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APLICACIONES DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO ENMICROBIOLOGÍA, VETERINARIA Y AGRICULTURA

APPLICATIONS OF FLOW CYTOMETRY IN MICROBIOLOGYVETERINARY SCIENCE AND AGRICULTURE

José Laguado, M.Sc.

BD Biosciences, Becton Dickinson de Colombia Ltda, Calle 20 No. 44-41 Bogotá DC,Colombia. Correspondencia: [email protected]

Recibido: Agosto 22 de 2007; Aceptado: Noviembre 12 de 2007

RESUMEN

La citometría de flujo es un método automatizado, multiparamétrico y cuantitativoque analiza las señales dispersadas y fluorescentes producidas por una célula alpasar por un haz de luz. El potencial de los nuevos métodos de análisis en el laboratorioen el campo de la microbiología viene creciendo de manera enorme en los últimosaños donde la citometría de flujo se ha consolidando como una herramienta rápida,sencilla, suficientemente sensible, económica, de fácil automatización para lascrecientes necesidades de desarrollo de Colombia. La citometría permite obtenerinformación sobre la fisiología, morfología, genética y diversidad de microorganismos,animales y plantas. Las variadas aplicaciones de la citometría en la microbiología dealimentos, la microbiología ambiental, la medicina veterinaria y la agricultura buscaahora complementar o reemplazar técnicas ya existentes adaptándonos a la continuaevolución de las necesidades de los mercados globales de la ciencia y la economía.

Palabras clave: Citometría de flujo, microbiología, veterinaria, agricultura.

ABSTRACT

Flow cytometry, an automated, multiparametric and quantitative method, analyzes thescattering and fluorescence signals produced as series of single cell pass through alaser beam. The potential of the new methods of analysis in the microbiology laboratoryhas grown enormously in the past few years and flow cytometry has consolidated itselfas a fast, simple, sensitive, economic and automated analysis tool for the increasingdevelopment needs of Colombia. Accordingly, flow cytometry can be used to obtaindata on the physiology, morphology, genetics and diversity of microorganisms, animalsand plants. The diverse flow cytometric applications in food and, environmentalmicrobiology, veterinary medicine and agriculture can complement or replace existingtechniques in order to adapt research laboratories to the growing necessities of theglobal science and economy markets.

Key words: Flow cytometry, microbiology, veterinary, agriculture.

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REVISIÓN LITERATURA

Rev.MVZ Córdoba 12(2): 1077-1095, 2007

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INTRODUCCIÓN

Citometría es un término genérico quese aplica a cualquier tecnología que seusa para la med ic ión, recuento,comparación u otra caracterización decélulas. La citometría de flujo es unatecnología de rápido crecimiento ydesarrollo que permite examinar muchaspropiedades de un gran número decélulas en poco tiempo. Algunos autores(1) definen a la citometría de flujo comouna tecnología analítica que permite lamed ic ión s imul tánea de var iascaracterísticas de muestras biológicas.Se pueden realizar recuentos celulares,para separar células o para realizaranálisis de marcadores bien sean desuperficie o intracelulares (1). Desde susinicios en la década del 70 para el estudiode poblaciones de células en inmunologíala citometría se convirtió en una técnicacuant i ta t iva aprec iada, de ba jacomplej idad, económica y fác i l demantener en el laboratorio dada laevolución en la química de los reactivosy modernidad de los instrumentos. Éstase ha convertido en un método innovadorde anál is is que permite tener unaaproximación lo suficientemente sensible,espec í f i ca y ráp ida para d iversasaplicaciones en estudios básicos (2,3),microbiología clínica (4) y recientementeen biotecnología (5).

Son extensos los beneficios de aplicar lacitometría de flujo en el laboratorio.Algunos ejemplos son: identificación rápidade microorganismos de interés clínico (6),estudios de susceptibilidad o resistenciaa medicamentos (7), disminución de lostiempos de procesamiento, análisis y tomade decisiones terapéuticas (8) o ladetección temprana de enfermedadesinfecciosas emergentes y re-emergentes(9,10). Asimismo, en la microbiologíaambiental presenta nuevas oportunidadespara entender la adaptación de losmicroorganismos a ambientes extremos,nuevos ecosistemas o para realizar la

detección rápida de bacterias o virus queson viables pero se encuentran en unestado no cultivable y por lo tanto nodetectable por métodos convencionales decultivo. Si bien muchas estrategias decultivo redundan en los aislamientosprevistos de diferentes fuentes naturales,la gran variedad filogenética y fisiológicade estos aislamientos demuestran lanecesidad de desarrol lar nuevasestrategias de detección cualitativa ycuantitativa. Los análisis por citometría deflujo proveen información sobre el númerode células, los tamaños del genoma, lavariabilidad de las poblaciones, entre otrascaracterísticas (11-13).

El principio de la citometría de flujo se basaen que las células suspendidas en un líquidoson pasadas individualmente al frente deuna fuente de luz intensa (generalmenteun láser) y los datos de la luz reflejada, yen la mayoría de los casos, de lafluorescencia, son recogidos y organizadosen un archivo. Los análisis posteriores delas poblaciones y sub-poblaciones seproducen mediante el uso de programasde cómputo especializados lo cual permiteobtener información valiosa para elinvestigador o el clínico. Debido a sucapacidad de recolectar información demiles o millones de células al mismo tiempo,la citometría de flujo facilita el análisismultiparamétrico como lo realizan otrastécnicas de laboratorio (microarreglos omicroarrays, proteómica). Estacaracterística de analizar millones decélulas también facilita la obtención dedatos estadísticamente significativos enun período de tiempo corto (14). Hoy seconsiguen en el mercado sistemas concapacidad de anal izar más de 15parámetros de manera simultánea contasas de análisis superiores a 70.000células por segundo y con la posibilidadde tener estaciones robóticasautomatizables para reducir los costos delos análisis e incrementar la eficienciaoperativa.

REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 12 (2), Julio - Diciembre 2007

Figura 1. Diagrama simplificado de los principales componentes de un citómetro de flujoy su funcionamiento interno. Tomado y modificado de BD Biosciences (USA).

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Los recientes avances de la citometría deflujo permiten a los microbiólogos explorarlas complejas interacciones entre losmicroorganismos y su medio ambienteincluso al detalle de poder realizar análisisde una sola célula (15). La informaciónsobre la expresión génica o la combinaciónde la citometría de flujo con otros métodosmoleculares más modernos ha permitido,también, visualizar cambios, adaptacionese identi f icación de comunidadesespecíficas y novedosas al igual quecélulas individuales dentro de una poblaciónheterogénea (16,17). Con los tópicosdescritos en esta revisión se pretendeilustrar de una manera sencil la losfundamentos básicos de la citometría deflujo y sus aplicaciones en las áreas de lamicrobiología, la medicina veterinaria y laagricultura. Asimismo, las limitaciones delos métodos tradicionales y los avancestecnológicos de la citometría son motivode discusión y análisis.

FUNDAMENTOS DE LACITOMETRÍA DE FLUJO

El lector puede consultar a otros autoresque han realizado revisiones sobre losfundamentos de la citometría de flujo(18) o visitar la página web http://www.cyto.purdue.edu donde podrá

acceder a un curso en línea sobre lateoría, principales aplicaciones de lac i tometr ía de f lu jo , fuentes dein formac ión ad ic iona l , mater ia lbibliográfico y seminarios especializados.De manera sencilla, lo que sucede en uncitómetro de flujo es que a partir de unamuestra biológica (la gran mayoría de loscasos son células) que es colocada ensuspensión en un líquido, se hace pasar,en lo posible, célula por célula, a travésde una celda de flujo que está siendoimpactada por una fuente de luzmonocromática. Los rayos de luz alencontrarse con las células son difractadosa todos lados o son bloqueados. Lainformación de esta dispersión o bloqueoes filtrada, recolectada y detectada porlos componentes especiales del instrumentopara convertirlas en valores digitales queson guardados en un archivo con el fin deser analizados luego por un software

especializado (Figura 1). Este procesofísico-químico que ocurre con la muestrase logra por intermedio de los trescomponentes principales de un citómetrode f lu jo (Tab la 1) e l cua l es uninstrumento muy reconocido en lapráctica clínica de rutina pero que ahoraha incrementado su uso en ot rasaplicaciones no clínicas (2,3,5).

Laguado - Aplicaciones de la citometría

Tabla 1. Principales sistemas y componentes de un citómetro de flujo.

SISTEMA FUNCIÓN

Fluidos Transportar la muestra hacia el haz de luz del láser y

mantener sus propiedades fisicoquímicas.

Óptico Iluminar las partículas de la muestra y obtener las señales

de luz resultantes en los filtros y detectores apropiados

Electrónica Convertir las señales de luz en señales electrónicas que

un computador y programa de cómputo puedan interpretar.

Tabla 2. Principales etapas para la realización de un experimento usando la técnica decitometría de flujo.

ETAPA

Preparación

Citometría de Flujo

Análisis de datos

OBJETIVO

Visualizar el experimento en un

análisis previo (pre-citometría)

mediante la adecuación de las

condiciones de la muestra y del

citómetro.

Realizar la lectura de la muestra

y un pre-anál is is de su

comportamiento.

Interpretar los archivos y

convertirlos en información útil.

ACTIVIDADES

Selección de parámetros a

medir y react ivos

necesarios.

Diseño de Protocolos de

preparación.

Tinción de células.

Selección de fluorocromos.

Procesamiento de las

muestras en un citómetro

de flujo.

Medición de los parámetros

seleccionados en la fase

de preparación.

Revisión de los datos en un

programa de cómputo

especializado.

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El análisis citométrico requiere de unapreparación y formulación de estrategiascon el ánimo de garantizar el éxito delos experimentos. Esto se hace a travésde protoco los que genera lmenteinvolucran tres fases (Tabla 2) pero quede manera general siguen el siguientecomportamiento: 1) hacer unasuspensión de las células; 2) continuarcon pasos sucesivos donde las células,lavadas o no, son incubadas en tubos omicroplacas con anticuerpos marcadoscon sustanc ias f luorescentes of luorocromos ( i sot ioc ianato defluorescencia o FITC, ficoeritrina o PE,a lo f i coc ian ina o APC); 3) lavadosperiódicos para remover el exceso de

búferes, anticuerpos, fluorocromos oimpurezas.

En términos técnicos la citometría deflujo indica tres cosas fundamentalessobre una muestra en un experimento(Figuras 1, 2).

· El tamaño relativo de las partículas océlulas a lo cual se le denominaForward Scatter ó FSC. Esto no esmás que la luz que la partícula o célulano deja transmitir de forma frontal yestá relacionado con la superficiecelular o su tamaño. El instrumentotransforma la señal que es recolectadaen el detector FSC.


Figura 2. Ejemplos de visualización de los resultados de los datos obtenidos con uncitómetro de flujo. A) Los histogramas monoparamétricos donde se observan el parámetroseleccionado en el eje de las “X” (en este caso la intensidad de la fluorescencia relativarecibida en el detector para FL2) y el número de células o eventos en el eje de las “Y”. B)Los histogramas biparamétricos o dot-plots que permiten observar las células o eventosdistribuidos como una función de la intensidad de la señal con respecto a cada parámetro(en este caso de las fluorescencias relativas). En el Eje X se visualiza la intensidad deuna de las fluorescencias y en eje Y la otra fluorescencia. Los puntos blancos son losplots de las células detectadas y definidos como negativas para ambas Fluorescenciasaquellas que están cercanas al punto 0 de los dos ejes, positivas para la fluorescenciaen el eje de las X aquellos puntos cercanos a 600 y positivos para ambas fluorescenciasaquellos puntos que se visualizan en la intersección de los ejes X y Y entre 600 y 800.

A B

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· La complejidad relativa interna ogranularidad. Esto es, la luz que esdispersada a un ángulo de 90° de la luzincidente del láser o Side Scatter oSSC. Este parámetro está asociado conla rugosidad de la superficie celular y lacantidad de organelos dentro de lacélula. A mayor cantidad de organeloso elementos en el interior de la célulamayor será la complejidad registrada enel detector SSC.

· La Intensidad de la fluorescencia demanera relativa (cuando la muestra hasido teñida con anticuerpos marcadoscon fluorocromos o con algún tipo demolécula f luorescente) indicandomarcadores en la célula contra loscuales los anticuerpos usados o losfluorocromos han sido dirigidos.

Debido a que el tema de fluorescencia esde vital importancia para preparar la

estrategia y los estudios por citometríade flujo (Tabla 3). De manera breve, lafluorescencia ocurre cuando los fotonesde una luz incidente chocan contra unamolécula (un fluorocromo) permitiendo quelos electrones de los dobles enlaces pasena un nivel energético más alto (excitado).El retorno de la molécula a un estado deenergía más bajo está acompañado por laemisión de luz (la fluorescencia) y la pérdidade energía (19). Los métodos de tincióncon fluorescencia generalmente son rápidosy facilitan la visualización de las célulasen mezclas complejas de acuerdo a suscaracterísticas bioquímicas, fisiológicas opropiedades taxonómicas. Tambiénrepresentan componentes específicos delas células como organelos, enzimas omarcadores de superficie (20). Losfundamentos de la fluorescencia al igualque otras técnicas de tinción para célulasse han descrito previamente (13, 21).


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Los citómetros de flujo son instrumentosflexibles que documentan una granvariedad de aplicaciones. Sin embargo,es esta misma f lex ib i l idad la queinherentemente se asoc ia con laposibilidad de obtener resultados errados.Dentro de las causas más frecuentes deresultados inválidos se encuentran lossiguientes factores:

1) Como cualquier otra técnica delaboratorio, asumir los supuestoserrados por parte del operadorcuando se formulan las estrategiasexper imenta les ta les como lase lecc ión y es tab i l idad de losf luorocromos o e l número demoléculas blanco en la célula.

2) La inadecuada selección o ajuste delvo l ta je para la lec tura qu izásperdiendo las poblaciones de interésen el estudio.

3) La falta o sobre estimación de lacompensación del instrumento.

4) El deterioro del equipo por la faltade manten imiento ba jo lascond ic iones y parámetrosestablecidos por el fabricante.

Si bien los detalles técnicos no son partede esta revisión, algunos comentarios sehacen para ilustración del lector. Lascondiciones técnicas del instrumentodeben ser ajustadas de acuerdo al tipode células que se está evaluando. La granmayoría de los operarios visualizan losanálisis cuantitativos como se describenen la Figura 2 pero lo más importante atener en cuenta es que el instrumentodebe estar ajustado hasta que laspoblaciones sean visibles en el centrode los histogramas en un análisis de FSCversus SSC, es decir, un histograma tipoploteo de puntos o dot-plot (Figura 2B). Generalmente los experimentos queinvolucran fluorescencia se visualizan conlos histogramas tipo dot-plots y losexperimentos deben ser compensados

para cada intensidad de la fluorescencialo cual se hace mediante los reactivos o

controles adecuados. Finalmente, hayque ajustar el Threshold, o punto decorte, lo que permitirá al operadorseleccionar los datos a partir de loscuales quiere obtener información.Teniendo en cuenta estas senci l lasrecomendac iones, e l t rabajo encitometría de flujo se facilita para eloperario y para el análisis posterior quese realiza.

APLICACIONES DE LACITOMETRÍA DE FLUJO ENMICROBIOLOGIA

Algunas de las técnicas más usadas parae l d iagnóst i co o detecc ión demicroorganismos incluyen el cultivo,inmunoensayos, ag lu t inac ión,microscopia óptica y de fluorescencia ybiología molecular. Estas técnicas se hanutilizado a lo largo de los años por susencillez de uso, tradición, disponibilidaden el laboratorio y bajos costos. A pesarde esto, muchos métodos tradicionalesconsumen tiempo durante la preparaciónde las muestras, se basan en el examenvisual por parte del operador, presentandificultades técnicas al momento deimplementarlas o están limitadas a pocoscentros especializados. La citometría def lu jo , a l igua l que ot ros métodosmodernos, se conv ier te en unaherramienta fundamenta l en lamicrobiología combinando la deteccióndirecta y rápida de microorganismos (opartes de éstos), e l estudio de ladistribución de su tamaño (a través delos parámetros de FSC y SSC, tamaño ycomplejidad respectivamente) al igualotras característ icas bioquímicas yfisiológicas de una población o de célulasindividuales. Estudios previos resaltan lasventajas y beneficios de uti l izar lac i tometr ía de f lu jo en muest rasambienta les pero que por sugeneralización pueden ser extensibles acualquier aplicación en microbiología: 1)La velocidad con la cual se obtienen y


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procesan los datos; 2) la capacidad deseparación (cell sorting) que tienenalgunos citómetros lo que permite elaislamiento de poblaciones específicas eincluso células individuales para unposter ior es tud io f í s i co , qu ímico,biológico o molecular; 3) la adquisiciónrápida de múlt ip les datos para suposterior análisis; 4) la posibilidad de seruna técnica tanto cual itativa comocuantitativa (14, 15, 22).

Si bien las aplicaciones de la citometríade flujo al campo de la microbiología noson nuevas (2,4,19) esta herramientaestá poco desarrollada en Colombia enaplicaciones distintas a la clínica o lainvest igac ión bás ica . Las nuevasap l i cac iones en temas d i fe rentespermi t i rá e l avance e inc luso lareorganización de varios métodos usadosen ciencias biológicas tal y como sevienen practicando en la actualidad. Elcultivo tradicional usado en un períodode tiempo variable, a temperaturasadecuadas hasta observar coloniasvisibles para luego ser contadas eidentificadas. Esta labor, además detomar t iempo y es fuerzo, t ienel imitaciones ya que los medios nosat i s facen los requer imientos decrecimiento de todas las especies o sedeben utilizar varios medios para lograrla identificación de varias especies enuna misma muestra.

En el mundo globalizado de hoy lacitometría de flujo ha mostrado a lo largoy ancho del planeta ser de gran utilidadpara la detección o identificación demicroorganismos tales comoStaphylococcus aureus (6), Plasmodium

(4), Cyclospora (9), diferentes familias deVirus incluyendo Baculovir idae,

Herpesviridae, Myoviridae, Picordnaviridae

y Retroviridae (12, 13), Chlamydia (23),Rotavirus (24), Leptospira (25), Salmonella

(26), Listeria (26), Escherichia coli (27),Francisella tularensis (28) y hongos devarias especies (29) entre otros.

APLICACIONES DE LACITOMETRÍA DE FLUJO ENMICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL.

La citometría de flujo no sólo se usa conmuestras clínicas sino que también seaplica en una variedad de muestrasambientales y de alimentos tanto enpaíses desarrollados como en vía dedesarrol lo. Mediante el uso de laspropiedades de dispersión de la luzdentro del c i tómetro y/o un paneladecuado de anticuerpos monoclonalesmarcados con fluorocromos se puederealizar prácticamente la identificaciónde cualquier microorganismo de interés.Algunos autores revelan lo valiosos quepueden ser los análisis por citometríallegando a ser incluso más sensiblescomparados con los métodos de cultivotradicionales en la industria de alimentos(27,30). Para la exitosa comercializaciónde nuevos productos con mejorescaracterísticas para los consumidores esfundamenta l desarro l la r métodosanalíticos que logren detectar a tiemporiesgos para la salud pública. Tambiénpara las empresas es crítico reducir lostiempos de análisis para dar vía libre alos productos en el mercado nacional ointernacional. Un ejemplo de estasaplicaciones es el monitoreo de la calidadde los productos lácteos el cual requierede un análisis detallado de la cargamicrobiana. La citometría de flujo enconjunto con técnicas fluorescentes,después de realizar una clarificación dela muestra removiendo los lípidos yproteínas, se puede hacer la detecciónde bacterias viables y no viables en laleche lo que convierte a esta técnica enun método de análisis rápido que puedeser incorporado a la rut ina de unlaboratorio (31). Otro modelo es el delas bacterias acido lácticas que son devital importancia en la industria delácteos. Los “probióticos”, como seconocen comerc ia lmente, soningredientes microbianos benéficos parala salud y son incorporados al yogur, la


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leche, e l queso e inc luso a ot rosalimentos cárnicos. Para resolver algunosinconvenientes de su mejora en ellaboratorio tales como la optimización delcrecimiento, la regularización de laproducción y la determinación de laresistencia a las sales, entre otrasvariables, se necesitan de modernosmétodos para su enumerac ión yvaloración de la viabilidad. De nuevo, elmétodo de recuento en placa es tediosopresentando ciertas desventajas comola subestimación del número real debacterias presentes debido a daños enla célula o agregación de las mismas encadenas durante la formación de lascolonias. Aquí la citometría de flujo, comométodo moderno de anál is is en ellaboratorio de microbiología industrial,consigue una mejor aproximación a laevaluación de los cultivos primarios y delas poblaciones bacter ianas en losalimentos (32).

Los métodos tradicionales de recuentostotales de microorganismos en placastienen desventajas; otros métodosusados son manuales sin posibilidad deautomatización y muchos no permiten ladiferenciación rápida entre las distintasespecies. En contraste, un citómetro deflujo, como instrumento y método,admite rea l i zar la detecc ión ydiscriminación de microorganismoscultivables, además de otros que sonviables pero no cult ivables con laposibilidad de obtener células individualesde caracter í s t i cas f i s io lóg icas omorfológicas especiales (lo que se llamaen el lenguaje citométrico “eventos

raros”) que podrían beneficiar a laindustria de alimentos. La producción denuevos compuestos anti-bacterianosinocuos para el hombre, la selecciónd i recc ionada de nuevas cepas debacter ias o levaduras para lafermentación o el simple hecho de usaruna técnica que no use marcadoresgenéticos son algunos de los beneficiosque se obtienen al utilizar la citometría

de flujo en la industria de alimentos. Ellector puede consultar a Shapiro (1,19)y Mattanovich y Borth (5) para unarevisión completa de las aplicaciones dela citometría de flujo como un métodorápido para la separación celular (cell

sorting).

El tema ambiental es otro de los camposinteresantes donde nuevas aplicacionesde la c i tometr ía de f lu jo se hanimplementado con éxito. El crecienteinterés en microorganismos acuáticos yde ambientes extremos crece debido aque estos ecosistemas representan unimportante reservorio de diversidadgenét i ca y f i s io lóg ica donde lasconcentraciones de nutr ientes sonescasas y las temperaturas excesivas.Es aquí, en estos nuevos entornos, dondelas oportunidades para descubrir nuevasespecies de microorganismos, entendernovedosas vías metabólicas diferentes alas del carbono donde la metanogénesisy los organismos sulfato-reductorespredominan o s implemente parareest ructurar e l conoc imientotaxonómico están a la orden del día (16,17). En la medida en que se realicendescubrimientos y caracterización demicroorgan ismos la indust r iabiotecnológica comenzará la búsqueda denuevos productos que redundarán enmejores beneficios y superiores técnicaspara el laboratorio. El ejemplo clásico deesta bioprospección por parte de laindustria privada son las modernasenzimas resistentes y estables a las altastemperaturas que se usan paradesarrollar la técnica de Reacción enCadena de la Polimerasa (ó PCR) y queprocesan material genético con altocontenido de Guanina-Citosina (GC) congran fidelidad superando a sus homólogastradicionales (i.e. Taq Polimerasa). Paraestar en s intonía con un tema deactualidad nacional, Genencor (http://www.genencor.com) , una división de laempresa Danesa Danisco, ha lanzadorecientemente el producto Maxaliq™


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ONE, una enzima termoestable queconsigue un mayor rendimiento en lasplantas de producción de biocombustiblesy una mayor eficiencia en la producciónde etanol a partir de biomasa.

Otro ejemplo de la importancia de laaplicación de la citometría de flujo en eltema ambiental es la degradación dehidrocarburos. En un ambiente natural,o durante los derrames accidentales, ladegradación de hidrocarburos se damayormente por microorganismos en elsue lo o agua donde éstos sonderramados. No obstante , d i chacapac idad de degradac ión esdependiente de la salinidad del medio yde las comunidades involucradas en estosambientes. Si bien métodos modernoscomo la Reacción en Cadena de laPolimerasa, el uso de isótopos radiactivoso la determinación del ARN ribosomal (óARNr) consiguen identificar genes que seencuentran involucrados en las víasmetabólicas de degradación (33), éstostienen las limitaciones de ser técnicascostosas, especializadas y de necesitargran destreza por parte del operadorpara que el experimento se desarrolle conéxito. En este contexto, la citometría deflujo, en conjunto con otras técnicasmodernas de laboratorio, permite laidentificación, estudiar la adaptación yobservar la evolución de las diferentescomunidades de bacterias involucradasen la degradación de hidrocarburos. Esasí como se encontró que la bacteriaSphingomonas spp predominaba enambientes donde las concentraciones desales son bajas mientras que otroshalófilos extremos tales como Ralstonia

spp, Halomonas, Dietzia y Alcanivorax

fueron identificados en ambientes consalinidades más altas (33).

Estos ejemplos impulsan a creer que elanál is is por c itometr ía de f lujo demuest ras ambienta les para ladeterminac ión y v iab i l idad demicroorganismos conseguirá realizar una

mejor caracterización microbiológica delagua, suelos y aire buscando un mejorcontrol o prevención de riesgos para lasa lud humana o animal . También,permitirá continuar con las actividadesde bioprospección en busca de recursosgenéticos o bioquímicos que tengaaplicación industrial.

APLICACIONES DE LACITOMETRÍA DE FLUJO ENVETERINARIA.

Si bien la citometría de flujo no se aplicamucho en veterinaria, su uso en futurocercano aumentará de maneraconsiderable en la medida que seadifundida la posibilidad de su aplicaciónen otras especies distintas a pequeñosroedores. Los viajes modernos, lasmigraciones, los cambios demográficos,el comercio y el abuso de antibióticosson a lgunos de los fac tores queincrementan la amenaza de brotes,emergencia y re-emergencia de variasenfermedades infecciosas desde elsector pecuario. Simultáneamente, elcomercio internacional de alimentos seha incrementado en los últimos añosimponiendo barreras no arancelarias, másexigencia sanitaria, mejor tecnología deproducción y sofisticadas técnicas decontrol de calidad para ser competitivos.

La citometría surge como una nuevatecnología en los laboratorios clínicosveterinarios al igual que las aplicacionesclínicas en humanos. La citometría enveterinaria permite el análisis de unavariedad de células animales incluyendoap l i cac iones como e l recuento dereticulocitos, recuento de plaquetas,inmunofenotipificación de leucemias ylinfomas o recuentos diferenciales enmédula ósea en felinos, caninos, bovinosy equinos (34). También se usa lacitometría de flujo para el recuento desubpoblaciones de linfocitos en ovejas(35), diagnóstico veterinario de anemia


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hemolítica y neoplasias en equinos (36).Como es de anticipar, los instrumentos,reactivos y estrategias de análisis debenser adecuados para este t ipo deaplicaciones al igual que las condicionesde trabajo de los experimentos.

Quizás las aplicaciones más importantesde la citometría en veterinaria se basan,aunque no se limitan, a los estudios dela respuesta inmune de infeccioneseconómicamente relevantes para: a) lafabr i cac ión de vacunas; b) e lmejoramiento de las vacunas yaexistentes; c) el mejoramiento genéticode especies bovinas y equinas; d) eldesarrollo de modelos de respuestainmune en animales como primates nohumanos (especies de Mandriles-Baboon,monos Rhesus-Macaca spp y Cynomolgus,Macaca fascicularis) con el fin de adquirir

un entend imiento pro fundo de lapatogénesis de ciertas enfermedadesinfecciosas y la experimentación devacunas antes de comenzar ensayos enhumanos. Trabajos previos describen elseguimiento de la respuesta inmunehumoral de vacunas contra Mycoplasma

gallisepticum (37), los cuales refieren nosólo la prevención del establecimiento delmicroorganismo, sino también a laprevenc ión y segu imiento de laenfermedad. En el caso de Brucella, lainmunidad protectiva no está del tododeducida en animales pero la evidenciasugiere que la inmunidad celular, al menosen prospectos de vacunas ADN para B.

ovis y B. mellitensis, está mediada porLinfocitos T citotóxicos (incluyendo CD4+

y CD8+) y ésta juega un papel importanteen la protección contra el microorganismoen modelos murinos (38).


Figura 3. Ejemplo de un reporte y análisis por citometría de flujo de una muestra de espermade un bovino. El sistema BD FACSCount™ AF (BD Sperm Counting System) usa un Láser de488 nm que excita la fluorescencia de dos fluorocromos. Uno realiza la tinción del ADN entodas las células y emite un color amarillo cuando se excita a 488 nm. El otro, sólo entra lascélulas que tienen la membrana averiada (células presuntamente muertas o poco viables);este fluorocromo emite un color rojo cuando se excita a 488 nm. El volumen de la muestraanalizado es determinado por un estándar interno (las microesferas fluorescentes o “beads”)y los reactivos específicos. El reporte establece una relación de concentración precisa entreel volumen de la muestra y el recuento de las microesferas permitiendo la producción dedosis de inseminación más uniformes con un número específico de esperma.© 2004. Becton, Dickinson and Company. Todos los derechos reservados. Material cortesíade la oficina centralizada en Bélgica de BD Biosciences. Prohibida su reproducción,almacenamiento, transmisión en cualquier forma mecánica, electrónica, magnética, óptica oquímica, total o parcial sin el consentimiento previo por escrito de BD Biosciences. BD, BDFACS y BD FACSCount son marcas registradas de Becton, Dickinson and Company.

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Otra aplicación son las infecciones porMycobacter ium bov is , las cua lesrevisten implicaciones económicas paralos productores de ganado y son unaamenaza constante para la sa ludhumana. Al ser parásitos intracelularesque sobreviven y se replican dentro delas células del hospedero su detecciónpor métodos tradicionales es limitada yse requiere una aproximación másavanzada como la biología molecular ola citometría de flujo. Algunos paísesusan el Interferón Gama (INF-g) comomarcador pronóstico de los estadiosiniciales de la tuberculosis bovina enanimales no obstante, en bovinosmenores a 18 meses se presentanreacciones inespecíficas en el CF quepueden dificultar la interpretación de losresultados (39).

La otra aplicación importante de lacitometría de flujo en veterinaria es lacorre lac ión que ex is te ent re laconcentración y viabilidad del espermay la fertilidad en ganado. Desde loscomienzos de la inseminación artificial enbovinos y aves el método primario parala evaluación de la calidad del semen sebasa en la inspección visual de lamot i l idad de l esperma bajo unmicroscopio con la técnica de contrastede fase. Este método, si bien es baratoy rápido, es subjet ivo e imprecisodependiendo en gran medida de laexperiencia del operador. Los múltiplestrabajos de Christensen, Hansen ycolaboradores en el Departamento deCiencias Animales de la Real UniversidadVeterinaria y Agrícola de Dinamarca sonfamosos por combinar métodosfluorescentes con un citómetro de flujomodificado para el análisis de espermabovino en estaciones de inseminaciónartif ic ial (40). Al usar una versiónmodificada de un citómetro clínico se hadesarrollado un método rápido, precisoque permite: la selección del mejorsemen de toros y cerdos. El CF puedeevaluar la calidad, estructura, función y

motilidad del esperma luego de ciclos decongelación/descongelación; y, valorardaños en el esperma y su calidad para lafertil ización. De igual manera, estedesarrol lo tecnológico evidencia laimportancia de unificar los esfuerzosentre las neces idades de l sectorproduct ivo ( las Soc iedades deInseminación Artificial Danesas), laempresa pr ivada y los centros deinvest igac ión de exce lenc ia ( laUniversidad) para brindar solucionesinnovadoras al servicio de la comunidad.

APLICACIONES DE LACITOMETRIA DE FLUJO ENAGRICULTURA.

Las aplicaciones de la citometría de flujoen veterinaria son poco conocidas, aligual que las aplicaciones en el áreaagrícola en Colombia es mucho menosavanzado. Cuando se menciona lapalabra planta se hace referencia abriofitas, gimnospermas, angiospermas ydemás sin distinción alguna a menos quese especifique lo contrario.

El maíz, el arroz, el trigo, el sorgo, laavena, la caña de azúcar, el algodón, elbanano y la palma de aceite son cultivosimportantes desde el punto de vistaeconómico, ecológico y de nutrición paraColombia sin embargo las oportunidadespara avanzar tecnológicamente con lacitometría de flujo están lejos. Haybancos de germoplasma o extensastierras cult ivadas de cereales paraconsumo humano o para su uso posteriorcomo biocombustibles por mencionar losejemplos más re levantes. Dado loextenso de la aplicación de la citometríade flujo en plantas, que llevaría unarevisión adicional más detallada, estarevisión se refiere a los aspectos básicossin profundizar en la terminologíaespecializada usada por los expertos. Laaplicación de la citometría de flujo en laagr i cu l tura p lantea prob lemas


Figura 4. Visualización representativa de un histograma monoparamétrico del ciclo celulary análisis del contenido de material genético (ADN) por citometría de flujo

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adicionales. Las plantas tienen paredesgruesas ó rígidas, contienen cloroplastosy ot ros organe los que sonautofluorescentes lo que de por síp lantea un reto ad ic iona l para lapreparación de la muestra o para losanálisis posteriores de los datos. Tambiénes necesaria la inclusión de estándaresde comparación que estén previamentecaracter i zados o tengan va loresconocidos para la práctica del análisiscitométrico en plantas. Nuevos métodosde preparación, procesamiento demuestras y estándares de análisis se hanmater ia l i zado para reso lver estosinconvenientes como la preparación denúcleos completos en soluciones acuosasque luego pueden ser separadosfísicamente en un instrumento (41). Laobtención de un ADN de alta calidad esmandatario para realizar clonación yorganizar liberarías genómicas.

La terminología, a l no ser de usocot id iano, t iende a ser confusa y

requiere de atención adicional por partedel lector para hacer seguimiento a losresu l tados de un t rabajo o a lasmetodo log ías propuestas en laspublicaciones científicas. Expresionescomo tamaño del genoma o valor C (C-

Value), contenido de ADN nuclear y ciclocelular son incorporadas al análisis porcitometría de flujo en plantas. De manerailustrativa, un aspecto trascendental,como lo es e l c i c lo ce lu lar, es tácomprendido por las siguientes fases:Preparación para la síntesis de ADN o“G1”; Síntesis de ADN o “S”; Períodoprevio a la separación de la célula o “G2”donde se encuentra la doble cantidadde ADN que en la fase G1; Finalmente,la separación de las células o “M”

La citometría de flujo permite medir lacantidad de ADN presente en cada célulay la cantidad de éstas en cada fase. Elhistograma que resulta de esta mediciónes similar a los presentados en la Figura2 A y Figura 4.


0 200 400 600 800 1000

2N 4NContenido de ADN

Conte

os

celu

lare

s o e

vento

s

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La ploidia es un término que describe elnúmero de grupos o juegos decromosomas dentro de una célula. Unacélula haploide contiene la mitad (n) delnúmero normal de cromosomas (2n). Undip lo ide (2n) posee dos ser ies decromosomas y un poliploide contiene unincremento del número de cromosomascaracterístico (4n). La ploidia juega unpapel importante en la evolución de lasplantas permitiendo su adaptación a unaamplia variedad de ambientes geográficosy climas a lo largo del tiempo. De ahí laimportancia de realizar estudios paradeterminar la evolución de la ploidia,estudiar sus categorías, modos deformac ión, a t r ibutos eco lóg icos ymoleculares, mecanismos de especiación,comportamiento c i togenét i co yconsecuencias genéticas. La citometríade flujo aporta información valiosa paralos estudios de ploidia en plantas talescomo: 1) cambios en el contenido de ADNy caracter i zac ión de l genoma; 2)determinación de la prevalencia y eltiempo en que ocurren estos cambios;3) re lac ion de la genét i ca a lcomportamiento de la planta en suambiente; 4) La identificación de plantashíbridas (1, 42). Como el lector puedeanticipar, la cantidad de ADN presenteen cada planta o célula dependerá desu nivel de ploidia. Por ejemplo, lasplantas tetraploides (4n) tienen el doblede contenido de ADN y cromosomas quesus pares diploides y es en este mismosentido que se plantea la estrategia pararealizar el análisis de los histogramas ydel ciclo celular. La identificación dehíbridos es necesaria cuando se quiererealizar cruces entre plantas ya quediferentes niveles de ploidia puedenresultar en inestabilidad genómica onúmero impar de cromosomas lo queacarrea la infertilidad y bajos niveles deproductividad de estos cultivos.

Una de las grandes ventajas del uso dela citometría de flujo en plantas es quepara los experimentos se pueden utilizar

partes (como hojas) que permiten dejara la planta intacta en el laboratorio o elcampo sin necesidad de pérdida adicionalde los sujetos materia de estudio.Nuevamente una gran cantidad demuestras pueden ser procesadas en pocotiempo o muchas células son leídas enuna corrida produciendo datos consignificado estadístico.

Quizás la aplicación más importante dela citometría de flujo en la agriculturasea la determinación del contenido deADN. Algunos ejemplos de esta aplicaciónse publicaron para cultivos de café (43),algodón (44), más de 21 especies deSorgo (45), banano y plátano (46) opalma de aceite (Elaeis guineensis) (47),entre otros. En el caso de Musa, paradescribir el patrón, la clasificación de laploidia de las plantas se basa en lascaracterísticas morfológicas y un sistemade permutaciones genómicas que limitansu aplicación debido a los largos ciclosde vida del cultivo o de las extensionesde tierra necesarios para su cultivo. Elcultivador querrá tener la información,por lo menos básica, de la ploidia de susplantas o la composición del genoma parap lan i f i car las es t ra teg ias deapareamiento. La citometría de flujopresenta su utilidad, en conjunto conotros sistemas de marcadores genéticos,como un método para discriminar de unamanera ráp ida las co lecc iones degermoplasma y confirmar el tamaño ocomposición del genoma (46).

Además, como método alternativo rápidoy confiable, la citometría presenta demodo inicial sus ventajas y beneficiospara los cultivadores o investigadores delsector agrícola que requieran haceranálisis del contenido de ADN en plantaso descubrir la estabilidad genética decultivos autóctonos colombianos y losniveles de ploidia en diferentes siembrasde café (43), algodón (44) o caña deazúcar. El significado biológico o evolutivoque arroje el análisis de las posibles


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inserciones o deleciones o variacionesen el tamaño del genoma por otrosmecan ismos apor ta in teresanteperspect ivas para proyectos deinvestigación, sean básicos o aplicados.Los diversos proyectos genoma que sehan iniciado a nivel mundial no son ajenosa l sector agr í co la . Los aná l i s i sf i l ogenét i cos son necesar ios paraentender los orígenes y evolución de lasespecies y en el caso de las plantas noes la excepción. En este sentido ya secomenzaron trabajos para tener un mejorentendimiento de las especies de arroz(Oryza) mediante la construcción delibrerías genómicas donde la citometríade flujo jugó un papel destacado en ladeterminación del contenido de ADN, eltamaño del genoma de nueve de las doceespecies de Oryza y el análisis de lascélulas en división. Incluso, con losmodernos métodos se secuenciación yanál is is molecular las prediccioneshumanas sobre la generac ión de“genomas” o su composición puedenestar erradas y necesitar de clarificacióno corrección en bajo las circunstanciasapropiadas (46). Además, la citometríade flujo presenta una alternativa distintaque permite fraccionar el genoma nuclearen plantas realizando sorting de loscromosomas individuales y así tener unmétodo alterno a la secuenciaciónmolecular.

Para lograr esto, la sincronización delcultivo celular y el análisis de datos quepermita realizar tanto el análisis del ADNcomo el sorting de los cromosomas sepuede utilizar un citómetro de flujo deú l t ima generac ión los cua les sonbastante sencillos de utilizar a diferenciade sus antecesores.

AVANCES CIENTÍFICOS YPROGRESOS TECNOLÓGICOS

La disponibilidad de métodos de altacapacidad de procesamiento (High-

Throughput), el incremento continuo delas capacidades de los sistemas decómputo, los nuevos desarrollos en lossoftware para análisis y la creatividadde los investigadores han acelerado losdescubr imientos en la genómica,proteómica y los campos relacionados enel mundo. El conocimiento obtenido enestas áreas augura un futuro promisoriopara entender el impacto directo que losmicroorganismos t ienen en la vidahumana, las aplicaciones industrialesdireccionadas o como fuente de alimentopara animales de crianza. Es comúnobservar la integración de varias áreasdel conocimiento científico para ayudara la reso luc ión de prob lemas. Lahistología, la citometría de flujo, losmode los matemát icos , la b io log íasistemática y los ensayos funcionaleshan un i f i cado es fuerzos para lainvestigación de la respuesta inmune deun individuo (48); o la integración de laseparación celular (Cell Sorting), usandocitómetros de flujo modernos, sirve parapurificar poblaciones de células e integrarestos aná l i s i s a programas másavanzados de proteómica (49).

Por otro lado, los métodos tradicionalesde cult ivo determinan sólo célulascultivables en una muestra, requieren delargos tiempos de incubación o dependende las lecturas del observador. Estaaproximación limitada de la cienciapermi te ant i c ipar que aque l losmicroorganismos que estén en un nivelde detecc ión bajo por daño en lamembrana celular, que tengan bajaviabilidad, que se encuentren en escasonúmero o que sean de crecimientointracelular obligados no podrán serobservados (10, 25). Otros, tomarántiempos mucho más largos para servisibles en los cultivos (39). En estesentido una sola célula podría, bajo lascondiciones adecuadas, dar comienzo auna enfermedad, causar una epidemia oestropear toda la comercialización de unlote de alimentos. Técnicas innovadoras


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que permitan detectar partículas de 0.5÷m e identificar células individuales comola citometría de flujo cobran importanciapara describir mejor los posibles riesgospara la salud o para detectar infeccionesantes de su diseminación. Asimismo, eluso de nuevos métodos de t inciónfluorescentes que permitan discriminardentro de una pob lac ión losmicroorganismos vivos de los no viablesfacilitará la detección rápida y confiablede incluso parásitos intracelularesobligados que en otras circunstanciasnecesitarían de métodos de inoculaciónin vivo para determinar la infección o decu l t ivos ce lu lares . Lawson ia

intracellularis, que es un microorganismoque produce diarreas y muertes súbitasen cerdos de engorde, no crece enmedios de cultivos convencionales debidoa que necesita condiciones atmosféricasespeciales para su crecimiento o cuyaviabilidad se observa en monocapas decultivos celulares de entericitos (50).

Al integrarse a métodos modernos (3, 6)la citometría permite el desarrollo denuevos proced imientos de cu l t ivobacteriológico para el aislamiento demicroorganismos desconocidos o enambientes inhóspitos (11). Dadas lasmúltiples capacidades de la citometría ode los instrumentos modernos se puedemodificar las propiedades de deteccióndel FSC (detección de tamaño) por ladetecc ión y cuant i f i cac ión de laaglutinación de partículas. En este casoel análisis se modifica mediante laobservación y comparación de los dot-

plots de las bacterias agregadas deaquellas no aglutinadas como se observaen el caso de Leptospira (25). Tambiénse puede tomar venta ja de estamodif icación de la medición de laspropiedades del c i tómetro para ladetecc ión de enfermedadesneurodegenerativas en ganado como laEncefalitis Espongiforme Bovina como unapotencial prueba diagnóstica en suero enanimales ante mortem y no mediante el

análisis en tejidos por inmunohistoquímicapost mortem (51).

CONCLUSIONES

Colombia t iene un gran potencialexportador en la industria agropecuaria,una enorme biodiversidad y la recienteimplementación de plantas para producciónde biocombustibles. Sin embargo, el paísenfrenta permanentemente cruzadaspara desafiar las barreras no arancelariasque cada día son más notorias en lostratados de comercio. Esto, se haconvertido en serias limitaciones para laentrada en otros mercados de nuestrasexportaciones o de lograr una mayorparticipación internacional con nuevastecnologías. Es posible, por ejemplo,estudiar el contenido de ADN de lasactuales y futuras plantaciones de cañade azúcar, maíz, palma o yuca con elánimo de mejorar la genética de estoscu l t ivos buscando una mayorproductividad y competitividad en pro desatisfacer la creciente demanda local einternacional por bioetanol o biodiésel.Como país en vía de desarrollo Colombiarequiere un enfoque distinto que lepermita plantear serias estrategiasproactivas del uso de sus recursosnaturales que puedan derivarse del usode la citometría de flujo en las áreas dela microbiología, veterinaria y agricultura.Si bien la aplicación de la citometría enespacios distintos a la clínica apenascomienza en Colombia, se percibengrandes contribuciones por los distintosgrupos de investigación que actualmenteusan esta tecnología como herramientaen sus laboratorios. La búsqueda denovedosos microorgan ismos, e lentendimiento de la variabilidad genéticade las pob lac iones estud iadas, laproducción de biomoléculas para usomedicinal, la construcción de genotecasde ADN o la búsqueda de alianzas decooperación internacional son algunos delos esfuerzos sostenidos que se conciben


REFERENCIAS

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en tiempos recientes a nivel nacional conel ánimo de unificar el desarrollo deactividades académicas permanentes, lat rans ferenc ia de tecno log ía y lainvestigación conjunta.

Conflicto de intereses

El autor declara que actualmente esempleado de la empresa Becton Dickinsonen Colombia. Becton Dickinson andCompany es una de las compañías másreconocidas a nivel mundial por suaplicaciones en citometría de flujo. Aúnasí, la revisión incluye información deproductos en el campo de la citometría deflujo incluyendo instrumentos, reactivos ytecnología de punta de otras empresas.No obstante, el autor proclama que las

opiniones expresadas en este artículoson basadas en su conoc imiento ,experiencia, investigación académica ydesarro l lo pro fes iona l y que nocomprometen en absoluto a la empresaBecton Dickinson and Company o surepresentación en Colombia, BectonDickinson de Colombia Ltda.

Agradecimientos

A todos aquellos que realizaron la revisióncrítica de este manuscrito cuyos aportesfueron fundamenta les . A BectonDickinson, por permitirme ser parte desu propósito de “ayudar a las personasa vivir saludablemente”. Finalmente alapoyo incondicional de mi esposa LilianaSierra quien me alentó con esta revisión.


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