ANALISIS JURNAL INTERNASIONAL APLIKASI BIOTEKNOLOGI MODERN

Nama : RISYANTI

Nim : 4001414040

Rombel: 02 (BIOTEKNOLOGI)

Judul jurnal : Evaluation on a Streptococcus suis Vaccine Using Recombinant Sao-L

Protein Manufactured by Bioreactors as the Antigen in Pigs. Oleh K.-J. Hsueh et al,

Received for publication August 13, 2012. doi:10.1111/tbed.12067 .

Tujuan penelitian ini adalah untuk menghasilkan protein Sao-L (rsao L) dari strain

bakteri Streptococcus suis serotipe 2 dengan sistem ekspresi prokariotik pada bioreaktor

dan menggunakan rsao L sebagai antigen untuk vaksin bakteri Streptococcus suis pada

tikus dan babi.

Seperti yang kita tahu bahwa Streptococcus suis merupakan bakteri penyebab

arthritis, meningitis, septicaemia dan penyebab matinya babi secara tiba-tiba.

Streptococcus suis juga dikenal sebagai agen zoonis penting bagi manusia dan

diklasifikasikan menjadi 33 serotip berdasarkan struktur kapsul polisakaridanya.

Diantaranya adalah serotip 1, ½, 2, 7, 9, 14, dan 22 yang merupakan serotip paling

mematikan dibandingkan dengan serotip yang lain dan dapat di isolasi di berbagai negara

dan wilayah termasuk diantaranya adalah Amerika, Kanada, Eropa, Selandia Baru, dan

Taiwan. Di eropa, Streptococcus suis yang paling banyak diisolasi adalah tipe 2 dan 9. Di

Taiwan Lebih dari 80% babi positif mengandung bakteri Streptococcus suis dan sebagian

besar terinfeksi serotip 1 dan 2. Institut penelitian nasional dokter hewan di Pulawy

Polandia melaporkan bahwa Streptococcus suis serotipe 2 dapat diisolasi sedikitnya 45%

dari sampel paru-paru babi dan 80 % berasal dari kasus peternakan yang terinfeksi PRRS

(reproduksi babi dan syndrom pernapasan).

Banyak protein permukaan terlibat dalam patogenesis bakteri gram positif dan

telah terbukti menghasilkan respon imun yang kuat. Protein permukaan baru dari

Streptococcus suis, Sao (surface antigen one), yang merupakan strain yang sangat

dilindungi diantara strain Streptococcus suis yang telah diidentifikasi dan menjadi antigen

potensial untuk pengembangan vaksin yang efektif melawan Streptococcus suis. Sao

merupakan protein permukaan biasa yang mengandung MPR (muramidase-released

protein), sebuah membaran terminal-C dengan motif Leu-Pro-X-Thr-Gly (LPXTG), yang

memediasi banyak faktor virulensi selama masa infeksi. Sao protein dikode oleh 3 variasi

alel dari panjang gen yang berbeda, Sao-S (1,5 kb), Sao-M (1,7 kb), dan Sao-L (2,0 kb) dan

Sao-M adalah jenis yang paling umum. Pengebalan menggunakan protein Sao rekombinan

dapat memperoleh respon antibodi manusia yang kuat, menurunkan tanda-tanda klinis,

dan diseminasi bakteri, menaikkan tingkat kelangsungan hidup,memberi perlindungan

serotip silang pada tikus dan protokol vaksinasi babi, yang mengindikasikan bahwa rSao

merupakan antigen yang cocok untuk pengembangan vaksin sub unit Streptococcus suis.

Metode

Strain bakteri yang digunakan adalah bakteri Streptococcus suis BCRC yang

diperoleh dari Bioresource Collection and Research Center (BCRC) di Hsinchu, Taiwan,

yang diisolasi dari babi. Strain lainnya diperoleh dari Pingtung County Animal Disease

Control Center, di Pintung, Taiwan. Semua strain tumbuh pada suhu 37o di medium kaldu

daging dengan 0,5% ekstrak ragi. DNA bakteri yang diisolasi menggunakan darah dan

ekstrak jaringan genom DNA menggunakan kit sistem miniprep.

Amplifikasi PCR dan analisis sekuen gen Sao.

DNA dari Sao-L dan Sao-M telah diperkuat dengan 35 siklus yang terdiri dari denaturasi 1

menit pada suhu 94o C, 30 detik pendinginan pada suhu 56o C dan 2 menit pemanjangan

pada suhu 72o C. Pertama mengandung enzim restriksi yang dapat memotong DNA.

Produk PCR telah di dimurnikan dengan AxyPrep TM PCR kit pembersihan dan diklon ke

vektor ekspresi Pet32a berdasarkan pada intruksi pabrik. Nukleotida dan proteinnya telah

di bandingkan homologinya di GenBank menggunakan program BLAST.

Ekspresi Sao (rSao) rekombinan

Secara singkat, strain E. Coli BL21 menyimpan plasmid rekombinan yang telah di dikultur

di LB atau medium modifikasi pada suhu 37o C hingga absorbansinya mencapai 0,6 pada

panjang cahaya 600 nm. Kultur yang dihasilkan dan ultrafiltrasi dilakukan oleh Vivaspi

20 100 Kda MWCO. Konsentrasi kultur telah dianalisis dengan SPSS-PAGE dan diberikan

serum dari imun kelinci dengan rSao yang telah dimurnikan. Hasilnya negatif (tidak

menggumpal yang mengindikasikan konsentrasi endotoksinnya adakah < 0,125 IU/ml).

Konsentrasi dari protein Sao telah diperkirakan dengan membandingkan unit pengubah

komputerisasi dari BSA yang standarnya sama dengan SDS-PAGE. Setelah itu, rSao mentah

telah di nonaktifkan pada suhu 56o C selama 30menit, dan dikonfirmasi tidak adanya

bakteri dengan uji steril.

Persiapan vaksin.

Konsentrasi antigen rekombinan sebesar 55 μg/ml pada fasa cair dengan 25% air dalam

minyak di ajuvan air (w/o/w).

Hewan yang di pakai pada penelitian ini telah disetujui oleh NPUST manajemen kantor

laboratorium hewan. Penelitian ini menggunakan 2 hewan yakni Tikus dan Babi.

Keseluruhan tikus yang digunakan pada peneltian ini adalah 40 ekor dengan usia 3

minggu. Eksperimen ini diulangi sebanyak dua kali, dimana setiap eksperimen , 20 tikus

dibagi secara acak kedalam empat kelompok dan diimunisasi secara subkutan dengan

rSaO-L (n=5), rSao-M (n=5) atau vektor (n=5) dan dibesarkan dengan vaksin yang sama 2

minggu setelah imunisasi pertama. Sebelumnya telah diambil sampel darah (minggu ke 0)

dan minggu ke 2, dan minggu ke 4 setelah pemberian vaksin pertama kali untuk

menentukan titer antibodi menggunakan ELISA (enzim- esai imunosorben terkait).

Keseluruhan babi yang digunakan pada penelitian ini adalah 10 ekor dengan usia antara 3

sampai 4 minggu yang di bagi kedalam 2 kelompok (n=5). Satu diantaranya di imunisasi

secara intramuskular dengan vaksin rSao-L sebanyak 2 ml dan dibesarkan selama 2

minggu dan kelompok yang lain disuntik dengan garam steril sebagai kontrok yang tidak

divaksinasi. . Sebelumnya telah diambil sampel darah (minggu ke 0) dan minggu ke 2, 4

dan minggu ke 5 setelah pemberian vaksin pertama kali untuk menentukan titer antibodi

menggunakan ELISA (enzim- esai imunosorben terkait). Pemantauan anak babi dilakukan

setiap hari untuk mengetahui tanda-tanda klinis, suhu tubuh, dan berat badan serta

dimatikan selama 14 hari nekropsi. Pemeriksaan patologi ditunjukan dengan skor luka

yang dihitung berdasarkan luas area luka pada organ, dimana tanpa luka= 0, area luka

,33%=1, area luka,66%=5.

Analisis statistik

Semua data telah dianalisis dengan program statistik SAS.

Pembahasan

Setelah melewati identifikasi, kloning dan sekuensing gen bakteri Sao Streptococcus suis

diperoleh data yaitu ukuran DNA Sao-L (2013 bp), dan Sao-M (1743 bp). Selanjutnya Sao-

L dan Sao-M diklon kedalam plasmid Pet-32a(+) dan diekspresikan: ukuran DNA produk

telah terkonfirmasi setelah pemotongan oleh enzim restriksi bam HI/Hind III. Gen yang

telah di sekuensi dan dibandingkan terhadap sekuens dari AY864331 di GenBank

menggunakan BLAST. Pada Analisis dan ekspresi dari rSao, plasmid Pet-32a(+)

ditransformasikan kedalam E. Coli BL21 (DE3) untuk mengekspresikan rSao.

Imunogenitas dan ukuran dari rSao-L dan rSao-M dikonfirmasi lebih lanjut oleh anti

serum yang dikumpulkan dari imun kelinci yang telah dimurnikan. Pada Produksi rSao-L

menggunakan fermentor, Hasil dari tes LAL memastikan bahwa rSao mentah tidak ada

kontaminan endotoksin yang terdeteksi. Kemudian dilakukan Tes imunogenitas rSao pada

tikus dimana titer antibodi pada tikus yang diimunisasi dengan rSao L atau M secara

signifikan lebih tinggi daripada kelompok vektor dan kontrol pada minggu ke 4 setelah

imunisasi primer. Setelah di berikan bakteri Streptococcus suis, semua tikus pada

kelompok kontrol (p1) mati. Sebaliknya, 3 dari tikus terimunisasi rSao-L dan 4 dari tikus

yang terimunisasi rSao-M sehat. Selanjutnya imunisasi rSao-L pada babi menimbulkan

respon antibodi yang kuat. Titer antibody spesifik rSao-L dalam serum meningkat secara

significal pada babi berumur 2 minggu (minggu ke 4) dan 3 minggu (pada minggu ke 5)

setelah imunisasi pertama. Kemudian dilakukan penimbangan pada babi yang telah

diimunisasi dimana menunjukan peningkatan dari sebelumnya bila dibandingkan dengan

kelompok kontrol. Dilakukan Pengujian resistensi dengan cara pemberian bakteri strain

Streptococcus suis serotip 1 pada seluruh anak babi berumur 3 minggu setelah dilakukan

imunisasi pada minggu ke 5 dan suhu tubuhnya telah dicatat sebelumnya, hasilnya babi

kelompok kontrol bersuhu lebih tinggi dibandingkan kelompok babi yang telah divaksin.

Pengujian resisten pada kelompok kontrol menunjukan tanda-tanda klinis, termasuk

demam, aleksia,pembengkakan sendi dan sebaliknya pada babi kelompok vaksin.

Kesimpulan

Pemberian vaksin pada babi mengakibatkan babi resisten terhadap bakteri Streptococcus

suis.

Tinjauan dari segi bioetika terhadap produksi vaksin dari bakteri Streptococcus suis

untuk babi dan tikus.

Penelitian ini merupakan penelitian tentang evaluasi penggunaan vaksin yang

diproduksi dari rekombinan protein Sao-L pada babi. Babi merupakan hewan mamalia

yang juga diternakan dan dikonsumsi oleh sebagian orang, namun keadaan babi ditempat

peternakan yang tidak steril dapat mengakibatkan babi terkontaminasi berbagai macam

bakteri seperti bakteri Streptococcus suis yang dapat membahayakan kelangsungan hidup

babi, dimana bakteri tersebut dapat menimbulkan kematian mendadak dan berbahaya

apabila dikonsumsi oleh manusia. Keberadaan bakteri Streptococcus suis pada babi yang

dikonsumsi manusia akan menimbulkan berbagai penyakit seperti arthritis, meningitis,

septicaemia yang mengakibatkan tulang mengalami kelumpuhan. Penelitian ini bertujuan

untuk menguji vaksin dari protein rekombinan Sao-L terhadap infeksi bakteri

Streptococcus suis pada tubuh babi, sehingga diperoleh hasil yang menunjukan bahwa

vaksin Sao-L resisten terhadap bakteri Streptococcus suis. Penemuan ini sangat

bermanfaat karena dengan adanya vaksin ini dapat mengurangi timbulnya penyakit yang

disebabkan oleh bakteri Streptococcus suis pada babi yang ditularkan ke manusia.

Perkembangan bioteknologi modern semakin hari semakin maju, namun

keberadaannya tidak selamanya berdampak positif. Perkembangan bioteknologi yang

semakin pesat juga perlu memerhatikan dampak yang ditimbulkan atau sering disebut

dengan bioetika dalam bioteknologi. Penelitian ini menghasilkan dampak yang positif

dimana ditemukan vaksin yang akan melindungi babi dari bakteri Streptococcus suis yang

merugikan. Bioetika pada penelitian ini menguntungkan karena adanya keseimbangan

tata kehidupan manusia dengan kelangsungan fungsi lingkungan hidup, vaksin yang

dihasilkan dapat mengurangi berbagai macam penyakit yang ditularkan babi ke manusia.

Selain itu, hewan yang digunakan sebagai bahan percobaan pun tidak merugikan karena

menggunakan tikus dan babi yang jumlahnya tidak terlalu banyak, dan keberadaan tikus

yang umumnya tidak diinginkan oleh banyak orang sehingga penelitian ini memenuhi

landasan bioetika karena kebermanfaatannya bagi manusia.

Tidak adanya penyiksaan pada hewan yang dijadikan percobaan dan tidak adanya

kerugian yang ditimbulkan dari penggunaan bakteri menunjukan bahwa penelitian ini

memenuhi prinsip bioetika yang membawa kebermanfaatan bagi lingkungan dan

kelangsungan hidup manusia dan hewan.