profa. dra. ana elizabete silva departamento de biologia ibilce-unesp tecnologias de citogenÉtica...

Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia

IBILCE-UNESP

TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e

MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS

1956

Tijio e Levan

1960

Moorhead et al.

1970 1969

Gall e Pardue

cariótipo

culturas

bandeamento

ISH

1986

Pinkel et al.

1992

Kallioniemi et al.

1996

Schröck et al.

2002

Nakakuki et al.

...

FISH

CGH

SKY

aCGH

CITOGENÉTICA CLÁSSICA

CITOGENÉTICA MOLECULAR

CULTURA DE LINFÓCITOSMoorhead et al, 1960

1. Colheita de 5 ml de sangue e sedimentação2. Montagem da cultura:• meio de cultura (antibióticos) e soro fetal bovino

estímulo da divisão celular: fito-hemaglutinina (feijão Phaseolus vulgaris)cultivo em estufa a 37° C, por 72 horas

3. Bloqueio da divisão celular com colquicina: impede a formação do fuso mitótico acúmulo de metáfases

4. Colheita da cultura:• hipotonização: KCl 0,075M intumescimento das células e separação

das cromátides Fixação: metanol: ácido acético (3:1) preserva a estrutura dos cromossomos

www.geneticamedica.com.br/.../ citogenetica.htm

BANDEAMENTO CROMOSSÔMICO

Coloração usual com GiemsaBandeamento QBandeamento GBandeamento RBandeamento CColoração Ag-NOR

coloração uniforme dos cromossomos:identificação morfológica dos pares cromossômicos: 1, 2, 3, 16,

17, 18 e Y.

Classificação dos cromossomos em grupos: A - G

COLORAÇÃO USUAL

CLASSIFICAÇÃO DOS CROMOSSOMOS HUMANOS (GRUPOS A – G)

Grupo A (1-3): 3 pares de cromossomos gandesA1 e A3 metacêntricosA2 submetacêntricoGrupo B (4-5): 2 pares submetacêntricos grandesGrupo C (6-12+X): 7 pares submetacêntricos médio + XGrupo D (13-15): 3 pares acrocêntricos médio (satélite)Grupo E (16-18): 3 pares de cromossomos pequenos 16 metacêntrico 17 e 18 submetacêntricosGrupo F (19-20): 2 pares metacêntricos pequenosGrupo G (21-22+Y): 2 pares acrocêntricos pequenos (satélite) + Y

biocarampangue.tripod.com/ Segundo-medio.htm

46,XY

BANDA GTG: Seabright (1971)

Tratamento com tripsina e coloração com GiemsaBandas claras e escuras intercaladas (450 bandas)Bandas G+ricas em AT (pobre em genes)Bandas G-ricas em GC (rica em genes)Identificação de alterações estruturais e pareamento dos cromossomos

www.ucm.es/.../AVG/practicas/ cariotipo/carioP.htm http://www.scielosp.org/scielo.php?pid=S1413-81232002000300013&script=sci_arttext

Décadas 70-80: estudo citogenético identificação de cromossomos e regiões cromossômicas diferentes

alterações

•Perda: deleção monossomia

•Ganho: duplicação,

amplificação trissomia, poliploidia•Relocação:

translocação inversãoinserção

CULTURA CELULAR E BANDA G

500 bandas

Resolução:

~6milhões pb

~50genes/banda

>4 Mb

BANDA C (Sumner, 1972)

cora regiões centroméricas e heterocromatina constitutiva: constrições secundárias dos cromossomos 1, 9, 16 e Yq.tratamento em ácido (HCl) e alcali Ba(OH)2 regiões de heterocromatina constitutiva: coradas fortemente DNA da cromatina eucromatina é extraído (solubilizado).

BANDA C - POLIMORFISMOS CROMOSSÔMICOS

46,XY, inv(9q)

46,XY, 1qh+,inv(9q) 46,XX,1qh+

1

9

16

BANDA Ag-NOR – COLORAÇÃO POR

PRATA destaca as regiões do rDNA: RON constrições secundárias dos cromossomos com satélite (braços curtos dos acrocêntricos) (deposição de prata)o número de NORs/ metáfase: varia entre 5 a 10Impregnação pela prata nos cistrons ribossômicos ativos na intérfase anterior

COLORAÇÃO Ag-NORAssociação de satélites

ORDEM DAS ANOMALIAS CROMOSSÔMICASSISTEMA INTERNACIONAL DE NOMENCLATURA DOS

CROMOSSOMOS HUMANOS - 1995

Primeiro aberrações dos cr. Sexuais (X antes do Y)Aberrações dos autossomos em ordem numérica, independente do tipo de aberraçãoAberrações numéricas listadas antes das estruturaisVárias alterações estruturais em ordem alfabéticaExemplos:47,Y,t(X;13)(q27;q12),inv(10)(p13q22), +2148,X,t(Y;12)(q11;p12),del(6)(q11),+8,t(9;22)(q34;q11),+1,7,-21,+2250,XX,+1,+del(1)(p13),+dup(1)(q21q32),+inv(1)(p31q41),+8,+r(10)(p12q25),-21

CARIÓTIPO COMPOSTO42,XX,-7,-8,+13,-20,-21,-22

43,XX,-6,-11,-21

43,XX,-14,-18,-22

43,XX, ins(4;2)(q31;q24q32),-18,-20,-20

45,XX,-7

45,XX,-16

45,XX, ins(4;2)(q31;q24q32),-8

46,XX [4]

46,XX, ins(4;2)(q31;q24q32) [7]

46,XX, -X, ins(4;2)(q31;q24q32),+5

46,XX, ins(4;2)(q31;q24q32),+5,-8

Cariótipo composto:42~46,XX,-X,ins(4;2)(q31;q24q32),+5,-6,-7,-8,-11,+13,-14,-16,-18,-20,-21,-22[cp20]

ALTERAÇÕES CLONAIS

Clone: população de células derivada de um único progenitor.

Alteração clonal: quando um número de células têm o mesmo ou proximamente relacionado complemento cromossômico anormal.

Ter pelo menos 2 células com a mesma aberração:ganho cromossômico (trissomia) ou rearranjo estrutural

Ter pelo menos 3 células com perda cromossômica (monossomia)

ALTERAÇÕES CLONAIS42,XX,-7,-8,+13,-20,-21,-22

43,XX,-6,-11,-21

43,XX,-14,-18,-22

43,XX, ins(4;2)(q31;q24q32),-18,-20,-20

45,XX,-7

45,XX,-16

45,XX, ins(4;2)(q31;q24q32),-8

46,XX [4]

46,XX, ins(4;2)(q31;q24q32) [7]

46,XX, -X, ins(4;2)(q31;q24q32),+5

46,XX, ins(4;2)(q31;q24q32),+5,-8

Numéricas: +5[2], -8[3]

Estrutural: ins(4;2)(q31;q24q32)[11]

Cariótipo composto:42~46,XX,-X,ins(4;2)(q31;q24q32),+5,-6,-7,-8,-11,+13,-14,-16,-18,-20,-21,-22[cp20]

TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA MOLECULAR

FISH: Hibridação in situ fluorescente (aneuploidias, rearranjos, amplificação)SKY: Cariotipagem espectral (alterações estruturais - translocações)M-BAND: Bandeamento colorido (inversão, deleção/duplicação) CGH: Hibridação Genômica Comparativa (perdas ou ganhos cromossômicos)Array-CGH: maior resolução (desbalanços genômicos)

HIBRIDAÇÃO IN SITU FLUORESCENTE

FISH

Pinkel et al. (1986)

HIBRIDAÇÃO IN SITU FLUORESCENTE

FISH: técnica de mapeamento físico de DNA em que uma sonda de DNA marcada com fluorocromo é hibridizada ao cromossomo ou núcleo interfásico e visualizado em microscópio de fluorescência

Resolução: ~0,3 Kb (300 pb)

FISH - Fluorescent “in situ” hybridization

FISH - Hibridização Fluorescente “in situ”

Blue Acqua Green Yellow Orange Red

Cláudio C. SilvaUCG/LaGeneDNA Alvo: cromossomo ou região cromossômica

Sonda: segmento de DNA específico

ETAPASPreparação da lâmina (DNA alvo)

Denaturação: DNA alvo e sonda formamida a 70oC ou estufa To de ~80oC

Hibridização sonda/DNA (estufa a 37oC – câmara úmida - overnight)

Lavagem pós-hibridização: tampão 2xSSC (citrato de sódio)

Detecção da sonda e contracoloração: iodeto de propídeo (PI) ou DAPI

Fluorocromos: SondasFITC-fluoresceína (verde)Espectrum green ( verde)Rodamina (vermelho)Texas red (vermelho)

• Método para obtenção de núcleosinterfásicos a partir de tecido fresco

Desagregação dosnúcleos

Fixação dos núcleos

ETAPAS

Material:

-núcleos interfásicos: tecido fresco, congelado, cortes histológicos, esfregaços

-cromossomos metafásicos: cultura celular

4. Hibridação in situ Fluorescente - FISH

Pré-tratamento Aplicação da sonda(Ácido acético, RNase, pepsinaDesidratação Etanol)

ETAPAS

Co-denaturação Lavagem pós-hibridação

Contra-coloração Análise ao microscópio

Hibridização

(câmera úmida à 37oc)

ETAPAS

Tempo de vida limitado das lâminas:perda da fluorescência

http://www.fisiologia.kit.net/main/anime.htm -ANIMAÇÃO

TIPOS DE SONDASSondas que hibridizam estruturas cromossômicas específicas:-sonda alfa-satélite (centromérica)-sonda beta-satélite (satélite dos acrocêntricos D e G)-sonda satélite clássica (heterocromatina 1, 9, 16 e Y)-sonda telomérica (telômeros)Sondas de cópia única ou locus específicaSondas de cromossomo inteiro (WCP)

SONDAS CENTROMÉRICAS

Enumeração dos cromossomos e aneuploidias

APLICAÇÃO:

aneuploidias em núcleos interfásicos

Carcinoma de esôfago: tetrassomia 11 (verde)

gastrite:+7 gastrite: -7

úlcera: +8

SONDAS CENTROMÉRICAS

SONDAS TELOMÉRICAS

Aplicação:

-Deleções terminais

-perdas teloméricas

SONDAS TELOMÉRICAS

(cromossomo 5)

SONDAS LOCUS ESPECÍFICA

del (22q11.2)

Diagnóstico de doenças com microdeleção

Mucosa normal:

TP53 (vermelho)

17 (verde)

Adenocarcinoma gástrico:

Deleção TP53

1 sinal vermelho

Deleção do gene TP53 em câncer gástrico

SONDAS LOCUS ESPECÍFICA

SONDAS WCP – Cromossomo Total

http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1516-84842005000100018

A- Criança com anomalias congênitas: sonda do cromossomo 4; material extra, braço curto de um dos cromossomos 4 (seta), B-  Metáfase da mesma criança: sonda do cromossomo 9. Dois cromossomos 9 normais; a parte extra do cromossomo 4 identificada como tendo origem no cromossomo 9 (seta).

SONDAS WCP – Cromossomo Total

APLICAÇÕES DA TÉCNICA FISH

Mapeamento de genes e sequências gênicas

Estrutura e organização dos cromossomos

Identificação de rearranjos cromossômicos/ pequenas deleções

Monitoramento de indivíduos/populações expostas à mutagênicos

Identificação de alterações cromossômicas em esperma

Diagnóstico Pré-Natal e Pré-Implantação

Diagnóstico de neoplasias

Monitoramento de pacientes leucêmicos/transplante de medula óssea (doador de sexo oposto)

MICRODISSECÇÃO

http://www.accessexcellence.org/RC/VL/GG/microDissection.php

DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL E PRÉ-IMPLANTAÇÃO

APLICAÇÕES DA TÉCNICA FISH

DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL: FISH

Trissomias 13, 18 e 21 e monossomia X: aneuploidias mais comuns relacionadas com idade materna avançada e malformações fetais Citogenética convencional: diagnóstico em 8-15 diasFISH: resultado rápido (2-3 dias) em células do líquido amniótico não cultivadas

DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL: FISH

Trissomia do 21 Triplo X

DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL: FISH

Normal

DIAGNÓSTICO GENÉTICO PRÉ-IMPLANTAÇÃO

3 sinais verde: blastômero com trissomia do 21

DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIAS

AMPLIFICAÇÃO GÊNICA

CCND1, c-MYC, HER2/Neu

TRANSLOCAÇÕES

t(9,22); t(8;14)

DELEÇÕES

TP53 (17p13), RB (13q13)

DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIASAmplificação Gênica

(C-D) Amplificação Her-2 ( vermelho) – câncer de esôfago e gástrico

(E-F) Polissomia 17 (verde) gene Her-2 (vermelho)

DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIASAmplificação Gênica

DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIAS TRANSLOCAÇÃO

DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIAS TRANSLOCAÇÃO

CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY

CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKYSchrock et al., Science 273:494-497, 1996

Identificação precisa e simultânea de todos os cromossomos humanos: diferentes cores

Princípio: medição simultânea de todos os pontos do espectro emitidos pela amostra na faixa espectral visível e próxima a infra-vermelha: uso de múltiplas sondas sobrepondo-se espectralmente

Sondas: com 5 diferentes fluorocromos : Cy2, Spectrum green, Cy3, Texas red e Cy5 e suas combinações

Sondas dos 24 cromossomos humanos marcadas com 5 fluorocromos em combinação resultando em uma cor diferente para cada cromossomo.

CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY

Cor capturadaClassificação das cores pseudo-coloridas

CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY

CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY

Cariótipo normal

Cromossomos marcadores

Limitação:

-Cultivo celular – metáfases

-Não detecta deleções/duplicações e inversão

Evolução cariotípica: células de gibão hibridizadas com sondas humanas várias homologias cromossômicas

CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY

BANDAMENTO COLORIDOCROSS-SPECIES COLOR

BANDING

Permite a coloração sub-regional dos cromossomos para análise do cariótipo humano

Sondas: derivadas de primatas (gibão) do genêro Hylobates concolor e Hylobates syndactilus: cariótipos com extensa reorganização cromossômica quando comparado ao homem

Identificação de rearranjos cromossômicos: inversões, deleções, duplicações, inserções, translocações

BANDAMENTO COLORIDO

mBAND do cromossomo 5:

25 bandas coloridas: corresponde a uma resolução de 550 bandas (complemento haplóide)

BANDAMENTO COLORIDO

Cromossomo 5 humano mostrando a imagem direta (a) e a imagem re-processada (b). Qualquer alteração pode ser detectada por este sistema. 

BANDAMENTO COLORIDO

HIBRIDAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA - CGH

Método para detectar simultaneamente ganhos e perdas de regiões genômicas sem precisar de células em divisãoExtração do DNA: células teste (tumor) e referência (normal)DNA digerido com enzimas de restrição e marcados com fluorocromos diferentes (vermelho e verde)Hibridação simultânea com ambos DNA (teste e referência) sobre lâmina com cromossomos metafásicos normaisComparação intensidade relativa dos dois fluorocromos ao longo do comprimento de cada cromossomo

HIBRIDAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA - CGH

HIBRIDAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA - CGH

http://www.empiregenomics.com/site/technology_overview.php

HIBRIDAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA - CGH

Amplificação/ganho: excesso do DNA teste (verde)

Deleção/perda: excesso do DNA normal (vermelho)

HIBRIDAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA - CGH

http://www.sanger.ac.uk/HGP/Cytogenetics/

Hibridização Genômica Comparativa (CGH) em Hibridização Genômica Comparativa (CGH) em câncer gástrico câncer gástrico (Guan et al., 2000)(Guan et al., 2000)

Resolução: 0,5 Mb

array - CGH

-cromossomos metafásicos substituídos por sondas de DNA ou oligonucleotídeos chips DNA

Análise dos sinais fluorescentes: analisador de imagem, scanner confocal ou câmera CCD

http://www.dkfz.de/en/genetics/pages/projects/array_cgh.html

array - CGH

array - CGH

AVANÇOS TECNOLÓGICOS

1o. Microscópio -Leeuwenhoek

AVANÇOS TECNOLÓGICOS

http://www.empiregenomics.com/site/technology_overview.php

Array-CGH continua transformando a Citogenética:

-fornecendo alta-resolução

-tecnologia avançada para mapeamento preciso e detecção de aberrações cromossômicas.