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APLICACIONES BIOLÓGICAS DE LA

ESPECTROSCOPIA VIBRACIONAL

P. Carmona

Instituto de Estructura de la Materia (CSIC)

Aplicaciones Biológicas de la Espectroscopía Vibracional

Estudios

estructurales Aplicaciones

bioanalíticas

Componentes de alimentos

reestructurados (proteínas,

lípidos, agua).

Biodiagnóstico

P. Carmona (IEM)

A. Herrero (ICTAN)

I. Sánchez-Alonso (ICTAN)

P. Carmona (IEM)

E. López-Tobar (IEM)

M. Molina (UCM)

A. Toledano (IC)

M. Calero (ISCIII)

P. Martínez (Fundación CIEN)

Biocross S.L.

GRUPO DE BIOESPECTROSCOPIA

ESPECTROSCOPIA INFRARROJA Y RAMAN

Interacción radiación electromagnética-vibraciones moleculares

Grupos funcionales Estructura espacial

Análisis Químico

Tensión simétrica

2850 cm-1

Tensión asimétrica

2920 cm-1

Scissoring o tijera

1450 cm-1

Rocking o balanceo

725 cm-1

Wagging o aleteo

1300 cm-1

Twisting o torsión

1350-1180 cm-1

1800 1600 1400 1200 1000 800 600 4000,00

0,05

0,10

0,15

Re

lati

ve

in

ten

sit

y

cm-1

16

71

14

42

12

35

10

03

40

983

1

Ab1-40 amyloid peptide

A-DNA B-DNA

820-800 cm-1 850-825 cm-1

1600 1400 1200 1000 800 600

14

82

Ram

an

In

ten

sit

y/A

rbit

r. U

nit

s

Wavenumber/cm-1

17

05

15

99

15

75

15

30

13

17

12

50

13

68

14

16

10

98

10

43

98

3 92

1

86

78

12

78

3

72

4

66

86

29

1615-1640 cm-1

1650-1658 cm-1

Y = a + b1X1 + b2X2 +...+ bpXp

Yi, Xi = espectros de proteínas

ESTRUCTURA SECUNDARIA DE PROTEINAS

Regresión por Mínimos Cuadrados Parciales

(a) Synchronous and (b)

asynchronous 2D correlation

spectra constructed from

dynamic spectra.

Raman spectra of blood plasma from healthy controls (), patients with

moderate AD (- - -), Ab1-40 (- -) and Ab1-42 ( ) peptides

D = x1V1 + x2V2 + …..xnVn + a

D

AUC = 0,914

Curva ROC para la suma de marcadores Raman en las regiones

Amida I (1700-1600 cm-1) y 500-400 cm-1

6 5

10

Membrane

Cell front plate

Syringe pump

6 5

10

Membrane

Cell front plate

Syringe pump

CINETICAS DE INTERCAMBIO H/D MEDIBLES POR

ESPECTROSCOPIA IR-RAMAN

(k 2.5 min-1)

Proteínas Acidos Nucleicos

´ lámina-b doble hélice A, B (pares GC)

-hélice estructura Z (pares GC, AT, AU)

est. cuat. (lámina-b, -hélice, desordenada) est. cuat. (pares GC, AT, AU)

VENTAJAS DE LA ESPECTROSCOPIA OPTICA DE

CORRELACION 2D

• Resolución de bandas solapadas.

• Asignación de modos vibracionales mediante correlación de

bandas.

• Secuenciación temporal de cambios espectrales.

• Detectar interacciones moleculares a través de grupos que

generan bandas correlacionadas.

1750 1660 1570 1480 1750

1660

1570

1480

A

cm

-1

Espectros síncronos de la proteína P22

Hepatitis C virus

5

10

15

20

25

700750800850900950

Wavenumber/cm-1

Tim

e/m

in

Microscopio Raman Renishaw

-15 -10 -5 0 5 10 15

-40

-35

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

5

10

15

20

25

30

Fa

cto

r 2

: 2

6.5

6 %

Factor 1: 54.66 %

NC

SINF

A Factor 1 versus Factor 2 plot (score plot) of principal component

analysis from 16 healthy control and 29 scrapie-infected samples (NC

and SINF groups, respectively). (Carmona et al., J. Gen. Virol., 2005).

Structure of protein

Helix

b Sheet

b Turn

Other

Amino acid

The steric structure of the protein is

formed by interaction of amino acids.

Therefore, the steric structure depends

on the sequence of amino acids.

The structure of the protein is

classified into 4 structures as follows:

1. Primary

2. Secondary

3. Tertiary

4. Quaternary

Typical protein (lysozyme)

Quantitative analysis using UV/Vis spectrometer

0

5

200 400 250 300 350

Abs

Wavelength[nm]

Almost all proteins have a peak at 280 n, therefore,

quantitative analysis of protein can be performed

with a UV/Vis spectrometer. An alternative

quantitative analysis method is colorimetry using

reagent (such as the Lowry method , Biuret method,

etc.)

Concentration [%, M etc.] Concentration [%, M etc.]

Ab

s

Ab

s Calibration curve Quantitative analysis First of all, spectra of

each protein

concentration are

measured to produce

a calibration curve.

Next, unknown

samples are measured

and quantitative

analysis is performed

using the calibration

curve.

Benzene ring

(280 nm)

IR spectrum of typical protein

Amid I peak contains the

secondary structure

information (α-Helix, β-

Sheet etc.)

Using this peak, the IR-SSE

program calculates SSE by

PCR ( Principal

Component Regression) or

PLS (Partial Least Square)

method.

1700 1680 1660 1640 1620 1600

-1,2

-1,0

-0,8

-0,6

-0,4

-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

Pri

nc

ipa

l C

om

po

ne

nt

1, L

oa

din

gs

cm-1

16

321

68

6

16

54

Loadings plot of Factor 1 (Principal Component 1) for the

score plot in the previous Figure.

0

5

10

15

20

25

30

35

Controls Infected

b-S

hee

t S

tru

ctu

re (

%)

Bar diagram for the means of ß-sheet percentages measured for

healthy control and scrapie-affected samples from genetically selected

animals. (Carmona et al., Chemistry and Biology, 2004).

VIBRACIONES MOLECULARES

Espectroscopia Infrarroja Espectroscopia Raman

Absorción de radiación infrarroja Difusión inelástica de radiación

APLICACIONES

Estructura de la materia a nivel molecular (moléculas orgánicas, inorgánicas y

cristales)

Análisis químico (determinación de compuestos inorgánicos, orgánicos y biológicos) en estado sólido, líquido o gaseoso.

Teoría de grupos

ESTRUCTURA

Cálclulos de frecuencias de vibración