william ritchie, tagc inserm, marseille
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The ATD project is funded by the European Commission within its FP6 Programme, under the thematic area"Life sciences, genomics and biotechnology for health", contract number LHSG-CT-2003-503329
SIXTH FRAMEWORK PROGRAMMESIXTH FRAMEWORK PROGRAMME
William Ritchie, TAGC INSERM, Marseille
Differential repression of alternative transcripts: a screen for miRNAtargets
• Courts ARNnc (20-25 nt) qui servent de régulateurs post-transcriptionnels
•Issus de mRNAs de plus grande taille (60-90) : qui forment des tiges boucles: pre-miRNA
Differential repression of alternative transcripts: a screen for miRNAtargets
• Plant miRNA: clivage des mRNA
•Animal miRNAs: repression de la traduction
• Lim et al. (2005): dans le model animal les miRNAs peuvent abaisser le niveau des messagers
Mir-124 Mir-1
Differential repression of alternative transcripts: a screen for miRNAtargets
• Se fixent sur la région non traduite du 3’ (UTR)
• Comment sont affectés les niveaux d’expression si une forme est ciblée et une autre ne l’est pas ?
• Trouver des gènes qui possèdent au moins deux isoformes dont une (la plus longue) a une cible de miRNA (dans l’UTR 3’) et l’autre n’en a pas.
CDS
CDS
Differential repression of alternative transcripts: a screen for miRNAtargets
• la reconaissance de la cible par le miRNA implique souvent une courte séquence 6-8 nt hautement conservée apellé « seed »
HumanMouse
RatDog
Chicken
• En utilisant les données d’Ensembl un assemblage de 3495 UTRs conservés (human, mouse, dog, rat) est crée
• Recherche de toutes les sequences de 7nt sequences parfaitement conservés: cibles potentielles de miRNA
Differential repression of alternative transcripts: a screen for miRNAtargets
• En utilisant des comptages d’EST on compare le niveau d’expression des isoformes ciblées et des isoformes non ciblées
Non-targetedisoforms
targetedisoforms
% o
f to
tal E
ST
s
« Non-targeted »isoforms
« targeted » isoforms
Control
P=0.38 P=7e-5
• Les isoformes ciblées ont un niveau d’expression plus élevé !!!
Differential repression of alternative transcripts: a screen for miRNAtargets
a
Non Cardiovascular BrainNon BrainCardiovascular
MiR-124a MiR-1
nt t t ttnt nt nt
Rel
ativ
e is
ofor
m e
xpre
ssio
n (%
)
• Mais n’y a-t-il pas un effet tissu spécifique ?
•evoc ontology (v26)
lym-pho-reti-
brain res-pira-tory
uro-geni-tal
muscu-los-
Ali-men-tary
car-dio-vas-
En-do-crine
dermal
0
5
10
15
20
25
30
1/p.
valu
e
1925 35 42
29
26
10
<10 <10
MiR-124a
lym-pho-reti-
brain res-pira-tory
uro-geni-tal
muscu-los-
ali-men-tary
car-dio-vas-
en-do-crine
dermal
0
5
10
15
20
25
1/p.
valu
e
31
15
6184 39
43
16 <1011
MiR-1
Differential repression of alternative transcripts: a screen for miRNAtargets
Disrep
• 10 genes
• 3 types tissulaires differents
Cible potentiel de miRNA
Tous tissus Tissu 1 Tissu 2 Tissu 3
P>0.05 P>0.05 P<0.05
Differential repression of alternative transcripts: a screen for miRNAtargets
14640 distinct motifs(373,948 sites)
Motif present downtream of 1st polyA site + Differential Isoform Repression test (p<0.05)
9334 motifs
DISREP:312 motifs
7-mers in 10 mRNAs and 3 tissues
Four-way Conserved 7-mers in 3’ UTRs
6.4 e -31.2 e -41.0 e -8p-value enrichment
2829312After Disrep
44626093347-mers conserved in 4 species (>10 genes, >
3 tissues)
PUF protein fixation siteAREMiRNA
targets
Total motif
s
Differential repression of alternative transcripts: a screen for miRNAtargetsP
ropo
rtio
n of
targ
ets
for
Kno
wn
miR
NA
s in
mot
ifs
(%)
p-value for differential repression of targeted isoforms
0%
2%
4%
6%
8%
10%
12%
14%
16%
< 0.01 < 0.05 < 0.1 < 0.5
Disrep
Shuffle45
312
760
3810
29.6 2
61.2710.
1 3832.1
Differential repression of alternative transcripts: a screen for miRNAtargets
Trouver les 7-mers complementaires dans le genome
Extraire +/- 80 nt
Energie de repliement < -45Kcal
Four-way multi alignment + RNAZ p-value > 0.99 +
Criteres de structure et séquence
213 miRNA precursors (211 miRNAs)
Motif present downtream of 1st polyA site + Differential Isoform Repression test (p<0.05)
9334 motifs
DISREP:312 motifs
Hits de Megablast dans souris+rat+chien, avec la seed 100% conservée
Clustering des precurseurs chevauchants et elimination de ceux qui touchent au codant
456 miRNA precursors
7-mers dans 10 mRNAs et3 tissus
45 in miRNA registry
38 predicted by recent studies
128 novel precursors
Et les cibles qui ne correspondent pas a des precurseurs de miRNA
• Certaines cibles ne correspondent pas a des precurseurs potentiels
• Peut etre des sites de fixation d’un autre type d’ARNnc
• Longueur inconnue, structure inconnue
• Rechercher des motifs conservés et strusturéc
Et les cibles qui ne correspondent pas a des precurseurs de miRNA
● Alignements tout génome l'UCSC en utilisant des chaines de Markov et un filtre synthenie (homme,souris,chien,rat + zebrafish ou fugu) ● 5' UTR, 3' UTR, Intron, Intergenique
● Recherche de regions conservées
● Conservation d'une structure (RNAz p>0,9)
● Clustering hierarchique des differentes structures
● RNAforester
● Trop de branches tue la branche !!
● Trop de branches tue la branche !!
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