Análisis in silico y experimental de la interacción de la enolasade Haemophilus influenzae con plasminógeno de humano.

Yesenia Osorio Aguilar1, Alejandro Carabarin Lima1, 2, María Cristina González Vázquez1, Ygnacio Martínez Laguna1, Patricia Lozano Zarain1, Rosa del Carmen Rocha Gracia1. 1Posgrado en Microbiología, Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas, 2

Licenciatura en Biotecnología. Instituto de Ciencias, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla. Puebla, Pue. México.

yesenia.osorio.aguilar@gmail.com

Objetivo: Determinar el papel de la enolasa de H.influenzae, como proteína de unión al plasminógeno humano mediante ensayos in silico e in vitro.

MATERIALES Y MÉTODOS:

RESULTADOSInteracción de rEnoHi con Plasminógeno (Plg)

Fig. 1 A) SDS-PAGE 12% MP: marcador de peso molecular; Carril 1: plg;Carril 2: rEnoHi B) Inmunodetección mediante FAR-Western Blot de lainteracción rEnoHi-Plg con Ac policlonales anti rEnoHi. MP: marcador depeso molecular; Carril 1: interacción rEnoHi-Plg; Carril 2: rEnoHi C)Detección por ELISA de la interacción rEnoHi-Plg inmovilizado conanticuerpos policlonales anti rEnoHi. Bco: blanco; C-: Control negativo(albumina). Los datos representan la desviación estándar promedio ± SD,de tres experimentos independientes (*p<0.001) C- vs rEnoHi-Plg

Docking molecular mEnoHI-Plg

Interacciones mEnoHi-Plg (Puentes de H)

Conclusión: La interacción rEnoHi-Plg, indica que la enolasa de H.influenzae puede actuar como un factor importante de patogenicidad,como lo es la adherencia. Esto podría promover la degradación decomponentes de la matriz extracelular del hospedero, favoreciendo lainvasión y diseminación de H. influenzae en diversos tejidos.

Introduction: H. influenzae es una bacteria Gram negativa, responsable de enfermedades pediátricas invasivas como meningitis, epiglotitis, neumonía,artritis séptica, pericarditis, celulitis, bacteriemia (provocadas principalmente por cepas serotipo b). Las cepas de H. influenzae No Tipificable (HiNT),están asociadas principalmente a infecciones localizadas como otitis, conjuntivitis, sinusitis, bronquitis, neumonía y se encuentran asociadas a laenfermedad pulmonar obstructiva crónica en adultos (EPOC).1 La enolasa (EC 4.2.1.11) es una métalo enzima que participa en la vía glicolítica endiversos organismos; sin embargo, es reconocida como una proteína multifuncional ya que actúa como un receptor del plasminógeno, promoviendo suactivación a plasmina, que conlleva a la degradación de componentes de la matriz extracelular (MEC)2. En multiples patógenos se ha reportado el uso deeste mecanismo para adherirse e invadir a las células del hospedero3, sin embargo para el caso de H. influenzae aún no se ha descrito.

Identificación de residuos Proteína-ligando

Fig. 2 A) Estructura tridimensional de enolasa de H. influenzae; alfahélices y laminas beta (azul); motivo putativo de unión a plasminógeno(rosa) B) Péptido de 11 aminoácidos 1EFYNKENGMYE11 (mEnoHI);utilizado como ligando para realizar el Docking molecular C)Identificacion de los dominios Kringle (k1-K5) en la estructura de Plg(PDB 4A5T) D) Posicion de los residuos correspondientes a cada dominioKringle de Plg. E) Alineamiento del motivo putativo de unión aplasminógeno en H. influenzae (recuadro azul) y otros microorganismos.

Bibliografia:1.Langereis, J. D., & De Jonge, M. I. (2015). Emerging Infectious Diseases, 21(10), 1711–1718.2.Pancholi, V. (2001) Cell Mol Life Sci. 2001 Jun;58(7):902-20.3.Ay, D. A., Fragoso, G., Bobes, J., & Laclette, J. P. (2018). Plasminogen-binding proteins as an evasion mechanism of the host ’ s innate immunity in. 0(August), 1–16.

DominioKringle

ResiduosEnolasa H.i

Residuos Plg (4A5T)

Puentes de hidrogeno

Energia de afinidad

(Kcal/Mol)

Kd (nM)

K2 TYR253 GLU1 1 -3.9 1,383000

K3 TYR253 GLY310 1 -4.4 594,902

K5 LYS255GLU251

ARG471LYS468

2 -4.8 302,800

Tabla 1. Docking molecular: Resumen de resultados usando AutodockVina

Fig. 3 Docking molecular proteína-ligando. Los resultados exhibieronque mEnoHI (rosa) y PLG (gris) presentan complementariedad desuperficie, en el área de la interfaz; mHiENO mostró mayor afinidad porlos dominios K2, K3 y K5, teniendo una energia de afinidad kcal / molde -3.9, -4.4 y -4.8 respectivamente.

Fig. 4 A,B,C) La Interacción de mHiENO (cadena punteada) con losdominios Kringle del Plg, se muestra bien entrelazada por la formación de4 puentes de hidrogeno (esferas pequeñas verdes) y otros residuos delPlg que estabilizan la interacción (esferas grandes). D,E,F) Los residuosimportantes para la interacción corresponden a:K2: eTYR253-pgGLU1; K3:eTYR253-pgGLY310 Y K5: eLYS255-pgARG471 / eGLU1251-pgLYS468(Equivalentes a TYR3, LYS5 y GLU1 en mEnoHI).

A)

B)

C)

D)

E)

F)