amplifikasi isolat dna dengan polymerase chain reaction ruth
DESCRIPTION
biomedikTRANSCRIPT
Amplifikasi isolat DNA dengan Polymerase Chain Reactiona. Label tabung PCR sesuai dengan kode nomor sampel.b. Buat campuran Master Mix untuk reaksi PCR dengan total volume 25l Master Mix, 0,5l masing-masing forward dan reverse primer, dan dan 0,5l nuclease free water.c. Tambahkan 2l isolat DNA sampel pada campuran Master Mix dan masukkan kedalam mesin PCR (Thermal Cycler).d. Gen MMP-12 pada DNA sampel diamplifikasi dengan menggunakan mesin PCR (Thermal Cycler) dengan suhu denaturasi 950C selama 5 menit, diikuti 28 siklus denaturasi pada suhu 940C selama 45 detik, annealing pada suhu 530C selama 30 detik, dan elongasi pada suhu 720C selama 45 detik, dan tahap akhir pada suhu 720C selama 10 menit.e. Pada hasil elektroforesis pada pada agarose 2,5% akan terlihat fragmen DNA sebesar 137bp.Digesti amplifikat DNA dengan Enzim Restriksia. Label tabung Eppendorf 1,5ml sesuai kode nomor sampel.b. Buat campuran reaksi RFLP dengan total volume 25l untuk setiap sampel yang terdiri dari 20l PCR product, 0,5l (5 unit) enzim Taq DNA Polymerase sebanyak, 2,5l NE Buffer dan 0,5l nuclease free water.c. Inkubasi selama 10 menit pada suhu 720C didalam inkubator.d. Dilakukan digesti amplifikat dengan enzim restriksi Pvu IIe. Sampel dielektroforesis pada agarose 2,5% maka akan terlihat 1 band pada homozigot AA (137bp), 3 band pada heterozigot AG (137bp, 119bp, 18bp).Visualisasi Hail Restriksi dengan Elektroforesa Gel Agarosaa. Untuk membuat gel, timbang 2,5mg agarosa dalam 100ml buffer Tris EDTA 1x. Panaskan dan aduk diatas magnetic hot stirrer hingga larutan mendidih dan berwarna jernih.b. Matikan pemanasnya, dan ditambahkan ethidium bromide dan diaduk kembali.c. Cairan dituang ke casting tray dengan gel comb dan biarkan samapi mengeras.d. Setelah gel mengeras, cabut gel comb perlahan-lahan.e. Pipet 7l DNA Ladder, produk PCR dan produk RFLP ke dalam sumur-sumur gelf. Catat posisi sampel pada sumur-sumur gelg. Jalankan elektroforesis selama 90 menit dengan tegangan 70 volt.h. Pindahkan gel kedalam gel documentation untuk analisa dan dokumentasi hasil elektroforesis.