modifications chimiques et semisynthèses des protéines 2 ......développement de la ligation des...

Modifications chimiques et semi­synthèses des protéines 

● 2 Cours– Mercredi 15 septembre (10H­12H)

● I­Introduction● II­ Mutagenèse à suppression de non­sens● III­ « Click chemistry »● IV­  Ligation des Protéines Exprimées

– Historique 

– Vendredi 17 septembre (10H­12H)● IV­ Ligation Native des protéines 2

– Intéines● V­ Applications

I­Introduction

● Génome humain : 30­40000 gènes– 70 à 90 % contiennent 1 ou plusieurs exons

– Epissage alternatif des pre­ mARNs

● Protéome : – Modifications post­traductionnelles

● ex:  Phosphorylation : 1/3 des protéines des mammifères

Nbre astronomique de combinaisons de protéines

Modifications chimiques et semi­synthèses des protéines 

I­Introduction

● Protéome : Inventaire des modifications post­traductionnelles ?– Contexte des relations structure­fonctions

● Tissu● Type cellulaire● Temps 

– minute : transduction du signal– années : développement

=> 10aines­100aines de milliers de type protéiques● Dans notre corps● Au cours d'une vie

Comprendre ces modifications : échelle Protéomique ?

● Très long terme

● But (influence sur les fonctions) très stimulant – Essor de nouvelles technologies

– En provenance des domaines d'investigation les plus dynamique

● Protéomique● Bioinformatique● Génomique structurale● Et Chimie Biologique

=> Champs d'action largement multidisciplinaires

I­Introduction

La chimie et l'étude des processus biologiques

● Compréhension des fonctions propres (Biochimie)– Ex : catalyse enzymatique

● Maîtrise des fonctions pour des application non­biologiques (Chimie­Biologique ­> Chemical Biology)– Ex : réactions de catalyse non physiologique

I­Introduction

Synthèse des protéines : voies de préparation  Ribosomal

● Protéine avec résidus non naturels ou modifiés ?

● Protéine avec modification post­traductionnelle ?

 ... Purification à homogénéité très difficile– Ex PDB : 20000 structures / 150 avec 1 phosphorylation

– Moins encore avec lipidation/glycosylation

=> Synthèse chimique ?– Marquage

– Synthèse totale (taille limitée 100 aA)

I­Introduction

Besoins de protéines spécifiquement marquées ? 

● Utilisation de méthode d'ingénierie des protéines– Mutagenèse à suppression de non sens / frame shift

– Ligation des Proteines Exprimées (EPL)

=>

– Élimination de la plupart des difficultés propres au marquage

– Interdisciplinarité Chimie­Biologie

Combinaison de la puissance de la synthèse organique et des technologies de l'ADN recombinant

I­Introduction

Modifications chimiques et semi­synthèses des protéines 

● Plan– I­ Introduction

– II­ Mutagenèse à suppression de non­sens

– III­ « Click chemistry »

– IV­ Ligation des Protéines Exprimées

– V­ Applications

Non­sens suppression mutagenesis

● Incorporation de l'Aa non naturel en utilisant le codon ambre– Présence d'un tRNA 

« suppresseur » charger synthétiquement par l'Aa non naturel

– Le gène mutant est ajouté dans un système d'expression in vitro (extrait ribosomaux – purification ou kit commerciaux)

II­ Mutagenèse à suppression de non sens

➔ 1 ­ Synthèse in vitro de la protéine modifiée

Non­sens supression mutagenesis● Incorporation de l'Aa non naturel en utilisant le codon 

ambre :– Micro injection du tRNA dans un oocyte de Xenopus 

II­ Mutagenèse à suppression de non sens

2­ Synthèse in vivo de la protéine modifiée

Non­sens suppression mutagenesis● Incorporation de l'Aa non naturel en utilisant le codon 

ambre (UAG) – Présence d'un tRNA « suppresseur » charger synthétiquement 

par l'Aa non naturel

– Le gène mutant est ajouté dans un système d'expression in vitro

II­ Mutagenèse à suppression de non sens

Améliorations

Non­sens suppression mutagenesis● Codon frameshift (codons à 4 bases)

– Présence d'un tRNA « suppresseur » charger synthétiquement par l'Aa non naturel

II­ Mutagenèse à suppression de non sens

Non­sens supression mutagenesis● Incorporation de l'Aa non naturel en utilisant le codon 

ambre :– Micro injection du tRNA dans un oocyte de Xenopus

● ex : 

II­ Mutagenèse à suppression de non sens

Synthèse in vivo de la protéine modifiée

Non­sens suppression mutagenesis

● Difficultés– Préparation (chimie )

– Adressage du tRNA préchargé

● Solution :  E. coli modifiée– Système de traduction natif

● Génération d'un tRNACUA

 efficace chez coli 

Science. 2001 Apr 20;292(5516):498­500.

II­ Mutagenèse à suppression de non sens

Non­sens suppression mutagenesis

● Solution :  E. coli modifiée– Système de traduction natif

– Stratégies d'évolution dirigée : 

● génération d'un nouveau tRNACUA

II­ Mutagenèse à suppression de non sens

Non­sens suppression mutagenesis

● Solution :  E. coli modifiée– Système de traduction natif

– Stratégies d'évolution dirigée : 

● génération d'un nouveau tRNACUA

II­ Mutagenèse à suppression de non sens

N'est reconnu que par la tRNA Aa synthase de M. jannaschii : Ne peut­être chargé que par une Tyr

Non­sens suppression mutagenesis

● Solution :  E. coli modifiée– Système de traduction natif

– Capable de prendre en charge l'acétylation des tRNA par des Aa non naturels

– Stratégies d'évolution dirigée : ● génération d'un nouveau t­RNA● permettre le chargement d'autres résidus

II­ Mutagenèse à suppression de non sens

Non­sens suppression mutagenesis● Solution :  E. coli modifiée

● permettre le chargement d'autres résidus

II­ Mutagenèse à suppression de non sens

Non­sens suppression mutagenesis

● Solution :  E. coli modifiée● permettre le chargement d'autres résidus

II­ Mutagenèse à suppression de non sens

Non­sens suppression mutagenesisII­ Mutagenèse à suppression de non sens

Non­sens suppression mutagenesisII­ Mutagenèse à suppression de non sens

Non­sens suppression mutagenesisII­ Mutagenèse à suppression de non sens

Enzymatic aminoacylation of tRNA with unnaturalamino acids

II­ Mutagenèse à suppression de non sens

● Approches in vitro.

– Screening : tRNA + tRNA synthétase + spectro de masse 

– Quelles molécules chargeables ?

Enzymatic aminoacylation of tRNA with unnaturalamino acids

II­ Mutagenèse à suppression de non sens

Enzymatic aminoacylation of tRNA with unnaturalamino acids

II­ Mutagenèse à suppression de non sens

Très grosse diversité ...

Ribosomal Synthesis of Unnatural PeptidesII­ Mutagenèse à suppression de non sens

● Approches in vitro.

– Chargement chimique des AAnon naturels

– selon un code génétique modifié

Ribosomal Synthesis of Unnatural PeptidesII­ Mutagenèse à suppression de non sens

● Principale limite

– Compétition tRNACUA

 / Release Factor 1

● Faible rendement● RF1 indispensable chez coli● 320 genes chez E. coli se terminent par le codonUAG 

dont 44 sont essentiels)● Solutions :

– Surexpression du tRNACUA

– Mutant thermosensible du RF1 (augmentation de la température pendant l'induction

– Rendement 20 à 30% max (incorporé vs tronqué)

Ribosomal Synthesis of Unnatural PeptidesII­ Mutagenèse à suppression de non sens

● Solution : Ribo­X– Evolution dirigée de Ribosomes spécifiques (O­ribosome)

– Ne reconnaissent pas le RF­1

– Reconnaisent des mRNA spécifiques (o­mRNA)

● Sites de reconnaissance des ribosomes modifiés

Rendement > 60% (1 site)20 % pour deux aA non naturels

Ribosomal Synthesis of Unnatural PeptidesII­ Mutagenèse à suppression de non sens

● Amélioration: Ribo­Q– Evolution dirigée : Ribosomes pour codons Quadruplet

– Potentiel de 256 codons

RiboQ1 ; incorpore efficacement (et fidèlement) une Ser lors de la rencontre du codon AGGA

o­mRNA codant pour la Chloramphénicol acetyl Esterase

Ribosomal Synthesis of Unnatural PeptidesII­ Mutagenèse à suppression de non sens

● Amélioration: Ribo­Q– Evolution dirigée : Ribosomes pour codons Quadruplet

– Potentiel de 256 codons

– Engineering / la t­RNAsynthase pour l'incorporation Aa non naturels

Ribosomal Synthesis of Unnatural PeptidesII­ Mutagenèse à suppression de non sens

● Articles récents :– Neumann, H., Peak­Chew, S. Y.&Chin, J.W. Genetically encoding Nε­acetyllysine in recombinant 

proteins. Nature Chem. Biol. 4, 232–234 (2008) : nouvelle paire orthogonal trouvée chez Methanosarcina barkeri : pyrrolysyl­tRNA synthetase–tRNA

CUA

–

Ribosomal Synthesis of Unnatural PeptidesII­ Mutagenèse à suppression de non sens

● Applications–

–

Etude de la catalyse par des radicaux Y.

« Click Chemistry »II­Chimie Clique

● Chimie « Orthogonale »– Une seule réaction possible entre partenaire

– Pas (peu) de réaction  secondaire

– Condition douce

– Hauts rendements de couplage

« Click Chemistry »II­Chimie Clique

● Chimie « Orthogonale »– Une seule réaction possible entre partenaire

– Pas (peu) de réaction  secondaire

– Condition douce

– Hauts rendements de couplage

« Click Chemistry »II­Chimie Clique

● Chimie « Orthogonale »– Une seule réaction possible entre partenaire

– Pas (peu) de réaction  secondaire

– Condition douce

– Hauts rendements de couplage

« Click Chemistry »II­Chimie Clique

● Chimie « Orthogonale »– Une seule réaction possible entre partenaire

– Pas (peu) de réaction  secondaire

– Condition douce

– Hauts rendements de couplage

Hydroxylamine

« Click Chemistry »II­Chimie Clique

● Chimie « Orthogonale »– Une seule réaction possible entre partenaire

– Pas (peu) de réaction  secondaire

– Condition douce

– Hauts rendements de couplage

III­Chimie Clique« Click Chemistry »

III­Chimie Clique« Click Chemistry »

The Methanosarcina barkeri MS pyrrolysyl tRNA synthetase/ tRNACUA pair is a new orthogonal pair in E. coli.9,10 We demonstrated it can be evolved to direct the efficient incorporation of unnatural amino acids into genetically determined sites in recombinant proteins and several unnatural amino acids have now been incorporated by evolving this pair.

III­Chimie Clique

In situ click Chemistry

● Acetylcholinesterase– Azide _ Acetylene : 

● Sans Cu++● inhibiteur femtomolaire

III­Chimie Clique

Expressed Protein Ligation

● Résumé : Liaisons entre differents segments/blocs– Synthétiques

– Recombinants

– Recupération d'un produit avec des propriété inédite

● Principe énoncé in vitro– Retrouvé in vivo (intéines)

– Incorporation de 'velcros moléculaires' chimiques à l'extrémité des fragments

Expressed Protein Ligation

● INTRODUCTION

● ORIGINS OF EXPRESSED PROTEIN LIGATION

– Protein Semisynthesis

– Chemical Ligation of Unprotected Peptides 

– Native Chemical Ligation 

– Protein Splicing and Trans­Splicing

– Expressed Protein Ligation 

● MISE EN PRATIQUE DE l'EPL

– Résumé

– Production des fragments

– Un kit commercial

● APPLICATIONS OF EXPRESSED PROTEIN LIGATION

– Introduction of Fluorescent Probes

– Introduction of Posttranslational Modifications

– Introduction of Stable Isotopes.

– Introduction of Unnatural Amino Acids

– Topology Engineering of Proteins

● FUTURE OUTLOOK AND SUMMARY

Manipulations Chimiques des Protéines

● Semisynthesis of proteins by expressed protein ligation. Annu Rev Biochem. 2003;72:249­89. TW Muir– Expressed protein ligation. Eur. J. Biochem 2004;271:663­77 

R David, MPO Ritcher AG Beck­Sickinger

– Manipulating proteins with chemistry: a cross­section of chemical biology Trends Biochem Sci. 2005;30,26­34 ME Hahn and TW Muir

Développement de la ligation des Protéines Exprimées « EPL »

●Semi­synthèse des protéines●Ligation Chimique des peptides non­protégés●Ligation Chimique Native (NCL)●Epissage des protéines et Trans­épissage●Ligation des Protéines Exprimées (EPL)

Semi­synthèse des protéines● Historiquement :

– Blocs :  fragments de protéines (clivage)● Clivage Chimique (CNBr)● Clivage Protéolytique 

● Obervation ancienne (Dyckes Nature 1974)

– Clivage chimique (CNBr) : Pancreatic Trypsine inhibitor / Cytochrome c

– Repliement coopératif

– Proximité des extrémités : Homosérine lactone /Amine Term Libre

– Réaction chimique spontanée, recondensation spontanée, liaison native

● => Incorporation d'Aa non naturels dans le cytochrome C– (Wallace Biochemistry 1997)

Développement de la ligation des Protéines Exprimées

Semi­synthèse des protéines

Semi­synthese : Tout processus spécifique de modification d'une protéine naturelle (#  bioconjugaison : pas suffisamment spécifique)

● I ­ Marquages : modérément à hautement spécifique

– Exemples 1● Introduction d'une Cys (Mutagenèse standard)● Dérivation du thiol / réactif – sonde chimique

– Incorporation d'un « Cross linker photoactivable– Inc. Fluorophores– Préparation d'enzymes «photocagées »– Optimisation de l'affinité de la Maltose Binding Protéin

Développement de la ligation des Protéines Exprimées

Semi­synthèse des protéines● II ­ Stratégie de Protéolyse inverse :

– Enz protéolytique

– Altération des conditions de réaction : favoriser l'aminolyse vs hydrolyse

– Hte C° de solvant organique : Glycérol, DMF, Acétonitryl

– Blocage de l'intermédiaire peptyl­Enz

– Aminolyse avec Pep2 

– Résultats probants : Subtilisine, Trypsine, Papaïne

Développement de la ligation des Protéines Exprimées

Semi­synthèse des protéines● II ­ Stratégie de Protéolyse inverse :

– Exemple 1 : réalisation d'une nouvelle forme glycosylée de la Ribonucléase B (Witte K, JACS 1997)

● Réac enz. Oligosaccaride / ligation peptidique

 Introduction de l'oligosaccaride Sialyl Lewis X/ 1 site spécifique

Développement de la ligation des Protéines Exprimées

Semi­synthèse des protéines● III ­ Ligation peptidique enzymatiquement médiée (semi­

synthèse enzymatique) :– Ingénierie des sites actifs d'Enz. protéolytique

● Exemple Historique (Nakatsuka JACS 1987) : la trypsine– Ser (triade catalytique) ­> Cys– Activité d'acétylation +++

● Amélioration (Jackson Science 1994) : la « Subtiligase »– Ser­>Cys : Acétylation de l'Enz / substrat Pep1­Cterm­Phenylalanylglycolate– Pro­>Ala : suppression de l'encombrement stérique local : aminolyse efficace par 

Nterm­ Pep2– Reconstitution de Pep1­Pep2– Synthèse chimique de protéines entières – Prep de pep cycliques– Prep de protéines semi­synthetiques ...

Développement de la ligation des Protéines Exprimées

Semi­synthèse des protéines● III ­  Ligation peptidique enzymatiquement médiée (semi­

synthèse enzymatique) :– Ingénierie des sites actifs d'Enz. protéolytiques

● Amélioration (Jackson Science 1994) : la « Subtiligase »

Développement de la ligation des Protéines Exprimées

● 6 peptides de synthese 12 à 30 résidus

Protection­Déprotection

Synthèse totale de la Ribonucléase A + variants avec résidu(s) catalytique 4­fluorohistidine (153 Aa).

Décalage de l'activité vers les pH acide (4 vs 7)

Semi­synthèse des protéines● IV ­ Combinaison synthèse chimique et semi­synthèse 

enzymatique– Réaction de type hydrazone­oxime

● Ligation d'un peptide synthétique + fragment recombinant● Exemple : activité biologique de «Granulocyte colony Stimulating 

Factor » (analogue du G­CSF) (Gaertner J.BiolChem 1994)

– VALIDATION– Mutagénèse : insertion d'une séquence unique ­Lys­Ser­– Protéolyse spécifique– Oxidation périodique du N­term Frag2 en aldéhyde– Formation d'un hydrazide C­term Fragm1 par protéolyse inverse– Mélange Frag1 et Frag2 : religation en protéine native – EXTENTION– Définition d'un fragment central– Remplacé par un pep de synthèse : « synthetic cassette mutagenesis »

Développement de la ligation des Protéines Exprimées

Semi­synthèse des protéines● IV ­ Combinaison synthèse chimique et semi­synthèse 

enzymatique– Réaction type hydrazone­oxime

● Ligation d'un peptide synthétique + fragment recombinant● Exemple : activité biologique de «Granulocyte colony Stimulating 

Factor » (analogue du G­CSF) (Gaertner J.BiolChem 1994)

Développement de la ligation des Protéines Exprimées

Aldéhyde : réaction d'oxidation periodique

Fragment : digestion spécifique ­K­S­ par protease de Achromobacter 

Semi­synthèse des protéines● IV ­ Combinaison synthèse chimique et semi­synthèse 

enzymatique– Réaction type hydrazone­oxime

● Ligation d'un peptide synthétique + fragment recombinant● Exemple : activité biologique de «Granulocyte colony Stimulating 

Factor » (analogue du G­CSF)  (Gaertner J.BiolChem 1994)

Développement de la ligation des Protéines Exprimées

Insert

Hydrazide : réaction enzymatique (protease de Achromobacter)

Semi­synthèse des protéines● IV ­ Combinaison synthèse chimique et semi­synthèse 

enzymatique– Réaction type hydrazone­oxime

● Ligation d'un peptide synthétique + fragment recombinant● Exemple : activité biologique de «Granulocyte colony Stimulating 

Factor » (analogue du G­CSF)  (Gaertner J.BiolChem 1994)

Développement de la ligation des Protéines Exprimées

Insert

(Augmentation de la flexibilité)

(hydrazone)

Semi­synthèse des protéines● IV ­ Combinaison synthèse chimique et semi­synthèse 

enzymatique– Réaction type hydrazone­oxime

● Ligation d'un peptide synthétique + fragment recombinant● Exemple : activité biologique de «Granulocyte colony Stimulating 

Factor » (analogue du G­CSF)  (Gaertner J.BiolChem 1994)

Développement de la ligation des Protéines Exprimées

Insert

Semi­synthèse des protéines● IV ­ Combinaison synthèse chimique et semi­synthèse 

enzymatique– Réaction type hydrazone­oxime

● Ligation d'un peptide synthétique + fragment recombinant● Exemple : activité biologique de «Granulocyte colony Stimulating 

Factor » (analogue du G­CSF)  (Gaertner J.BiolChem 1994)

Développement de la ligation des Protéines Exprimées

+

Insert

Semi­synthèse des protéines● IV ­ Combinaison synthèse chimique et semi­synthèse 

enzymatique

Développement de la ligation des Protéines Exprimées

Semi­synthèse des protéines● Approches pour la synthèse chimique totale des protéines

– Utilisation de blocs non protégés (synthétiques) puis ligations● Exemple historique : synthèse totale de la HIV­1 Protéase (Schnölzer 1992 

Sciences)

– 2 x 50 résidus ( syntétiques)– Liaison thioester : solution aqueuse, pH 7

● Autres Chimie :– Thioether (1994)– oxime/hydrazone (1992­1994)– Thiazolidine (1994)– Dérivé amide (1994­2000)

● Approches pour la synthèse chimique totale des protéines– Utilisation de blocs non protégés (synthétiques) puis ligations

● Exemple historique : synthèse totale de la HIV­1 Protéase (Schnölzer 1992 Sciences)

– 2 x 50 résidus ( syntétiques)– Liaison thioester : solution aqueuse, pH 7

● Autres Chimie :– Thioether (1994)– oxime/hydrazone (1992­1994)– Thiazolidine (1994)– Dérivé amide (1994­2000)

Développement de la ligation des Protéines Exprimées

Ligation Chimique Native (NCL)● Formation d'une véritable liaison peptidique

– Mécanisme 1 bimoléculaire (optimisation de la réactivité)

– Mécanisme 2 réarangement monomoléculaire

● Formation d'une véritable liaison peptidique

– Mécanisme 1 bimoléculaire (optimisation de la réactivité)

– Mécanisme 2 réarangement monomoléculaire

Développement de la ligation des Protéines Exprimées

Ligation Chimique Native (NCL)● Formation d'une véritable liaison peptidique

– Kemp «prior thiol capture»

– Ligation totalement native (Dawson 1994 science) 

● Formation d'une véritable liaison peptidique– Kemp «prior thiol capture»

– Ligation totalement native (Dawson 1994 science) 

Développement de la ligation des Protéines Exprimées

N­terminal Cys

C­terminal α­thioesther● Améliorations

– Nterm # cys

– Cofacteur thiol catalitique

– Solution et phase solide

– Ligation séquentielle

Énormément de développements ...

● Améliorations– Nterm # cys

– Cofacteur thiol catalitique

– Solution et phase solide

– Ligation séquentielle

Énormément de développements ...

Ligation Chimique Native (NCL)● Formation d'une véritable liaison peptidique

– Kemp «prior thiol capture» 

– Ligation totalement native (Dawson 1994 science) ● Ex de protéines complètes

– human matrix Gla protein (84 residues) (Hackeng Protein Science 2001)

– anticoagulant microprotein S (116 residues) (Hackeng PNAS 2000)

– human neutrophil pro α­defensin­1 (75 residues) (Wu J Pept Res 

2003).● Protéines avec  modifications post­traductionnelles

– glycoproteins diptericin (58 residues) (Shin JACS 1999) – lymphotactin (93 residues) (Marcaurelle Chem Eur J 2001). – La proteine prion avec un mimétique de 

glycosylphosphatidylinositol (Ball J Pep Res 2001). 

● Formation d'une véritable liaison peptidique– Kemp «prior thiol capture» 

– Ligation totalement native (Dawson 1994 science) ● Ex de protéines complètes

– human matrix Gla protein (84 residues) (Hackeng Protein Science 2001)

– anticoagulant microprotein S (116 residues) (Hackeng PNAS 2000)

– human neutrophil pro α­defensin­1 (75 residues) (Wu J Pept Res 

2003).● Protéines avec  modifications post­traductionnelles

– glycoproteins diptericin (58 residues) (Shin JACS 1999) – lymphotactin (93 residues) (Marcaurelle Chem Eur J 2001). – La proteine prion avec un mimétique de 

glycosylphosphatidylinositol (Ball J Pep Res 2001). 

Développement de la ligation des Protéines Exprimées

Ligation Chimique Native (NCL)● Formation d'une véritable liaison peptidique

– Kemp «prior thiol capture» )

– Ligation totalement native ● Ex de protéines complètes● Proteines avec  modifications post­traductionnelles● Modifications non naturelles (sondes ou buts thérapeutiques)

– Le protooncogène H­Ras (166 residus) avec un Ras­binding domain (81 residus) + incorporation d'une étiquette fluorescente => suivi de l'interaction (Becker Chem Biol 2001, PNAS 2003).

– Une protéine d'erythropoïèse modifiée par un polyéthylène glycol(166 residues)  (Kochendoerfer Science 2003) 

● Prolongation de demi­vie , ● Amélioration de l'activité biologique

● Formation d'une véritable liaison peptidique– Kemp «prior thiol capture» )

– Ligation totalement native ● Ex de protéines complètes● Proteines avec  modifications post­traductionnelles● Modifications non naturelles (sondes ou buts thérapeutiques)

– Le protooncogène H­Ras (166 residus) avec un Ras­binding domain (81 residus) + incorporation d'une étiquette fluorescente => suivi de l'interaction (Becker Chem Biol 2001, PNAS 2003).

– Une protéine d'erythropoïèse modifiée par un polyéthylène glycol(166 residues)  (Kochendoerfer Science 2003) 

● Prolongation de demi­vie , ● Amélioration de l'activité biologique

Développement de la ligation des Protéines Exprimées

Ligation Chimique Native (NCL)● Formation d'une véritable liaison peptidique

– Kemp «prior thiol capture» 

– Ligation totalement native ● Ex de protéines complètes● Proteines avec  modifications post­traductionnelles● Modifications non naturelles (sondes ou buts thérapeutiques)● Crambin (46 résidu) (Bang Angew Chem Int 2004)

– En 1 pot– 3 peptides séquentiellement– Pas de purification intermédiaire– Haut rendement– Repliement dans le mélange de réaction– Native

● Formation d'une véritable liaison peptidique– Kemp «prior thiol capture» 

– Ligation totalement native ● Ex de protéines complètes● Proteines avec  modifications post­traductionnelles● Modifications non naturelles (sondes ou buts thérapeutiques)● Crambin (46 résidu) (Bang Angew Chem Int 2004)

– En 1 pot– 3 peptides séquentiellement– Pas de purification intermédiaire– Haut rendement– Repliement dans le mélange de réaction– Native

Développement de la ligation des Protéines Exprimées

Ligation des Protéines Exprimées (EPL)● Formation d'une véritable liaison peptidique

– Idem : Ligation totalement native (Dawson 1994 science) 

● Formation d'une véritable liaison peptidique– Idem : Ligation totalement native (Dawson 1994 science) 

Développement de la ligation des Protéines Exprimées

Protéine recombinante avec Cys en Nterm

+

Peptide de synthèse comprenant l'α­thioesther

Peut­ont obtenir l'α­thioesther par protéine recombinate ?

=> Oui, grâce aux intéines ...

Ligation des Protéines Exprimées (EPL)● L'épissage protéique (Paulus Annu Rev Biochem 2000)● L'épissage protéique (Paulus Annu Rev Biochem 2000)

Développement de la ligation des Protéines Exprimées

– Modification postraductionnelle naturelle (description : cooper EMBO J 1993)

– > 500 (09) (http://www.neb.com/neb/inteins.html)

● Eukarya (Levures, Algues, champignons)

● Eubacteria, Archaea

– Pas de contraintes de séquence sur les Exteine sauf ...

– Motifs conservés dans les Inteines

– Modification postraductionnelle naturelle (description : cooper EMBO J 1993)

– > 500 (09) (http://www.neb.com/neb/inteins.html)

● Eukarya (Levures, Algues, champignons)

● Eubacteria, Archaea

– Pas de contraintes de séquence sur les Exteine sauf ...

– Motifs conservés dans les Inteines

!  Présence d'une Cys à la jonction des Extéines(ou S ou T ...)

Ligation des Protéines Exprimées (EPL)● L'épissage protéique

– Motifs concervés dans les Inteines

● L'épissage protéique– Motifs concervés dans les Inteines

Développement de la ligation des Protéines Exprimées

Intein Block C Block D Block E Block H Consensus LhG..hhaG .K.IP..h .L.GhFahDG p.S..hh..h..LL..hGI

Ligation des Protéines Exprimées (EPL)● L'épissage protéique : mécanisme● L'épissage protéique : mécanisme

Développement de la ligation des Protéines Exprimées

succinimide

Ligation des Protéines Exprimées (EPL)● L'épissage protéique : mécanisme● L'épissage protéique : mécanisme

Développement de la ligation des Protéines Exprimées

– Thermodynamiquement défavorable● Torsion de liaison peptidique induit 

par la stucture 3D

– Thermodynamiquement défavorable● Torsion de liaison peptidique induit 

par la stucture 3D

Ligation des Protéines Exprimées (EPL)● L'épissage protéique : mécanisme

– Transfert de la C­Exteine

● L'épissage protéique : mécanisme– Transfert de la C­Exteine

Développement de la ligation des Protéines Exprimées

Intermédiaire branché

succinimide

Ligation des Protéines Exprimées (EPL)● L'épissage protéique : mécanisme

– Réaction de cyclisation (Asn conservée en Cterm de l'Intéine)

● L'épissage protéique : mécanisme– Réaction de cyclisation (Asn conservée en Cterm de l'Intéine)

Développement de la ligation des Protéines Exprimées

(i) Excision de l'intéine (succinimide)(ii) Formation de la liaison peptidique Même réaction chimique que dans la 

Ligation Chimique Native (S­>N acyl transfert)

Ligation des Protéines Exprimées (EPL)● L'épissage protéique

– Exploitation Biotechnologique : construction recombinante  ● Extéine N­term : séquence protéique d'intérêt● Extéine C­term pour une chromato d'affinité● Une mutation de l'Asn conservée ­> Ala de l'intéine

● L'épissage protéique– Exploitation Biotechnologique : construction recombinante  

● Extéine N­term : séquence protéique d'intérêt● Extéine C­term pour une chromato d'affinité● Une mutation de l'Asn conservée ­> Ala de l'intéine

Développement de la ligation des Protéines Exprimées

Ligation des Protéines Exprimées (EPL)● L'épissage protéique

– Exploitation Biotechnologique : ● mutation de l'Asn conservée de l'intéine :

● L'épissage protéique– Exploitation Biotechnologique : 

● mutation de l'Asn conservée de l'intéine :

Développement de la ligation des Protéines Exprimées

– Blocage à la première étape ...

– Substitution de la cyclisation monomoléculaire par une Thiolyse bimoléculaire (ajout d'un thiol en eccès)

=> Préparation d'un dérivé α­thioester

OK pour ligation chimique natives

+ peptide synthétique

Produit semi­synthétique

– Blocage à la première étape ...

– Substitution de la cyclisation monomoléculaire par une Thiolyse bimoléculaire (ajout d'un thiol en eccès)

=> Préparation d'un dérivé α­thioester

OK pour ligation chimique natives

+ peptide synthétique

Produit semi­synthétique

Ligation des Protéines Exprimées (EPL)● L'épissage protéique

– Exploitation Biotechnologique : ● Trans­epissage :

● L'épissage protéique– Exploitation Biotechnologique : 

● Trans­epissage :

Développement de la ligation des Protéines Exprimées

– Intéine en 2 morceaux inactifs

– Reconstitution intéine active● Affinity tag sur l'intéine découpé● Synthèse chimique d'un morceau ● Splicing in vivo (2 prot 

recombinantes)● Dénaturation­renaturation des 2 

nécessaire in vitro ...● ... non ! Intéine DnaE  (Synechocytis) 

naturellement en 2 morceaux– Plus de dénaturation

– Intéine en 2 morceaux inactifs

– Reconstitution intéine active● Affinity tag sur l'intéine découpé● Synthèse chimique d'un morceau ● Splicing in vivo (2 prot 

recombinantes)● Dénaturation­renaturation des 2 

nécessaire in vitro ...● ... non ! Intéine DnaE  (Synechocytis) 

naturellement en 2 morceaux– Plus de dénaturation

Purification

Reconstitution

Ligation des Protéines Exprimées (EPL)● L'épissage protéique

– Exploitation Biotechnologique : ● Trans­epissage :

● L'épissage protéique– Exploitation Biotechnologique : 

● Trans­epissage :

Développement de la ligation des Protéines Exprimées

– Intéine en 2 morceaux inactifs● Génération de Prot semisynt. 

(Lew J Mol Biol 1998)● Marquage isotopique dans des 

segments spécifiques (RMN) (Yamasaki JACS 1998; Xu PNAS 1999; Otomo Biochemistry 1999; Romanelli PNAS 2004)

● Interaction in vivo (Paulmurugan PNAS 2002; Kim PNAS 2004; Yang PNAS 2003; Chin PNAS 2003)

– Intéine en 2 morceaux inactifs● Génération de Prot semisynt. 

(Lew J Mol Biol 1998)● Marquage isotopique dans des 

segments spécifiques (RMN) (Yamasaki JACS 1998; Xu PNAS 1999; Otomo Biochemistry 1999; Romanelli PNAS 2004)

● Interaction in vivo (Paulmurugan PNAS 2002; Kim PNAS 2004; Yang PNAS 2003; Chin PNAS 2003)

Ligation des Protéines Exprimées (EPL)● L'épissage protéique

– Exploitation Biotechnologique : ● Applications :

– Formation de puces à protéines (Tan Bioor Med Chem Lett 2004; Lue Methods Mol Biol 2004; Sydor Bioconj Chem 2002; Sun Biotechniques 2004)

● L'épissage protéique– Exploitation Biotechnologique : 

● Applications :– Formation de puces à protéines (Tan Bioor Med Chem Lett 2004; Lue Methods 

Mol Biol 2004; Sydor Bioconj Chem 2002; Sun Biotechniques 2004)

Développement de la ligation des Protéines Exprimées

 => Epitope scanning, kinase assays : sensibilité de la puce x 10000

Ligation des Protéines Exprimées (EPL)● L'épissage protéique

– Exploitation Biotechnologique● Applications :

– Imagerie cellulaire (Kim PNAS 2004)

– Système de screening in vitro :● Intéine + GFP (Gangopadhyay Anal chem 2003)

– Plantes transgéniques  (Chin PNAS 2003) : ● résistance au Glyphosphate (herbicide)

● splitting entre noyaux et chloroplaste

● L'épissage protéique– Exploitation Biotechnologique

● Applications :– Imagerie cellulaire (Kim PNAS 2004)

– Système de screening in vitro :● Intéine + GFP (Gangopadhyay Anal chem 2003)

– Plantes transgéniques  (Chin PNAS 2003) : ● résistance au Glyphosphate (herbicide)

● splitting entre noyaux et chloroplaste

Développement de la ligation des Protéines Exprimées

=> Pas de transmission du gène fonctionnel au pollen

Ligation des Protéines Exprimées (EPL)

● L'épissage protéique– Exploitation Biotechnologique : 

● L'épissage protéique– Exploitation Biotechnologique : 

Développement de la ligation des Protéines Exprimées

– Processing normal

– Complémentation induite

– Self complémentation (mutant sans processing) 

– Processing normal

– Complémentation induite

– Self complémentation (mutant sans processing) 

Ligation des Protéines Exprimées (EPL)● L'épissage protéique

– Exploitation Biotechnologique : ●  Molecular switches

● L'épissage protéique– Exploitation Biotechnologique : 

●  Molecular switches

Développement de la ligation des Protéines Exprimées

– Conditional splicing : Température (Zeidler Nat Biotechnol 2004)

– Ligand (rapamycin) induces trans­splicing (Mootz JACS 2003)

– Conditional splicing : domaine de fixation inséré (Buskirk PNAS 2004; Skretas Protein Science 2005)

– Conditional splicing : Température (Zeidler Nat Biotechnol 2004)

– Ligand (rapamycin) induces trans­splicing (Mootz JACS 2003)

– Conditional splicing : domaine de fixation inséré (Buskirk PNAS 2004; Skretas Protein Science 2005)

Ligation des Protéines Exprimées (EPL)● L'épissage protéique

– Exploitation Biotechnologique : ● Molecular switches

● L'épissage protéique– Exploitation Biotechnologique : 

● Molecular switches

Développement de la ligation des Protéines Exprimées

– Conditional splicing : Température (Zeidler Nat Biotechnol 2004)

– Ligand (rapamycin) induces trans­splicing (Mootz JACS 2003)

– Conditional splicing : domaine de fixation inséré (Buskirk PNAS 2004; Skretas Protein Science 2005)

– Conditional splicing : Température (Zeidler Nat Biotechnol 2004)

– Ligand (rapamycin) induces trans­splicing (Mootz JACS 2003)

– Conditional splicing : domaine de fixation inséré (Buskirk PNAS 2004; Skretas Protein Science 2005)

RésuméMise en pratique de l'EPL

●Prot recombinante Cys N­term + Pep de synthèse α thio­Esther

ProtéineCys­Peptide­COSR

●Prot recombinante α thio­Esther + Pep de synthèse Cys Nterm

Cys­Peptide

●Pep de synthèse Cys N­term + Pep de synthèse α thio­Esther

●Prot recombinante α thio­Esther + Prot recombinane Cys Nterm

Peptide­COSR

Protéine ­COSR Cys­Peptide

ProtéineCys­Protéine ­COSR

­ Synthèse chimique totale100 aA/bloc)

­ In vitro ou in vivo

­ Introduction de propriétés non natives / 100 aA C­term

­ Introduction de propriétés non natives / 100 aA N­term

Autres possibilitésMise en pratique de l'EPL

ProtéineCys­Protéine ­COSR Cys­Peptide­COSR

­COSR Cys­

RSOC­­Cys

● Stratégie d'EPL séquentielle– Insertion

– Cyclisation

– ...

=> Production des fragments + ligation 

(in vitro ou in vivo)

● Stratégie d'EPL séquentielle– Insertion

– Cyclisation

– ...

=> Production des fragments + ligation 

(in vitro ou in vivo)

Production des fragments (protéines recombinantes)● Passage de l'extrait cellulaire sur la colonne d'affinité

● Formation du dérivé α­thioesther :

– Petites molécules nucléophiles

– Pénétration de la poche catalytique

– Stabilité du α ­thioester

– Réactivité suffisante pour la ligation

● Alkyl­thioester stable mais peu réactif● Additifs Alkylthiols + thiophenol● Acide 2­mercaptoethansulfonique (MESNA)

● Passage de l'extrait cellulaire sur la colonne d'affinité

● Formation du dérivé α­thioesther :

– Petites molécules nucléophiles

– Pénétration de la poche catalytique

– Stabilité du α ­thioester

– Réactivité suffisante pour la ligation

● Alkyl­thioester stable mais peu réactif● Additifs Alkylthiols + thiophenol● Acide 2­mercaptoethansulfonique (MESNA)

Mise en pratique de l'EPL

Production des fragments (protéines recombinantes)

● Production de la Cys N­term– Expression directe avec Met­Cys­Prot

● Met aminopeptidase (mauvais rendements

– Protéolyse● Facteur Xa (Cterm de Ile­Glu­Gly­Arg, Ile­Asp­Gly­Arg  et Ala­Glu­Gly­Arg. )

● TEV (protéase du tobacco etch virus Glu­X­X­Tyr­X­Gln­ ­Ser/Cys.)

– Intéines modifiées autoclivables● pH­température● Risque de clivages intempestifs ...

● Production de la Cys N­term– Expression directe avec Met­Cys­Prot

● Met aminopeptidase (mauvais rendements

– Protéolyse● Facteur Xa (Cterm de Ile­Glu­Gly­Arg, Ile­Asp­Gly­Arg  et Ala­Glu­Gly­Arg. )

● TEV (protéase du tobacco etch virus Glu­X­X­Tyr­X­Gln­ ­Ser/Cys.)

– Intéines modifiées autoclivables● pH­température● Risque de clivages intempestifs ...

Mise en pratique de l'EPL

Un kit commercial●  Le système IMPACT® (New England Biolabs)●  Le système IMPACT® (New England Biolabs)

Mise en pratique de l'EPL

– Basé sur une intéine mutante (Asn/Gln­>Ala)

● pas d'autocatalyse● Scission induite (Thioysel)● Production de l'α­thioester ou de 

la Cys therminal

– Vecteurs

– Colonne de Chitine

– Basé sur une intéine mutante (Asn/Gln­>Ala)

● pas d'autocatalyse● Scission induite (Thioysel)● Production de l'α­thioester ou de 

la Cys therminal

– Vecteurs

– Colonne de Chitine