited for application in human beings, at least for the present, for a variety of technical and ethical reasons.

Somatic cell gene therapyIn somatic cell gene therapy, the gene is introduced only in somatic cells, especially of those tissues in which expression of the concerned gene is critical for health. Expression of the introduced gene relieves/ eliminates symptoms of the disorder.

Broad methods•A normal gene may be inserted into a nonspecific location within the genome to replace a nonfunctional gene. This approach is most common. •An abnormal gene could be swapped for a normal gene through homologous recombination. •The abnormal gene could be repaired through selective reverse mutation, which returns the gene to its normal function. •The regulation (the degree to which a gene is turned on or off) of a particular gene could be altered.

http://en.wikipedia.org/wiki/Gene_therapy

• Není možno zasáhnout všechny buňky• Sebevražedné geny a by-stander efekt

Cross et Burmester: Gene Therapy for Cancer Treatment: Past, Present and Future. Clinical Medicine and Research 2006;4:218-227.

„…Currently gene therapy is being used to create recombinant cancer vaccines. …“

From donated blood (usually leukapheresis) precursor cells – monocytes are extracted and in Step 1 of cell culture, transformed into dendritic cells. From tumour tissue specimens obtained from surgery, a tumour-specific antigen is produced with which dendritic cells are loaded. Additionally, dendritic cells are also loaded with a control antigen – key-hole limpet hemocyanin (KLH). The control antigen enables monitoring of the success of vaccination. After an activation step, Step 2, the ‘mature’ antigen-loaded dendritic cells are administered to the patient in the form of vaccination.

Oncolytic gene therapy vectors are generally viruses that have been genetically engineered to target and destroy cancer cells while remaining innocuous to the rest of the body. A number of different viruses have been used for this purpose, including vaccinia, adenovirus, herpes simplex virus type I, reovirus and Newcastle disease virus.38

However, there are several unique stumbling blocks for oncolytic virotherapy in humans. Most people have antibodies to the common viruses used for therapy development which often leads to an immune response that clears the viral agent before it has had time to infect cells. In addition, the use of replication competent viral particles often calls for increased safety precautions, making clinical trials more expensive and cumbersome. In a trial using a modified vaccinia virus to treat breast and prostate cancer, patients were required to be isolated in a specialized hospital facility for a week to ensure that the virus had completely cleared before being allowed back into the general population.

The most notable adenoviral therapy is the ONYX-015 viral therapy. ONYX-015 is an adenovirus that has been engineered to lack the viral E1B protein. Without this protein, the virus is unable to replicate in cells with a normal p53 pathway. In addition, the E1B protein is essential for RNA export during viral replication.45 Cancer cells often have deficiencies in the p53 pathway due to mutations and thus, allow ONYX-015 to replicate and lyse the cells. Cancer cells also exhibit altered RNA export mechanisms that allow for the export of viral RNA even in the absence of the E1B protein. ONYX-015 has been tested in phase I and II trials on squamous cell carcinoma of the head and neck that resulted in tumor regression which correlated to the p53 status of the tumor.

Onkolytické viry

The second type of oncolytic virotherapy undergoing clinical trials uses herpes simplex virus type 1. Two vectors, G207 and NV1020, are currently in phase I and phase II trials for treatment of intractable cancers. Mutations in several genes of these herpes viruses ensure that they replicate efficiently only in cancerous cells.The lytic portion of the life cycle directly kills cells and the thymidine kinase that is expressed from the viral genes sensitizes cells to ganciclovir.

Challenges in Gene Therapy

http://learn.genetics.utah.edu/units/genetherapy/gtchallenges/

From Research to Trials (15 years for ADA)

STEP 1: Learn about the disease Is the disorder a good candidate for gene therapy? To find out, study the disease. 1) Get money for the project2) Get approval for the project3) Perform clinical research4) Perform biological research5) DECISION: Is the disorder a good candidate for gene therapy?

STEP 2: Design a gene therapy 1) Use your knowledge of the disorder to design a gene therapy2) Test the therapy in appropriate models of the disease3) DECISION: Does your therapy look promising?

http://learn.genetics.utah.edu/units/genetherapy/gtresearch/

STEP 3: Get money and approval for clinical trials1) Get money for the trials2) Get approval for the trials

STEP 4: Phase One clinical trial1) Establish safety and dosage limits in a small group of people (20-80)2) DECISION: Does your therapy still look promising?

STEP 5: Phase Two clinical trial1)Test the efficacy and safety in a larger group of people (100-300)2) DECISION: Is your therapy effective in a larger group of people?

STEP 6: Phase Three clinical trial1) Test the therapy in a large group of people (1,000-3,000)2) DECISION: Is your treatment successful?

STEP 7: Get FDA approval for general clinical use1) Write proposals, fill out paperwork, answer questions and wait for approval

STEP 8: Phase Four clinical trial1) Further test the efficacy and optimal use of the treatment in general use

www.wiley.co.uk/genetherapy/clinical/

Shrnutí

• Genová terapie v léčbě nádorů– Je lehčí buňku zničit, než ji opravit a zpravidla

stačí krátká exprese genu – Vzhledem k povaze onemocnění jsou pacienti

ochotni podstoupit nové postupy

• Genová terapie (by-stander efekt)

• Imunoterapie