polymerase chain reaction (pcr)- רקע היסטורי : שיטה שפותחה ב -1983 ע " י...

Polymerase Chain Reaction (PCR):רקע היסטורי -

ע"י קארי מוליסת מאפשרת אמפליפיקציה של מליוני 1983 שיטה שפותחה ב- כל עוד ידועים רצפים המקיפים אותו.DNAעותקים של

התוצאות מתקבלות תוך מספר שעות בלבד

בהתחלה בוצע ידנית. כיום- יש מכשירים המבצעים את הריאקציה.

: פרס נובל לכימיה1993

::PCRPCRמרכיבי ריאקציית ה-מרכיבי ריאקציית ה-

( נוקליאוטידים( נוקליאוטידיםdNTP’sdNTP’s -) -)A T G CA T G C)תחלים )פריימרים(תחלים )פריימרים בופר המכיל יוני בופר המכיל יוניMgMg+2+2

אנזים אנזיםTaq PolymeraseTaq Polymerase( תבנית( תבניתTemplateTemplate))

Hot water bacteria: Thermus aquaticusTaq DNA polymerase

Life at High Temperaturesby Thomas D. BrockBiotechnology in Yellowstone© 1994 Yellowstone Association for Natural Sciencehttp://www.bact.wisc.edu/Bact303/b27

Melting

94 oC

Tem

pera

ture

100

0

50

T i m e

5’3’

3’5’

Melting

94 oC

Tem

pera

ture

100

0

50

T i m e

3’5’

5’3’

Heat

Melting

94 oCAnnealing

Primers50 oC

Extension72 oC

Tem

pera

ture

100

0

50

T i m e

3’5’

5’3’5’

5’

Melting94 oC

Melting

94 oCMelting

94 oCAnnealing

Primers50 oC

Extension72 oC

Tem

pera

ture

100

0

50

T i m e

30x

3’5’

5’3’

Heat

Heat

5’

5’

5’

Melting

94 oCMelting

94 oCAnnealing

Primers50 oC

Extension72 oC

Tem

pera

ture

100

0

50

T i m e

30x

3’5’

5’3’5’

5’

5’

5’

5’

5’

Melting

94 oCMelting

94 oCAnnealing

Primers50 oC

Extension72 oC

Tem

pera

ture

100

0

50

T i m e

30x

3’5’

5’3’ 5’

5’5’

5’

5’

5’

Heat

Heat

Melting

94 oCMelting

94 oCAnnealing

Primers50 oC

Extension72 oC

Tem

pera

ture

100

0

50

T i m e

30x

3’5’

5’3’ 5’

5’5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

Fragments of defined length

Melting

94 oCMelting

94 oCAnnealing

Primers50 oC

Extension72 oC

Tem

pera

ture

100

0

50

T i m e

30x

3’5’

5’3’ 5’

5’5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

:PCRמחזור ה-

Step 1 7 min at 94˚C Initial Denature

Step 2 45 cycles of:

20 sec at 94˚C Denature20 sec at 52˚C Anneal1 min at 72˚C Extension

Step 3 7 min at 72˚C Final Extension

Step 4 Infinite hold at 4˚C Storage

Melting

94 oC

Melting

94 oC

AnnealingPrimers

50 oC

Extension

72 oC

X30

DNA Between The Primers DNA Between The Primers Doubles With Each Thermal Doubles With Each Thermal

CycleCycle

0Cycles

Number1

3

8

2

4

1

2

4

16

5

32

6

64

More Cycles = More More Cycles = More DNADNANumber of cycles

0 10 15 20 25 30Size

Marker

Theoretical Yield Of PCRTheoretical Yield Of PCRTheoretical yield = 2n x y

Where y = the starting number of copies and

n = the number of thermal cycles

= 107,374,182,400

If you start with 100 copies, how many copies are made in 30 cycles?

2n x y

= 230 x 100

= 1,073,741,824 x 100

::PCRPCRשימוש ב-שימוש ב-

קריאת רצף התוצריםקריאת רצף התוצריםזיהוי מחלות גנטיותזיהוי מחלות גנטיותאיבחון איפקציות ויראליות/חיידקיותאיבחון איפקציות ויראליות/חיידקיותקביעת מין העוברקביעת מין העוברמוטגנזה מכוונתמוטגנזה מכוונת

ריצוף דנ"א

קביעת רצף הנוקליאוטידים של מקטע דנ"א מסויים

.70השיטה המקובלת כיום- פותחה ע"י פרדריק סנגר בשנות ה-

1980: Walter Gilbert (Biol. Labs) & Frederick Sanger (MRC Labs)

Dideoxy DNA sequencing-How it works:

מעמידים ארבע ריאקציות שונות. בכל ריאקציה:

DNA templatePrimer annealed to template DNAרק פריימר אחד!!! :DNA polymerasedNTPS (dATP, dTTP, dCTP, and dGTP)

ddNTP: ddATP/ ddTTP/ ddCTP/ ddGTP אך בריאקציית הריצוף- מוסיפים גם הנוקליאוטידים הללו מסומנים

מריכוז שאר הנוקליאוטידים.1/100ריכוזם-

לא יכול להיווצר קשר פוספודיאסטרי- וההלונגציה – H’-3 יש לו OH’-3? במקום ddNTPלמה של השרשרת לא יכולה להמשיך.

מהלך הריאקציה: מהלך הריאקציה: PCRPCRזהה לריאקציית זהה לריאקציית

-דנטורציה של מקטע ה-דנטורציה של מקטע הDNADNAאותו אנו מרצפים אותו אנו מרצפים

AnnealingAnnealing-של הפריימר ל- של הפריימר ל TemplateTemplate

ExtentionExtention הארכת השרשרת היא לכיוון אחד בלבד בגלל ששמנו - הארכת השרשרת היא לכיוון אחד בלבד בגלל ששמנו -רק פריימר אחדרק פריימר אחד

מתי ההארכה מסתיימת??? מתי ההארכה מסתיימת???

מעלות מעלות9494 -כאשר מעלים את הטמפרטורה ל- -כאשר מעלים את הטמפרטורה ל- ddNTPddNTP - כאשר נכנס נוקליאוטיד - כאשר נכנס נוקליאוטיד

הרצה על ג'ל מיוחד )אקרילאמיד( הרצה על ג'ל מיוחד )אקרילאמיד(אנליזה של התוצאות:אנליזה של התוצאות:

מה מתקבל בריאקציה?

מסומן ddNTP ריאקציות- בכל אחת 4העמדנו אחר

מתקבלים תוצרים באורכים שונים- המסתיימים במקומות שבהם ישנו נוקליאוטיד

מסומן

תוצרים ארוכים

תוצרים קצרים

Radio-labeled ddNTPs (4 rxns)

קריאת הרצף(5 ’to 3)’

GGATATAACCCCTGT

כיום- הריצוף אוטומטי ומשתמש בסימון פלורסנטי במקום רדיואקטיבי

ריצוף רדיואקטיבי: דורש הרבה זמן ושימוש בחומר רדיואקטיבי

היום הוחלף בשימוש בסימון פלורסנטי- כל נוקליאטיד מסומן בצבע אחר. ארבעת הריאקציות אוחדו לריאקצייה אחת.

ההרצה- בג'ל קפילרי מיוחדכל נוקליאוטיד מסומן- נותן פיק של צבע שנקרא ע"י המכשיר