(sequencing based...

DNAタイピング結果解析

SBT(Sanger,NGS)法(Sequencing Based Typing)

HLA研究所⼩島 裕⼈

HP掲載⽤

NGS（Next Generation Sequencing） 2 施設Sanger法 6 施設

参加施設数

検査方法NGS

Sanger法

Sanger法

NGS検査対象領域

施設結果報告（Sanger法）

施設結果報告（Sanger法）

施設結果報告（NGS）

施設結果報告（NGS）

※ NGS は2施設、別法のため評価せず。

結果相違の原因（Sanger法）

1. Ambiguityの見落とし2. 塩基配列の挿入/欠失多型の判定3. Codon 86 のAmbiguity4. 表記ミス5. 第3区域のAmbiguity 判定ミス

1. 最新アリル抜け2. Forward, Reverse の片方で判定（領域の端）3. 新規アリル

【要改善】 → 必ず対策が必要

【要確認】 → できれば対策が必要

【その他】

1. 検査対象領域外のAmbiguity

【要改善】 1. Ambiguityの見落とし

A*24:03 抜け

A*24:03, A*24:07 抜け

【対策】 ダブルチェックなど

H2901： A座

区別できない

【要改善】 1. Ambiguityの見落とし

【対策】 ダブルチェックなど

H2903： C座

C*06:04 抜け

区別できない

【要改善】 2. 塩基配列の挿入/欠失多型の判定

2施設（29D24, 29D61）で、挿入/欠失多型を区別できていなかった。

例） H2901の場合： C座, DQB1座

C*12:84N ・・・ C*12:02に対して1塩基挿入DQB1*03:197Q ・・・ DQB1*03:01 に対して6塩基欠失

【要改善】 2. 塩基配列の挿入/欠失多型の判定

H2902, H2903, H2904 において区別できていない挿入/欠失多型は次のとおり。

H2902： A座, B座, C座, DQB1座

【要改善】 2. 塩基配列の挿入/欠失多型の判定

H2903： A座, B座

H2904： A座, DRB1座

これらの施設は、解析ソフト「uTYPE」であったが、同じく「uTYPE」を用いている他の2施設では、挿入/欠失多型を区別できていた。 → 設定の問題？

【対策】 2. 塩基配列の挿入/欠失多型の判定 （uTYPE）

0*が付いているときはその上でダブルクリックすると…

コメントがでてくる。確認後“はい”をクリックするとNull Alleleが候補から外れます。

【要改善】 3. Codon 86 のAmbiguity

H2901 DRB1座

2施設（29D24, 29D61）で、Codon 86 のAmbiguity を区別できていなかった。

区別できる

【要改善】 3. Codon 86 のAmbiguity H2904 DRB1座

Codon 86 primer を使用しているが、区別できていない。→ 解析ソフト設定の問題？

区別できる

【対策】 3. Codon 86 のAmbiguity （uTYPE）

ここを選ぶとCodon86を適応した解析結果が表れる

Codon 86 primer 使用の場合は、Filter ボタンを押すことで反映される。

Codon 86 プライマー： Codon 86 GTG相補的プライマー

H2902

GKK GGT

H2901

増幅しない。

Codon 67 Codon 86 Codon 86

【補足】 Codon 86 Ambiguity の重要性について

なぜ、Ambiguityが起きるのか？

→ 遺伝子が似ている組み合わせを区別できない。

Allele 1Allele 2

Allele 3Allele 4

多型部分の判定結果

（Allele1 とAllele3）、（Allele2 とAllele4）の配列が似ている。

同一抗原内アリル多型は、配列が類似している。

（日本人頻度0.1%以上のDR座アリルを対象）

1アミノ酸（1コドン）が異なる組み合わせ

日本人頻度0.1%以上では、codon 86 が異なる組み合わせのみが、複数（4種類）存在する。

Allele 1Allele 2

Allele 3Allele 4

多型部分の判定結果

Allele 1Allele 3

Allele 2Allele 4

1箇所のみが異なる組み合わせが、2種類以上

日本人頻度0.1%以上では、codon 86のみ

【参考】 なぜ、codon 86 のみが異なる多型が多いか。

＜HLA-ClassⅡ分子を上からみた図＞

86番アミノ酸抗原ペプチド

86番目のアミノ酸位置は、T細胞認識に重要な部分であると考えられている。

【要改善】 4. 表記ミス

H2901 B座

【要改善】 4. 表記ミス

H2902 DPB1座

H2904 DPB1座

【対策】 ダブルチェックなど

【要改善】 5. 第3区域のAmbiguity 判定ミス

H2901 DRB1座 （できれば区別）

H2903 DRB1座

区別できない！

【要確認】 1. 最新アリル抜け

例） H2901の場合： DRB1座

（IMGT登録）バージョン 3.27, 2017/01/20

【要確認】 1. 最新アリル抜け

H2902： A座, C座, DRB1座

H2902, H2903, H2904 における最新アリルは次のとおり。

【要確認】 1. 最新アリル抜け

H2903： A座, DRB1座, DQB1座

（H2904： なし）

【要確認】 2. Forward, Reverse の片方で判定（領域の端）

H2901 DRB1座

H2902 DRB1座

H2904 DRB1座

片方のプライマーからの情報では確定しない施設があった。

【要確認】 3. 新規アリル

H2904 DQB1座

Sanger法では確定することは困難。場合によっては、クローニングや他法（SSP法、NGS）によって確認する必要もある。

※undefined （29D61）DQB1*05:03/06:01 493(C>T), DQB1*05:09/06:56 MM0(exon3 未登録) 補足

補足 Exon 3 が未登録のアリル候補について（uTYPE）

H2904 DQ座Codon 133（変異部分）

Exon 3 未登録のアリルは、赤塗で表示され、候補に含まれる。

【その他】 1. 検査対象領域外のAmbiguity

H2902 DRB1座

H2903 DPB1座

検査対象領域によって、Ambiguity が異なっていた。

まとめ

NGSは、2施設でキットが異なり、施設間評価は

できなかった。

Sanger法は、各施設に技術的問題は考えられず、

判定時のミスに注意をする必要がある。他法よりも正確な

データが得られる一方で、多くの情報量を判断に用いるこ

とが多いため、ソフトウェアの使用方法やcodon 86 にみ

られるようなHLAの特徴を知っておくとよい。